核酸样品的制备方法及组合物
本申请是分案申请，其母案的中国申请号是201180068485.2，国际申请号是PCT/US2011/067374，申请日是2011年12月27日。t
本申请要求于2010年12月27日提交的美国临时申请序号61/427,321的优先权，其全部通过引用结合到本文中。t
发明领域t
本发明提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如，应用全基因组扩增)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸的纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。t
背景
在例如基因诊断、癌症研究或法医学等许多研究领域中，基因组DNA的不足对可在样品上进行的基因试验的类型和数量而言可是严重的限制性因素。设计以克服该问题的一个方法是全基因组扩增。目标是以非特异性的方式扩增有限的DNA样品以产生与原始样品无区别但具有更高DNA浓度的新样品。典型的全基因组扩增技术的目的是在遵守原始序列表征的同时将样品扩增至微克水平。t
首个全基因组扩增方法描述于1992年，并且是基于聚合酶链式反应的原理。Zhang及同事(Zhang,L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:5847-5851；通过引用结合到本文中)开发了引物延伸PCR技术(PEP)以及Telenius和合作者(Telenius等,Genomics.1992,13(3):718-25；通过引用结合到本文中)设计了简并寡核苷酸引物PCR法(DOP-PCR)。t
PEP涉及高数目的PCR循环，其通常利用Taq聚合酶和在低的严格性温度下退火的15个碱基的随机引物。虽然已以不同的方式改善PEP方案，但其仍导致不完全的基因组覆盖度，未能扩增某些序列例如重复序列。未能启动并扩增包含重复序列的区域可导致全基因组的不完全表征，因为横穿基因组长度的稳定的引物覆盖度提供了基因组的最佳表征。该方法对非常少的样品(如单个细胞)也有有限的效率。此外，Taq聚合酶的使用意味着最大的产物长度为约3kb。t
DOP-PCR为通常用Taq聚合酶和半简并寡核苷酸(例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG(SEQIDNO:12)，例如其中N=A、T、C或G)的方法，所述寡核苷酸在低退火温度下结合人基因组内约一百万个位点。在第一循环后用较高退火温度进行大量循环，其仅允许在第一步骤中标记的片段扩增。这导致全基因组的不完全表征。与PEP相似，DOP-PCR产生平均400-500bp、最大长度3kb的片段，尽管已报道产生长达10kb的片段。另一方面，如对PEP所指出，基因组DNA的低输入(少于1ng)降低了保真度和基因组覆盖度(Kittler等,Anal.Biochem.2002,300(2),237-44)。t
多重置换扩增(MDA，亦称为链置换扩增；SDA)是基于随机六聚体对变性DNA的退火而不基于PCR的等温方法，随后在恒定温度下进行链置换合成(Blanco等,1989,J.Biol.Chem.264:8935-40，通过引用结合到本文中)。其已适用于少量的基因组DNA样品，导致具有有限的序列表征偏好的高分子量DNA的合成(Lizardi等,NatureGenetics1998,19,225-232；Dean等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002,99,5261-5266；这两者通过引用结合到本文中)。随着DNA通过链置换合成，逐渐增加的许多启动事件发生，形成超分支DNA结构的网络。所述反应可通过Phi29DNA聚合酶或通过大片段的BstDNA聚合酶催化。Phi29DNA聚合酶具有比Taq聚合酶导致的错误率低至1/100的校对活性。t
所需要的是在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化，和/或可在单一容器中完成的全基因组扩增方法。t
发明简述
本发明提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如DNA文库)(例如应用全基因组扩增，例如MDA)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)(例如，皮克级或纳克级)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。t
在一些实施方案中，本发明提供了在通用缓冲液中制备核酸文库的方法，所述方法包括：a)将核酸样品(例如，基因组DNA)加入通用缓冲液中，其中所述通用缓冲液包含dNTP和引物；b)将所述通用缓冲液与多种基本上纯化的酶接触，其中所述酶有聚合酶活性、激酶活性和磷酸酶活性，并且其中所述接触是在使得产生扩增的核酸的条件下进行；c)处理所述通用缓冲液(例如通过机械、化学或酶的方法)使得产生剪切的扩增核酸；d)处理所述通用缓冲液以灭活聚合酶的活性；和e)将所述通用缓冲液与连接酶和核酸接头在使得产生连接接头的核酸文库的条件下接触；其中以上步骤在通用缓冲液中完成而无需在步骤中的一些或全部之间或期间进行核酸的纯化。t
在具体的实施方案中，通过全基因组扩增(例如，MDA)产生扩增的核酸。在另外的实施方案中，所述步骤(例如步骤a)–e))中的一些或全部在单一容器中进行。在其它实施方案中，所述方法还包括处理包含所述连接接头的核酸文库的通用缓冲液使得蛋白和dNTP从所述通用缓冲液中移除。在具体的实施方案中，所述处理包括将所述通用缓冲液与蛋白酶和磷酸酶接触，或柱纯化所述通用缓冲液。在其它实施方案中，所述接头包含发夹结构引物，并且其中所述连接接头的核酸文库包含环形模板。t
