用于DNA末端修复、腺苷酸化、磷酸化的酶组合物
本申请要求2013年9月25日提交的美国专利申请序列号61/882,480和2013年11月15日提交的美国专利申请序列号61/904,543的优先权，每个专利申请通过引用整体并入本文。
用于高通量DNA测序的几种方法(Nature.437,376-380(2005)；Science.309(2005)728-1732)依赖通用的扩增反应，借此使DNA样本随机成片段，然后被处理，使得不同片段的末端均含有相同的DNA序列。可将具有通用末端的片段用单一对扩增引物在单一反应中进行扩增。在扩增前将片段文库分离成单分子水平确保被扩增的分子形成离散的群体。然后可进一步分析这些离散的群体。或者可在乳剂中(Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005))或在表面上(Nucleic Acids Research 27,e34(1999)；Nucleic Acids Research 28,e87(2000))进行该分离。
将通用启动序列添加到可待由聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶的末端，可通过本领域那些技术人员所已知的多种方法来实现。例如，在其5'端含有通用序列，并在其3'端含有简并序列的通用引物可用于PCR(DOP-PCR,例如,PNAS 93(1996)14676-14679)以扩增随机来自复杂靶序列或靶序列的复杂混合物的片段。该引物的简并3'部分在随机DNA位置退火，且可被延伸以生成在其5'端具有该通用序列的靶的拷贝。
或者，可将含有通用启动序列的接头连接到所述靶序列的末端。该接头可以是单链的或双链的。双链接头可能具有突出端或可能具有平端。具有突出端的接头与靶序列上的突出端互补，该靶序列可能已经由限制性内切核酸酶消化而生成，或由DNA聚合酶或末端转移酶添加。具有平端的接头用在也是平端的靶，在将所述DNA剪切成片段的过程中形成，或由如本领域技术人员所已知的末端修复反应所形成。
单一接头或两个不同接头可能与靶序列用于连接反应中。如果靶已被操作使得它的末端是一样的，即，两末端均是平的或两端均具有相同的突出，则单一相容的接头的连接将生成两端均具有那个接头的模板。然而，如果使用两个相容的接头，接头A和接头B，则形成连接产物的三种排列：在两端具有接头A的模板、在两端具有接头B的模板以及一端具有接头A且另一端具有接头B的模板。此最后的产物是，在一些情况下，来自连接反应唯一所需的产物，并且因此连接反应后的另外的纯化步骤是必要的，以从两端具有相同接头的连接产物中将其纯化。
许多分子生物学研究技术和应用，如为下一代测序(NGS)制备DNA文库需要将合成的DNA接头添加到受关注的DNA片段的两端。通常通过以下步骤添加合成的接头：(1)通过物理方式或酶促剪切受关注的DNA样本，(2)将所得的DNA片段进行钝化和磷酸化；(3)将钝化的DNA片段的3'端由一个核苷酸延伸，优选由dATP延伸，(4)将所得的DNA片段连接到3'端具有dTTP延伸的接头。靶DNA片段的dA加尾防止它们与其它DNA片段的分子内或分子间的连接，且从而增加具有预期结构的片段的产率。
最近意识到DNA片段的末端修复/钝化和dA加尾反应可在一个管内完成，首先通过在较低的温度下进行DNA钝化和磷酸化反应，然后在较高的温度下对该钝化的DNA片段进行加尾。可获得以类似的方式工作的商业NGS样本制备试剂盒(NxSeq DNA Sample Prep Kit,Lucigen；NEBNext UltraDNALibrary Prep Kit,Illumina from NEB；PureGenome HE NGSLibrary Prep Reagents,EMD Milipore)。然而，只有EMD Millipore公开了用于DNA 3'端末端延伸的酶：嗜热NovaTaq DNA聚合酶。其它两个供应商提供产品使用推荐(在65-72℃下孵育)，其引起本领域的技术人员认为嗜热DNA聚合酶还用于dA加尾步骤。表1显示来自NewEngland Biolabs、EMD Milipore和Lucigen的DNA末端修复和dA加尾反应的商业试剂和方案。
