用癌症抗原特异的主动免疫疗法治疗之后，针对肿瘤抗原的体液免疫应答及其与改善的临床结果的联系
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年9月5日提交的美国临时申请号61/874,279以及于2013年10月17日提交的美国临时申请号61/892,373的优先权益，为了全部目的，在此将所述两项的每一项通过引用整体并入。
发明背景
免疫系统由许多不同的细胞类型、生物分子和器官组成。这些包括淋巴细胞、单核细胞和多形核白细胞、为数众多的可溶的化学介质(细胞因子和生长因子)、胸腺、出生后的骨髓、淋巴结、肝脏和脾脏。所有这些组分通过复杂的通信系统共同作用以抵抗诸如细菌、病毒、真菌和寄生虫的微生物侵入物以及肿瘤细胞。共同地，这些组分将特定的分子抗原识别为外来物或者是其它的威胁，并启动针对含有外来抗原的细胞或病毒的免疫应答。免疫系统还利用与用于识别微生物或病毒侵入物相同的机制，通过主动监视发挥作用以清除损伤的细胞或癌细胞。免疫系统通过不是严格的外来的、但是在靶细胞中异常表达或突变的抗原来识别损伤的细胞或癌细胞。
人前列腺酸性磷酸酶(PAP)主要在前列腺中表达。在患有前列腺癌或其它前列腺病况的患者中常常观察到升高的PAP血清水平，其中在患有转移的前列腺癌的患者中发现了最高的PAP血清水平。(KirchenbaumAnnals.oftheNewYorkAcademyofSciences1237(2011)64-70)。在一组有限的正常的非前列腺组织(包括胰岛细胞和皮肤的毛囊皮脂腺单位)以及在其它肿瘤环境(包括乳腺和结肠)中也观察到了极低水平的PAP表达。PAP在这些组织中的表达水平可以比在患有前列腺癌或其它前列腺病况的患者的前列腺中所检测到的低1-2个数量级。(Graddisetal.,Prostaticacidphosphataseexpressioninhumantissues.IntJClinExpPathol.2011March31；4(3):295–306)。
超过95％的前列腺癌细胞表达PAP。因此利用PAP作为靶标，已经设计了一些前列腺癌的免疫治疗策略。例如CancerBiologyandTherapy(2005年3月、第4卷第3期)报道了来自下述临床研究的有前景的结果：收集患者自身的免疫细胞，刺激以变为对PAP具有免疫反应性的，然后通过静脉注射使其返回至患者。这些新的免疫学方法依赖能够有效诱导PAP特异的免疫(包括T细胞介导的免疫)的方法。
有效的免疫疗法的一个结果可能是抗原扩散，其可能由在针对免疫疗法的初始应答期间的肿瘤细胞死亡所导致，所述肿瘤细胞死亡可导致肿瘤相关抗原的释放和特异性针对这些抗原的自身反应性T淋巴细胞和/或B淋巴细胞的启动。抗原扩散随后可以促进更有效的肿瘤杀伤，并且其可以以更高的频率发生在临床应答者中，因而为新型的基于机制的临床结果生物标志物的鉴定提供了途径。参见，例如Ribas,A.etal.,Determinantspreadingandtumorresponsesafterpeptide-basedcancerimmunotherapy.TrendsImmunol,24,58-61(2003)。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供了用于测量抗原扩散的系统、方法或组合物，以预测经受癌症免疫疗法的患者的治疗结果，或鉴定用于癌症免疫疗法的有前景的靶标。
一方面，本发明提供了确定癌症患者对癌症免疫疗法的治疗反应的方法，所述方法包括下述步骤：i.获得与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平；ii.用免疫疗法(例如IL2、CTLA-4抑制剂或IDO抑制剂)对癌症患者进行治疗；iii.获得来自用免疫疗法治疗之后的患者血液样品的、与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平；以及iv.测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线和治疗后抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。在一些情况下，所述癌症为前列腺癌。在一些情况下，所述预先确定的生物标志物抗原包括选自下述的一种或多种(例如两种或更多种)抗原：ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3、LGALS8、PSA、PSMA以及前列腺酸性磷酸酶(PAP)。在一些情况下，所述预先确定的生物标志物抗原为选自下述的一种或多种(例如两种或更多种)抗原：ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3和LGALS8。
一方面，本发明提供了确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应的方法，所述方法包括下述步骤：i.获得与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平；ii.利用靶标癌症抗原，用CASAI对癌症患者进行治疗；iii.获得来自用CASAI进行治疗之后的患者的血液样品的、与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平；以及iv.测量与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的基线与治疗后抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些实施方案中，所述方法还包括：i.获得与靶标癌症抗原以及一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的基线水平和治疗后水平；和ii.测量与靶标癌症抗原反应的基线水平和治疗后水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与靶标癌症抗原反应的治疗后抗体水平的增加以及与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，相对于与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加对阳性治疗反应更加具有预测性。在一些情况下，相对于单独地与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加和与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加的组合对阳性治疗反应更加具有预测性。在一些情况下，相对于与靶标癌症抗原和一种或多种其它生物标志物抗原(其不是ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3或LGALS8)反应的抗体水平的治疗后的增加，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加以及与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加的组合对阳性治疗反应更加具有预测性。
一方面，本发明提供了确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应的方法，所述方法包括下述步骤：i.获得与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平，其中所述一种或多种预先确定的生物标志物抗原选自：a.包括靶标癌症抗原以及一种或多种其它生物标志物抗原的生物标志物抗原；和b.不包括靶标癌症抗原的一种或多种生物标志物抗原；ii.利用所述靶标癌症抗原，用CASAI对癌症患者进行治疗；iii.获得来自用CASAI进行治疗之后的患者的血液样品的、与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后的抗体水平；以及，iv.测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平与治疗后的抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，测定针对至少两种预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)的基线和治疗后的反应性抗体水平。
在一些情况下，来自患者的基线反应性抗体水平或治疗后的反应性抗体水平是反应性的IgG水平。
在一些情况下，CASAI治疗包括在离体条件下激活患者的血细胞的步骤。
在一些情况下，CASAI治疗使用选自前列腺酸性磷酸酶(PAP)和PAP融合蛋白的靶标癌症抗原。
在一些情况下，CASAI治疗使用PAP-GM-CSF作为靶标癌症抗原。
在一些情况下，患者罹患选自下述的癌症：前列腺癌、黑素瘤、神经胶质瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌以及结直肠癌。在一些情况下，所述患者罹患前列腺癌。
在一些情况下，利用固体支持表面和荧光标记或酶标记来测量反应性抗体水平。
在一些情况下，CASAI使用免疫调节剂。例如，CASAI可以使用选自下述的免疫调节剂：GM-CSF，toll样受体(TLR)-2、3、4、5、7、8或9的激动剂；检验点抑制剂；细胞因子；以及白介素(IL)-12、IL-12p70、IL-10、IL-35，转化生长因子(TGF)β或吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶的抑制剂。细胞因子可以选自：IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。IL-12、IL-12p70、IL-10、IL-35、TGFβ或IDO的抑制剂可以是与IL-12、IL-12p70、IL-10、IL-35、TGFβ或IDO结合的抗体。在一些情况下，将免疫调节剂与用于CASAI治疗的靶标癌症抗原融合。
在一些情况下，一种或多种预先确定的生物标志物抗原为PSA以及一种或多种其它生物标志物抗原。例如，一种或多种预先确定的生物标志物抗原可以是PSA以及KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8和LGALS3中的一种或多种。
在一些情况下，靶标癌症抗原不是PSA，并且预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括PSA。在一些情况下，靶标癌症抗原不是PSA，并且预先确定的生物标志物抗原是PSA。在一些情况下，靶标癌症抗原不是PAP，并且预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括PAP。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括ERAS以及选自KLK2、KRAS、PSA、LGALS3和LGALS8的任意的1、2、3、4或5种标志物。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括KRAS以及选自KLK2、ERAS、PSA、LGALS3和LGALS8的任意的1、2、3、4或5种标志物。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括LGALS3以及选自KLK2、KRAS、ERAS、PSA和LGALS8的1、2、3、4或5种标志物。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括KLK2以及选自KRAS、ERAS、PSA、LGALS3和LGALS8的1、2、3、4或5种标志物。在其它实施方案中，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括LGALS8以及选自KLK2、KRAS、ERAS、PSA和LGALS3的1、2、3、4或5种标志物。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括PSA以及选自KLK2、KRAS、ERAS、LGALS3和LGALS8的1、2、3、4或5种标志物。
在一些实施方案中，本发明提供了确定经受Sipuleucel-T治疗的前列腺癌患者中的治疗反应的方法，所述方法包括下述步骤：i.获得与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的抗体的基线水平，所述预先确定的生物标志物抗原，例如，选自KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3和PSA；ii.向癌症患者施用利用包含PAP氨基酸序列的蛋白离体激活的T细胞；iii.获得来自用激活的T细胞治疗之后的患者血液样品的、与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的治疗后抗体水平；以及iv.测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的基线抗体水平和治疗后的抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，针对预先确定的生物标志物抗原(例如，非靶标的预先确定的生物标志物抗原)的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，所述方法还包括：i.获得与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)以及一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平和治疗后抗体水平；和ii.测量与靶标癌症抗原反应的基线抗体水平和治疗后抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)反应的治疗后抗体水平的增加以及与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，和与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)反应的抗体水平的治疗后的增加相比，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加对阳性治疗反应更加具有预测性。在一些情况下，和单独地与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)反应的抗体水平的治疗后的增加，或者与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)和一种或多种其它生物标志物抗原(其不是ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3或LGALS8)反应的抗体水平的治疗后的增加相比，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加以及与靶标癌症抗原(例如，包括PAP的抗原)反应的抗体水平的治疗后的增加的组合对阳性治疗反应更加具有预测性。
在一些情况下，包含PAP氨基酸序列的蛋白为PAP-GM-CSF融合蛋白。
在一些情况下，来自患者的基线反应性抗体水平或治疗后反应性抗体水平是反应性的IgG水平。
在一些情况下，Sipuleucel-T治疗是离体的。
在一些情况下，利用固体支持表面和荧光标记或酶标记测量反应性抗体水平。
在一些情况下，标志物之一是ERAS。在其它情况下，标志物之一是KLK2。在其它情况下，标志物之一是PSA。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定用于增加患者生存期的癌症治疗的靶抗原的方法，所述方法包括：i.获得与一种或多种生物标志物抗原反应的抗体的基线水平；ii.用癌症免疫疗法对罹患癌症的患者进行治疗；iii.获得来自用癌症免疫疗法治疗之后的患者血液样品的，与一种或多种生物标志物抗原反应的抗体的治疗后水平；iv.将基线反应性抗体水平与治疗后的反应性抗体水平进行比较，以确定反应性抗体水平增加的一种或多种生物标志物抗原；v.将一种或多种生物标志物抗原的反应性抗体水平的增加与生存期的增加进行关联；以及vi.将其中反应性抗体水平的增加与生存期相关联的一种或多种生物标志物抗原，鉴定为用于增加患者生存期的癌症治疗的靶抗原。