在另外的实施方案中，所述方法还包括用能够消化存在的任何非环化核酸的至少一种核酸外切酶处理包含所述环形模板的通用缓冲液。在一些实施方案中，所述方法还包括加热包含所述核酸外切酶的通用缓冲液使得所述核酸外切酶失活。在另外的实施方案中，所述接头包含3’和/或5’的封闭基团，并且其中所述连接接头的文库包含末端封闭的模板。在其他实施方案中，所述方法还包括用能够消化存在的任何非末端封闭核酸的至少一种核酸外切酶处理包含所述末端封闭模板的通用缓冲液。在另外的实施方案中，所述方法还包括加热包含所述核酸外切酶的通用缓冲液使得所述核酸外切酶失活。t
在一些实施方案中，所述通用缓冲液还包含乳化剂。在某些实施方案中，所述乳化剂为聚山梨醇酯(例如，Tween20、Tween40、Tween60或Tween80)。在其它实施方案中，所述通用缓冲液还包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含二价金属阳离子。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含无机盐。在另外的实施方案中，所述无机盐为硫酸铵。t
在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含聚腺苷酸。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含α-连接的二糖。在一些实施方案中，所述α-连接的二糖包含海藻糖。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含还原剂。在具体的实施方案中，所述还原剂还包含二硫苏糖醇(DTT)。在某些实施方案中，所述通用缓冲液还包含白蛋白或白蛋白样蛋白。t
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤c)后，孵育所述通用缓冲液使得在已剪切的扩增核酸中产生磷酸化的平末端(和/或加A尾的末端)。在其它实施方案中，所述基因组DNA的量为10pg-50ng(例如，10pg-50pg、50pg-1ng或1ng-50ng)。在一些实施方案中，对所述连接接头的核酸文库进行测序方法或进行滚环扩增。在某些实施方案中，所述多种基本上纯化的酶包括phi29聚合酶、Klenowexo-聚合酶、多核苷酸激酶、焦磷酸酶或其任何组合。t
在一些实施方案中，本发明提供了包含以下的至少四种(或至少五种、或至少六种、或至少七种或至少八种)的组合物：a)缓冲剂、b)乳化剂、c)二价金属阳离子、d)无机盐、e)聚腺苷酸、f)α-连接的二糖、g)还原剂和h)白蛋白或白蛋白样蛋白。t
在某些实施方案中，所述组合物还包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。在其它实施方案中，所述乳化剂为聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自：Tween20、Tween40、Tween60或Tween80。在另外的实施方案中，所述无机盐为硫酸铵。在另外的实施方案中，所述α-连接的二糖包含海藻糖。在一些实施方案中，所述还原剂包含二硫苏糖醇(DTT)。t
在另外的实施方案中，所述组合物还包含dNTP和/或引物。在其它实施方案中，所述组合物还包含多种基本上纯化的酶，其中所述酶有聚合酶活性、激酶活性和磷酸酶活性。在一些实施方案中，所述多种基本上纯化的酶包含Phi29聚合酶、Klenowexo-聚合酶、多核苷酸激酶、焦磷酸酶、连接酶或其任何组合。t
在一些实施方案中，所述组合物还包含核酸接头。在某些实施方案中，所述接头包含发夹结构引物。在其它实施方案中，所述组合物还包含核酸外切酶。在某些实施方案中，所述核酸外切酶为核酸外切酶III或核酸外切酶VII。在另外的实施方案中，所述组合物还包含随机引物。在其它实施方案中，所述随机引物适用于全基因组扩增方法，例如MDA。t
附图详述
图1以流程图的形式显示了单管文库制备过程的示例性实施方案。列出的具体细节(酶/孵育温度和时间等)仅为示例性的并可根据制备的文库的不同类型而变化。t
图2显示了来自实施例1的结果并显示了全基因组扩增(WGA)中用phi29聚合酶/klenowexo-聚合酶在30分钟内将ng水平的DNA扩增至μg水平的能力。图2A显示了如通过qPCR测量的扩增产物的总产量，以及图2B显示了扩增产物的凝胶电泳分析。t
图3显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中将WGADNA片段超声处理至长度为几百个碱基对的能力。t
图4显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中phi29/klenowexo-酶混合物利用DNA寡核苷酸对DNA进行补平和加A尾的能力并用质谱法进行分析。通过利用T5000系统的ESI-TOF质谱仪的样品分析的结果显示在WGA酶加入前(图4A)和加入后(图4B)两者的样本分析。t
图5显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中phi29/klenowexo-酶混合物利用DNA寡核苷酸补平末端DNA的能力并用质谱法进行分析。通过利用T5000系统的ESI-TOF质谱仪的样品分析的结果显示在WGA酶加入前(图5A)和加入后(图5B)两者的样本分析。t
图6显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中多核苷酸激酶利用DNA寡核苷酸磷酸化DNA的5’端的能力并用质谱法进行分析。图6显示了在多核苷酸激酶加入之前(图6A)和之后(图6B)带有寡核苷酸的样品的分析。t
图7显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中利用DNA寡核苷酸用T4连接酶连接DNA片段的能力和凝胶电泳分析。t
图8显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中利用DNA寡核苷酸用T4连接酶连接DNA片段的能力和质谱法分析。用连接酶(图8A)和不用连接酶(图8B)的样品分析用ESI-TOF质谱仪处理。t
