一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
技术领域
本发明涉及无创产前筛查检测领域，具体涉及一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用。
背景技术
唐氏综合征，又称21-三体综合征或者先天愚型，是由新生儿染色体异常所引起的先天性疾病。唐氏综合征的发病概率大约在1/800～1/600，在小儿三体型染色体疾病中占的比重最高，约为70％～80％，而且该病的发病率会随着产妇生育年龄的增高而上升。产前诊断筛查对于筛查唐氏综合症是很重要而且很有实用性的一部分，大家所熟知的产前诊断筛查方法主要是传统的一些筛查方法，如羊膜腔穿刺抽取羊水、绒毛膜取样以及穿刺抽取脐带血等方法。这些方法带有一定的创伤性，对孕妇和胎儿也会造成一定的危险，严重者甚至可能会带来流产的风险。而且，穿刺抽取羊水要在孕妇孕周达到16周以后才能进行，因为孕周16周后胎儿才能达到一定的成熟度，易于检测。如果此时诊断结果显示胎儿染色体异常，则已经错过了最佳的流产时期，可能需要通过引产来解决，这大大增加了孕妇的痛苦且增加了并发症发生的可能。
上世纪九十年代，有研究报道了孕妇的血液循环中有胎儿游离DNA(cff-DNA)的存在，后来有研究也报道发现孕妇血浆中存在胎儿核糖核酸(RNA)，这些重大的临床研究发现为无创性产前筛查胎儿染色体异常提供了新的可能性。近年来无创性产前筛查诊断取得了巨大的突破和进展，胎儿游离细胞已经成功地应用于非侵入性产前诊断胎儿性别和Rh血型鉴定，这些重大的研究和成果都是建立在对母体血浆中cff-DNA序列测定的基础上实现的。但是在孕妇血浆中，母源性游离DNA含量占整个游离DNA的绝大部分，cff-DNA只占孕妇血浆中游离DNA总量的3％～5％，所以传统的DNA提取技术及PCR等方法难以对胎儿唐氏综合征进行准确的判断。
因此，高效、准确的检测判断胎儿染色体是否为非整倍体就显得极为重要，同时也成为了无创产前筛查技术的关键。
CN104195241A公开了一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法。本发明通过孕妇尿液中游离DNA提取结合高通量测序及生物信息分析，可以检测胎儿染色体是否非整倍，从而辨别胎儿是否患唐氏综合症。该方法DNA提取与DNA高通量测序数据库构建为两个独立的过程，且步骤繁琐，漂洗复杂，容易影响检测结果。
目前的无创产前筛查诊断过程中，游离DNA的提取一般是单独采用市售游离DNA提取试剂盒进行提取，与文库构建是作为两个独立的环节进行的，整个筛查诊断过程中所需涉及的试剂盒繁多，操作步骤复杂，容易造成DNA样本的损失或污染，从而影响高通量测序结果。同时游离DNA的文库构建过程中纯化不彻底，容易留下接头自连的问题，污染测序文库，也会影响检测结果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的构建胎儿染色体文库，为无创检测胎儿染色体是否为非整倍体奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种胎儿染色体文库构建的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于DNA提取的试剂和用于DNA文库构建的试剂。
本发明中，游离DNA的提取和文库的构建只需通过一个试剂盒便可完成，可以系统的实现样本DNA的提取和文库构建，操作步骤简单，不会造成DNA样本的损失或污染。
作为优选技术方案，所述用于DNA提取的试剂包括：游离DNA提取试剂、游离DNA沉淀试剂、游离DNA漂洗试剂。
优选地，所述用于DNA文库构建的试剂包括：DNA末端修复试剂、连接修复DNA的接头试剂、PCR扩增引物和纯化文库的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括用于收集提取DNA的离心柱、用于洗脱DNA与文库的超纯水和磁珠悬浮液。
优选地，所述游离DNA提取试剂包括：0.02-0.2MTris-HCl缓冲液、100-500μg/mL蛋白酶K、0.01-0.1MEDTA和0.05-0.3％Triton-100；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.08M、0.1M、0.12M、0.15M、0.18M、0.19M或0.2M；
所述蛋白酶K的浓度例如可以是100μg/mL、101μg/mL、102μg/mL、105μg/mL、108μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、480μg/mL或500μg/mL；
所述EDTA的浓度例如可以是0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.1M；
所述Triton-100的浓度例如可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％、0.2％、0.23％、0.25％、0.28％或0.3％。
优选地，所述游离DNA沉淀试剂为有机溶剂，优选为甲醇、无水乙醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的混合。
优选地，所述游离DNA漂洗试剂包括：0.02-0.2MTris-HCl缓冲液、2-10M异硫氰酸胍和0.4-3MNaCl；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.08M、0.1M、0.12M、0.15M、0.18M、0.19M或0.2M；
所述异硫氰酸胍的浓度例如可以是2M、2.1M、2.2M、2.5M、2.6M、2.8M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、5.5M、6M、6.5M、7M、7.5M、8M、8.5M、9M、9.5M、9.8M或10M；
所述NaCl的浓度例如可以是0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.8M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.5M、2.6M、2.8M、2.9M或3M。
优选地，所述DNA末端修复试剂包括：0.02-0.2MTris-HCl缓冲液、0.05-0.2U/μLTaqDNA聚合酶、10-100mMMgCl2和50-200mMKCl；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.08M、0.1M、0.12M、0.15M、0.18M、0.19M或0.2M；
所述TaqDNA聚合酶的浓度例如可以是0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL、0.1U/μL、0.11U/μL、0.12U/μL、0.13U/μL、0.14U/μL、0.15U/μL、0.16U/μL、0.17U/μL、0.18U/μL、0.19U/μL或0.2U/μL；