表1.来自商业供应商试剂盒所使用的单管DNA末端修复和dA加尾条件和试剂。
NEB和Lucigen产品代表成套试剂，其中DNA末端修复(钝化和磷酸化)和dA加尾反应所需要的全部酶由用户合并成单一混合物中(酶混合物)。然而，所述反应缓冲液是单独提供的，且没有与酶预混成随时可用的主混合物。EMD Milipore试剂盒包含在单独小瓶内所提供的DNA末端修复和dA加尾反应的全部组分。其它供应商正提出双组分的工作流程，其中受关注的DNA片段首先被钝化和磷酸化，以及然后在第一步骤的酶失活或去除后，添加dA加尾酶。
一般将两种充分表征的聚合酶推荐为在许多克隆方案中所使用的用于dA加尾反应的优选的酶：3'-5'外切核酸酶活性缺陷的嗜温Klenow片段突变体，或嗜热Taq DNA聚合酶。这些酶执行非模板指导合成的能力，如在DNA片段的DNA3'端添加额外的核苷酸，为本领域的技术人员所已知。
然而，已知两个酶均表现某些偏好，其中最重要的是它们偏爱在其3'端有嘧啶(dT或dC)的DNA片段的3'末端延伸和具有3'-末端嘌呤(dA或dG)的那些DNA片段的仅局部延伸。结果是，效率低的dA加尾反应后剩余的钝DNA片段可参与分子内连接反应，从而形成在天然状态下基因组中不存在的杂合DNA分子。如果这样的杂合分子在其3'端含有dA延伸，接头序列可能被添加到它们，且然后这样的分子可进行测序反应。如果文库制剂含有许多这样的嵌合分子，则它们随后可能使基因组序列的装配复杂或损害基因组序列的装配。在NGS应用中嵌合DNA分子可能损害测序的基因组的装配。因此，需要用于NGS文库制备应用的非偏性DNA片段末端修复/加尾的改进的酶组合物。
该公开的酶组合物在长期保存期间是稳定的，且当与在dA加尾步骤中常规使用的嗜热Taq DNA聚合酶和嗜温Klenow片段exo-突变体相比较时，还呈现更好的效率和更少的偏性。在公开的组合物中用于dA加尾反应的酶是嵌合DNA聚合酶，其没有5'-3'或3'-5'外切核酸酶活性，由栖热菌属DNA聚合酶和非特异性DNA结合结构域间的融合所生成。适于生成在本发明中所使用的这样的嵌合DNA聚合酶的DNA结合结构域可能选自由来自Sso家族DNA结合蛋白的DNA结合结构域组成的组，其包括，但不限于，来自超嗜热古细菌(hyperthermophilic archaebacteria)硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso7d碱性染色体蛋白和来自嗜酸硫化叶菌(S.acidocaldarius)的Sac7d蛋白，在一个实施方案中，该酶是与非特异性DNA结合结构域融合的布氏栖热菌(Thermus brockianus)DNA聚合酶(mod-Tbr，由在Thermo Scientific DyNAmoTM产品中所使用的酶作为例证，存放在拉脱维亚微生物菌株保藏(MSCL,登录号P1397,鉴定参考BL21(DE3)(pRAT5-DIVOpt))，该酶不具有5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性。在另一个实施方案中，该酶是与非特异性DNA结合结构域融合的水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶(mod-Taq)，存放在MSCL(登录号P1396，鉴别参考ER2566(pLATE51-fusion9))，该酶没有5'-3'或3'-5'外切核酸酶活性。