图9显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中利用DNA寡核苷酸用核酸外切酶III和核酸外切酶VII的核酸外切酶消化DNA的能力和凝胶电泳分析。t
图10显示了来自实施例1的结果并显示了在WGA缓冲液中利用DNA寡核苷酸用核酸外切酶III和核酸外切酶VII的核酸外切酶消化DNA的能力和质谱法分析。然后将用核酸外切酶处理的样品(图10B)和未用核酸外切酶处理的连接反应(图10B)上样于用T5000系统的ESI-TOF质谱仪上。t
详述
本发明提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如，应用全基因组扩增)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸的纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。t
制备DNA文库的现有方法通常利用了例如超声处理、雾化等用于DNA剪切的物理方法。接着是合适长度的片段的选择并接着酶的步骤(包括DNA接头的连接)以制备用于测序的样品。这些方法需要大量的起始材料(例如数μg)、大量时间(很多小时)并且在各个步骤之间需要DNA的纯化。在各个单独步骤之间不需要纯化并且包含全基因组扩增步骤的过程的使用将允许更简单的一管(onetube)过程。反过来讲，这将允许用大量减少的时间和精力从显著更少量的起始模板中创建DNA文库。此类方法由本发明提供。本发明提供了步骤之间不需要纯化的快速并且简单的方法，其可在单一的管/容器中进行，以从少量起始DNA模板中创建DNA文库用于DNA测序或其它应用。t
在某些实施方案中，本发明用全基因组扩增(利用例如phi29聚合酶和klenowexo-聚合酶等酶)、物理DNA断裂方法(例如超声处理)、末端修复/加A尾反应(利用例如phi29聚合酶、klenowexo-聚合酶和多核苷酸激酶等酶)、用DNA接头的连接反应(利用例如T4连接酶等酶)和核酸外切酶处理(利用例如核酸外切酶III和核酸外切酶VII等酶)创建DNA模板的文库。在某些实施方案中，本发明需要更少时间(例如30分钟-1小时)、更少的起始材料和更少的操作/传递时间以创建DNA文库。在具体的实施方案中，将本发明的方法集成于自动微流体系统/机器人系统中。t
在一些实施方案中，对所得DNA文库进行测序技术。基于测序方法，应用合适的接头创建所述DNA文库。下面描述示例性测序技术。t
核酸测序技术的说明性非限制实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序技术和染料终止子测序技术以及“下一代(nextgeneration)”测序技术。本领域的普通技术人员应认识到因为RNA在细胞中是较不稳定的并且在实验上更容易受到核酸酶攻击，所以通常在测序前将RNA反转录成DNA。t
链终止子测序利用使用修饰的核苷酸底物的DNA合成反应的序列特异性终止。延伸在模板DNA上的特定位点处通过用在该区域与模板互补的短的放射性或其他标记的寡核苷酸引物来起始。所述寡核苷酸引物用DNA聚合酶、标准的四种脱氧核苷酸碱基和低浓度的单链终止核苷酸(最通常为双脱氧核苷酸)来延伸。该反应在带有轮流作为双脱氧核苷酸的各个碱基的四个单独的管中重复。通过DNA聚合酶的链终止核苷酸的限制性掺入产生一系列相关的DNA片段，其仅在使用特定的双脱氧核苷酸的位置终止。对于各反应管，片段通过平板聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过装有粘性聚合物的毛细管电泳按大小分离。所述序列通过读取产生来自标记引物的可视化标记的泳道来确定，如同你从凝胶自上而下扫描一样。t
或者，染料终止子测序标记终止子。完全测序可在单个反应中完成，其通过用在不同波长发出荧光的单独的荧光染料标记各个双脱氧核苷酸链终止子来进行。t
已出现被称作“下一代测序”技术的一组方法作为Sanger测序法和染料终止子测序法的替代方法(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等.,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；其各自通过引用其整体结合到本文中)。下一代测序(NGS)方法享有大规模并行、高通量策略的共同特征，与旧的测序方法相比具有更低成本的目的。NGS法可大致分为需要模板扩增的方法和不需要模板扩增的方法。需要扩增的方法包括作为454技术平台的由Roche市售的焦磷酸测序(例如，GS20和GSFLX)、由Illumina市售的Solexa平台和由AppliedBiosystems市售的SupportedOligonucleotideLigationandDetection(SOLiD)平台。非扩增方法，亦称作单分子测序，举例有由HelicosBioSciences市售的HeliScope平台以及分别由VisiGen、OxfordNanoporeTechnologiesLtd和PacificBiosciences市售的新平台。t
在焦磷酸测序(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第6,210,891号；美国专利第6,258,568号；其各自通过引用其整体结合到本文中)中，模板DNA断裂，末端修复，连接接头并通过用荷有与所述接头互补的寡核苷酸的微珠捕获单一模板分子来原位克隆扩增。荷有单一模板类型的各个微珠区域化成油包水的微泡，并且所述模板用被称为乳液PCR的技术来克隆扩增。乳液在扩增后破碎并且微珠沉积到在测序反应期间充当流动池的皮可滴定板的单独孔中。当存在测序的酶和发光的报告物例如荧光色素酶的情况下在流动池中发生四种dNTP试剂中每一种有序、反复的引入。在合适的dNTP添加至测序引物的3’端的情况下，引起的ATP的产生导致孔内爆发发光，其用CCR相机记录。实现阅读长度大于或等于400个碱基是可能的，并可实现1x106个序列阅读，这导致多达5亿个碱基对(500Mb)的序列。t