在一些实施方案中，本发明提供了用于确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应的系统，所述系统包括：i.处理器；ii.通过互联与处理器连接的存储器；iii.与互连线连接的通信接口，并且适用于：a.接收代表一组治疗前相关数值的第一组电子数据信号，每一数值指示CASAI治疗之前，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平；b.接收代表与治疗前数值组相对应的一组治疗后相关数值的第二组电子数据信号，第二组数值中的每一数值指示来自用CASAI治疗之后的患者血液样品的、与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平，以及；iv.比较引擎，其与处理器连接，并且被配置为将治疗前数值组与治疗后数值组进行比较，从而确定治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变；以及v.输出模块，其被配置为提供代表治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变的输出数据信号，其中相对于其基线水平，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些实施方案中，本发明提供了用于确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应的系统，所述系统包括：i.处理器；ii.通过互连线与处理器连接的存储器；iii.用互连线连接的通信接口，并且适用于：a.接收代表一组处理前相关数值的第一组电子数据信号，每一数值指示CASAI治疗之前，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平，其中所述一种或多种预先确定的生物标志物抗原选自：1.包括靶标癌症抗原以及一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原的生物标志物抗原；和2.不包括靶标癌症抗原的一种或多种生物标志物抗原；b.接收代表与治疗前数值组相对应的一组治疗后相关数值的第二组电子数据信号，第二组数值中的每一数值指示来自用CASAI进行治疗之后的患者血液样品的、与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平；以及，iv.比较引擎，其与处理器连接，并且被配置为将治疗前数值组与治疗后数值组进行比较，从而确定治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变；以及v.输出模块，其被配置为提供代表治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变的输出数据信号，其中相对于其基线水平，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，将处理器进一步配置为确定参照数值组，将其用作患者来自治疗前数值组的基线抗体水平，所述治疗前数值组指示CASAI治疗之前，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的基线抗体水平。在一些情况下，一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)选自ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3和LGALS8。
在一些情况下，iii.系统通信接口还适用于：c.接收与CASAI靶标抗原反应的抗体治疗前水平和治疗后水平的数值；iv.系统比较引擎被进一步配置为将治疗前数值和治疗后数值进行比较，从而确定与靶标抗原反应的抗体水平的存在、不存在或者增加的幅度；以及v系统输出模块被进一步配置为提供代表与靶标抗原反应的抗体水平的存在、不存在或者增加的幅度的输出数据信号，其中与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的增加以及与靶标癌症抗原反应的抗体水平的增加的组合预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，CASAI治疗中使用的靶标癌症抗原不是PSA，并且所述一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)包括PSA。在一些情况下，CASAI治疗中使用的靶标癌症抗原是PSA，并且所述一种或多种预先确定的生物标志物抗原包括靶标生物标志物抗原PSA以及一种或多种其它非靶标的预先确定的生物标志物抗原。
在一些情况下，反应性抗体水平为反应性IgG水平。
在一些情况下，靶标癌症抗原为PAP或PAP融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了确定经受免疫调节治疗的前列腺癌患者中的治疗反应的方法，所述方法包括下述步骤：i.获得与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的基线水平，所述非靶标的预先确定的生物标志物抗原选自：ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3以及LGALS8；ii.向所述前列腺癌患者施用免疫调节剂和前列腺癌抗原(例如PAP或PSA)；iii.获得来自用免疫调节剂治疗之后的患者血液样品的、与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的治疗后水平，所述非靶标的预先确定的生物标志物抗原选自：ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3和LGALS8；以及iv.将与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的基线水平和治疗后水平之间的差异进行比较，其中相对于其基线水平，针对非靶标的预先确定的生物标志物抗原的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些实施方案中，所述方法还包括：i.获得与靶标癌症抗原以及一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的基线水平和治疗后水平；和ii.测量与靶标癌症抗原反应的基线水平和治疗后水平之间的差异，其中相对于其基线水平，与所述靶标癌症抗原反应的治疗后抗体水平的增加以及与所述一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，相对于与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加对阳性治疗反应更加具有预测性。在一些情况下，相对于单独地与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加，或者与靶标癌症抗原以及一种或多种其它生物标志物抗原(其不是ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3或LGALS8)反应的抗体水平的治疗后的增加，与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平的治疗后的增加以及与靶标癌症抗原反应的抗体水平的治疗后的增加的组合对阳性治疗反应更加具有预测性。
附图简要描述
图1：研究设计，其中用箭头指示免疫监测时间点(Kantoffetal.,2010)。0的三个治疗周期(或剂量)和治疗完成之后的治疗后随访时间点第2周、第10周以及第22周/进展后随访分别表示为Wk2、Wk-10、Wk-22/PPFU(进展后随访)。
图2：利用ProtoArray，在IMPACT中鉴定针对第二抗原的血清IgG应答的示意图。将治疗前和治疗后血清样品中的IgG水平进行比较，以鉴定针对ProtoArray上特异性蛋白(抗原)的IgG应答(相对于治疗前，治疗后血清IgG水平≥2倍的平均增加，其中FDR≤10％)。在三个治疗后时间点，即Wk-2、Wk-10和Wk-22/PPFU，观察到的IgG应答所针对的抗原的数量(y轴)，(x轴)显示Sipuleucel-T和对照组的患者。
图3：利用LuminexxMAP对来自IMPACT的患者中针对第二抗原的血清IgG应答的确认，和IgG应答者之间的重叠的分析。(A)利用LuminexxMAP，在治疗后10周确认IMPACT中的IgG应答。显示了对照和Sipuleucel-T组中的治疗前和治疗后血清IgG水平的Log2(y轴)。显示了3种第二抗原(PSA、KRAS和LGALS3)的数据。显示了针对PAP(初始抗原)的IgG的血清水平用于参考。细节参见表4。(B)利用文氏图显示来自Sipuleucel-T组的患者中针对不同抗原的IgG应答的重叠。显示了在第10周，具有针对不同抗原的重叠的IgG应答的患者的数量。左：重叠包括针对PAP(初始抗原)的IgG应答；右：重叠仅包括针对第二抗原的IgG应答。将IgG应答者定义为对比治疗前，治疗后血清IgG水平具有≥2倍的增加的患者。在此显示了代表性实例。
图4：在IMPACT的Sipuleucel-T组中，针对指定的第二抗原的IgG血清水平的治疗后变化(log2)与OS的相关性。显示了针对PSA(左)或LGALS3(右)的IgG血清水平对比OS的Kaplan-Meier曲线，其中通过在第10周对比治疗前的血清IgG水平的中值倍数变化将患者分组(≥中值，实线；<中值，短划线)；水平虚线指示估计的中值OS。Kaplan-Meier曲线下的森林图显示了来自多变量Cox模型的血清IgG水平变化(log2级)与OS的相关性的HR和95％CI(针对基线PSA和LDH调整的)(细节参见表8)；森林图中的盒子指示HR，以及须指示95％CI。IgG中的每一种的HR和p值都位于森林图的左侧。P值显示至3个有效数字。**p≤0.01；*p≤0.05；●p≤0.1。
图5：IMPACT中Sipuleucel-T组的抗PSA和抗LGALS3IgG应答者(R)和非应答者(NR)的OS以及来自对照组(C)的患者中的Kaplan-Meier曲线。显示了在第2周(左)、第10周(中)和第22周(右)的IgG应答的数据。顶图：抗PSAIgG；底图：抗LGALS3IgG。将IgG应答者定义为，治疗后血清IgG水平相对于治疗前具有≥2的增加的患者。分析中的患者的总数在各曲线的右上方给出；同时显示了R(IgG应答者，实线)、NR(IgG非应答者，短划线)以及C(对照，点划线)组中的患者的数量。细节参见表8。
图6：(A)：描述了管理系统的实例框图，所述管理系统被配置为根据一实施方案，确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行的癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应。(B)：描述了根据一实施方案，用于确定癌症患者对用靶标癌症抗原进行的癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗的治疗反应的方法的实例流程图。
图7描述了可以在其上实施公开的实施方案的数据处理系统的实例框图。
发明详述
I.引言
通过癌症免疫疗法的肿瘤组织的破坏可以导致针对非靶向的肿瘤相关抗原的免疫应答，这一现象被称为抗原扩散，决定簇扩散或表位扩散(Vanderlugtetal.,2002)。下文进一步详细描述用于癌症免疫疗法的方法和组合物。
存在来自用少量患者进行的研究的报道，其显示抗原扩散的程度可能预示用癌症免疫疗法治疗后的生存优势(Santegoets,2011；Butterfield,etal.,2003；T.C.HardingMN,etal.,2008；Mittendorf,etal.,2006)。测量抗原扩散的程度对于下述可能很重要：(i)理解免疫应答和体内的作用机制，(ii)鉴定有效的临床应答的早期、治疗后生物标志物，和(iii)鉴定自身可能是未来产品开发的治疗靶标的抗原。
显示在针对癌症免疫疗法的初始应答期间的肿瘤细胞死亡或组织损伤可导致抗原特异的自身反应性T和/或B淋巴细胞的释放和启动，所述抗原并非所述疗法直接靶向的(Vanderlugtetal.,2002)。扩大的免疫应答可随后促进更有效地杀死肿瘤细胞(Hardwick,etal.,2011；Corbiere,etal.,2011)，包括可能不表达免疫疗法所靶向的肿瘤抗原的那些细胞(Santegoets,2011)。该领域的早期研究已经表明，与非应答者相比，在临床应答者中可以更高频观察到针对癌症免疫疗法的扩大的抗体应答(Santegoets,2011；Butterfield,etal.,2003；T.C.HardingMN,etal.,2008；Mittendorf,etal.,2006)。在针对靶标特异的癌症疫苗和免疫疗法治疗如用于前列腺癌的PSA免疫疗法(Nesslinger,etal.,2010)和用于乳腺癌的Her2/neu疫苗接种(Disis,etal.,2004)以及MAGE-A3疫苗接种(Hardwick,etal.,2011；Corbiere,etal.,2011)的应答中，观察到了抗原扩散(即针对免疫疗法中未包含的抗原的抗体应答)。在针对用非靶标特异的免疫调节剂的免疫疗法治疗的应答中也观察到了抗原扩散。例如，用抑制免疫系统检验点的免疫调节剂抗CTLA4(易普利姆玛)进行的前列腺癌的治疗能够导致扩大的免疫应答(Kwek,etal.,2012)。
因此，本文提供了用于测量经受免疫疗法的患者中抗原扩散程度的方法和组合物，所述免疫疗法如CASAI、用癌症细胞或来源于癌症细胞的抗原的混合物进行的治疗，或者用免疫调节剂进行的治疗。同时提供了用于预测针对治疗的阳性治疗反应的方法和组合物。此类方法和组合物可以包括利用抗原扩散的测量。此类方法和组合物还可以包括与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(如本文提供的生物标志物抗原)反应的抗体水平的测量。此类方法和组合物还可以包括在响应用免疫调节剂进行的癌症治疗、用癌症细胞或来源于癌症细胞的抗原的混合物进行的治疗或者CASAI中，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(如本文提供的生物标志物抗原)反应的抗体水平的变化的测量。此外，本文提供了用于鉴定开发其它CASAI疗法的新的癌症抗原的方法和组合物。
II.定义
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域中的常规含义。
在确定治疗反应的背景下，本文使用的术语“确定”指预测、鉴定、估计、量化、计算或者以其他方式得到患者对癌症抗原特异的免疫疗法(例如CASAI)的治疗反应。在一些情况下，确定指提供关于阳性治疗反应的可能性的预后、估计或预测(例如基于与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的增加)。在一些情况下，阳性治疗反应的可能性是相对的。例如，可能性可以是相对于接受相同或相似的免疫疗法的一般患者群体增加或降低。在一些情况下，可能性是相对于匹配的群体，例如具有一种或多种相似的风险因子(例如格里森评分、PSA水平、LDH、骨损伤或二磷酸盐的使用)的患者群体增加或降低。在一些情况下，可能性是绝对的。
本文使用的术语“抗原”指引起免疫应答的分子，如蛋白、半抗原、碳水化合物、脂质等。例如，抗原能够引起T细胞激活、B细胞激活，或者T和B细胞激活。通常，抗原或者其部分与主要组织相容性复合体(MHC)结合，并通过抗原呈递细胞呈递至T细胞受体。抗原被抗体识别，并且能够与抗体结合。
本文使用的术语“癌症抗原”指在癌症细胞中异常表达、突变或者癌症细胞特异的抗原。示例性的癌症抗原包括但不限于：前列腺酸性磷酸酶(PAP)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、碳酸酐酶IX、HER-2/neu、细胞毒性T-淋巴细胞抗原4、前列腺特异性抗原(PSA)、乙型肝炎表面抗原、端粒酶逆转录酶(TERT)、存活素、EGFRvIII、黑素细胞来源的肽、多黑素瘤相关的肽以及宫颈癌抗原HPV-16-E7。癌症抗原还可以包括在本文被鉴定为由于细胞免疫疗法之后或细胞免疫疗法期间的抗原扩散引起增强的免疫应答的抗原(例如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3)。癌症抗原可以包括来源于同种异体或自体肿瘤细胞的组合物，或者包含同种异体或自体肿瘤细胞的组合物。在一些情况下，将癌症抗原包装于病毒、病毒样颗粒或脂膜中。在一些情况下，在一个或多个重组表达盒中编码癌症抗原。
本文使用的术语“免疫调节剂”指调节免疫系统的组合物或制剂。免疫调节剂可以包括激活免疫系统的组合物或制剂(例如佐剂或激活剂)或者下调免疫系统的组合物或制剂。佐剂可以包括基于铝的组合物以及包含细菌或分枝杆菌细胞壁组分的组合物。激活剂可以包括激活抗原呈递细胞以刺激细胞免疫应答的分子。激活剂可以包括但不限于：toll样受体TLR-2、3、4、6、7、8或9的激动剂，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；TNF；CD40L；CD28；FLT-3配体；或细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21。激活剂还可以包括抑制免疫抑制物活性的化合物(如免疫抑制物IL-10、IL-35、TGFβ、IDO或环磷酰胺的抑制剂)或者抑制免疫检验点活性的化合物(如针对CTLA4、PD-1或PD-L1的抗体)。激活剂还可以包括共刺激分子，如CD40、CD80或CD86。免疫调节剂还可以包括下调免疫系统的试剂，如针对IL-12p70的抗体，toll样受体TLR-2、3、4、5、6、8或9的拮抗剂，或者免疫功能的常规抑制物如环磷酰胺、环孢菌素A或FK506。可将这些试剂(例如佐剂、激活剂或负调节物)组合以形成最佳免疫应答。
