TM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用附图说明" src="/d/file/p/2020/11-23/c1c06ae254f73e56e3dad330ad508c42.gif" />
一种基于Ion PGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用
技术领域
本发明涉及高通量测序领域，具体是一种基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用。
背景技术
随着高通量测序发展逐渐成熟和成本的不断降低，使测序技术逐渐成为基础生物学研究和医学检测的常规实验方法。从人类基因组计划构建了第一个基因图谱开始，新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高速发展。但全基因组结构复杂，周期长，费用高，限制了它的发展。
新一代测序技术催生了丰富多彩的基因组图谱。然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究。扩增子测序就是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。这种高针对性的方法可以高效的发现，验证和筛选关注区域的基因组变异。相比全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确快速的研究，适用于大量样本的特定基因组区域研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)目标区域扩增：将待测样本的DNA、针对目标区域设计的多重PCR扩增引物以及多重PCR扩增目标区域试剂混合进行PCR扩增反应；
(2)引物、修饰清除：将步骤(1)所得到的反应产物与MPclean试剂混合进行反应；
(3)接头连接：将步骤(2)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接头连接反应；
(4)磁珠纯化：将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到DNA文库；
(5)文库扩增：将步骤(4)所得到的DNA文库加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，并进行磁珠纯化得到目的DNA文库；
(6)文库检测：将步骤(5)所得到的目的DNA文库采用Qubit检测文库浓度；
(7)高通量测序：对步骤(6)所得到的合格文库按照等浓度混合并进行AgilentBioanalyzer2100质检，质检后IonPGMTM平台进行高通量测序；
其中，步骤(1)中所用的多重PCR扩增目标区域试剂pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μLHigh-FidelityDNAPolymerases、8-12mM的Tris-HCl缓冲溶液、45-55mM的NaCl溶液、8-12mMMgCl2、2-4mM二硫苏糖醇、8-12mMdNTPs混合液；
步骤(2)中所用的MPclean试剂为针对引物特定修饰的清除试剂；
步骤(3)中接头连接反应试剂由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300-500U/μL的T4DNALigase和6-10U/μL的BstWarmStartDNAPolymerase，连接反应缓冲液pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：pH8.0的45-55mMTris-HCl缓冲溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫苏糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs混合液、8-12mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4；
步骤(4)中所用磁珠为AgencourtAMPureXP磁珠；
步骤(5)中所用的扩增试剂pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μLHotStartHigh-FidelityDNApolymerase、pH8.8-9.0的64-68mM的Tris-SO4、18-22mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4、200-240μMdNTPs混合液。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中待测样本的DNA来自于血液、上皮脱落细胞等。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)的反应产物片段大小为111-187bp，平均为154bp。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)的接头为由如下正反两个序列组成的P1：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
P1的正序列如SEQIDNO:1所示，P1的反序列如SEQIDNO:2所示。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中的标签接头是由如下正反两个序列组成的AXAdapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'
AXAdapter的正序列如SEQIDNO:3所示，AXAdapter的反序列如SEQIDNO:4所示。
作为本发明进一步的方案：AXAdapter选自：
A1Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A1Adapter的正序列如SEQIDNO:5所示，A1Adapter的反序列如SEQIDNO:6所示；
A2Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A2Adapter的正序列如SEQIDNO:7所示，A2Adapter的反序列如SEQIDNO:8所示；
A3Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A3Adapter的正序列如SEQIDNO:9所示，A3Adapter的反序列如SEQIDNO:10所示；
A4Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A4Adapter的正序列如SEQIDNO:11所示，A4Adapter的反序列如SEQIDNO:12所示；
A5Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A5Adapter的正序列如SEQIDNO:13所示，A5Adapter的反序列如SEQIDNO:14所示；
A6Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A6Adapter的正序列如SEQIDNO:15所示，A6Adapter的反序列如SEQIDNO:16所示；
A7Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A7Adapter的正序列如SEQIDNO:17所示，A7Adapter的反序列如SEQIDNO:18所示；
A8Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3'
5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A8Adapter的正序列如SEQIDNO:19所示，A8Adapter的反序列如SEQIDNO:20所示；
A9Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3'
5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A9Adapter的正序列如SEQIDNO:21所示，A9Adapter的反序列如SEQIDNO:22所示；
A10Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3'
5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A10Adapter的正序列如SEQIDNO:23所示，A10Adapter的反序列如SEQIDNO:24所示；
A11Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGCGAT3'
5'ATCGCGGATGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A11Adapter的正序列如SEQIDNO:25所示，A11Adapter的反序列如SEQIDNO:26所示；
A12Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATCGAT3'
5'ATCGATTCCGGATCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A12Adapter的正序列如SEQIDNO:27所示，A12Adapter的反序列如SEQIDNO:28所示；
A13Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGACCACTCGAT3'
5'ATCGAGTGGTCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A13Adapter的正序列如SEQIDNO:29所示，A13Adapter的反序列如SEQIDNO:30所示；
A14Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATCGAT3'
5'ATCGATAACCTCGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A14Adapter的正序列如SEQIDNO:31所示，A14Adapter的反序列如SEQIDNO:32所示；
A15Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGCGAT3'
5'ATCGCAGCTTGGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A15Adapter的正序列如SEQIDNO:33所示，A15Adapter的反序列如SEQIDNO:34所示；
A16Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTTACACACGAT3'
5'ATCGTGTGTAAGACTGAGTCGGAGACACGC3'