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利第6,833,246号；美国专利第7,115,400号；美国专利第6,969,488号；其各自通过引用其整体结合到本文中)中，测序数据以更短长度的阅读形式产生。在该方法中，将单链片段化的DNA末端修复以产生5’磷酸化的平末端，接着将Klenow介导的单个A碱基添加至所述片段的3’端。A的添加有利于T-突出接头寡核苷酸的添加，所述寡核苷酸随后用于捕获散布有寡核苷酸锚(anchor)的流动池表面上的模板-接头分子。将所述锚用作PCR引物，但由于模板的长度及其与其它邻近锚寡核苷酸的相似性，通过PCR的延伸导致与邻近锚寡核苷酸杂交的分子的“拱桥”以在流动池表面上形成桥型结构。将这些DNA环变性并切割。接着用可逆的染料终止子对正向链进行测序。掺入的核苷酸的序列通过检测后掺入的荧光来确定，在dNTP加入的下个循环之前移除各荧光和封闭。序列阅读长度范围从36个核苷酸至超过50个核苷酸，每次分析运行整体输出超过十亿对核苷酸。t
利用SOLiD技术测序核酸分子(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第5,912,148号；美国专利第6,130,073号；其各自通过引用其整体结合到本文中)还涉及模板的断裂，连接寡核苷酸接头，附着微珠，并通过乳液PCR克隆扩增。在此之后，将荷有模板的微珠固定于玻璃流动池的衍生表面上，并与所述接头寡核苷酸互补的引物退火。但是，不是利用该引物来3'延伸，反而是其用于提供5'磷酸基团来连接包含两个探针特异性碱基的询问(interrogation)探针，之后连接6个简并碱基和四种荧光标记之一。在所述SOLiD系统中，询问探针在各探针的3’端有两种碱基的16种可能组合，并在5’端有四种荧光之一。荧光颜色和由此各探针的特性与指定的颜色空间的编码方案对应。变性之后进行多轮(通常7轮)的探针退火、连接和荧光检测，并接着用相对于最初引物偏移一个碱基的引物进行第二轮测序。以该方式，可在计算上重新构建模板序列，并且模板碱基被询问两次，导致精确度增加。序列阅读长度平均为35个核苷酸，每次测序运行整体输出超过40亿个碱基。t
在某些实施方案中，应用纳米孔测序(参见例如Astier等,JAmChemSoc.2006Feb8;128(5):1705-10,通过引用结合到本文中)。纳米孔测序背后的理论应利用当纳米孔浸入导电流体并穿过导电流体施加电势(电压)时所发生的事件：在这些条件下可观察到由于穿过纳米孔的离子传导所致的微弱电流，而且电流量对纳米孔的大小是极其敏感的。若DNA分子穿过(或DNA分子的部分穿过)纳米孔，其可使穿过纳米孔的电流强度发生变化，从而允许确定DNA分子的序列。t
来自HelicosBioSciences的HeliScope(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第7,169,560号；美国专利第7,282,337号；美国专利第7,482,120号；美国专利第7,501,245号；美国专利第6,818,395号；美国专利第6,911,345号；美国专利第7,501,245号；其各自通过引用其整体结合到本文中)是首个商品化的单分子测序平台。该方法不需要克隆扩增。将模板DNA断裂并在3’端聚腺苷酸化，最后的腺苷带有荧光标记。变性的聚腺苷酸化的模板片段与流动池表面上的多聚(dT)寡核苷酸连接。通过CCD相机记录捕获的模板分子的初始物理位置，接着将标记切割并洗掉。通过加入聚合酶并顺序加入荧光标记的dNTP试剂完成测序。掺入事件产生与所述dNTP对应的荧光信号，并且在每轮dNTP加入之前通过CCD相机捕获信号。序列阅读长度范围为25-50个核苷酸，每次分析运行整体输出超过10亿个核苷酸对。t
也任选适用于本发明的由StratosGenomics,Inc.开发的另一种示例性核酸测序方法涉及Xpandomer的使用。该测序过程通常包括提供通过模板指导的合成产生的子链。所述子链通常包括在对应于靶核酸的部分或全部的邻接核苷酸序列的序列中的多个耦合的亚基，在所述靶核酸中单独的亚基包含系链(tether)、至少一种探针或核碱基残基和至少一种选择性可切割键。选择性可切割键被切割以产生长于所述子链的多个亚基长度的Xpandomer。Xpandomer通常包含系链和报告元件，其用于解析对应于靶核酸的全部或部分的邻接核苷酸序列的序列中的遗传信息。接着检测Xpandomer的报告元件。与基于Xpandomer的方法相关的其他细节描述于例如在2008年6月19日提交的名为“通过延伸的高通量核酸测序(HIGHTHROUGHPUTNUCLEICACIDSEQUENCINGBYEXPANSION)”的美国专利公布第20090035777号，其以其整体结合到本文中。t
其它的新单分子测序方法包括通过利用VisiGen平台合成的实时测序(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009；美国专利第7,329,492号；美国专利申请序号11/671956；美国专利申请序号11/781166；其各自通过引用其整体结合到本文中)，其中利用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子对固定的引物DNA模板进行链的延伸，通过添加核苷酸产生可检测的荧光共振能量转移(FRET)。t
由PacificBiosciences开发的另一种实时单分子测序系统(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；美国专利第7,170,050号；美国专利第7,302,146号；美国专利第7,313,308号；美国专利第7,476,503号；其全部通过引用结合到本文中)利用了直径为50-100nm并包含约20仄升(10x10-21L)反应体系的反应孔。利用固定的模板、修饰的phi29DNA聚合酶和高局部浓度的荧光标记dNTP进行测序反应。高局部浓度和连续的反应条件允许通过利用激光激发、光波导和CCD相机的荧光信号检测实时捕获掺入事件。t