一个实施方案是在随时可用的主混合物(“Master Mix”)中所提供的公开的酶组合物。主混合物含有mod-Tbr或mod-Taq，其与T4DNA聚合酶、Klenow片段、T4多核苷酸激酶和全部其它组分(包括反应缓冲液和三磷酸核苷)预混，其中dATP浓度是dGTP的浓度的10倍，并且是dTTP和dCTP的浓度的5倍，其为在一个管内，经两步反应进行DNA钝化、磷酸化和dA加尾反应所需。这样的不同的酶、缓冲液和三磷酸核苷的混合物在-20℃温度下在长期保存期间是稳定的。
附图简述
图1显示在实施例2中所使用的分别终止于G、C、T和A的双链寡核苷酸。
图2显示在各种反应缓冲液中，由显示dA加尾效率的Klenow片段exo-所处理的图1的单独双链体寡核苷酸。
图3显示在各种反应缓冲液中在各种pH下，由显示dA加尾效率的Taq DNA聚合酶所处理的图1的单独双链体寡核苷酸。
图4显示各种底物浓度下，由显示dA加尾效率的经修饰的布氏栖热菌DNA聚合酶所处理的图1的单独双链体寡核苷酸。
图5示意性示出根据一个实施方案在一种反应混合物中DNA末端修复和3'末端延伸。
图6显示使用不同聚合酶在一个反应混合物中DNA末端修复和3'末端延伸。
图7显示根据一个实施方案所描述的组合物的稳定性。
在一个实施方案中，公开的组合物包含以下组分：
酶：
1u/μl T4多核苷酸激酶
0.32u/μl T4DNA聚合酶
0.12u/μl Klenow片段
0.2u/μl mod-Tbr DNA聚合酶
反应辅因子和核苷酸：
20mM MgCl2
2mM dATP
0.4mM dCTP
0.4mM dTTP
0.2mM dGTP
2mM ATP
可使用100mM-105mM Tris-HCl(pH 8.3)和单价金属盐酸盐(例如NaCl、KCl、LiCl)以20mM至50mM的浓度范围配制组合物离子强度和pH值。在一个实施方案中，该组合物含有以下稳定剂和冷冻保护剂：20mM DTT、0.2％Triton X-100、12％(v/v)甘油、0.07％NP40、0.07％吐温20和0.024mM EDTA。
一个实施方案是用于在单个容器(如Eppendorf型管、96孔板或任何其它用于建立酶促反应的器皿)内进行DNA末端修复和末端核苷酸添加的方法。在一个实施方案中，DNA末端修复包括生成平端和磷酸化的DNA片段。在一个实施方案中，在单个容器内将DNA片段与所述的组合物混合，以及在单个容器内进行该DNA片段的DNA末端修复和核苷酸加尾。在一个实施方案中，该末端核苷酸是腺苷，其被添加到该DNA片段的3'末端，并被称为dA加尾。在一个实施方案中，使该单个容器的内容物经历第一个反应条件以促进DNA末端修复反应，且然后使该容器的内容物经历第二反应条件以促进dA加尾反应和使DNA末端修复反应失活，其中该DNA末端修复反应包括使该DNA片段钝化和磷酸化，且该dA加尾反应包括通过将单一dA添加到该末端被修复的DNA片段的3'端上使该DNA片段腺苷酸化。在一个实施方案中，所述第一反应条件包括使所述单个容器的内容物经历18℃至22℃(包括端值)的温度持续5至10分钟(包括端值)的时间段，以及所述第二反应条件包括使所述容器内容物经历72℃至75℃(包括端值)的温度持续10至20分钟(包括端值)的时间段。在一个实施方案中，所述第一反应条件包括使所述容器内容物经历约20℃的温度持续约5分钟，以及所述第二反应条件包括使所述容器内容物经历约72℃的温度持续约10分钟。在一个实施方案中，dA加尾的DNA片段的产率超过75％。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括在DNA末端修复之前生成DNA片段。DNA片段可通过物理DNA剪切方法如超声雾化和流体动力剪切，或通过使用DNaseI或其它内切核酸酶的酶促消化来生成。在一个实施方案中，所述DNA样本包括基因组DNA。在一个实施方案中，所述方法可进一步包括通过将合成DNA接头接合到核苷酸加尾的DNA片段的一端或两端来生成DNA文库。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述末端修复和dA加尾的DNA片段连接到在其3'端有dT延伸的合成DNA接头。