可以以与一种或多种癌症抗原物理连接的融合肽提供免疫调节剂。在一些情况下，癌症抗原和免疫调节剂存在于用于引入患者或者来自患者的细胞中的一个或多个表达盒上，例如以诱导癌症抗原-免疫调节剂融合蛋白的表达。在其它情况下，以与癌症抗原时间和/或空间接近的方式，表达免疫调节剂或向患者提供免疫调节剂或者将免疫调节剂与离体患者细胞接触。
本文使用的术语“癌症免疫疗法”指设计以引起或增强患者中针对癌症细胞的免疫应答的任何疗法。例如，癌症免疫疗法包括但不限于：癌症抗原特异的主动免疫疗法、用免疫调节剂(例如免疫抑制物的激活剂或抑制剂或者检验点抑制剂的抑制剂)进行的治疗，或者用癌症细胞或来源于癌症细胞的抗原的混合物进行的治疗(例如用来源于癌细胞系的抗原进行的治疗)。
本文使用的术语“癌症抗原特异的主动免疫疗法”(CASAI)指患者针对一种或多种靶标癌症抗原的免疫。CASAI可以指离体治疗，其中从患者中移出外周血单核细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞和/或抗原呈递细胞)，并与一种或多种靶标癌症抗原接触。然后可以将细胞再次引入患者中。CASAI还可以指体内CASAI，其中将靶标癌症抗原引入患者中，并在其中发生免疫应答。在一些情况下，CASAI利用与免疫调节剂融合的一种或多种靶标癌症抗原，或在免疫调节剂存在的情况下的一种或多种靶标癌症抗原，所述免疫调节剂如佐剂或激活剂。示例性的CASAI方法包括在体内或离体，在一种或多种免疫调节剂存在的情况下，将患者的抗原呈递细胞与一种或多种靶标癌症抗原接触，所述免疫调节剂如GM-CSF，TNF；CD40L；CD28；或FLT-3配体；toll样受体TLR-2、3、4、5、6、8或9的激动剂；检验点抑制剂，如针对CTLA4、PD-1或PD-L1的抗体；细胞因子，如IL-1、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21；或者IL-10、IL-35、TGFβ或IDO的抑制剂。示例性的CASAI方法还包括在体内或离体，将患者的抗原呈递细胞与和免疫调节剂融合的一种或多种癌症抗原接触，所述免疫调节剂如GM-CSF、TNF；CD40L；CTLA4；CD28；FLT-3配体；toll样受体TLR-2、3、4、5、6、8或9的激动剂；检验点抑制剂，如针对CTLA4、PD-1或PD-L1的抗体；细胞因子，如IL-1、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21；或者免疫抑制物如环磷酰胺、IL-10、IL-35、TGFβ或IDO的抑制剂。示例性的CASAI方法还包括在体内或离体，将患者的抗原呈递细胞与和共刺激分子(如CD40、CD80或CD86)融合的一种或多种癌症抗原接触。
本文使用的术语“细胞特异的主动免疫疗法”指用同源的或同种异体癌细胞或来源于该癌细胞的抗原进行的患者的免疫(例如用来源于癌细胞系如LnCAP或PC-3细胞的抗原进行的治疗)，以诱导针对癌细胞中存在的一种或多种癌症抗原的免疫应答，并激活或增加患者自身肿瘤细胞的免疫监视。
本文使用的术语“免疫检验点抑制剂”、“检验点抑制剂”等指抑制免疫系统的控制机制活性的化合物。免疫系统检验点或免疫检验点是免疫系统的抑制性通路，其通常作用为维持自身耐受性或调节生理学免疫应答的持续时间或幅度，以将附属的组织损伤最小化。检验点抑制剂可以通过抑制通路中的蛋白的活性来抑制免疫系统检验点。免疫系统检验点蛋白包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡1蛋白(PD1)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)。由此，检验点抑制剂包括CTLA4、PD1或PD-L1的拮抗剂。例如，与CTLA4、PD-1或PD-L1结合并拮抗它们的功能的抗体是检验点抑制剂。此外，抑制免疫系统检验点的抑制功能的任何分子(例如，肽、核酸、小分子等)都是检验点抑制剂。
本文使用的术语“生物标志物”指有机体生物状态的指示物。可以测量生物标志物的水平以确定有机体的生物状态。示例性的生物标志物包括代谢产物和大分子，如蛋白、碳水化合物和脂质。生物标志物可以指示疾病(如癌症)的存在或者疾病或病况的严重程度。例如，生物标志物的存在或不存在可以指示恶性疾病、转移或其缺乏。在一些情况下，一种或多种生物标志物或其组合的水平可以指示疾病预后、治疗反应或者预测治疗结果。在其它情况下，生物标志物是抗原，并且与一种或多种生物标志物抗原或其组合反应的抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或其亚类，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的水平能够指示疾病预后、治疗反应或者预测治疗结果。
本文使用的术语“预先确定的生物标志物抗原”指为特定生物状态的已知指示物的一种或多种生物标志物抗原或其组合。例如，可以检测和/或测量一种或多种预先确定的生物标志物抗原，以获得疾病预后或确定治疗反应。可选地或此外，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原或其组合反应的抗体的水平可以指示特定的生物状态。例如，可以检测和/或测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原或其组合结合的反应性抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或它们的亚类，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的水平，以获得疾病预后或确定治疗反应。
预先确定的生物标志物抗原包括但不限于单独的或任何组合的PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8/PCTA-1、PAP或PAP-GM-CSF。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原选自ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3、LGALS8和靶标癌症抗原。因此，在一些实施方案中，可以检测和/或测量与单独的或任何组合的PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF中的一种或多种反应的抗体的水平，以获得疾病预后或确定治疗反应。在一些情况下，可以确定相对于治疗前对照的，与预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的水平。
在一些实施方案中，与预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的水平包括与一种或多种不是靶标癌症抗原的抗原反应的抗体。类似地，在一些实施方案中，与预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的水平不包括与靶标癌症抗原反应的抗体。由此，本文的预先确定的生物标志物抗原包括非靶标的预先确定的生物标志物抗原。
本文使用的“非靶标的预先确定的生物标志物抗原”指预先确定的生物标志物抗原，对于具体受试者而言，所述抗原不是施用于所述受试者的在CASAI治疗中所使用的靶标癌症抗原。因此，由于靶标癌症抗原可以，例如取决于所应用的CASAI治疗而变化，非靶标的预先确定的生物标志物抗原的数量和身份也可以改变。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是选自ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3和LGALS8的一种或多种抗原的任何组合。因此，在一些实施方案中，可以检测和/或测量与单独的或任何组合的ERAS、KRAS、KLK2、PSA、LGALS3和LGALS8中的一种或多种反应的抗体的水平，以获得疾病预后或确定治疗反应。例如，在一些情况下，用靶标癌症抗原进行CASAI治疗，并通过测量与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的水平来确定治疗结果或治疗反应。
在一些情况下，可以检测和/或测量与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平结合与靶标癌症抗原反应的抗体的水平，以获得疾病预后或确定治疗反应。例如，在一些实施方案中，用靶标癌症抗原进行CASAI治疗，并通过测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(包括靶标癌症抗原以及一种或多种其它生物标志物抗原)反应的抗体的水平来确定治疗结果或治疗反应。
本文使用的术语“反应性抗体”指与靶标癌症抗原或生物标志物抗原结合的抗体。例如PAP反应性抗体指与PAP结合的抗体。此外，“与......反应的抗体水平”、“反应性抗体水平”、“与......反应的抗体的水平”等指与特异性抗原反应或者与之结合的抗体的水平，例如血清浓度。例如，“与LGALS8反应的抗体水平”指与LGALS8结合的抗体的血清浓度。作为另一实例，确定与LGALS8或KRAS中的一种或多种反应的抗体水平指确定与LGALS8结合的抗体的血清浓度，确定与KRAS结合的抗体的血清浓度，或者确定与LGALS8结合的抗体的血清浓度以及与KRAS结合的抗体的血清浓度这两项。可以基于绝对或相对基础来确定抗体水平。
本文使用的术语“基线抗体水平”指在一轮癌症免疫疗法治疗开始之前测量的，或者从一轮癌症免疫疗法治疗开始之前获得的样品所测量的一种或多种预先确定的生物标志物抗原特异的抗体的水平或浓度。基线抗体水平可以包括基线IgA、IgD、IgE、IgG或IgM水平，或者一种或多种免疫球蛋白亚类(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的基线水平。例如，患者可被鉴定为需要癌症疗法，并在治疗开始之前为该患者确定，或者从治疗开始之前获得的样品确定与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的IgG的基线水平。此外或者可选地，患者过去可能已经接受过癌症免疫疗法治疗(例如用免疫调节剂进行的治疗，用细胞特异的主动免疫疗法进行的治疗或者CASAI治疗)，可以在另外的治疗开始之前或者从治疗开始之前获得的样品确定基线抗体水平。
可选地，“基线抗体水平”可以指免疫系统还未被激活或者近期还未被激活以攻击肿瘤细胞的患者预期的普遍接受的水平或范围。例如，基线抗体水平可以是与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的浓度，其不指示强抗癌症免疫应答或指示强抗癌症免疫应答的缺乏。作为另一实例，基线抗体水平可以是通常在未罹患癌症的个体中所见的，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的浓度。因此，可以从参考来源如书、出版物、期刊文章、数据库、图表、电子表格或者从万维网获得此类基线抗体水平。在一些情况下，可以从未罹患癌症的群体测定基线抗体水平。
可以基于绝对或相对基础来确定与一种或多种预先确定的抗原反应的基线抗体水平。例如，可将与一种或多种预先确定的抗原反应的基线抗体水平与标准进行比较。在一些情况下，与一种或多种预先确定的抗原反应的基线抗体水平可以被确定在标准之下、在标准之上或者显著在标准之下或之上。在一些实施方案中，由于预先确定的生物标志物抗原是自身抗原，因此与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平预期较低。
本文使用的术语“治疗后抗体水平”指一轮癌症免疫疗法治疗开始之后确定的，一种或多种生物标志物抗原特异的抗体的水平或浓度。可以基于绝对或相对基础来确定与一种或多种预先确定的抗原反应的治疗后抗体水平。治疗后抗体水平包括治疗后IgA、IgD、IgE、IgG或IgM水平，或者一种或多种免疫球蛋白亚类(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的治疗后水平。例如，可以向患者施用癌症疗法，并且在治疗开始之后确定该患者中与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的IgG的治疗后水平。
可以在癌症免疫疗法开始之后的任何时间获得与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的治疗后抗体水平。例如，可以在癌症免疫疗法治疗开始后的约2天之后确定与预先确定的生物标志物抗原反应的一种或多种抗体的治疗后水平。作为另一实例，可以在癌症免疫疗法治疗开始后约1周之后确定治疗后抗体水平。作为另一实例，可以在癌症免疫疗法治疗开始后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26周或更久之后确定治疗后抗体水平。在一些情况下，可将样品储存然后分析，以确定治疗后抗体水平。
本文使用的术语“靶标癌症抗原”可以指在治疗上向癌症患者施用的抗原。在一些情况下，靶标癌症抗原激活免疫系统或其组分，以识别、结合、攻击、调理(opsonize)、吞噬或中和所述抗原。例如，在响应治疗中，患者可以产生与靶标癌症抗原结合的抗体。可选地，“靶标癌症抗原”可以指与治疗上向癌症患者施用的抗体结合的抗原。
III.方法
在一些实施方案中，本发明提供了确定癌症患者对CASAI治疗的治疗反应的方法。所述CASAI治疗包括下述步骤：
i.获得与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的基线抗体水平；
ii.利用靶标癌症抗原，用CASAI治疗患者；
iii.获得来自用CASAI治疗之后的患者的血液样品中的，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的治疗后抗体水平；以及，
iv.测量与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的基线抗体水平与治疗后抗体水平之间的差异，其中相对于其基线水平，针对一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)的抗体水平的增加预示着阳性治疗反应。
在一些情况下，一种或多种预先确定的生物标志物抗原选自a)生物标志物抗原，其包括靶标癌症抗原以及一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原；和b)不包括靶标癌症抗原的一种或多种生物标志物抗原。A.获得基线抗体水平
可以以本领域已知的任何方式获得基线抗体水平。例如，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体的基线水平。在一些情况下，可将一种或多种预先确定的生物标志物抗原固定于固体支持表面上，以及将血液、血清或来源于血液、血清的组合物与固定的生物标志物抗原接触，以允许反应性抗体的结合，所述反应性抗体如反应性IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或者它们的亚类，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。然后通过将表面与用荧光团或酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的二抗接触，酶标记的二抗可以结合至所述反应性抗体。然后可以通过测量结合至表面的荧光团或酶的量来检测或测量反应性抗体的水平。
用于检测反应性抗体的ELISA形式的改变对本领域技术人员而言将是显而易见的。例如，除酶之外的可检测的标记如荧光团、放射性核素或发色团可以连接至二抗。类似地，可以利用可选的第二检测试剂。例如，可以使用蛋白A、蛋白G或者与IgG结合的任何其它试剂来检测与其上固定有生物标志物抗原的固体支持表面结合的反应性IgG。作为另一实例，可以以不用标记物的方式来检测和测量反应性抗体。例如，生物标志物抗原可以结合至固体支持表面，并且血液、血清或来源于血液、血清的组合物的样品可以经过所固定的生物标志物抗原。然后可以通过干扰量度法或者通过测量由表面等离子体共振引起的折射的改变来检测反应性抗体与生物标志物抗原的结合。