在某些实施方案中，应用由PacificBiosciences开发的利用零模式波导孔(ZMW)的单分子实时(SMRT)DNA测序法或类似方法。用该技术，DNA测序在各自包含数千个零模式波导孔(ZMW)的SMRT芯片上进行。ZMW为数十纳米直径的洞，其在沉积于二氧化硅基片上的100nm金属薄膜内制成。每个ZMW成为提供刚好20仄升(10-21升)检测体积的纳光子可视化小室。在该体积中，可在数千个标记核苷酸的背景中检测单个分子的活性。t
由于ZMW通过合成进行测序，因此其提供了用于观察DNA聚合酶的窗口。在各小室中，将单个DNA聚合酶分子附着在底部表面使得其永久留在检测体积内。接着将磷酸连接的核苷酸(其每种类型用不同染色的荧光团标记)以高浓度引入反应溶液中，其促进了酶的速度、精确度和处理能力。由于ZMW的小尺寸，甚至在这样高的、生物学相关的浓度下仅一小部分时间核苷酸就占据检测体积。此外，对检测体积的访问很快，持续仅几微秒，这是由于扩散必须携带核苷酸的非常短的距离。结果是背景极低的。t
可适用于本发明的用于所述实时测序的过程和系统描述于例如2008年7月29日对Xu等授权的名为“荧光核苷酸类似物及其用途(Fluorescentnucleotideanalogsandusestherefor)”的美国专利第7,405,281号、2008年1月1日对Turner等授权的名为“光学限制的阵列及其用途(Arraysofopticalconfinementsandusesthereof)”的美国专利第7,315,019号、2007年12月25日对Turner等授权的名为“分子的光学分析(Opticalanalysisofmolecules)”的美国专利第7,313,308号、2007年11月27日对Turner等授权的名为“用于分子分析的装置和方法(Apparatusandmethodforanalysisofmolecules)”的美国专利第7,302,146号和2007年1月30日对Turner等授权的名为“用于分子光学分析的装置和方法(Apparatusandmethodsforopticalanalysisofmolecules)”的美国专利第7,170,050号，2007年10月26日由Lundquist等提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20080212960号、2007年10月26日由Williams等提交的名为“用于单分子检测的流动池系统(Flowcellsystemforsinglemoleculedetection)”的美国专利公布第20080206764号、2007年10月26日由Hanzel等提交的名为“活性表面耦合聚合酶(Activesurfacecoupledpolymerases)”的美国专利公布第20080199932号、2008年2月11日由Otto等提交的名为“小环形DNA的可控链剪切(CONTROLLABLESTRANDSCISSIONOFMINICIRCLEDNA)”的美国专利公布第20080199874号、2007年10月26日由Rank等提交的名为“其上沉积有定域分子的物品及其生产方法(Articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20080176769号、2007年10月31日由Eid等提交的名为“减轻分析反应中的光损伤(Mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)”的美国专利公布第20080176316号、2007年10月31日由Eid等提交的名为“减轻分析反应中的光损伤(Mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)”的美国专利公布第20080176241号、2007年10月26日由Lundquist等提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20080165346号、2007年10月31日由Korlach提交的名为“用于杂交材料基质的均匀表面及其制备和使用方法(Uniformsurfacesforhybridmaterialsubstratesandmethodsformakingandusingsame)”的美国专利公布第20080160531号、2007年10月26日由Lundquist等提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20080157005号、2007年10月31日由Rank等提交的名为“上面沉积有定域分子的物品及其生产方法(Articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20080153100号、2007年10月26日由Williams等提交的名为“电荷开关核苷酸(CHARGESWITCHNUCLEOTIDES)”的美国专利公布第20080153095号、2007年10月31日由Lundquist等提交的名为“用于分析材料的基质、系统和方法(Substrates,systemsandmethodsforanalyzingmaterials)”的美国专利公布第20080152281号、2007年10月31日由Lundquist等提交的名为“用于分析材料的基质、系统和方法(Substrates,systemsandmethodsforanalyzingmaterials)”的美国专利公布第20080152280号、2007年10月31日由Korlach提交的名为“用于杂交材料基质的均匀表面及其制备和使用方法(Uniformsurfacesforhybridmaterialsubstratesandmethodsformakingandusingsame)”的美国专利公布第20080145278号、2007年8月31日由Lundquist等提交的名为“用于分析材料的基质、系统和方法(SUBSTRATES,SYSTEMSANDMETHODSFORANALYZINGMATERIALS)”的