一个实施方案是一种含有用于执行单管DNA钝化和dA加尾的公开的方法的公开的组合物和使用说明书的试剂盒。在一个实施方案中，所公开的组合物包含0.5u/μl-1.5u/μlT4多核苷酸激酶、0.2u/μl-0.5u/μl T4DNA聚合酶、0.1u/μl-0.2u/μl Klenow片段和0.1u/μl-0.5u/μl mod-Tbr DNA聚合酶；反应辅因子和核苷酸：20mM MgCl20.4mM-3mM dATP、0.2mM-0.6mM dCTP、0.2mM-0.6mM dTTP、0.1mM-0.4mM dGTP、1.5mM-2.5mMATP：离子强度和pH调节剂：100mM-105mM Tris-HCl(pH 8.0-8.8)；单价金属盐酸盐，例如，NaCl、KCl、LiCl(20mM至50mM)；和稳定剂和冷冻保护剂：15mM-30mM DTT；0.1％-0.4％Triton X-100；10％-20％(v/v)甘油；0.05％-0.15％NP 40；0.05％-0.15％吐温20；和0.02mM-0.1mM EDTA。
在一个实施方案中，所公开的组合物包含酶：1u/μl T4多核苷酸激酶、0.32u/μlT4DNA聚合酶、0.12u/μl Klenow片段和0.2u/μl mod-Tbr DNA聚合酶；反应辅因子和核苷酸：20mM MgCl22mM dATP、0.4mM dCTP、0.4mM dTTP、0.2mM dGTP、2mM ATP；离子强度和pH调节剂：100mM-105mM Tris-HCl(pH 8.3)；单价金属盐酸盐例如NaCl、KCl、LiCl(20mM至50mM)；和稳定剂和冷冻保护剂：20mM DTT；0.2％Triton X-100；12％(v/v)甘油；0.07％NP40；0.07％吐温20；和0.024mM EDTA。
现在参考以下实施例进一步详细描述本发明，这些实施例仅作为说明。
实施例1
证明不同的酶要求不同的缓冲液
本领域已知每种酶具有不同的最佳保存和反应条件。酶保存条件往往不同于在表2所显示的推荐的反应条件，表2显示由以下商业供应商所销售的DNA钝化、磷酸化和dA加尾的酶的保存和反应缓冲液的组分：Thermo Fisher Scientific，New England Biolabs和Life Technologies。
表2.用于DNA片段的钝化、磷酸化和dA加尾的酶的保存缓冲液(SB)和反应缓冲液(RB)
为获得本发明的组合物，全部以上所指示的酶T4DNA聚合酶、Klenow片段、T4DNA多核苷酸激酶和具有末端加尾活性的经修饰的嗜热聚合酶，如经修饰的布氏栖热菌或水生栖热菌DNA聚合酶，必须被预混成能够以单一步骤并且在一个容器内使DNA片段有效钝化、磷酸化和dA加尾的稳定的共混物。重要的是要注意这远不是微不足道的，并且甚至本领域那些技术人员也需要试验大量的保存和反应条件来获得当保存时将会稳定，以及当在酶促反应中使用时有效的混合物，且将不能保证来确定最佳保存和反应条件。在这样的混合物中的酶可具有不同的最佳要求，这使它们在单一共混物中不相容。此外，在制备随时可用的1X-2X酶混合物时，由于冷冻保护剂对酶促反应的负面影响，使用高浓度的冷冻保护剂如甘油往往是不恰当的，因为它们影响物理和化学环境从而导致反应条件改变。此外，高浓度冷冻保护剂可能对酶活性具有抑制作用。结果是，只可使用低浓度冷冻保护剂，其往往不足以防止酶共混物的冻结。因此，在多个冻融循环中有非常高的酶活性损失风险。一种酶所需的添加剂可能对该组分共混物的另一种酶的保存和/或催化活性任一项是有害的。这同样适用于盐，以及其浓度，其用于缓冲系统，以及用于在随时可用的混合物的pH值。一般来说，随时可用的混合物的稳定性由单价盐耐受性和存在足够的离子强度来确定。单价盐可能是其中金属，例如，Na、K或Li在溶液中具有净1+电荷的任一种盐。