所述MgCl2的浓度例如可以是10mM、11mM、12mM、13mM、15mM、18mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM。
所述KCl的浓度例如可以是50mM、51mM、53mM、55mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
优选地，所述连接修复DNA的接头试剂包括：10-100mMTris-HCl缓冲液、0.01-0.5mMT4DNA连接酶和0.1-1μM连接接头；
所述Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.08M、0.1M、0.12M、0.15M、0.18M、0.19M或0.2M；
所述T4DNA连接酶的浓度例如可以是0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM；
所述连接接头的浓度例如可以是0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM。
优选地，所述PCR扩增引物为常规的通用引物和index引物；
index引物为标签引物，不同的DNA样本在连接接头的时候，一头会连接通用引物，另一头会连接index引物；通用引物的序列是相同的，index引物之间序列是不同的，即每个DNA样本通过不同的index引物进行区分，方便测序后数据的归类与分析。
优选地，所述通用物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述通用引物的核苷酸序列如下：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′(SEQIDNO.1)。
优选地，所述index引物的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2-13所示的片段，所述index引物的核苷酸序列如下：
Primer1:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.2)；
Primer2:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.3)；
Primer3:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.4)；
Primer4:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.5)；
Primer5:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.6)；
Primer6:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.7)；
Primer7:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.8)；
Primer8:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.9)；
Primer9:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.10)；
Primer10:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.11)；
Primer11:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.12)；
Primer12:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.13)。
优选地，所述PCR扩增引物的浓度为0.02-0.5mM，例如可以是0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM。
优选地，所述纯化文库的试剂为磁珠悬浮液。
第二方面，本发明提供一种使用如第一方面所述的试剂盒用于构建胎儿染色体高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
1)提取待测样本的DNA；
2)将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库。
优选地，所述待测样本为母体外周血、尿液、脑脊液、血清、唾液或是宫颈灌洗液中的任意一种或至少两种的混合。
优选地，所述待测样本的母体的孕周为12-24周，例如可以是12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周。
优选地，步骤(1)所述提取待测样本的DNA包括如下步骤：
(1)取300-500μL待测样品，加入300-600μL，优选400-550μL游离DNA提取试剂，45-65℃，优选50-60℃水浴保温5-20min，优选8-15min；
(2)加入300-600μL，优选400-550μL游离DNA沉淀试剂，室温孵育1-10min，优选3-8min后转移至离心柱中；
(3)离心弃废液，加入300-600μL，优选400-550μL游离DNA漂洗试剂，离心弃废液，重复该步骤一次；
(4)取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干1-10min，优选3-8min；
(5)加入10-100μL，优选20-50μL超纯水至离心柱中，离心收集游离DNA。
本发明中，试剂盒提取游离DNA需要的血浆样本量少，减少了孕妇外周血的采集量，降低了成本；且本发明优化了DNA提取过程，漂洗剂进行了改进，只需加入本发明漂洗剂清洗两次便可，相比于现有技术中麻烦的漂洗步骤，不仅简化了漂洗步骤，而且得到的DNA纯度更高。
所述游离DNA提取试剂的体积例如可以是300μL、310μL、320μL、330μL、350μL、360μL、380μL、400μL、420μL、450μL、480μL、500μL、520μL、550μL、580μL或600μL；
所述水浴保温的温度例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃；
所述水浴保温的时间例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min；
所述游离DNA沉淀试剂的体积例如可以是300μL、310μL、320μL、330μL、350μL、360μL、380μL、400μL、420μL、450μL、480μL、500μL、520μL、550μL、580μL或600μL；
所述室温孵育的时间例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min；
所述游离DNA漂洗试剂的体积例如可以是300μL、310μL、320μL、330μL、350μL、360μL、380μL、400μL、420μL、450μL、480μL、500μL、520μL、550μL、580μL或600μL；