美国专利公布第20080128627号、2007年10月22日由Rank等提交的名为“用于增强核酸测序的聚合酶和试剂(Polymeraseenzymesandreagentsforenhancednucleicacidsequencing)”的美国专利公布第20080108082号、2007年6月11日由Foquet等提交的名为“用于进行分析反应的基质(SUBSTRATESFORPERFORMINGANALYTICALREACTIONS)”的美国专利公布第20080095488号、2007年9月27日由Dixon等提交的名为“模块光学组件和集成了该组件的系统(MODULAROPTICALCOMPONENTSANDSYSTEMSINCORPORATINGSAME)”的美国专利公布第20080080059号、2007年8月14日由Korlach等提交的名为“其上沉积有定域分子的物品及其生产方法(Articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20080050747号、2007年3月29日由Rank等提交的名为“其上沉积有定域分子的物品及其生产方法(Articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20080032301号、2007年2月9日由Lundquist等提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20080030628号、2007年6月15日由Lyle等提交的名为“引物延伸的可控起始(CONTROLLEDINITIATIONOFPRIMEREXTENSION)”的美国专利公布第20080009007号、2006年3月30日由Rank等提交的名为“其上沉积有定域分子的物品及其生产方法(Articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20070238679号、2006年3月31日由Korlach等提交的“用于监测酶活的方法、系统和组合物及其用途(Methods,systemsandcompositionsformonitoringenzymeactivityandapplicationsthereof)”的美国专利公布第20070231804号、2007年2月9日由Lundquist等人于提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20070206187号、2006年12月21日由Hanzel等提交的名为“用于核苷酸类似物掺入的聚合酶(Polymerasesfornucleotideanalogueincorporation)”的美国专利公布第20070196846号、2006年7月7日由Lundquist等提交的名为“用于同时实时监测来自多种来源的光信号的方法和系统(Methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)”的美国专利公布第20070188750号、2006年12月1日由Eid等提交的名为“减轻分析反应中的光损伤(MITIGATIONOFPHOTODAMAGEINANALYTICALREACTIONS)”的美国专利公布第20070161017号、2006年11月3日由Turner等提交的名为“核苷酸组合物及其用途(NucleotideCompositionsandUsesThereof)”的美国专利公布第20070141598号、2007年11月27日由Korlach提交的名为“用于杂交材料基质的均匀表面及其制备和使用方法(Uniformsurfacesforhybridmaterialsubstrateandmethodsformakingandusingsame)”的美国专利公布第20070134128号、2005年12月2日由Eid等提交的名为“减轻分析反应中的光损伤(Mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)”的美国专利公布第20070128133号、2005年9月30日由Roitman等提交的名为“反应性表面、基质及制备该表面和基质的方法(Reactivesurfaces,substratesandmethodsofproducingsame)”的美国专利公布第20070077564号、2005年9月29日由Xu等提交的名为“荧光核苷酸类似物及其用途(Fluorescentnucleotideanalogsandusestherefore)”的美国专利公布第20070072196号和2005年8月11日由Lundquist等提交的名为“用于监测来自单一来源的多种光信号的方法和系统(Methodsandsystemsformonitoringmultipleopticalsignalsfromasinglesource)”的美国专利公布第20070036511号，以及Korlach等(2008)“用于零模式波导孔纳米结构中的单一DNA聚合酶分子的靶向固定的选择性铝钝化(SelectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsingleDNApolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures)”Proc.Nat'I.Acad.Sci.U.S.A.105(4):11761181；其所有通过引用其整体结合到本文中。t
实施例t
实施例1
单管DNA文库的产生
本实施例描述了用于从少量起始材料中产生DNA文库的示例性单管方法，其在步骤之间不需要DNA纯化并应用通用缓冲液。方法在图1中进行一般性概括。简言之，该过程以含水样品开始，接着对其进行裂解/核酸提取方案并在通用全基因组扩增(WGA)缓冲液中洗脱。该缓冲液的组合物示于表1中：t
表1
接着将样品在95℃下加热1分钟使基因组DNA变性并允许短的随机引物结合。在冷却至合适温度(例如~37℃)后加入包含phi29聚合酶、klenowexo-聚合酶、多核苷酸激酶和焦磷酸酶的WGA酶混合物，并在37℃下孵育30分钟以扩增基因组物质。t