在制备用于DNA片段末端修复/dA加尾的稳定的酶主混合物时，与在本实施例中以前所公开的信息相反，所公开的随时可用的组合物(包含酶T4DNA聚合酶、Klenow片段、T4多核苷酸激酶和mod-Tbr或mod-Taq DNA聚合酶和全部其它以前所描述的必需的反应组分)能够实现有效的DNA片段的单管钝化、磷酸化和dA加尾，其导致dATP延伸的DNA片段的产率超过75％。所公开的组合物提供一种主混合物，当与其它商业NGS样本制备试剂盒比较时，其减少用于制备DNA片段(如用于NGS文库制备)所需要的移液步骤数。减少移液步骤简化了NGS文库制备工作流程，因为它涉及较少的操作和动手时间，将误差降至最低，以及因此提供整个样本组的更一致的结果。所公开的组合物混合物在短得多的反应时间内修饰DNA片段，因为它在20℃下在5分钟内使DNA片段钝化和磷酸化，并通过在72℃下在10分钟内在它们的3'端添加dATP来修饰这些片段。因此，使用所公开的组合物混合物，两个反应共同仅花费15分钟。
测试被称为端转化主混合物(End Conversion Master Mix)的所公开的组合物的一个实施方案。该端转化主混合物包含以下2X浓度和比率的酶、缓冲液和其它必需反应/保存组分：1u/μl T4多核苷酸激酶；0.32u/μl T4DNA聚合酶；0.12u/μl Klenow片段，和0.2u/μl mod-Tbr DNA聚合酶。反应辅因子和核苷酸是：20mM MgCl2,2mM dATP；0.4mM dCTP；0.4mMdTTP；0.2mM dGTP；2mM ATP。所述端转化主混合物的离子强度和pH可使用100mM-105mMTris-HCl(pH 8.3)和20mM至50mM的单价金属盐酸盐(例如NaCl、KCl、LiCl)进行配制。稳定剂和冷冻保护剂是：20mM DTT；0.2％Triton X-100；12％(v/v)甘油；0.07％NP 40；0.07％吐温20；和0.024mMEDTA。
适于在酶共混物中使用的其它盐和稳定剂将对本领域技术人员是显而易见的，且对于在钝化和/或dA加尾反应中所使用的不同的DNA聚合酶可不同。
实施例2
缓冲液和聚合酶组合物对钝化、加尾和磷酸化的作用
为测试DNA片段3'端加尾效率和分析取决于3'末端核苷酸的潜在的偏性，开发和使用一种长度和3'末端核苷酸均不同的，并在其5'端用Cy5标记的四个寡核苷酸双链体的模型系统(图1)。
检查Klenow片段exo-突变体的dA加尾能力，并在图2显示，其中泳道(A)是补充有0.2mM dATP的最佳Klenow片段缓冲液(10x反应缓冲液，EP0421)；泳道(B)是含有1mM DTT和0.2mM dATP的商业缓冲液G；以及泳道(C)是优化的DNA末端修复缓冲液(快速DNA末端修复试剂盒K0771)。在37℃下使用5个单位的酶在50μl的反应混合物(含有如图1所示的Cy-5标记的寡核苷酸双链体的7.5pmol当量分子混合物)中执行dA加尾反应。条带对代表有或没有单一另外的dA的该寡核苷酸双链体。
图2显示泳道A-1x Klenow缓冲液+0.2mM dATP；泳道B-1x G缓冲液和1mM DTT+0.2mM dATP；以及泳道C-1x末端修复缓冲液。
在图2中所陈述的结果提示Klenow片段exo-，甚至在30分钟的孵育后，在全部三种测试反应混合物中不能均匀地延伸寡核苷酸，相较于那些以3'-末端嘌呤(A/G)为特征的，更有效地延伸3'-末端嘧啶(C/T)。此外，由Klenow片段exo-进行的dA加尾在(C)缓冲液中效率最低，所述(C)缓冲液对于执行DNA片段的钝化和磷酸化的酶最佳，但对于Klenow片段是次最佳的。
检查Taq DNA聚合酶的dA加尾能力，并在图3显示，其中泳道(A)是优化的DNA末端修复缓冲液(pH 7.5)；泳道(B)与A中是相同的但pH 8.0；以及泳道(C)与A中是相同的但pH8.3。优化的缓冲液是来自快速DNA末端修复试剂盒K0771的10X末端修复反应混合物。在60℃下使用7.5个单位的酶在50μl反应混合物(含有如图1所示的Cy-5标记的寡核苷酸双链体的7.5pmol当量分子混合物)中执行反应。
