植物药miRNA396家族的应用
技术领域：
该项技术发明属于植物药(中草药)、生物分子学、表观遗传学、基因组学范畴。
背景技术：
该项技术发明应用了包括：植物药(中草药)热力学提取技术、基因测序技术、生物信息技术、和分子生物学技术等。
发明内容：
背景：
黄芪属被子植物门、双子叶植物纲、原始花被亚纲、蔷薇目、豆科类植物。它是植物种类中最大科目之一，我国使用的药用黄芪有蒙古黄芪(Astragalus membranaceus[Fisch]Beg.var mongholicus)，或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus[Fisch]Beg.)的干燥根。黄芪英文为membranous milk-vetch root，日文为ogi，而朝鲜文称之为hwanggi。黄芪是我国中药应用于临床最多的品种之一，中国药典记载，黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌等功效 [1]。膜荚黄芪主要含有的化学成分包括：多糖、皂甙、黄酮、氨基酸和微量元素等[2]。临床和实验室研究证实中药黄芪对人类具有显著的免疫调节功能和抗肿瘤等作用[3-7]。虽然膜荚黄芪全基因组学尚未被解码，但它的全转录组和表达序列标志(expressed sequence tag，EST)已完成检测[8]。从742,721个高质量序列读数中包括了已知的9,893个独特序列。这将有利于今后黄芪的生物合成和生物化学改良研究，同时黄芪的代谢和生物合成通路也被明确。
微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类小的内源性非编码RNA。它们来源于miRNA初级转录产物(primary transcripts miRNA，pri-miRNAs)，具有一个发夹型结构[9]。在植物中，miRNA是通过直接裂解转录物调节靶基因[10，11]或抑制它的转录水平[12]。miRNA对植物的生长发育和逆境胁迫(stress responses)起着重要的调节作用[13-18]。
自从首次发现植物拟南芥miRNA后，miRNA的研究飞速发展[19，20]。到目前为止，已确定了206种24,521个miRNA的基因，根据miRNA基因库(miRBsse 21)资料显示，经计算机分析处理已明确30,424个成熟miRNA序列[21]。但始终未见任何对中药饮片miRNA图谱研究文献报道。
中药饮片是植物药原材料经干燥炮制加工后的特殊药品，一般经中医师处方后煎煮饮用。中药原材料经加工、销售、储存、配制和煎煮等直至患者服用具有相当复杂漫长的过程，与一般植物miRNA分析研究目的和方法存在很大差异，植物miRNA分析的主要目的是观察植物进化过程、便于增产改良以及对抗逆境胁迫等，均采用新鲜植物的各个部位作为观察研究对象。而中药饮片miRNA研究目的是考虑在热力学作用下小RNA的稳定性，了解作为药品进入 体内的真实情况，以及了解是否具有潜在的调节靶基因miRNA存在。为此我们选择了黄芪进行该项研究。
具体实施措施
1 材料与方法
1.1 黄芪煎煮液制备
1.1.1 药材：膜荚黄芪饮片购于养和堂中药饮片公司(批号：140924)，10g/袋。
1.1.2 药材准备：用微波炉(功率325W)加热2min，干燥灭菌，然后用灭菌注射用水100ml浸泡30min。将黄芪浸泡溶液置微波炉加热(功率525w)6min，移去黄芪，得到黄芪煎煮液，冷却备用。方法见文献[22]。
1.1.3 过滤：将冷却后的黄芪煎煮液置入超滤容器装置，该装置滤膜孔径为0.22μm，超滤容器装置购于美国Membrane Solutions LLC公司(产品号：VFPPES122250)，收集滤液1ml于无菌干燥试管。
1.1.4 待测样本RNA保存：收集滤液以1∶9体积加入Trizol试剂(Invitrogen公司，USA)，并立即用聚乙烯薄膜覆盖封口，置-20℃保存待测。
1.2 小RNA库构建和高通量测序
1.2.1 RNA样本质量控制：纯化和确定总RNA含量(使用NanoDrop ND-1000设备)，并建立样本质量控制报告。
1.2.2 文库构建和测序：将样本总RNA用于小分子RNA文库构建。经纯化后的小分子RNA分别经5’接头和3’接头连接后经RT-PCR扩增，形成小分子RNA的cDNA文库，直接用于深度测序。长度范围控制在～130-150bp(相当于～15-30nt小RNA)[23]。深度测序使用Agilent2100 Bioanalyzer设备，由康成生物技术有限公司完成。