可将生物标志物抗原固定，用于检测单孔板，例如24、48、96或384孔板中的单一生物标志物。可选地，可将生物标志物抗原固定于珠子，例如如例如LuminexxMAP技术中的荧光珠(www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/)或者作为微阵列，例如如ProtoArray平台中的微阵列(www.invitrogen.com/protoarray)。在一些情况下，荧光珠是光谱可区别的，这使得多重抗原偶联的珠子可以用于高通量平行监测血清中的多种生物标志物抗原-反应性抗体水平。可以通过与支持表面的非特异吸附，通过与表面的化学反应(例如与生物标志物抗原的赖氨酸或N端伯胺反应)或者通过使用捕获试剂如捕获抗体来固定生物标志物抗原。
在其它实施方案中，可以在未将生物标志物抗原固定于表面的情况下确定基线反应性抗体水平。例如，可将血清中的抗体固定于表面，并且可以将一种或多种生物标志物抗原与所固定的抗体接触。可以通过缀合至生物标志物抗原或第二检测试剂(例如二抗)的标记物来检测通过反应性抗体结合至表面的生物标志物抗原。可选地，可以以不用标记物的方式如通过干扰量度法或者作为折射率的改变，来检测通过反应性抗体结合至表面的生物标志物抗原。结合至表面的生物标志物抗原的水平与反应性抗体的水平成比例。
在其它实施方案中，可以通过观察反应性抗体结合至生物标志物抗原的尺寸的变化来确定基线反应性抗体水平。例如，可以通过荧光各向异性或者利用尺寸排阻柱来测量标记的生物标志物抗原的尺寸。可将生物标志物抗原与血液、血清或者来源于血液、血清的组合物接触，并且标记的生物标志物抗原的尺寸的增加可以指示反应性抗体的存在。
在一些实施方案中，确定与单独的或者任何组合的下述预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体的基线水平：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF。在一些情况下，预先确定的生物标志物是选自PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP以及PAP-GM-CSF中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种、任何七种或者八种生物标志物抗原。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是ERAS以及选自PSA、LGALS3、KRAS、KLK2、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是KRAS以及选自PSA、LGALS3、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是PSA以及选自LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是KLK2以及选自PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是LGALS8以及选自PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是LGALS3以及选自PSA、LGALS8、KRAS、ERAS、KLK2、PAP和PAP-GM-CSF中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种生物标志物抗原。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原包括PAP或PAP-GM-CSF以及PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或全部。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原包括PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8中的任何一种或多种，但不包括PAP、含有PAP的融合蛋白或PAP-GM-CSF。
在一些实施方案中，靶标癌症抗原是或者包含PSA，并且预先确定的生物标志物抗原是靶标癌症抗原(PSA)以及下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种：LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8。在一些情况下，靶标癌症抗原不是PSA，并且非靶标的预先确定的生物标志物抗原包括PSA以及LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8中的一种或多种。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原包括受试者的CASAI治疗中所使用的靶标癌症抗原以及下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8。
在一些情况下，确定与单独的或任何组合的下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体的基线水平：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物是选自PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8和LGALS3中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种，或者任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种非靶标的预先确定的生物标志物抗原。
在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是ERAS以及选自PSA、KLK2、KRAS、LGALS8和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。在其它情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是KRAS以及选自PSA、KLK2、ERAS、LGALS8和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是KLK2以及选自PSA、ERAS、KRAS、LGALS8和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是LGALS3以及选自PSA、KLK2、KRAS、LGALS8和ERAS中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是LGALS8以及选自PSA、KLK2、KRAS、ERAS和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是PSA以及选自KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8和LGALS3中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种生物标志物抗原。
在一些情况下，通过测量抗原扩散而非测量针对CASAI治疗中所利用的癌症抗原的应答来确定阳性治疗结果的预测。在此类情况下，癌症治疗中所利用的癌症抗原不被用作确定基线反应性抗体水平的生物标志物抗原。例如，在一些情况下，不测量、不利用或者不需要与靶标癌症抗原(例如PAP或PAP-GM-CSF)反应的抗体的基线水平，以获得预测的治疗反应。
B.用CASAI、细胞特异的主动免疫疗法或免疫调节剂治疗癌症患者
本文提供了用癌症免疫疗法治疗癌症患者的方法。可以在体内或离体实施所述治疗。一般而言，通过使患者针对一种或多种癌症抗原发生免疫而实施CASAI。该免疫诱导免疫系统攻击荷抗原的肿瘤细胞。本发明的方法可用于任何癌症类型的治疗，用于任何癌症类型的治疗结果的预测，或者用于适合用作癌症疫苗抗原的其它靶标的鉴定。例如，本发明可被用于罹患前列腺癌、黑素瘤、神经胶质瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、乳腺癌或结直肠癌的患者。
体内CASAI包括将一种或多种靶标癌症抗原用于刺激患者体内的免疫应答的方法。例如，可向患者注射一种或多种靶标癌症抗原以刺激免疫应答。在一些情况下，靶标癌症抗原是纯化的多肽。例如，可将一种或多种纯化的靶标癌症抗原与药物赋形剂混合，并注射进患者中。在一些情况下，将多肽与免疫调节剂融合，或者与免疫原性的载体蛋白如钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合，所述免疫调节剂如：GM-CSF，TNF；CD40L；CTLA4；CD28；FLT-3配体；toll样受体TLR-2、3、4、5、6、8或9的激动剂；检验点抑制剂，如针对CTLA4、PD-1或PD-L1的抗体；细胞因子，如IL-1、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21；或者免疫抑制物(如IL-10、IL-35、TGFβ或IDO)的抑制剂。在一些情况下，将所述多肽与共刺激分子如CD40、CD80或CD86融合。在一些情况下，将癌症抗原与佐剂或其它免疫调节剂混合，并注射进患者中，以增强免疫反应。在一些实施方案中，多肽癌症抗原是PAP或PAP融合蛋白。在一些情况下，多肽癌症抗原是由与GM-CSF融合的PAP组成的PAP融合蛋白。
可选地，在一些情况下，靶标癌症抗原不是纯化的多肽。例如，癌症抗原可由一种或多种表达盒编码。然后可将表达盒引入体内以刺激免疫应答。在一些情况下，将表达盒包装进载体(如病毒载体)中，以确保足够的转染和表达。在一些情况下，载体自身是癌症抗原。例如，可将病毒(例如，HEV、HPV、HBV、HCV或由来源于它们的衣壳蛋白制备的病毒样颗粒(VLP))引入患者中。在一些情况下，病毒或VLP靶向肿瘤细胞(例如，它与肿瘤细胞上或肿瘤细胞周围所见的细胞表面蛋白结合)。载体可以引发针对吸收了所述载体的细胞的免疫应答。在一些情况下，VLP可以包括含有衣壳蛋白或其部分的以及靶标抗原或其部分的衣壳融合蛋白。在一些情况下，病毒或其它包装可以携带编码免疫调节剂的其它表达盒。在一些实施方案中，表达盒编码由与GM-CSF融合的靶标癌症抗原组成的融合蛋白，如PAP-GM-CSF。
在一些情况下，在离体条件下实施CASAI治疗。离体CASAI包括这样的方法，其中从患者中提取抗原呈递细胞(APCs)，在体外将其与抗原接触，以产生激活的APC，然后将激活的APC再次引入患者中。在一些情况下，体外扩增抗原呈递细胞以提供足够数量的细胞，从而诱导强免疫应答。在一些情况下，在体外，使用激活的APC来激活T细胞、B细胞或NK细胞，然后将激活的APC、T细胞、B细胞和/或NK细胞再次引入患者中。
在一实施方案中，本发明提供了在人类受试者中诱导细胞毒性细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：(a)从受试者中分离APC；(b)在有效激活APC的条件下，在体外将APC暴露于包含与PAP共价连接的GM-CSF的蛋白缀合物；(c)向所述受试者施用激活的APC；以及(d)重复步骤(a)-(c)至少一次，其中每次循环在步骤(c)发生之后至少10天开始。在另一实施方案中，将步骤(a)-(c)重复一次，其中步骤(a)在步骤(c)之后14天发生。
在另一实施方案中，可以用细胞特异的主动免疫疗法对患者进行治疗。例如，可以用靶标癌症抗原对患者进行治疗，所述靶标癌症抗原是来源于患者自身肿瘤细胞或同种异体肿瘤细胞的抗原的混合物。例如，可以杀死一种或多种肿瘤细胞系，如前列腺肿瘤LnCAP或PC-3细胞系，并且可以从中提取抗原(例如蛋白)混合物。可将混合物与药物赋形剂混合，并引入患者中。在一些情况下，也可将混合物与佐剂或免疫调节剂组合。在一些情况下，用同源的或同种异体肿瘤细胞进行的治疗可以刺激针对患者的癌细胞的免疫应答(例如识别、结合、攻击、调理、诱导凋亡或坏死、吞噬等)。在一些实施方案中，作为用来源于患者的自身肿瘤细胞或同种异体肿瘤细胞的抗原的混合物进行的治疗的结果，一种或多种预先确定的生物标志物抗原的增加可以预测阳性治疗结果。
在另一实施方案中，可以用免疫调节剂如本文所述的一种或多种免疫调节剂对患者进行治疗。在一些情况下，用激活免疫系统或抑制免疫系统抑制物(例如检验点)的免疫调节剂进行的治疗可以导致针对患者的癌细胞的增加的免疫监视或活性(例如识别、结合、调理、诱导凋亡或坏死、吞噬等)。在一些情况下，作为用免疫调节剂进行治疗的结果，一种或多种预先确定的生物标志物抗原的增加可以预测阳性治疗结果。
在另一实施方案中，可以测量罹患癌症的患者或患者群体的自身抗原反应性抗体水平，并使之与总生存期相关。然后与增加的总生存期相关的，与特定生物标志物抗原或生物标志物抗原组反应的抗体水平可以将该抗原或抗原组鉴定为用于癌症免疫疗法的靶抗原。在一些情况下，与增加的总生存期相关的，与一种或多种生物标志物抗原反应的抗体水平的增加可以将该一种或多种生物标志物抗原鉴定为用于癌症免疫疗法的靶抗原。在一些情况下，与一种或多种生物标志物抗原反应的抗体水平的增加是从治疗前水平至治疗后水平的增加。在一些情况下，生物标志物抗原包括或者是单独的或是任何组合(如本文所述的任何前述组合)的PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF中的任何一种或多种。在一些情况下，测量并比较非靶标的预先确定的生物标志物抗原，以确定反应性抗体的存在、不存在或增加的程度。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原包括或者是单独的或任何组合(如本文所述的任何前述的组合)的KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3或PSA中的任何一种或多种。
C.测量基线抗体水平与由CASAI治疗、细胞特异的主动免疫疗法或用免疫调节剂进行的治疗所诱导的抗体水平之间的差异
可以利用基线抗体水平与由癌症免疫疗法治疗所诱导的抗体水平之间的差异来鉴定响应所述治疗的患者，鉴定适合用作靶标癌症抗原的其它抗原或者预测治疗结果，所述抗体与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应。例如，与通过治疗，反应性抗体水平未增加或者未显著增加的患者相比，在针对CASAI治疗、细胞特异的主动免疫疗法或用免疫调节剂进行的治疗的应答中，增加针对某些预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)的反应性抗体的患者，可以显示出总生存期延长、复发降低、肿瘤负荷较大降低或者无疾病进展。由此，可取的是，鉴定在针对治疗的应答中，与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的抗体的水平增加的患者。
可以利用本领域已知的任何方法来确定与预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的治疗前水平和治疗后水平。上文描述了治疗前抗体水平(即基线抗体水平)的检测和测量。用于检测和测量由癌症免疫疗法治疗(例如CASAI、细胞特异的主动免疫疗法或用免疫调节剂进行的治疗)所诱导的抗体水平的组合物和方法是相同的，除了抗体是在治疗开始之后(包括治疗完成之后或一轮治疗完成之后)从血液、血清或来源于血液、血清的组合物获得的。在一些情况下，在治疗期间收集血液或血清，并将其用于与基线抗体水平的比较，以预测治疗结果。可以在治疗开始之后任何时间点收集血液或血清，并对反应性抗体进行分析。例如，可以在进入治疗方案1周之内，或者在治疗开始之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24或26周或更久收集血液或血清。
例如，可以利用在治疗开始之前从患者获得的血清，通过ELISA，确定与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF中的一种或多种)反应的抗体的基线水平。作为另一实例，可以利用在治疗开始之前从患者获得的血清，通过ELISA，确定与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原(例如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3中的一种或多种)反应的抗体的基线水平。作为另一实例，可以利用在治疗开始之前从患者获得的血清，通过ELISA，确定与靶标癌症抗原以及一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原(例如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3中的一种或多种)反应的抗体的基线水平。在一些情况下，所述基线水平可以是治疗前反应性抗体水平的预先确定的参照值或阈值。