所述室温晾干时间例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。
优选地，步骤(3)和步骤(5)所述离心的转速为8000-15000r/min，例如可以是8000r/min、8100r/min、8200r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min或15000r/min，优选为1000-13000r/min，进一步优选为12000r/min。
优选地，步骤(3)和步骤(5)所述离心的时间为20-120s，例如可以是20s、21s、22s、23s、25s、26s、28s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s、65s、70s、75s、80s、85s、90s、95s、100s、105s、110s、115s、118s或120s，优选为30-100s，进一步优选为60s。
优选地，步骤(2)所述构建高通量测序文库包括如下步骤：
(1)取5-50ng，优选10-25ng提取的游离DNA，加入1-30μL，优选5-15μLDNA末端修复试剂进行末端修复，得到修复后DNA；
(2)加入8-35μL，优选12-25μL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接；
(3)按体积比1：(0.3-5)，优选1：(0.8-3)的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀1-10min，优选2-6min后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；
(4)加入10-50μL，优选15-40μL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至干净的EP管中；
(5)加入15-60μL，优选25-45μLPCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1：(0.3-5)，优选1：(0.8-3)的比例加入磁珠悬浮液纯化，得到最终的高通量测序文库。
本发明中，优化了文库构建的步骤，将磁珠悬浮液的加入比例进行了优化，使得纯化后的DNA纯度更高，且缩短了混匀的时间，简化了步骤，还降低了文库构建过程中接头自连的残留，提高了测序文库的纯度和浓度。
所述游离DNA例如可以是5ng、6ng、7ng、8ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、45ng或50ng；
所述DNA末端修复试剂例如可以是1μL、2μL、3μL、5μL、8μL、10μL、12μL、15μL、18μL、20μL、23μL、25μL、28μL或30μL；
所述连接修复DNA接头例如可以是8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、15μL、16μL、18μL、20μL、21μL、23μL、25μL、26μL、28μL、30μL、32μL、33μL、34μL或35μL；
步骤(3)所述体积比例如可以是1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.8、1：1、1：1.2、1：1.5、1：1.6、1：1.8、1：2、1：2.2、1：2.5、1：2.6、1：2.8、1：3、1：3.2、1：3.5、1：3.8、1：4、1：4.2、1：4.5、1：4.8或1：5；
所述混匀时间例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min；
所述PCR扩增引物例如可以是15μL、16μL、18μL、20μL、21μL、23μL、25μL、26μL、28μL、30μL、32μL、33μL、35μL、36μL、38μL或40μL；
步骤(5)所述体积比例如可以是1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.8、1：1、1：1.2、1：1.5、1：1.6、1：1.8、1：2、1：2.2、1：2.5、1：2.6、1：2.8、1：3、1：3.2、1：3.5、1：3.8、1：4、1：4.2、1：4.5、1：4.8或1：5。
优选地，使用如第一方面所述的试剂盒用于构建胎儿染色体高通量测序文库的方法包括如下步骤：
1)提取待测样本的DNA：
(1)取300-500μL待测样品，加入500μL游离DNA提取试剂，56℃水浴保温10min；
(2)加入500μL游离DNA沉淀试剂，室温孵育5min后转移至离心柱中；
(3)12000r/min离心1min弃废液，加入500μL游离DNA漂洗试剂，12000r/min离心1min弃废液，重复该步骤一次；
(4)取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干5min；
(5)加入40μL超纯水至离心柱中，12000r/min离心1min收集游离DNA；
2)将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库：
(1)取20ng提取的游离DNA，加入9μLDNA末端修复试剂进行末端修复，得到修复后DNA；
(2)加入20μL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接；
(3)按体积比1:1.1的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀3分钟后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；
(4)加入28μL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至干净的EP管中；
(5)加入35μLPCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1:1的比例加入磁珠悬浮液纯化，得到最终的高通量测序文库。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或如第二方面所述的方法用于检测胎儿染色体是否为非整倍体的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明试剂盒可用于检测胎儿染色体是否为非整倍体，不仅具有很好的准确性和特异性，而且还提高了检测效率，减小了检验的操作时间和成本；
(2)本发明试剂盒相比于目前国内外市场上的其他游离DNA文库构建试剂盒，能直接对孕妇血浆进行游离DNA提取，进行测序文库构建，无需使用单独的市售游离DNA提取试剂盒，避免了DNA样本的损失和污染；
(3)本发明试剂盒提取游离DNA需要的血浆样本量少，减少了孕妇外周血的采集量，降低了成本；