A16Adapter的正序列如SEQIDNO:35所示，A16Adapter的反序列如SEQIDNO:36所示。
作为本发明进一步的方案：步骤(5)中所用的扩增引物为：
Primer1：5'CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
Primer2：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC3'
Primer1的序列如SEQIDNO:37所示，Primer2的序列如SEQIDNO:38所示。
根据上述构建方法构建的扩增子DNA文库。
本发明还提供一种用于构建基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的多重PCR扩增目标区域试剂，pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μLHigh-FidelityDNAPolymerases、8-12mM的Tris-HCl缓冲溶液、45-55mM的NaCl溶液、8-12mMMgCl2、2-4mM二硫苏糖醇、8-12mMdNTPs混合液。
作为本发明进一步的方案：多重PCR扩增目标区域试剂，pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μLHigh-FidelityDNAPolymerases、10mM的Tris-HCl缓冲溶液、50mM的NaCl溶液、10mMMgCl2、3mM二硫苏糖醇、10mMdNTPs混合液。
一种用于构建基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的接头连接反应试剂，由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300-500U/μL的T4DNALigase和6-10U/μL的BstWarmStartDNAPolymerase，连接反应缓冲液pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：pH8.0的45-55mMTris-HCl缓冲溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫苏糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs混合液、8-12mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4。
作为本发明进一步的方案：所述酶为400U/μL的T4DNALigase和8U/μL的BstWarmStartDNAPolymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH8.0的50mMTris-HCl缓冲溶液、10mM的KCl、10mM二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4。
一种用于构建基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的扩增试剂，pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μLHotStartHigh-FidelityDNApolymerase、pH8.8-9.0的64-68mM的Tris-SO4、18-22mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4、200-240μMdNTPs混合液。
作为本发明进一步的方案：扩增试剂，pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μLHotStartHigh-FidelityDNApolymerase、pH8.9的66mM的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μMdNTPs混合液。
上述多重PCR扩增目标区域试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂在构建扩增子DNA文库中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明步骤简单，目标区域富集后通过一次的PCR扩增，然后采用磁珠纯化产物，即得到测序文库；同时降低了建库的成本，减少了由于PCR扩增中引入突变的可能。使得测序质量更佳精确。
附图说明
图1是本发明基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库构建方法的流程图。
图2是采用AgilentBioanalyzer2100对本发明混合文库的检测结果图，其中，(a)中混合文库编号：1507，片段大小：204bp，质量浓度：927.0pg/μL，摩尔浓度：6884.0pmol/L；(b)中混合文库编号：2897，片段大小为207bp，质量浓度：838.50pg/μL，摩尔浓度：6133.19pmol/L。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1，本发明实施例中，一种基于IonPGMTM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法
1、试剂
本实施例采用以下试剂：High-FidelityDNAPolymerases(NewEnglandBiolabs)、T4DNALigase(NewEnglandBiolabs)、BstWarmStartDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、HotStartHigh-FidelityDNApolymerase(NewEnglandBiolabs)、接头P1和Adapter(BiooScientific)
目标区域扩增所用的多重PCR扩增目标区域试剂pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μLHigh-FidelityDNAPolymerases，10mM的Tris-HCl缓冲溶液、50mM的NaCl溶液、10mMMgCl2、3mM二硫苏糖醇、10mMdNTPs混合液；
连接反应所用的酶为T4DNALigase(400U/μL)和BstWarmStartDNAPolymerase(8U/μL)，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMTris-HCl缓冲溶液(pH8.0)，10mM的KCl，10mM二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4；
PCR扩增所用的多重PCR扩增目标区域试剂pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μLHotStartHigh-FidelityDNApolymerase、66mM的Tris-SO4(pH8.9)、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μMdNTPs混合液。
2、实验步骤
(1)待测样本的DNA采集。
在本实施例中，总共采集了60样本的DNA。35份血样DNA采用天根试剂盒提取，25份口腔拭子采用专门的口腔拭子DNA提取方法提取。
(2)多重PCR扩增富集目标片段。
对待测样本的DNA进行Qubit浓度测定，以及Nanodrop2000纯度测定。
按照表1的体系加入各试剂进行PCR扩增
表1
PCR反应条件如表2所示：
表2
(3)引物、修饰清除
向PCR产物内加入2μLFuPaReagent，旋涡混匀，瞬离2s(共22μL)，根据表3所示的程序进行反应：
表3
(4)接头连接并纯化
1)稀释混合街头，如表4所示。
表4
2)想上一步的PCR反应体系中加入以下组分：如表5所示。
表5
PCR反应条件，如表6所示。
表6
3)磁珠纯化连接产物，采用AgencourtAMPureXP磁珠纯化产物。
接头P1为：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
样品的AXAdapter分别如下：
A1Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A2Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A3Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A4Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A5Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A6Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A7Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'；
A8Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3'
5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A9Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3'
5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
A10Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3'
5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'。
(5)文库扩增，向纯化后风干的磁珠中加入50μL的扩增试剂和2μL的LibraryAmplificationPrimerMix，重悬磁珠混匀，磁力架上放置2-3min，取上清至PCR管中，涡旋混匀进行PCR扩增反应：
PCR反应条件，如表7所示。
表7
PCR扩增引物序列为：
Primer1：5'CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
Primer2：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC3'。
(6)文库进行磁珠纯化，采用AgencourtAMPureXP磁珠纯化产物。
(7)用Qubit检测文库浓度，用具体检测结果如表8。
表8
用AgilentBioanalyzer2100检测文库片段大小，结果见附图2。
(4)高通量测序及结果分析。
每次测序反应检测16个样本，总共进行4次测序反应。
通过对IonPGMTM平台的4次测序反应的测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过97％，均一性平均达到100％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