1.2.3 序列的初步分析：Agilent测序得～30nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析[24]。将初级分析得到的序列进行分类注释，以获得样品中包含的各组分及表达量信息。剩余的小分子RNA序列与miRNA数据库(miRBase21)所有植物的miRNA序列进行比对，得到样品中已知miRNA的含量、首位点碱基分布及表达丰度等信息。
1.2.4 生物信息学分析：使用novoalign 10.1软件(Novocraft TechnologiesSdn Bhd)对已知所有的植物miRNA序列进行对比，确定miRNA特征。通过前体序列分析，确定其茎环结构和成熟miRNA序列。后期采用手工方法查找经热力学处理后的miRNA与miRNA数据库(miRBase 21)标准序列的差异，建立经热力学 处理后饮片黄芪的miRNA谱。
2 结果
2.1 黄芪小分子RNA的基本描述
经Agilent 2100 Bioanalyzer对黄芪提取液样本的深度测序，获得初步描述性结果(见图1)。黄芪提取液深度测序后可得到9,931,049读数，这些读数代表了4,606,460种类型的小RNA片段，其中成熟miRNA序列为24,994条。序列长度分布和读数见图1。小RNA分布呈斜率直线分布，各长度类型随nt增长而减少。长度为16-20nt读数为3,875,742，占总数的48.12％，为主要部分。其中16nt占12.83％，17nt占12.51％。而长度在20-24nt占40.39％。即小RNA数量上高于可能的miRNA。24-30nt所占比例较低。
2.2 黄芪成熟miRNA及前体分析
使用novoalign软件对黄芪提取液与已知所有植物miRNA序列进行对比，仅得到1个豆科MIR6300保守序列。鉴于黄芪提取液是经历了干燥、储存、加热和微波等处理后的标本，我们采用了手工查找对比方法，研究发现有510种前体miRNA序列，分别属于23个家族。根据文献[25]设置读数阈值为10，其中超过10读数的有11个序列(见图2)。对高丰度表达的miRNA继续进行分析，研究表明其中存在46个保守或非保守或残缺不全的miRNA序列，这些miRNA的长度在15-21nt，大多短于miRBase 21同名序列。它们在大豆、拟南芥和水稻等植物上均存在进化上的保守性，以豆科类miRNA种类表达为最多见(见表1)。其中高度保守并耐高温和微波等处理的仅1个miRNA(tcc-miR396d)。而非保守并耐高温和微波等处理的新发现的miRNA有9个序列，包括：miRNA166i、miRNA396和miRNA5077(见表2)。其中miRNA396家族序列包含了7个相同序列(mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、pab-miR396b、pab-miR396c、ptc-miR396f、ptc-miR396g-5p)。
表1.黄芪miRNA谱以及与miRBase 21数据库的对比
表2.黄芪中新发现的非保守的miRNA种类
2.3 黄芪提取液的miRNA根据种子区域分类的表达
文献报道，根据经热力学处理后核苷酸结构特性与小的干扰性RNA(smallinterfering RNAs，siRNAs)靶基因识别功能的相互作用，将siRNA分为3类，其中I类siRNA分子具有最强烈的基因沉默效应，I类siRNA的鉴别标准为3’端1-7核苷肽位点上(即种子区域，seed region)有4-7个A或U(AU≥57％)[26]。结果显示，黄芪提取液有5个miRNA序列符合I类siRNA结构标准(见表3)，它们包括：miRNA5139、miRNA6173、miRNA396、miRNA8155和miRNA166i。其中miRNA396家族序列包含了8个相同序列(mdm-miR396e、mdm-miR396f、mdm-miR396g、pab-miR396b、pab-miR396c、ptc-miR396f、ptc-miR396g-5p、ttc-miR396d)。同时除了这类miRNA与保守和新的非保守miRNA序列有部分重叠之外，均显示了经热力学处理后明显miRNA链的断裂，以5’端的断裂为主，但种子区域呈现了高度稳定(见表3)。
表3.经热力学处理的黄芪提取液I类siRNA序列与已知数据库的比较
注：上列表示miRBase 21数据库序列，下列表示所测得的黄芪提取液序列。序列方向为5’→3’，方框内为种子区域(红色)。miR396家族因与表1和表2内容相同省略。蓝色为核苷酸表达差异部分。
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附图说明
图1是黄芪小RNA种类分析(长度分布和读数)图
注：横轴为小RNA长度分布，从左到右分别表示16nt到30nt，纵轴为每个长度小RNA的读数。
图2是前体miRNA主要种类(读数＞10reads)图
注：横轴为前体miRNA的种类，纵轴为miRNA前体的读数。