然后患者可以经受癌症免疫疗法治疗(例如诸如Sipuleucel-T治疗的CASAI治疗，细胞特异的主动免疫疗法或者用免疫调节剂进行的治疗)，并在治疗方案开始之后获得血液或血清。然后可以确定因此获得的治疗后样品中的与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的抗体的血清浓度，并与基线水平进行比较。在一些情况下，然后可以将显示与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的治疗后水平在阈值之上的患者鉴定为响应治疗和/或可能具有阳性治疗结果。
在一些情况下，可将显示与一种或多种预先确定的生物标志物抗原(例如非靶标的预先确定的生物标志物抗原)反应的抗体在基线水平之上的治疗后增加的患者鉴定为响应治疗和/或可能具有阳性治疗结果。在一些情况下，反应性抗体水平的增加可以指示下述可能性：总生存期延长、复发降低、肿瘤负荷较大降低或者无疾病进展。在一些情况下，可基于测量的与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平相对于基线值的增加而将患者分为非应答者和应答者。在一些情况下，与非应答者相比，应答者被预测具有更好的治疗结果(例如更高的缓解或无进展的可能性)。
在一些实施方案中，方法提供了测量癌症免疫疗法治疗所诱导的，与下述预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体的水平的升高(例如与基线水平相比)：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP以及PAP-GM-CSF。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是下述生物标志物抗原中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种、任何七种或八种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP以及PAP-GM-CSF。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原包括下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或六种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2以及LGALS8。在一些情况下，方法提供了测量癌症免疫疗法治疗所诱导的，与靶标癌症抗原以及下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体的水平的升高(例如与基线水平相比)：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8以及LGALS3。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原包括靶标癌症抗原以及下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或六种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2以及LGALS8。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是ERAS以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：PSA、LGALS3、KRAS、KLK2、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是KRAS以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：PSA、LGALS3、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是KLK2以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：PSA、LGALS3、ERAS、KRAS、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是PSA以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：KRAS、LGALS3、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是LGALS3以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：PSA、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP或PAP-GM-CSF。在其它情况下，预先确定的生物标志物抗原是LGALS8以及下述生物标志物抗原中的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或七种：PSA、LGALS3、ERAS、KLK2、KRAS、PAP或PAP-GM-CSF。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是PSA。在一些情况下，靶标癌症抗原不是PSA，并且预先确定的生物标志物抗原是或者包括PSA。在一些情况下，靶标癌症抗原是PSA，并且预先确定的生物标志物抗原是PSA以及LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的一种或多种。在一些情况下，靶标癌症抗原是PSA，并且非靶标的预先确定的生物标志物抗原是LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2、LGALS8、PAP和PAP-GM-CSF中的一种或多种。在一些情况下，靶标癌症抗原是PAP或PAP-GM-CSF，并且非靶标的预先确定的生物标志物抗原是PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2和LGALS8中的一种或多种。
在一些实施方案中，方法提供了测量癌症免疫疗法治疗所诱导的，与下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体的水平的升高(例如与基线水平相比)：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8。
在一些情况下，通过测量抗原扩散而非测量针对CASAI治疗中利用的靶标癌症抗原的应答来确定阳性治疗结果的预测。在一些情况下，在癌症治疗中利用的靶标癌症抗原因而不被用作确定基线抗体水平的生物标志物，不被用作预测治疗结果的生物标志物，或者仅与其它生物标志物组合用作预测治疗反应的生物标志物。例如，在一些情况下，由Sipuleucel-T治疗所诱导的与PAP或PAP-GM-CSF反应的抗体的水平未被测量，未将其与基线IgG水平进行比较，或者未被利用以获得预测的治疗反应。例如，在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是或者包括PSA、LGALS3、ERAS、KRAS、KLK2或LGALS8中的任何一种或多种，但是不包括靶标癌症抗原，例如不包括PAP、含有PAP的融合蛋白或PAP-GM-CSF。作为另一实例，在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是或者包括PSA、LGALS3、ERAS、KRAS、KLK2、LGALS8中的任何一种或多种，但是不包括靶标癌症抗原，例如不包括PAP、含有PAP的融合蛋白或PAP-GM-CSF。
可选地，在一些情况下，对针对靶标癌症抗原的免疫应答连同一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原进行测量。例如，预先确定的生物标志物抗原可以是或者包括靶标癌症抗原，如PAP或PAP-GM-CSF以及一种或多种非靶标癌症抗原如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3。
在针对治疗的应答中，与一种或多种生物标志物反应的IgG水平相对于基线反应性抗体水平的至少约1.2-200倍的增加可以指示阳性治疗结果。例如，反应性抗体水平在基线值之上的至少约1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或更高倍的增加可以指示阳性治疗结果。本领域技术人员将会认识到，不同的抗体水平检测技术显示出不同的敏感性和动态范围，因此用于确定增加的阈值可以取决于抗体测量中所应用的方法。
类似地，用于确定针对癌症免疫疗法治疗的应答中的增加(其预示阳性治疗结果)的阈值可以取决于生物标志物抗原。仅通过举例说明的方式，与一种生物标志物抗原反应的抗体水平的至少1.5倍的增加可以预示阳性治疗结果。然而，在该实例中，与不同的生物标志物抗原反应的IgG的水平的增加必须至少为2倍，以预示阳性治疗结果。类似地，用于确定针对癌症免疫疗法的应答中的增加(其预示阳性治疗结果)的阈值可以取决于测量的抗体同种型。
在一些情况下，测量针对多种生物标志物的反应性抗体水平的增加能够增加方法的预测能力。例如，与仅一种预先确定的生物标志物反应性抗体水平增加的患者或显示无应答的患者相比，在针对治疗的应答中两种或更多种预先确定的生物标志物反应性抗体水平升高的患者可以显示更大程度的抗原扩散或者增加的具有阳性治疗结果的可能性。例如，可将在针对治疗的应答中与ERAS和KLK2都反应的抗体升高的患者鉴定为具有增加的阳性治疗结果的可能性。类似地，可以测量针对其它生物标志物(例如两种以上生物标志物、三种以上生物标志物、四种以上生物标志物、五种以上生物标志物等)的反应性抗体水平以进一步增加方法的预测能力。例如，可将与ERAS、KLK2和KRAS反应的抗体相对于基线值增加的患者鉴定为具有增加的阳性治疗结果的可能性。作为另一实例，可将与PSA以及一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原反应的抗体相对于基线值增加的患者鉴定为具有增加的阳性治疗结果的可能性。
在一些情况下，与一组预先确定的生物标志物抗原中的任何一种反应的抗体水平的治疗后增加可以指示阳性治疗结果。例如，可将显示出与2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的预先确定的生物标志物抗原中的任何一种反应的抗体水平相对于基线水平的大量增加(例如1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7.5、10、15、20、25、30、40或50倍或更多倍)的患者鉴定为可能具有阳性治疗结果。例如，如果患者显示出相对于与PSA、KLK2、ERAS、KRAS、LGALS8或LGALS3中的任何一种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。
作为另一实例，如果患者显示出相对于与PSA以及KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3中的任何一种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与KLK2以及PSA、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3中的任何一种或多种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与KRAS以及PSA、KLK2、ERAS、LGALS8或LGALS3中的任何一种或多种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与LGALS3以及PSA、KRAS、ERAS、LGALS8或KLK2中的任何一种或多种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与LGALS8以及PSA、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS3中的任何一种或多种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为又一实例，如果患者显示出相对于与靶标癌症抗原以及任何一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原如PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。
类似地，可以通过鉴定在针对癌症免疫疗法治疗的应答中显示出与3、4、5、6或更多种不同的预先确定的生物标志物抗原中的至少任何两种反应的抗体的增加的水平的患者来获得增强的预测能力。例如，如果患者显示出相对于与ERAS、KRAS、LGALS8、LGALS3、PSA或KLK2中的至少两种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与ERAS、KRAS、LGALS8、LGALS3、PSA或KLK2中的至少两种反应的IgG的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。类似地，如果患者显示出相对于与ERAS、KRAS、LGALS8、LGALS3、PSA或KLK2中的至少三种反应的IgG的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。
作为另一实例，如果患者显示出相对于与ERAS、KRAS、LGALS8、LGALS3、PSA或KLK2中的至少四种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与PSA、ERAS、KRAS、LGALS8、KLK2或LGALS3中的至少五种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果。作为另一实例，如果患者显示出相对于与下述预先确定的生物标志物抗原反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果：PSA、ERAS、KRAS、LGALS8、KLK2和LGALS3。作为另一实例，如果患者显示出相对于与靶标癌症抗原以及下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的至少一种、两种、三种、四种、五种或全部六种反应的抗体的基线水平的增加，则可将其鉴定为可能具有阳性治疗结果：PSA、ERAS、KRAS、LGALS8、KLK2或LGALS3。
在一些情况下，与靶标癌症抗原反应的抗体的水平未被利用，或者仅结合与一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原反应的抗体水平利用，以预测治疗结果。例如，在一些情况下，PAP、PAP-GM-CSF，或PAP与PAP-GM-CSF两者的反应性抗体水平未被测量或者被用于预测治疗结果。在其它情况下，对PAP、PAP-GM-CSF，或者PAP与PAP-GM-CSF两者的反应性抗体水平进行测量，并与基线水平进行比较，同时对一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原反应性抗体水平进行测量，并与基线进行比较以预测治疗结果。
在一些实施方案中，提供通过下述来预测治疗结果或患者应答的方法：测量与一种或多种生物标志物抗原或其组合反应的抗体的基线和治疗诱导的水平，并将该信息与鉴定为患者健康或响应的预测因素的其它参数组合，以得到治疗结果的最终预测。其它参数包括但不限于：整体患者健康、肿瘤大小，肿瘤分期或等级(例如格里森评分、AJCCTNM分期、Whitmore-Jewett分期、Nottingham分级系统)；PSA水平、骨损伤的存在、二磷酸盐的使用、乳酸脱氢酶水平、血细胞比容水平、年龄、营养、流动性、强度、能量、身体活动、情绪、认知或者特定患者中并存病的存在。其它参数还可以包括针对CASAI或细胞特异的主动免疫疗法治疗中所利用的靶标癌症抗原的免疫应答的度量。例如，CD54上调或与治疗中利用的靶标癌症抗原反应的抗体的水平，例如PAP-GM-CSF反应性IgG水平或PAP反应性IgG水平。
本领域技术人员将会理解，反应性抗体水平的其它组合和/或除本文明确教导的那些之外的其它参数可用于患者治疗结果的预测、响应治疗的患者的鉴定或者适合用作癌症疫苗抗原的抗原的鉴定。此外，理解本发明不限于明确教导的那些组合。
IV.生物标志物抗原