图3A-1x末端修复缓冲液，pH 7.5；B-1x末端修复缓冲液，pH 8.0；C-1x末端修复缓冲液pH 8.3。
在图3中所陈述的结果提示Taq DNA聚合酶在pH7.5下优选3'末端嘧啶的延伸，其对于钝化和磷酸化反应最佳。pH值从pH 7.5至pH 8.3的增加对于Taq DNA聚合酶dA加尾效率和均匀性具有积极的作用。然而，甚至在20分钟的孵育后，相较于本实验所使用的其它底物，具有3'末端G的寡核苷酸被延伸的效率较低。
用mod-Tbr DNA聚合酶(exo-)优化反应条件实验揭示酶如Taq聚合酶对于dA加尾优选增加的pH，但显示对有3'末端C或T的DNA片段的偏好较低(见图4)。为确保dA加尾效率更高，使反应混合物富集dATP，将其浓度增加至1mM。为模拟当各种量的DNA片段必须被钝化和dA加尾的情形，用恒定量(5个单位)的mod-Tbr DNA聚合酶在优化的缓冲液(来自快速DNA末端修复试剂盒K0771的10X末端修复反应混合物)中在pH 8.3使用增加的dATP浓度(1mM)和不同量的如图1所示的寡核苷酸双链体进行该实验。
图4显示泳道A 1.5pmol双链寡核苷酸的混合物；泳道B 7.5pmol双链寡核苷酸的混合物；泳道C 15pmol双链寡核苷酸的混合物；泳道D 22.5pmol双链寡核苷酸的混合物；以及泳道E 30pmol双链寡核苷酸的混合物。在60℃下在50μl反应混合物中执行反应10分钟。
在图4中所陈述的结果4显示mod-Tbr DNA聚合酶有效地且均匀地在大范围浓度的测试底物中延伸全部类型的DNA末端，因此胜过Klenow片段exo-酶和Taq DNA聚合酶。
对照DNA片段用于在一个反应混合物中测试DNA末端修复和DNA3'端加尾的效率。该DNA片段是265bp，具有3'和5'末端突出端，并在其5'端缺乏磷酸，且通过PsuI和PstI裂解和随后的碱性磷酸酶的处理来生成。当单个DNA片段可含有3'和/或5'突出端并缺乏5'末端磷酸时，该DNA底物模拟DNA物理剪切后的情形。
1μg的DNA片段在50μl反应混合物中与商业末端修复酶混合物(ThermoScientific,K0771)和5单位的嗜热DNA聚合酶：mod-Tbr DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶孵育。在20℃孵育反应混合物5分钟，此允许末端修复酶钝化和磷酸化DNA片段末端，接着在72℃孵育10分钟，该条件有利于嗜温末端修复酶和由嗜热DNA聚合酶进行的DNA 3'端加尾同时失活。在该步骤后，长度为60bp，并携带3'末端dT延伸的DNA接头，被添加到反应混合物至最终浓度为1μM。在22℃下使用T4DNA连接酶5分钟完成将该DNA接头连接到DNA片段，且降所得的反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行分析。在图5中显示该实验方案。在图6中显示结果，其中D1和D2是使用mod-Tbr DNA聚合酶所制备的样本；T1和T2是使用Taq DNA聚合酶所制备的样本；F代表对照DNA片段；L是O’RangeRuler 50bp DNA阶梯(Thermo Scientific,SM0613)；A是有连接到DNA片段的两端的接头的381bp反应产物(60+261+60bp)；以及B是有连接到DNA片段一端的接头的321bp反应产物(261+60bp)。
图6显示泳道D1、D2-使用DyNAmoIVDNA聚合酶制备的样本；泳道T1、T2-使用TaqDNA聚合酶制备的样本；F-对照DNA片段；A显示有连接到DNA片段的两端的接头的381bp反应产物(60+261+60bp)；B显示有连接到DNA片段一端的接头的321bp反应产物(261+60bp)；L-O’RangeRuler 50bp DNA阶梯(Thermo Scientific,SM0613)。