接着将样品进行物理剪切(例如通过超声处理)并允许在30℃下再孵育30分钟以补平刚剪切的分子的末端。在升高的温度下孵育以灭活聚合酶(例如75℃下10分钟)后加入DNA接头(在本实施例中为如下述的发夹结构寡核苷酸)以及T4连接酶和ATP。允许反应在25℃下孵育适量时间(平末端在~15分钟内完成，末端加A尾反应需要更久)。在本实施例中，产生单链的环状DNA分子。因此，接着加入核酸外切酶在37℃温育以去除存在的任何非环化DNA。值得注意的是如果本实施例对于不同的测序技术形成非环化的模板，可改变核酸外切酶并在接头上包含一些5’和/或3’封闭剂以实现相同的结果。接着将核酸外切酶在95℃下加热灭活并将样品用其他清除试剂处理，包括用蛋白酶K处理以去除酶/蛋白组分和用磷酸酶处理以去除未使用的dNTP(虽然也可使用其他的清除程序例如用树脂的程序)。在合适的孵育时间和温度后并用升高的温度灭活清除酶，反应通过最终的清除/大小选择过程(例如，结合洗脱和流过树脂)进行。t
图2显示了使用上述方法以1ng的肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)(Kp)基因组DNA起始的WGA可获得的产量。Kp特异性DNA的产量超过2.5μg(2500倍扩增)，在凝胶电泳上显示出WGA反应所见的典型模糊状(smear)图和适量的总DNA。t
用于生成图2的数据的材料和方法为如下。将1ng肺炎克雷白氏杆菌(K.pneumoniae)(Kp)纯化的基因组DNA用作起始材料。将表1中的缓冲液、100个单位的Phi29和40个单位的Klenowexo-用于WGA，其使用以下反应条件：100μl总体积，加入酶之前加热至95℃持续1分钟，冷却样品至4℃，然后在加入酶并混合后在37℃持续30分钟，接着在75℃持续10分钟。图2A显示了通过qPCR测量的扩增产物的总产率，并且图2B显示了用1%琼脂糖、溴化乙锭UV光可视化的扩增产物的凝胶电泳分析。t
将如图2中制备的全基因组DNA(20μl)在浮于4℃水浴中的薄壁PCR管中用杯角式(cuphorn)超声波仪(Misonix3000，功率10级(全功率约200w))超声处理适量时间。接着取这些反应的10μl等分试样上样于1%EtBr/琼脂糖凝胶上，以100V和UV光源运行45分钟。图3显示了不同量的超声时间对A9缓冲液中WGADNA大小的影响。5分钟后大部分DNA在几百bp范围内，对许多测序技术来说这是一个合理的范围(尽管如果需要更小的片段，进一步的超声处理可进一步减小其大小)。t
接下来，将“rxn前”寡核苷酸(下文所示，各1μM的终浓度)相互杂交并与表1中的缓冲液和100个单位的phi29以及40个单位的klenowexo-混合。然后将该反应在30℃下孵育30分钟并接着在75℃下孵育10分钟。接着在加入WGA酶前(图4A)和加入WGA酶后(图4B)通过利用T5000系统的ESI-TOF质谱仪分析样本。末端补平的寡核苷酸的序列在下文示出，其带有添加的非模板A(主要产物)。t
Rxn前
上链(topstrand)：CATGCGGATGCAGAGGAGGACGACTCTGATGTCT(SEQIDNO:1)t
下链(bottomstrand)：GCAATGAAGACATCAGAGTCGTCCTCCTCTGCATCCGCATGTGT(SEQIDNO:2)t
Rxn后(加上所示的A)
上链：CATGCGGATGCAGAGGAGGACGACTCTGATGTCTTCATTGCAt
(SEQIDNO:3)t
下链：GCAATGAAGACATCAGAGTCGTCCTCCTCTGCATCCGCATGA(SEQIDNO:4)t
图4中所示的是，当在30℃下孵育30分钟时在A9缓冲液中用于WGA的酶对用于剪切DNA模型的DNA寡核苷酸进行末端补平并加A尾。在实施例的这一部分，其杂交时使用具有5’突出端和3’突出端两者的寡核苷酸组，这允许WGA酶切掉3’突出端并相反填平5’突出端得到平末端DNA分子，其接着可具有添加的非模板A。在30℃下孵育30分钟后，将样品在75℃下加热10分钟并利用ESI-TOF质谱仪(T5000系统)来分析。t
接下来，将“rxn前”寡核苷酸(下文所示，各1μM的终浓度)相互杂交并与上表1中的缓冲液和100个单位的phi29和40个单位的klenowexo-混合。然后将该反应在37℃下孵育5分钟并接着在75℃下孵育10分钟。接着在加入WGA酶前(图5A)和加入WGA酶后(图5B)通过用T5000系统的ESI-TOF质谱仪来分析样本。描述于图右边部分的末端补平的寡核苷酸的序列在下文示出，其带有平末端(主要产物)。t
Rxn前
上链：CATGCGGATGCAGAGGAGGACGACTCTGATGTCT(SEQIDNO:1)t
下链：GCAATGAAGACATCAGAGTCGTCCTCCTCTGCATCCGCATGTGT(SEQIDNO:2)t
Rxn后(加上所示的A)
上链：CATGCGGATGCAGAGGAGGACGACTCTGATGTCTTCATTGC(SEQIDNO:5)t
下链：GCAATGAAGACATCAGAGTCGTCCTCCTCTGCATCCGCATG(SEQIDNO:6)t
图5中所示的是，当在37℃下孵育5分钟时在表1缓冲液中用于WGA的酶对用于剪切DNA模型的DNA寡核苷酸进行末端补平但不加A尾。特别地，当杂交时，使用具有5’突出端和3’突出端两者的上述寡核苷酸组，这允许WGA酶切掉3’突出端并相反填平5’突出端得到平末端DNA分子。在37℃下孵育5分钟后，将样品在75℃下加热10分钟并用ESI-TOF质谱仪(T5000系统)分析。t
接下来，将两种互补的寡核苷酸彼此杂交得到不带5’磷酸或3’磷酸的平末端双链体。该双链体与表1的缓冲液和5个单位的多核苷酸激酶混合并在30℃下孵育30分钟并接着在75℃下孵育10分钟。接着通过利用T5000系统的ESI-TOF质谱仪来分析样品。t
寡核苷酸#1：5’TGCGGATGCAGAGGAGGATGACTCTGATGTCT(SEQIDNO:7)t