本文提供了预测患者中癌症免疫疗法治疗的治疗结果的生物标志物抗原。例如，通过CASAI治疗产生针对驻留型肿瘤细胞的强免疫应答的患者可以显示出抗原扩散。此类患者在其血清中可以显示出增加水平的与CASAI疗法中利用的特异性抗原(例如PAP-GM-CSF)以及其它决定簇(如肿瘤中存在的其它抗原)都反应的抗体。检测到增加水平的与CASAI疗法中利用的抗原和/或肿瘤中存在的其它抗原反应的抗体可以指示阳性治疗反应。类似地，与此类生物标志物抗原反应的抗体的高水平或相对于基线增加的水平可以预示用免疫调节剂进行治疗的患者中的阳性治疗反应。此外，在针对癌症免疫疗法的应答中增加且与阳性治疗反应相关的反应性抗体水平可以指示，在相同或不同的患者中，与此类反应性抗体结合的生物标志物抗原是癌症免疫疗法(例如CASAI)的良好的靶标癌症抗原。
生物标志物抗原包括患者在针对癌症免疫疗法治疗的应答中对其产生反应性IgG的任何抗原。生物标志物抗原还包括在针对癌症免疫疗法治疗的应答中其反应性抗体水平的变化预示治疗结果的那些抗原。例如，可以通过下述鉴定生物标志物抗原：获得与任何内源或异源蛋白或其它抗原反应的抗体的基线水平；用本领域已知的任何癌症免疫疗法治疗患者，测量与在针对所述治疗的应答中测试的抗原反应的抗体水平的变化；记录患者的治疗结果；以及确定与特定生物标志物抗原或生物标志物抗原的组合反应的抗体水平的任何变化是否预示治疗结果。在一些情况下，可以以高通量的方式(例如利用蛋白微阵列或荧光珠技术)确定候选生物标志物，并利用较低通量分析如ELISA确认。确认可以包括使用本领域已知的标准统计方法，包括本文所述的那些。
在一些情况下，通过参照建立的癌症通路图来选择预先确定的生物标志物抗原。例如，京都基因与基因组百科全书(KEGG)提供了涉及下述的基因资源：结直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、急性髓细胞性白血病、基底细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌以及非小细胞肺癌。类似地，Ingenuity提供了鉴定对不同类型的癌症的发展重要的基因产物的癌症信号通路数据库。可将与特定的癌症通路相关的在这些图或通路中鉴定的一种或多种基于产物或其组合用作生物标志物抗原，所述生物标志物抗原用于监测针对癌症类型的癌症免疫疗法治疗的治疗反应，或用于预测来自针对癌症类型的癌症免疫疗法治疗的治疗结果。
可选地，可以利用癌细胞mRNA表达的高通量测量来鉴定候选生物标志物抗原。例如，Tayloretal.,2010报道了在前列腺癌细胞中过表达的基因。可将相应的基因产物用作候选靶标，所述靶标用于将与这些候选物中的一种或多种或其组合反应的基线抗体水平与针对用于前列腺癌的癌症免疫疗法治疗的应答中的抗体水平进行比较。
如本文所提供的，预测性的非靶标的生物标志物抗原包括单独的或在任何组合(如本文所述的前述组合中的任何组合)中的下述非靶标的预先确定的生物标志物中的一种或多种：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8或LGALS3。在一些情况下，通过下述对此类抗原进行鉴定：对一组候选抗原进行测试以确定候选抗原中的一种或多种的反应性抗体水平的增加的测量是否能够预测针对主动免疫疗法的阳性应答。本文提供了示例性候选抗原LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2和LGALS8以及它们在癌症中报道的作用的简要描述：
LGALS3：可溶性半乳糖苷结合凝集素3(半乳凝素-3)：具有不同表达的多功能凝集素LGALS3(Newlaczyl,etal.,2011；Perillo,etal.,1998)已知在细胞粘附、迁移(San,etal.,2000)和前列腺癌进展(Newlaczyl,etal.,2011；Califice,etal.,2004)中发挥作用。它在前列腺肿瘤中高表达，且在激素抗性肿瘤中表达降低(Laderach,etal,2013)。LGALS3在细胞质/细胞核表达模式中的改变与前列腺癌进展相关(vandenBrule,etal.,2000)。LGALS3敲低导致裸鼠前列腺中降低的细胞迁移、入侵、细胞增殖以及肿瘤生长(Wang,et.al.,2009)。其被报道为促血管生成分子以及血管内皮生长因子(VEGF)-和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-介导的血管生成反应的介质(Markowska,etal.,2010)。LGALS3是K-Ras的结合伴侣，并激活K-Ras介导的信号转导(Elad,etal.,2004；Shalom-Feuerstein,etal.,2005)。它被c-Abl磷酸化，该过程受PTEN调节(Balan,etal.,2012)；天然的而非磷酸化形式的LGALS3被PSA剪切(Balan,etal.,2012)，可能改变受体介导的信号转导。
KRAS：v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物：K-Ras是哺乳动物Ras蛋白家族的成员。K-Ras的致癌激活突变或异常表达涉及不同的恶性疾病，包括前列腺癌。在转移性前列腺肿瘤中，32％显示出K-Ras突变或过表达(Taylor,etal.,2010)，以及90％显示出Ras/Raf信号通路的激活(Taylor,etal.,2010)。
ERAS：胚胎干细胞表达的Ras：E-Ras是小GTP酶Ras蛋白家族的成员。E-Ras最初仅在胚胎干细胞(ES)中发现，它在移植的ES细胞转变被畸胎瘤中发挥重要作用(Takahashi,etal.,2003)。在胃癌中，它在约40％的肿瘤中表达(如通过免疫组织化学所确定的)；发现表达与向肝脏(p<0.0001)和淋巴结(p<0.05)的转移显著相关(Kubota,etal.,2010)。还未在前列腺癌背景中表征E-Ras。
KLK2/hK2：激肽释放酶相关肽酶2：KLK2主要在前列腺组织中表达(Darson,etal.,1999)，并且负责将前前列腺特异性抗原(PSA)剪切为其酶活形式(Williams,etal.,2010)。它在前列腺肿瘤细胞中高表达，并且可能是前列腺癌风险和检测的标志物(Nam,etal.,2006；Nam,etal.,2003；Magklara,etal.,2000；Helo,etal.,2009；Raaijmakers,etal.,2007)。PSA和KLK2都由前列腺中相同的分泌上皮细胞产生，并且KLK2在分化不良的癌细胞中高表达(Rittenhouse,etal.,1998)。
1.1.9LGALS8(半乳凝素-8)：可溶性半乳糖苷结合凝集素8(半乳凝素-8，前列腺癌肿瘤抗原1[PCTA-1])：通过表面表位作图和表达克隆，LGALS8最初被鉴定为前列腺癌肿瘤抗原(Su,etal.,1996)。它在肿瘤组织中广泛表达，包括前列腺肿瘤的所有TNM(肿瘤-淋巴结转移)分期(Laderach,etal.,2013)。在用GVAX疗法(由两种同种异体前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3组成的全细胞前列腺癌疫苗，其被修饰以分泌GM-CSF)进行治疗后的转移性前列腺癌患者中观察到了针对LGALS8的抗体应答(Nguyen,etal.,2010)。
在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原可以包括PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF中的任何1、2、3、4、5、6、7或8种。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原可以包括PSA以及KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF中的任何1、2、3、4、5、6或7种。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原可以包括ERAS以及PSA、KLK2、KRAS、LGALS8、LGALS3、PAP、PAP-GM-CSF中的任何1、2、3、4、5、6或7种。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原可以包括KRAS以及PSA、KLK2、ERAS、LGALS8、LGALS3、PAP或PAP-GM-CSF中的任何1、2、3、4、5、6或7种。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原可以包括PSA、ERAS、KRAS、LGALS8、LGALS3、PSA、PAP或PAP-GM-CSF中的至少两种。
在一些实施方案中，预先确定的生物标志物抗原是非靶标的预先确定的生物标志物抗原。在一些情况下，预先确定的生物标志物抗原是靶标癌症抗原与一种或多种非靶标的预先确定的生物标志物抗原的组合。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原选自KLK2、KRAS、ERAS、PSA、LGALS3以及LGALS8。在一些情况下，非靶标的预先确定的生物标志物抗原是下述非靶标的预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种、任何两种、任何三种、任何四种或任何五种：PSA、LGALS3、KRAS、ERAS、KLK2或LGALS8。
V.统计方法
本文提供了用于鉴定和确认生物标志物的统计方法，所述生物标志物用于(i.)鉴定响应CASAI治疗的患者，(ii.)预测阳性治疗结果，以及(iii.)其它CASAI治疗方法。本文还提供了利用测量的反应性IgG水平的变化以产生预测的治疗结果的统计方法。
A.用于鉴定和确认生物标志物并预测治疗结果的统计方法
可以利用如(Smyth,etal.,2004；SmythGK,2005)中所述的配对t检验(参数的或非参数的)或其变形(如‘Limma’R/Bioconductor中实施的中等配对t检验)，将在针对癌症免疫疗法治疗的应答中的来自蛋白微阵列(例如ProtoArray)或LuminexxMAP平台的测量的反应性抗体水平与基线抗体水平进行比较，从而产生指示测量的变化显著的统计置信度的t统计值和p值。在一些情况下，可以通过应用某些阈值或启发法(heuristics)，例如通过移除未超过阈值背景水平或不符合统计置信度的阈值(例如不具有0.05或0.05之下的p值)的测量的IgG水平将此类检验的结果进行过滤。类似地，可以从更进一步的随访中移除注解不详(即存在少量或不存在关于蛋白产物或基因功能的信息)的生物标志物抗原。在一些情况下，可针对统计置信度度量实施Benjamini和Hochberg方案，以获得p值的多重检验调整和估计的伪发现率(FDR，在某一p值处估计的伪发现百分比)(Benjamini,1995)。
在一些实施方案中，可以通过LuminexxMAP获得针对一种或多种生物标志物抗原的治疗前和治疗后反应性IgG水平的信号强度(例如log2)，并利用单向配对的威尔科克森符号秩检验进行比较。在一些情况下，可以利用单向威尔科克森秩和检验将治疗后的反应性IgG水平的倍数变化进行比较。在一些情况下，可以利用特定的阈值来定义抗原应答，以便过滤掉统计学上不显著的或者不可能是统计学上显著的变化。例如，在一些情况下，可将针对抗原的“IgG应答”定义为反应性抗体水平从治疗前至治疗后增加至少约1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或更多倍。
可以通过使用Kaplan-Meier分析来观察生物标志物与治疗结果(如总生存期(OS))之间的相关性。Kaplan-Meier分析允许随时间估计生存期，即使当患者退出或者被研究了不同长度的时间。在Kaplan-Meier分析中，根据各先前时间间隔的生存的累积概率来估计生存至给定时间点的概率。在一些情况下，然后可将通过Kaplan-Meier分析所显示的影响生存累积概率的变量聚集，以鉴定任何特定组(例如具有特定的生物标志物反应性IgG水平改变的那些)是否与更好的阳性治疗结果相关(例如与更长的总生存期相关)。
可选地或此外，如果存在足够数量的数据点，则可以利用Cox比例风险模型对反应性抗体水平或反应性抗体水平的组合与阳性治疗结果之间的相关性进行检验。在一些情况下，可以利用所有已知的变量，即利用“全模型”(例如反应性抗体应答(例如高、低或无应答)、PSA水平、乳酸脱氢酶水平、骨损伤、格里森评分、二磷酸盐的使用等)来进行Cox比例风险模型分析。该全模型可以提供用于拒绝零假设的p值(例如用于拒绝抗体应答与增加的总生存期无关的假设的p值)。全模型还可以提供风险比估计。风险比在1之下指示解释变量(例如针对治疗的反应性抗体应答)与更长的总生存期相关。
也可以在无抗体应答状态的情况下实施Cox比例风险模型分析，即在无指示抗体应答的变量的情况下，利用包括预后和临床因素(例如PSA水平、乳酸脱氢酶水平、Gleason评分等)的“基础模型(basemodel)”。可以利用具有1的自由度的卡方统计，用似然比检验将基础模型与全模型进行比较。这可以提供指示解释变量(例如针对治疗的反应性抗体应答)是否提供了预测结果的统计学显著的改善的p值。
在一些实施方案中，可以利用基于Cox比例风险模型的双向Wald检验对IgG水平或IgG应答的治疗前与治疗后的变化和总生存期(OS)之间的相关性进行分析。例如，可以利用(i)从治疗前至治疗后的血清IgG水平的倍数变化(log2)；和(ii)IgG应答状态(是/否)，利用根据基线风险因素(如PSA和乳酸脱氢酶(LDH)水平)调整的单变量或多变量模型对相关性进行评估。可以根据癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)的其它分析中使用的建模方法选择基线PSA(log10)和LDS(log10)值，用于多变量模型(Kantoff,etal.,2010；Sheikh,etal.,2013)。
VI.系统
下文提供的是对可以用于上文所述的系统和方法的一些装置(和那些装置的组件)的描述。这些装置可以用于，例如通讯、处理和/或存储与上文所述的任何功能性相关的数据。本领域普通技术人员将会理解，下文所述的装置可能仅具有下文所述的组件中的一些或者可能具有其它组件。
图6A描述了根据一实施方案的管理系统的示例框图，所述管理系统被配置为确定癌症患者对癌症免疫疗法(如用靶标癌症抗原进行的癌症抗原特异的主动免疫疗法(CASAI)治疗)的治疗反应。在示例的实施方案中，系统900包括通过网络910与多个数据源905连接的计算机系统915。本文所述的技术不限于任何特定类型的计算机系统或计算机网络。例如，网络915可以是局域网(LAN)、广域网(WAN)、无线网、总线连接、互连线，或者跨越电子系统中的一个或多个传输线或痕迹的通讯数据或控制信息的任何其它方式。例如，可以在与计算机系统915直接相连的用户界面手动接收数据源。其它实施方案是可能的。
计算机系统915包括处理器901和经互连总线908连接在一起的系统存储器904。在其它实施方案中，处理器901和系统存储器904可以直接互连，或者可以通过一个或多个中间组件或单元间接相连。处理器901和系统存储器904可以是本领域已知的任何通用或专用组件，并且不限于任何特定类型的处理器或存储器系统。系统存储器可被配置存储系统和控制数据，以用于本文所述的实施方案中。计算机系统915还可以与数据库935(内部或外部)连接以接收数据。
计算机系统915在通信接口920处接收来自不同源的输入数据903。计算机系统915对接收的数据进行处理，并通过输出模块925在它的输出处提供得到的数据。在优选实施方案中，计算机系统接收代表基线抗体水平的第一组数据值，并向比较引擎930提供那些值。计算机系统可以接收代表治疗后抗体水平的第二组数据值，并向比较引擎930提供那些值。比较引擎930可被配置为将治疗前抗体水平与治疗后水平进行比较，以确定是否存在由所述治疗导致的抗体水平的变化。
特别地，比较引擎930可被配置为将第一组数据值中接收的基线抗体水平的每一数值与第二组数据值中治疗后抗体水平的对应数值进行比较，以确定他们是相等还是不同。在一实施方案中，如果通过比较引擎930确定了两个数值之间的差异，则可以通过所述比较引擎显示指示此差异的信号。类似地，在可选实施方案中，如果确定所述两个数值是相等的，则可以通过所述比较引擎显示指示此相等的信号。在另一实施方案中，如果确定与预先确定的抗原反应的治疗后抗体水平高于或显著高于基线抗体水平，则通过所述比较引擎显示这样的信号。在另一实施方案中，如果确定与预先确定的抗原反应的治疗后抗体水平未高于或确定未显著高于基线抗体水平，则通过所述比较引擎显示这样的信号。在一些情况下，显著性的阈值可以是统计值，例如如果测量的数值满足统计截止值如特定的t值或p值，例如p≤0.05，则抗体水平显著更高。在其它情况下，显著性的阈值可以是基于经验确定的数值。例如，在一些情况下，如果基线与治疗后抗体水平相差约1.1、1.2、1.5、2、2.5、3、5、7、10倍或更多倍，则比较引擎将它们鉴定为不同。