在图6中所陈述的结果显示mod-Tbr DNA聚合酶生成更多正确结构的产物(片段A)，表明该酶胜过Taq DNA聚合酶，且更适合于在一种反应混合物内与DNA末端修复酶使用。只有钝化的和然后dA加尾的对照DNA片段可被连接到含有dT的接头。主导的最大的条带A代表有两端连接接头的DNA片段，而只有一小部分的对照DNA片段F未经处理。
这些数据表明当在单一反应混合物中使用不同的热稳定DNA聚合酶进行时，DNA末端修复和DNA3'端dA加尾反应的效率不同，且进一步，包含mod-Tbr的本发明的反应混合物在效率上胜过以前用于所述反应的其它组合物。此外，值得注意的是，当使用发明的组合物时，没有更大DNA片段的痕迹，该更大的DNA片段可在然后可连接在一起的钝化的DNA片段的未完全dA加尾的情况下出现。
实施例3
2x浓缩末端转化主混合物的稳定性
对于稳定性测试，如公开的2x末端转化主混合物被保存在-20℃和+25℃(以代表加速的稳定性测试)不同的时间段。使用在图5中所示的相同的实验方案执行稳定性测试。将1μg对照DNA片段在已经在-20℃保存的1x末端转化主混合物的50μl反应混合物中孵育5min，从而允许末端修复酶钝化和磷酸化DNA末端，接着在72℃下孵育10分钟，该条件有利于嗜温DNA末端修复酶和由mod-Tbr DNA聚合酶进行的DNA 3'端加尾同时失活。在该步骤后，将携带3'末端dT延伸的长度为60bp的DNA接头添加到反应混合物中至最终浓度为1μM，以及在22℃下使用T4DNA连接酶执行连接5min。将所得的反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行分析。在图7中显示该结果，其中A1和A2是使用在-20℃下保存2周的末端转化主混合物所制备的样本；B1和B2是使用在+25℃下保存1周的末端转化主混合物所制备的样本；C1和C2是使用在+25℃下保存2周的末端转化主混合物所制备的样本；F是对照DNA片段；L是O’RangeRuler 50bp DNA阶梯(Thermo Scientific,SM0613)；A是有连接到DNA片段的两端的接头的381bp反应产物(60+261+60bp)；以及B是有连接到DNA片段一端的接头的321bp反应产物(261+60bp)。
图7显示A1、A2-使用在-20℃下保存2周的末端转化主混合物所制备的样本；B1、B2-使用在+25℃下保存1周的末端转化主混合物所制备的样本；C1、C2-使用在+25℃下保存2周的末端转化主混合物所制备的样本；F-对照DNA片段；A-有连接到DNA片段的两端的接头的381bp反应产物(60+261+60bp)；B-有连接到DNA片段一端的接头的321bp反应产物(261+60bp)；L-O’RangeRuler 50bpDNA阶梯(Thermo Scientific,SM0613)。
在图7中所陈述的结果指示末端转化主混合物在+25℃下保留功能活性2周，因此被认为在长期保存时间期间是稳定的。该组合物在4℃下至少稳定1周。此外，在图7中所陈述的结果指示末端转化主混合物在单一混合物中提供有效的钝化、磷酸化和dA加尾。
申请者通过引用并入在随附的计算机可读序列表中所含有的材料，该序列表被识别为Thermo_Fisher_Scientific_Baltics_UAB_33_ST25.txt，其文件创建日期为2013年9月24日，12:29P.M.，且文件大小为2.06千字节。
在本说明书中所显示和描述的实施方案仅是作为本领域技术人员的发明者的具体实施方案，并不是以任何方式的限制。所以，可在以下权利要求范围内在不背离本发明的精神的情况下对那些实施方案作出各种变化、修改或变更。所引用的参考文献通过引用明确地整体并入本文。