(4)本发明试剂盒对游离DNA提取和文库构建流程进行了优化和改进，优化的文库构建流程和方法，降低了文库构建过程中接头自连的残留，提高了测序文库的纯度和浓度，操作简便，检测结果具有更好的特异性和准确性。
附图说明
图1为本发明Agilent2100检测游离DNA图；
图2为本发明Agilent2100检测文库图；
图3为本发明荧光定量PCR扩增曲线图；
图4为本发明荧光定量PCR熔解曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1无创产前筛查胎儿染色体非整倍体试剂盒的制备
游离DNA提取试剂：其中Tris-HCl缓冲液配制终浓度为0.1M，蛋白酶K为500μg/mL，EDTA为0.02M，Triton-100为0.05％，混合后按25mL/支分装储存。
游离DNA沉淀试剂：异丙醇，按25mL/支分装储存。
游离DNA漂洗试剂：其中Tris-HCl缓冲液配制终浓度为0.1M，异硫氰酸胍为8M，NaCl为1.5M，混合后按50mL/支分装储存。
DNA末端修复试剂：其中Tris-HCl缓冲液配制终浓度0.2M，TaqDNA聚合酶为0.2U/μL，MgCl2为20mM，KCl为100mM，混合后按450μL/支分装储存。
连接修复DNA的接头：其中Tris-HCl缓冲液配制终浓度为100mM，T4DNAligase为0.05mM，连接接头adaptor为0.5μM，混合后按1mL/支分装储存。
PCR扩增引物：Index引物和通用引物，使用终浓度为0.2mM，分别按2mL/支分装储存；
通用引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′(SEQIDNO.1)；
Index引物：
Primer1:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.2)；
Primer2:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.3)；
Primer3:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.4)；
Primer4:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.5)；
Primer5:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.6)；
Primer6:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.7)；
Primer7:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.8)；
Primer8:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.9)；
Primer9:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.10)；
Primer10:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.11)；
Primer11:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.12)；
Primer12:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQIDNO.13)。
收集提取DNA的离心柱和收集管各50支；用于洗脱DNA和文库的超纯水5mL/支；纯化磁珠10mL/支。
将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
实施例2高通量文库的构建
1)提取待测样本的DNA：
(1)取300-500μL孕妇外周血血浆，加入500μL游离DNA提取试剂，56℃水浴保温10min；
(2)加入500μL游离DNA沉淀试剂，室温孵育5min后转移至离心柱中；
(3)12000r/min离心1min弃废液，加入500μL游离DNA漂洗试剂，12000r/min离心1min弃废液，重复该步骤一次；
(4)取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干5min；
(5)加入40μL超纯水至离心柱中，12000r/min离心1min收集游离DNA；
2)将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库：
(1)取20ng提取的游离DNA，加入9μLDNA末端修复试剂进行末端修复，得到修复后DNA；
(2)加入20μL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接；
(3)按体积比1:1.1的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀3分钟后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；
(4)加入28μL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至干净的EP管中；
(5)加入35μLPCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1:1的比例加入磁珠悬浮液纯化，得到最终的高通量测序文库。
通过Qubit荧光计以及高灵敏Agilent2100芯片生物分析仪分别对测序文库进行定量和片段大小分析，结果如图1所示，Qubit定量结果显示游离DNA构建的文库浓度为10.33ng/μL，文库总量为309.9ng。
取1μL文库稀释10倍后，通过高灵敏Agilent2100芯片生物分析仪对其片段大小进行检测，结果见图2。从图2可以看出，游离DNA构建的文库片段大小检测峰值为322bp和488bp，其中322bp附近的片段是由片段205bp附近的游离DNA与接头连接后形成的；488bp附近的片段是由较大的游离DNA片段与接头连接形成，该游离DNA片段由于浓度较低，在游离DNA片段2100检测中未出现峰值，当连接了接头后，由于进行了PCR扩增，浓度增高，因此在文库检测中会出现峰值，与相关报道一致。
实施例3文库质检
通过实时荧光定量PCR进一步检测文库是否存在接头自连污染，从文库中取出1μL溶液，使用KAPABIOSYSTEMS公司的高通量测序文库定量试剂盒，按照说明书操作步骤对文库进行检测。检测结果见图3和图4。图3显示文库扩增曲线重复性非常好，3次重复检测的Ct值分别为11.98、11.94和11.95，表明文库构建成功，qPCR操作未造成污染。图4是文库的熔解曲线图，从图4可以看出文库熔解曲线中只有单一的峰，没有杂峰，表明采用本发明涉及的试剂盒和方法构建的文库没有出现接头自连的现象，文库纯度非常高，适合用于高通量测序平台测序。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