可以利用专门设计的计算机硬件或电路或者由专门设计的软件模块或组件编程的通用的计算硬件，或者硬件和软件的任何组合来实施比较引擎930。本文所述的技术不限于硬件电路或软件的任何特定组合。例如，比较引擎930可以包括现成的比较器电路组件或专门设计的路比较器电路。如技术人员所充分理解的，比较器电路被配置为将两个或更多个数值进行比较，以及输出指示两个数值是否相等或不相等的结果。可选地，可以在存储器904中存储的软件中实施比较功能，并通过处理器901执行。
图6B描述了根据一实施方案，用于确定癌症患者对癌症免疫疗法的治疗反应的方法的示例流程图，所述癌症免疫疗法如细胞特异的主动免疫疗法、用免疫调节剂进行的治疗或者用靶标癌症抗原进行的(CASAI)治疗。在示例的实施方案中，方法900在操作950处开始，其中在计算机系统的通信接口处接收第一组电子数据信号。第一组电子数据信号代表一组相关的治疗前数值，各治疗前数值指示治疗前与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平。在一实施方案中，治疗是用靶标癌症抗原进行的CASAI，并且预先确定的生物标志物抗原选自：(1)包括所述靶标癌症抗原和一种或多种其它预先确定的生物标志物抗原的生物标志物抗原，或(2)不包括所述靶标癌症抗原的生物标志物抗原。
方法900在操作951处继续，其中可以由指示CASAI治疗前与一种或多种预先确定的生物标志物抗原反应的基线抗体水平的治疗前数值组来确定参照抗体水平值组。所述参照抗体水平值组可以用作特定患者的基线抗体水平。在一实施方案中，计算机系统自动确定治疗前的参照数值组。在其它实施方案中，参照数值组可以手动录入系统(例如通过医学专业人员)。例如，在计算机系统初始化时，所述系统可以被指向，例如从系统存储器904或者利用查询数据库935检索治疗前数值组，以及向比较引擎930提供那些数值以用于分析。在其它实施方案中，计算机系统接收其它输入以从治疗前数值组获得参照数值组。然后系统可以提供一组输出数据信号，所述信号代表治疗后数值组中的哪些数值已经从治疗前数值组发生了改变。例如，系统可以确定治疗前数值中的哪些数值已经增加。在至少某些实施方案中，相对于其基线水平，与预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体水平的增加可以预测针对治疗的阳性治疗反应。在其它实施方案中，相对于其基线水平，与预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体水平的增加可以提供适合用于CASAI治疗的靶标癌症抗原。
通过下述继续方法900：在通信接口处接收代表一组与治疗前数值组相对应的治疗后数值的第二组电子数据信号通信接口，各治疗后数值指示来自用癌症免疫疗法进行治疗之后的患者血液样品的，与预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体水平。然后可将治疗前数值与治疗后数值进行比较(操作953)，以确定治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变。可选地，如果在操作951处确定参照数值组，则可将参照组与治疗后数值进行比较。然后系统可以提供一组输出数据信号，所述信号代表治疗后数值组中的哪些数值从治疗前数值组发生了改变。例如，系统可以确定治疗前数值组中的哪些数值已经增加。在另一实例中，系统可以利用例如统计截止值来确定治疗前数值中的哪些数值显著增加。在至少某些实施方案中，相对于其基线水平，与预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体水平的增加可以预测针对治疗的阳性治疗反应。在一些实施方案中，可将与预先确定的生物标志物抗原中的一种或多种反应的抗体水平相对于其基线水平的改变输入风险模型中，如本文在等式(1)中所述的Cox比例风险模型，以预测治疗结果或者提供治疗反应的度量。在一些情况下，在与比较基线与治疗后反应性抗体水平相同的系统上实施比例风险的计算。这完成了根据一示例实施方案的方法900。
应当理解，图6B中显示的具体操作描述了用于在IT环境中监测事件的方法的具体实施方案。在可选实施方案中也可以实施其它操作顺序。例如，可选实施方案可以以不同的顺序来实施上文概述的操作。此外，单个操作可以包括可视情况以不同顺序实施的多个子步骤，并且根据具体应用可以添加或去除其它操作。本领域普通技术人员会认识到多种可能的变型、修改和替代方案。
图7描述了数据处理系统的示例框图，通过所述系统可以实施公开的实施方案。可以用不同的计算机系统配置来实践本发明的实施方案，如手持设备、微处理器系统、基于微处理器的或可编程的用户电子产品、小型计算机、大型计算机等。还可以在分布式计算环境中实践实施方案，其中通过经基于电线的或无线网络连接的远程处理设备来执行任务。
图7显示了可以与本发明描述的实施方案一起使用的数据处理系统的一个实例，如数据处理系统1000。注意虽然图7阐明了数据处理系统的多个组件，但是其并不意图表示互连组件的任何特定结构或方式，因为此类细节与本文所述的技术无密切关系。也将理解，还可以使用网络计算机和具有较少组件或者可能更多组件的其它数据处理系统。图7的数据处理系统可以是，例如个人计算机(PC)、工作站、平板电脑、智能电话或其它手持无线装置或具有相似功能的任何装置。
如所显示的，数据处理系统1001包括与微处理器1003连接的系统总线1002、只读存储器(ROM)1007、易失性随机存取存储器(RAM)1005以及其它非易失性存储器1006。在示例的实施方案中，微处理器1003与高速缓冲存储器1004连接。系统总线1002可以适用于将这些不同的组件互连在一起，以及将组件1003、1007、1005和1006与显示控制器和显示装置1008以及外围装置互连，所述外围装置如输入/输出(“I/O”)装置1010。I/O装置的类型可以包括键盘、调制解调器、网络接口、打印机、扫描仪、摄影机或本领域熟知的其它装置。通常，I/O装置1010通过I/O控制器1009与系统总线1002连接。在一实施方案中，I/O控制器1009包括用于控制USB外围装置的通用串行总线(“USB”)适配器或其它类型的总线适配器。
RAM1005可被实施为连续需要电源以更新或保持存储器中的数据的动态RAM(“DRAM”)。其它非易失的存储器1006可以是磁性硬盘驱动器、磁性光驱、光驱、DVDRAM或在从系统中移除电源之后保持数据的其它类型的存储器系统。虽然图7显示了作为与数据处理系统中的其余组件连接的局部装置的非易失的存储器1006，技术人员将会理解，描述的技术可以使用远离系统的非易失的存储器，如通过网络接口(如调制解调器或以太网接口(未显示))与数据处理系统连接的网络存储装置。
考虑到这些实施方案，根据该说明书，显而易见的是可将描述的技术的方面，至少部分体现于软件、硬件、固件或其任何组合中。还应当理解，实施方案可以应用不同的涉及存储于数据处理系统中的数据的计算机执行功能。换言之，可以在响应执行存储器中存储的指令序列的计算机或其它数据处理系统中实施所述技术。在不同的实施方案中，可以独立地或者与软件指令组合使用硬连线电路，以实施这些技术。例如，可以通过包含用于实施操作的硬连线逻辑的特定硬件组件或者通过定制的硬件组件或编程的计算机组件的任何组合来实施所述的功能。本文描述的技术不限于硬件电路和软件的特定组合。
本文的实施方案还可以是存储于体现在计算机硬件或计算机程序产品的计算机可读存储介质上的计算机代码的形式。计算机可读介质可以适用于存储计算机程序代码，根据本文所述的技术，当所述代码被计算机或其它数据处理系统(如数据处理系统1000)执行时，适用于使系统执行操作。计算机可读介质可以包括以数据处理装置可获取的形式存储信息的任何结构，所述数据处理装置如：计算机、网络装置、平板电脑、智能电话或具有类似功能的任何装置。计算机可读介质的实例包括能够在其上存储信息的任何类型的有形制品，如硬盘驱动器、软盘、DVD、CD-ROM、磁性光盘、ROM、RAM、EPROM、EEPROM、闪存及其等同物、磁卡或光卡或者适合存储电子数据的任何类型的介质。计算机可读介质也可以分布于网络连接的计算机系统中，所述介质可以以分布式的方式存储或执行。
在此，将本说明书中引用的全部出版物和专利申请以引用的方式并入，如同明确且单独指出将各单独的出版物或专利申请以引用的方式并入。
尽管已经通过示例的方式和为清晰理解的目的的实例详细描述了上述发明，但根据本发明的教导，在不脱离所附的权利要求的精神或范围的情况下，可以对其作出某些改变和修改，这对本领域技术人员将是显而易见的。
实施例
下述实施例仅以示例说明的方式而非限制性的方式提供。技术人员将会容易地认识到能够改变或修改以获得基本类似的结果的多种非关键参数。
实施例1：患者的Sipuleucel-T治疗
PA2024是由Dendreon公司(Seattle,Wash.)制备的含有PAP和GM-CSF序列的专利重组融合蛋白，其用于研究细胞免疫疗法Sipuleucel-T。PA2024在杆状病毒/Sf21系统中表达。
根据由合适的研究审查委员会批准的研究者发起的方案收集所有受试者和健康供体样本。收到知情同意之后，通过机采收集白血细胞，并准备进行运输和/或处理。将受试者的机采细胞离心，以移除自体血浆，然后将其在0.9％氯化钠USP溶液中重悬，并通过1.077g/ml重力的的浮力密度溶液(BDS)。收集接触面的细胞，并在0.9％氯化钠USP溶液中洗涤，洗涤之后使其通过BDS1.065g/ml重力分离溶液。然后收集通过密度溶液的细胞，并在0.9％氯化钠USP溶液中洗涤。将这些名为BDS65细胞的细胞与PA2024一起在
实施例2：利用蛋白微阵列分析针对Sipuleucel-T疗法的体液应答
A.用于利用ProtoArray，发现Sipuleucel-T治疗之后的IgG应答的样品
可从IMPACT提供知情同意的共224名患者获得治疗前和治疗后血清样品(Kantoffetal.,2010；Sheikhetal.,2013)；155名处于Sipuleucel-T组，以及69名处于对照组。从患者中收集血清样品，仅截至目标疾病进展时为止(Kantoffetal.,2010)；因此，在较早时间点比在较晚时间点获得来自更多患者的样品。在IMPACT中，血清样品对可被如下评估：(i)治疗前和第2周，n＝204(142名Sipuleucel-T患者和62名对照患者)；(ii)治疗前和第10周，n＝132(93名Sipuleucel-T，39名对照)；以及(iii)治疗前和第22周，n＝76(60名Sipuleucel-T，16名对照)。
当进行ProtoArray分析时，从IMPACT中Sipuleucel-T组的47名患者以及对照组的13名患者可获得来自治疗前和所有3个治疗后时间点的血清样品。对来自对照组的所有13名患者和来自Sipuleucel-T组的随机选择的28名患者的子集的样品进行ProtoArray分析(以确保成功分析来自各时间点的大致25份样品)。清除失败的分析和阵列质量对照之后，可获得来自下述患者的ProtoArray数据进行分析：(i)治疗前和2周，25名Sipuleucel-T和12名对照，(ii)治疗前和10周，24名Sipuleucel-T和11名对照，(iii)治疗前和22周，24名Sipuleucel-T和13名对照。
B.蛋白微阵列分析，阵列数据QC&标准化
ProtoArrayv5.0(LifeTechnologiesCorporation)(Wolchocketal.,2009；Madanetal.,2010；Kantoffetal.,2010；Hodietal,2010；以及Hoosetal.,2010)使用利用来自Invitrogen的UltimateTMORF(开放阅读框)集合或来自由Protometrix开发的激酶克隆
利用GenePix6.0软件将阵列列表文档中的人蛋白定位于具有130μm(直径)的固定特征尺寸的各阵列图像上。在利用来自AlexaFluor缀合的斑点和各子阵列中印刷的鼠抗体将阵列对齐之后，通过GenePix软件调整特征大小以与特征最佳匹配。利用软件确定阵列中各斑点的像素强度，并保存至文档。利用LifeTechnologyProtoArrayProspector软件处理所有量化的点文档，以确定哪个蛋白与样品相互作用。所述软件利用微阵列上的合适的对照点，进行背景校正和鲁棒线性模型标准化(RLM)(Hoosetal.,2012)。
分析之前，过滤掉微阵列上在所有样品中具有低强度的信号以及来自不具有已知的GenBank标识符(即靶蛋白注解不详或未注解)的靶抗原的那些信号。这在ProtoArray上留下针对7,221种蛋白亚型的IgG测量，对应于6,255种独特靶抗原，其中用其进行所有后续分析。
C.统计分析
在‘R’计算环境中实施统计分析(cran.us.r-project.org/)。统计检验是双向的，除非另外指明。报道了相对于治疗前的血清IgG水平的变化(例如“在第10周IgG水平的倍数变化”指在第10周的IgG水平与治疗前水平的比例)。
为了评估治疗前至治疗后IgG水平变化的统计显著性，利用中等配对t检验(limma,R/Bioconductor)(SmythGK,2005)对来自ProtoArray分析的标准化的信号强度(log2)进行检验。使用Benjamini和Hochberg方案来实施p-值的多重检验校正，并获得估计的伪发现率(FDR，在某一p值处估计的伪发现百分比)(BenjaminiYH,1995)。
为了评估治疗之后IgG水平的增加，利用单向配对的威尔科克森符号秩检验将来自LuminexxMAP的治疗前和治疗后信号强度(log2)进行比较。为了评估Sipuleucel-T组中治疗之后IgG水平的倍数变化是否高于对照组，利用单向威尔科克森秩和检验将来自两组的数值进行比较。针对抗原的‘IgG应答’被定义为与治疗前相比，治疗后信号强度增加≥2倍(特定阈值)。
D.配对的治疗前/治疗后比较，以确定Sipuleucel-T诱导的体液应答
为了鉴定在针对治疗的应答中诱导的IgG抗体，利用蛋白微阵列，利用经常与微阵列数据一起使用的中等配对t检验(Limma)将治疗前&治疗后血清样品进行比较(SmythGK,2004)。在配对分析之前，清除下述抗体：(i)经过三个治疗后时间点，至少5％的Sipuleucel-T组样品中，表达未超过阵列的背景信号，具有0.05的p值，和(ii)针对微阵列上的靶标没有已知的Refseq注解(即靶蛋白注解不详)。这留下了7,221种抗体，其中用其实施所有的下游分析。
相对于治疗前组，Sipuleucel-T治疗后组中上调2倍(其中Benjamini和Hochberg估计的FDR≤10％)的抗体编号分别为第6、14和26周的56、162和23。相对于治疗前组，Sipuleucel-T治疗后组中上调3倍(其中Benjamini和Hochberg估计的FDR≤10％)的抗体编号分别为第6、14和26周的4、7和4。安慰剂治疗后没有抗体上调(其中估计的FDR≤10％)。各治疗后时间点的前30种抗体靶标(相对于治疗前，治疗后具有最高的倍数上调，其中估计的FDR≤10％)在表1中给出。PAP(或ACPP)是在所有治疗后时间点前30种抗体靶标中的一种。已经证明一些在前的靶标在前列腺癌疾病进展中有直接作用(如LGALS3或半乳凝素-3(Wang,etal.,2009；Merseburger,etal.,2008；vandenBrule,etal.,2000)、ECE1或内皮素转化酶1(Whyteside,etal.,2010；Lambert,etal.,2008；Dawson,etal.,2006；Kopetz,etal.,2002)、ANPEP或氨肽酶N(Guzman-Rojas,etal.,2012；Larkin,etal.,2012；Pasqualini,etal.,2000))。
表1A：前30种第6周上调的抗体靶标(ACPP加粗标示)。列给出的是：protoArray斑点位置标识符；基因符号；基因名称；在中等配对t检验中，相对于BASIM，治疗后的总倍数变化；来自配对t检验的t统计值；配对t检验中的p值和调整的(多重检验校正的)p值(Benjamini和Hochberg)；以及抗体被上调2倍或更多倍的个体数量，其中强度差异为至少1000。
表1B：前30种第10周上调的抗体靶标(ACPP加粗标示)。列定义参见表1A。
表1C：前30种第22周上调的抗体靶标(ACPP加粗标示)。列定义参见表1A。
在前的靶标未在已知的癌症/睾丸抗原家族之中(Scanlan,etal.,2004)(如NY-ESO-1或MAGE、GAGE、PAGE、LAGE家族)。对于此观察结果可能有几方面原因。如较前所指出的，对由标准(激素和辐射(Nesslinger,etal.,2007))以及免疫疗法(Nesslinger,etal.,2010；Kwek,etal.,2012；Nguyen,etal.,2010)诱导的自身抗体应答的研究已经显示，治疗后诱导的免疫应答可能针对先前在文献中未作为癌症抗原进行表征的靶标。此外，大部分众所周知的癌症/睾丸抗原都是利用cDNA文库和来自癌症患者并且不是治疗后背景的血清样品发现的。可能的是，在治疗背景中，产生了针对不是通过癌症患者的筛选所通常鉴定的新抗原的免疫应答。在由治疗所诱导的增强的炎症状态中，在肿瘤细胞死亡增加的背景下可能产生治疗后的应答，这诱导针对通常识别为自身的自身抗原的应答。
注意，ProtoArray上不存在三组最常引用的前列腺抗原，即PSA，PSMA和PSCA，PSMA和PSA。存在PSCA，但是针对PSCA的抗体在Sipuleucel-T治疗后未显著上调。