寡核苷酸#2：5’AGACATCAGAGTCATCCTCCTCTGCATCCGCA(SEQIDNO:8)t
图6中显示多核苷酸激酶将磷酸化表1的缓冲液中的DNA。特别地，当杂交时，应用具有平末端并且无5’磷酸的上述寡核苷酸组。在37℃下用多核苷酸激酶孵育30分钟后，将反应加热至75℃达10分钟并用ESI-TOF质谱仪(T5000系统)分析。图6显示了在加入多核苷酸激酶之前(图6A)和之后(图6B)带有寡核苷酸的样品的分析。t
接下来，将各自带有5’突出端的两种互补的寡核苷酸一同杂交。带有互补5’突出端的发夹结构寡核苷酸也单独杂交。接着在表1的缓冲液中将这些寡核苷酸与1000个粘性末端连接单位的T4DNA连接酶混合。接着将该反应在16℃下孵育适量时间(30分钟、60分钟、120分钟)并随后在75℃下孵育10分钟。接着将样品(包括仅发夹结构的对照、仅插入片段的对照和发夹结构+插入片段但无连接酶的对照)上样于1％琼脂糖凝胶上并用溴化乙锭和UV光源可视化。t
插入的寡核苷酸：
5'-P-GAAGCATGCGGATGCAGAGGAGGACGACTCTGATGTCTTCATTGC(SEQIDNO:9)t
5'-P-GAAGGCAATGAAGACATCAGAGTCGTCCTCCTCTGCATCCGCATG(SEQIDNO:10)t
发夹结构寡核苷酸
5'-P-CTTCTCTCTCTCttttcctcctcctccgttgttgttgttGAGAGAGA(SEQIDNO:11)t
互补的5’突出端是加粗的，发夹结构的互补茎(stem)是带下划线的，小写的发夹结构碱基表示非配对碱基。t
图7显示了通过凝胶电泳，可用T4DNA连接酶和ATP在表1中的缓冲液中进行连接反应。特别地，当杂交时用双链体DNA分子两端上有5’“粘性末端”的寡核苷酸组和有互补的5’“粘性末端”突出的发夹结构寡核苷酸。在16℃下在添加有ATP的表1的缓冲液中进行连接。对于分析，使用凝胶电泳并且其显示在30分钟后反应完成主要得到迁移至~120bp处的产物，迁移至~75bp处的次要产物以及无“插入片段”的起始材料(其迁移至~50bp处)(注：尽管发夹结构寡核苷酸具有高浓度但其在凝胶上是不可见的，这是由于其为明显单链部分的寡核苷酸，其允许最小限度的溴化乙锭嵌入)。t
接下来，各自具有5’突出端的同样的两种互补的寡核苷酸一同杂交(SEQ9和SEQ10)。具有互补5’突出端的发夹结构寡核苷酸也单独杂交(SEQIDNO：11)。接着在表1的缓冲液中将这些寡核苷酸与1000个粘性末端连接单位的T4DNA连接酶混合。接着将该反应在16℃孵育适量时间30分钟接着在75℃孵育10分钟。接着将样品(包括发夹结构+插入片段但无连接酶的对照)上样于利用T5000系统的ESI-TOF质谱仪。t
图8显示通过质谱分析，可在表1的缓冲液中用T4DNA连接酶和ATP进行连接反应。当杂交时使用上文所示的寡核苷酸组，其在双链体DNA分子的两端上具有5’“粘性末端”和具有互补的5’“粘性末端”突出的发夹结构寡核苷酸。在添加有ATP的表1的缓冲液中于16℃下连接30分钟。对于分析，在添加了连接酶(图8A)或未添加连接酶(图8B)的情况下用ESI-TOF质谱仪分析发夹结构“插入片段”寡核苷酸和“发夹结构”寡核苷酸的混合物。其显示了在没有连接酶的情况下仅可看到起始材料，但在有连接酶的情况下没有看到插入片段寡核苷酸而看到存在高分子量产物，其对应于具有在任一末端连接的发夹结构寡核苷酸的插入片段双链体分子(在加连接酶的反应中仍观察到发夹结构，因为其为插入片段起始浓度的10倍)。t
接下来，将各自具有5'突出端的两种互补的寡核苷酸一同杂交(SEQ9和SEQ10)。将具有互补的5’突出端的发夹结构寡核苷酸也单独杂交(SEQIDNO：11)。然后在表1的缓冲液中将这些寡核苷酸与1000个粘性末端连接单位的T4DNA连接酶混合。接着将该反应在16℃下孵育适量时间30分钟并接着在75℃下孵育10分钟。接着将样品与核酸外切酶III和核酸外切酶VII混合并在37℃下孵育30分钟。该样品和仅插入片段的对照、仅发夹结构的对照和未用核酸外切酶处理的连接反应的对照上样于1%琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭和UV光源可视化。t
图9显示了核酸外切酶(具体为核酸外切酶II和核酸外切酶VII)在表1的缓冲液中是有功能的并且可用于从反应中去除非环状DNA产物。这些反应用如图8和图9中运行的连接反应并在37℃下使其接受核酸外切酶III和核酸外切酶VII持续30分钟。接着将样品用凝胶电泳来分析，其显示非环状产物的去除和环状产物的保留。t
接下来，将各自带有5’突出端的同样的两种互补寡核苷酸一同杂交(SEQ9和SEQ10)。将具有互补的5’突出端的发夹结构寡核苷酸也单独杂交(SEQIDNO：11)。然后在表1中的缓冲液中将这些寡核苷酸与1000个粘性末端连接单位的T4DNA连接酶混合。然后将该反应在16℃下孵育适量时间30分钟并接着在75℃下孵育10分钟。接着将反应物与核酸外切酶III和核酸外切酶VII混合并在37℃下孵育30分钟。接着将样品(图10B)和未用核酸外切酶处理的连接反应物(图10B)上样于使用T5000系统的ESI-TOF质谱仪。t
图10显示了核酸外切酶(具体为核酸外切酶II和核酸外切酶VII)在表1的缓冲液中是有功能的并且可用于从反应中去除非环状DNA产物。这些反应用如图8和图9中运行的连接反应并在37℃下使其接受核酸外切酶III和核酸外切酶VII持续30分钟。接着将样品用ESI-TOF质谱仪器分析，其显示非环状产物的去除和环状产物的保留。t
本申请中提到的所有出版物和专利在此通过引用结合到本文中。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域的技术人员而言是显而易见的。尽管已描述本发明关于特定的优选实施方案，但应理解的是所要求的本发明不应过度限制于这些特定的实施方案。事实上，对于相关领域中技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意旨在权利要求的范围内。t