E.癌症信号通路中的Sipuleucel-T治疗后抗体靶标的富集
对Sipuleucel-T治疗之后，针对癌症相关信号通路中的靶标产生的抗体的富集进行检测。此类富集支持治疗后肿瘤组织破坏和针对癌症抗原的免疫应答的启动的假说。利用KEGG(Kanehisa,etal.,2012)和Ingenuity(IPA)知识库(www.ingenuity.com/products/pathways_analysis.html；www.ingenuity.com/science/knowledge_base.html)来检查治疗后上调的抗体靶标的前10％(～720种倍数变化的靶标，其中FDR≤10％)中癌症相关通路中的基因或靶标的富集。经验性地(对于KEGG通路，10,000次自助抽样)或利用费舍尔精确检验(对于Ingenuity知识库中的通路)确定富集。对于费舍尔精确检验，背景组(或抽样‘总体’)是与ProtoArray平台上展示的靶标组交叉的IPA知识库中的全部基因。
对于KEGG前列腺癌通路(经验性p值0.003，基于来自ProtoArray的与前10％(即～720)列表相似大小的随机靶标列表的10,000次抽样)、KEGGVEGF信号通路(经验性p值0.005)以及KEGGmTOR信号通路(经验性p值0.006)中的基因而言，富集了第10周的抗体靶标。已知VEGF活性与前列腺癌生长和成骨细胞的骨转移相关(Aragon-ChingJB,etal.2010；DaiJ,etal.2004)。通常通过PTEN的丢失，PI3K/Akt/mTOR信号转导在30-50％的前列腺癌中上调，并且与增加的肿瘤分期、等级以及生化复发风险相关(Morgan,etal.,2009)。
F.Sipuleucel-T诱导的抗体靶标显示出针对前列腺肿瘤过表达的基因的富集
对在前列腺肿瘤和正常组织中的基因表达的最大的报道研究(Ribasetal.,2009；Foxetal.,2011)中被报道为在前列腺肿瘤中过表达的基因进行检测，以确定在第10周，针对由此类基因编码的抗原的反应性IgG是否富集。考虑相对于正常的前列腺组织，在至少33％的前列腺肿瘤(原发性和转移性的组合)中过表达的基因，这给出了678种基因的列表。在这678种基因中，152种被展示为ProtoArray上的蛋白产物。对这152种蛋白与在IMPACT中，在第10周，血清IgG水平从治疗前水平增加所针对的抗原的重叠进行评估。100和50个最高度诱导IgG的靶标与这152种产物显著重叠；前100个当中的6个靶标(p＝0.012，超几何检验)和前50个当中的4个靶标(p＝0.013)与152种前列腺肿瘤中过表达的基因产物重叠。
实施例3：Sipuleucel-T治疗后观察到的针对自身抗原的抗体应答的确认
A.背景
在实施例2中，如图2中所示，利用ProtoArray平台广泛评估用Sipuleucel-T进行治疗之后，针对自身抗原的IgG水平的升高。结果显示，治疗后的抗体应答可以靶向前列腺癌信号通路中涉及的蛋白。该实施例利用独立平台，对利用ProtoArray平台鉴定的一些抗体靶标进行了评估。
B.用LuminexxMAP确认针对第二抗原的血清IgG应答
利用独立的分析平台LuminexxMAP确认针对利用ProtoArray鉴定的第二抗原的子集的IgG应答(Pickering,etal.,2002)。我们选择LuminexxMAP，因为它的低样品体积需求、高报告灵敏度、宽线性范围以及多重IgG检测的能力。从用ProtoArray，在第10周观察到的IgG应答所针对的162种第二抗原中选择10种用于确认(表2)。
表2：利用ProtoArray，在来自IMPACT的患者中鉴定的非靶标的候选抗原。
在这10种抗原中，5种对应在治疗后水平上显示出最高倍数增加的IgG(LGALS3、ANPEP、ECE1、FBXO6和CACNG1)；已知LGALS3(Newlaczyl,etal.,2011；Califice,etal.,2004；Laderach,etal.,2013)、ANPEP(Fukusawa,etal.,2006；Larkin,etal.,2012；Sorensen,etal.,2013)、ECE1(Lambert,etal.,2008；Herrmann,etal.,2006；Nelson,etal.,1995；Nelson,etal.,2005)在前列腺肿瘤中以高水平表达或者在前列腺癌发展中具有功能性作用。我们基于在癌症中报道的功能相关性和/或在前列腺肿瘤中增加的表达选择其余的5种抗原；即KLK2(Darson,etal.,1999；Williams,etal.,2010；Rittenhouse,etal.,1998)、ERAS(Kubota,etal.,2010)、KRAS(Taylor,etal.,2010)、TSPAN13(Arencibia,etal.,2009)以及LGALS8(Laderach,etal.,2013；Su,etal.,1996)。ProtoArray数据显示，在较早时间点(第2周)和较晚时间点(第22周)，针对这10种候选第二抗原中的大部分的IgG的水平也升高(表3)。
表3.用ProtoArray所测量的，在IMPACT中，在第2周和第22周，针对候选抗原的IgG水平的增加。
基于下述标准，从ProtoArray数据(实施例2)中选择抗原：
i.在来自Sipuleucel-T与对照组的患者的比较中，用Sipuleucel-T(n＝93)治疗后的IgG水平比用对照(n＝39)有更高的倍数变化，对于比较，p≤0.01。
ii.在Sipuleucel-T治疗的患者(n＝93)中，与治疗前相比，治疗后IgG水平显著增加(p≤0.01)，并且≥10％的患者显示IgG应答(定义为与治疗前相比，治疗后的IgG水平≥2倍的增加)。
通过LuminexxMAP确认Sipuleucel-T诱导的针对下述抗原的IgG水平的增加：PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8以及LGALS3(表4和图3)。
表4.利用LuminexxMAP，确认在IMPACT中，在第10周，针对候选第二抗原的血清IgG应答。
如所期望的，也确认了针对PAP和PA2024的IgG水平的增加。在来自IMPACT中的≥25％(范围：28-44％)的Sipuleucel-T治疗的患者中观察到了针对一些抗原的IgG应答，所述抗原例如PSA、KLK2、KRAS、ERAS和LGALS3。在≥10％(范围：12-15％)的Sipuleucel-T治疗的患者中观察到了抗PSA、抗KRAS或抗ERASIgG水平的5倍的增加。在对照患者中，在治疗之后，针对这些抗原的IgG水平未显著升高(p>0.01，表4)。
为了确定在IMPACT中，在第10周时间点观察到的针对第二抗原的IgG应答是否也发生在其它时间点，对来自IMPACT中其它可获得的治疗后时间点(第2周和第22周)的血清样品进行检测(参见表5A和5B)。
表5A.利用LuminexxMAP，评估在IMPACT中，在第2周，针对候选抗原的IgG应答。
表5B.利用LuminexxMAP，评估IMPACT中，在第22周，针对候选抗原的IgG应答。
在IMPACT中，在第2周(n＝142)和第22周(n＝60)，在Sipuleucel-T组中观察到了针对PSA、KLK2、KRAS、ERAS、LGALS8和LGALS3的IgG水平的显著(p≤0.01)增加。
C.用于验证分析的抗原来源和制备
从OrigeneTechnologies，Invitrogen和SinoBiologicalInc.获得用于验证的抗原。表6中提供了来源于各供应商的抗原列表，以及与用于蛋白产生的克隆和表达细胞系有关的信息。为了评估分析对于蛋白表达系统或纯化标签的依赖性的目的，利用多种表达系统和纯化标签来制备一些蛋白(即PAP、KRAS、ERAS、KLK2；表6)。
表6.LuminexxMAP分析中使用的蛋白试剂。
D.血清样品评估
对于LuminexxMAP分析，可从下述患者中获得来自IMPACT临床研究的血清样品对：(i)治疗前和第2周，n＝204(142名Sipuleucel-T和62名对照患者)；(ii)治疗前和第10周，n＝132(93名Sipuleucel-T，39名对照)；以及(iii)治疗前和第22周，n＝76(60名Sipuleucel-T，16名对照)。
E.利用Luminex
利用LuminexxMAP，通过LifeTechnologiesCorporation评估针对候选抗原的IgG水平，所述LuminexxMAP使用多种抗原缀合的、光谱可区别的荧光(Pickering,etal.,2002)。对来自IMPACT患者的所有可获得的治疗前和治疗后血清样品对进行评估。利用与珠子结合的抗GST抗体将GST标记的蛋白与珠子缀合，并且非GST标记的蛋白直接(共价地)与珠子缀合。以1:200稀释来分析血清样品(30mL)。用捕获的抗原和实验样品并行进行蛋白信号分析和对照分析(阴性和阳性)。将被珠子直接捕获的BSA和抗GST缀合的珠子上捕获的GST用作阴性对照。在评估的样品中，针对BSA的IgG的中值荧光强度<100，并且针对GST的中值荧光强度<500，指示低背景信号。阳性对照包括抗人IgG(以指示分析的样品中血清的存在)和人IgG(以指示二抗的存在)。
在分析之前，将来自LuminexxMAP的所有信号都进行log2转换。最初一式三份来分析患者血清样品的子集(n＝120)，以评估平台的技术再现性。在一批次中，对于各评估的抗原而言，三组样品的中值变异系数(CV)很低(<5％)。因此，剩余的血清样品与对照一起在一次运行中进行分析。为了避免批次影响，用相同量的抗原缀合珠子运行来自患者的治疗前和治疗后血清样品。
F.来自IMPACT的Sipuleucel-T组中的血清IgG应答者间的重叠
为了确定Sipuleucel-T治疗的患者是否共有针对同样的第二抗原的IgG应答，我们对IgG应答者之间的重叠进行了评估(对于代表性实例，参见图3B中的文氏图，以及对于细节，参见表7)。具有针对第二抗原的IgG应答的大部分Sipuleucel-T治疗的患者与那些具有针对PAP的IgG应答的患者重叠(图2B，左)。在针对多种不同的第二抗原(例如ERAS和KLK2，或者LGALS3和KRAS，p≤0.01，超几何检验)的IgG应答者中也观察到了显著的重叠。例如(在2B中，右)，当考虑针对PSA、ERAS、LGALS8和LGALS3的IgG应答时，25％(23/93)的Sipuleucel-T治疗的患者显示出针对所述相同抗原中的三种或更多种的应答，以及9％显示出针对这些抗原中全部四种的应答。在这种情况下，根据所述抗原，少数(≤30％)IgG响应是独特的(即不与针对其它抗原的IgG应答重叠)。
表7.IMPACT的Sipuleucel-T组中，在第10周，为针对不同抗原的IgG应答者的患者数量的重叠。
跨越治疗后时间点，Sipuleucel-T诱导的IgG应答在很大程度上是一致的。来自在第10周具有针对抗原的IgG应答的IMPACT中的Sipuleucel-T组的患者，在较早(第2周)和较晚(第22周)时间点，通常表现出针对相同抗原的IgG应答(p≤0.01，超几何检验，表8和9)。
表8.跨越第2周和第10周治疗后时间点的IgG应答的重叠。
表9.跨越第10周和第22周时间点的IgG应答的重叠。
G.IMPACT中，Sipuleucel-T诱导的血清IgG水平的变化与OS的相关性
利用多变量Cox模型，在IMPACT中，对在第10周，Sipuleucel-T诱导的IgG水平的变化与OS的相关性进行评估，针对基线PSA和LDH水平而调整。Sipuleucel-T诱导的抗PSAIgG(风险比[HR]＝0.63，95％CI0.46，0.86；p<0.01)和抗LGALS3IgG(HR＝0.60，95％CI0.38，0.96；p＝0.04)水平的变化与增加的OS显著相关(图4，表10)。Sipuleucel-T诱导的抗KLK2IgG和抗ERASIgG水平的变化显示，趋向与增加的OS相关(0.05<p<0.1)。
表10.血清IgG水平倍数变化的log2与OS的相关性。
在Sipuleucel-T组中，针对PSA(应答者n＝36，非应答者n＝57；HR＝0.38，95％CI0.19，0.80；p＝0.01)和LGALS3(应答者n＝26，非应答者n＝67；HR＝0.25，95％CI0.09，0.72；p＝0.01)的IgG应答(在第10周具有≥2倍的增加)也与增加的OS显著相关(表11)。相对于对照组的患者，Sipuleucel-T组中的为抗PSAIgG应答者的患者显示出显著增加的OS(HR＝0.27，95％CI0.12，0.58；p<0.01；图4，表12)，而Sipuleucel-T组中的为抗PSAIgG非应答者的患者的OS与对照组患者的无显著差异(HR＝0.71，95％CI0.41，1.23；p＝0.23)。类似地，与对照组的相比，Sipuleucel-T组中的为抗LGALS3IgG应答者的患者显示出显著增加的OS(HR＝0.16，95％CI0.06，0.49；p<0.01；图4)，而Sipuleucel-T组中的为抗LGALS3IgG非应答者的患者的OS与对照组患者无显著差异(HR＝0.66，95％CI0.38，1.12；p＝0.12)。这些结果表明，针对第二抗原的IgG水平的相对适度增加(≥2倍)可以鉴定，Sipuleucel-T治疗之后，比未显示这些IgG增加的患者更可能具有显著生存优势的患者。
表11.IgG应答(治疗后血清IgG水平≥2倍的增加)与OS的相关性。
表12.在IMPACT中，在第10周，Sipuleucel-T治疗的IgG应答者与IgG非应答者的OS与对照患者中的比较。
在来自IMPACT的Sipuleucel-T组的患者中，相对于对照患者，抗PA2024和抗PAPIgG应答者显示出增加的OS，而抗PA2024和抗PAPIgG非应答者则未显示出增加的OS(表12)。然而，在抗PA2024和抗PAPIgG应答者中观察到的OS的增加不如在抗PSA或抗LGALS3IgG应答者中的那些显著。利用不同的方法对来自IMPACT的数据的先前的分析显示，针对PAP或PA2024的合计的体液(IgG和IgM组合的)和细胞免疫应答与增加的OS相关(Sheikh,etal.,2013)。
在来自IMPACT的Sipuleucel-T治疗的患者中，在第2周针对PSA的IgG应答与增加的OS显著相关(应答者n＝35，非应答者n＝107；HR＝0.42，95％CI0.22，0.79；p<0.01；图5；表13)，以及在第2周针对LGALS3的IgG应答显示趋向增加的OS(应答者n＝41，非应答者n＝101；HR＝0.57，95％CI0.31，1.02；p＝0.06)。相对于对照组中的患者，在第2周，Sipuleucel-T组的为抗PSA或抗LGALS3IgG应答者的患者(而非对应的非应答者)显示出显著增加的OS(p<0.01)(图5；表14)。与对照组患者相比，在第2周具有针对初始抗原(PAP或PA2024)的IgG应答的Sipuleucel-T组的患者也显示出增加的OS(p<0.05，表14)，而无IgG应答的患者的OS与对照组的患者无显著差异。在第22周，IgG应答未与OS显著相关；然而相对于非应答者，在Sipuleucel-T组中，具有抗PSAIgG应答的患者显示趋向增加的OS(应答者n＝18，非应答者n＝42；HR＝0.35，95％CI0.12，1.05；p＝0.06，表13)。
表13.IgG应答(治疗后血清IgG水平≥2倍的增加)与OS的相关性。
表14.在IMPACT中，在第2周和第22周，Sipuleucel-T治疗的IgG应答者和IgG非应答者中的OS与对照患者中的比较。
H.结论
在Sipuleucel-T治疗的受试者中，对针对候选抗原PSA、KRAS、ERAS、LGALS3、LGALS8和KLK2的IgG的评估显示了，相对于在治疗前时间点测量的IgG水平，治疗后的水平显著升高。在可评估的安慰剂治疗的受试者中未观察到升高。该结果提供了Sipuleucel-T治疗后，针对第二抗原的抗原扩散的证据。观察到的IgG应答所针对的一些抗原，在前列腺肿瘤中显示出增加的表达或体细胞突变(KRAS、KLK2、LGALS8和LGALS3)，具有前列腺特异性表达(KLK2)，或者已知是前列腺肿瘤抗原(LGALS8)。因此，结果表明了针对前列腺肿瘤Sipuleucel-T疗法后的体内活性。此外，例如KRAS、ERAS、KLK2、LGALS3、LGALS8和PSA代表了用于针对前列腺癌的未来免疫疗法的有前景的靶标。
具有针对个别抗原的IgG应答的受试者显著重叠，表明一些受试者同时具有针对多种抗原的IgG应答。在Sipuleucel-T治疗的受试者中，针对一些抗原(例如PSA和LGALS3)的IgG应答与OS相关。因此，针对以上抗原的IgG应答可以用于预测针对Sipuleucel-T的临床应答者。由于针对多种抗原的IgG应答能够增加与OS的相关性，因此针对多种抗原的IgG可以提供用于在Sipuleucel-T治疗的受试者中评估临床结果的有效的、多变量、治疗后药代动力学生物标志物。
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