miR-124在乳腺癌骨转移疾病中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及miR-124在诊断乳腺癌骨转移、制备抑制乳腺癌骨转移的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤，其发病率占女性肿瘤第一位，而死亡率占第二位。尽管随着诊断和治疗水平的发展，早期乳腺癌更容易得到诊断，并已有标准的治疗选择，生存率也有所提高。然而，晚期乳腺癌患者常发生局部进展或远处转移，目前仍无公认的治疗标准，生存期亦未得到显著改善。乳腺癌远处转移最常见的部位是骨。在晚期乳腺癌患者中，骨转移的发生率高达65％至75％，而首发转移部位为骨者占27-50％。乳腺癌骨转移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓压迫等骨相关事件，严重影响患者的生存质量和总体预后。
目前认为乳腺癌骨转移应视为全身性疾病，需采取综合治疗措施，以达到预防和治疗SREs，缓解疼痛，恢复功能，提高生活质量，延长生存期的目的。除了化疗、内分泌治疗和分子靶向治疗等全身治疗以及手术治疗和放疗等局部治疗外，骨调节药物因可发挥预防和治疗骨转移相关事件的作用，已在乳腺癌骨转移患者的治疗中占据重要地位。然而，骨调节药物并不能预防乳腺癌患者发生骨转移，亦没有证据证实其可延长患者的总体生存期。因此，深入研究发生乳腺癌骨转移的机制，寻找新的治疗靶点，将有助于进一步改善患者的生存质量，延长生存期。
乳腺癌骨转移过程中，肿瘤细胞经过迁移、侵袭、粘附等环节到达骨微环境后，和骨微环境中的成骨细胞、破骨细胞、骨基质细胞之间产生复杂的相互作用，导致成骨/破骨平衡打破，形成了主要表现为溶骨性病变的病灶，引发骨相关事件。在以上过程中，许多发挥调控作用的基因或分子表达出现异常，可能成为新的作用靶点或诊断标志物，微小RNA(microRNA，miRNA)就是其中的研究热点之一。作为基因转录后调控的重要元件之一，miRNA可通过作用于与乳腺癌发生发展相关的信号转导通路或骨微环境中的重要细胞因子或趋化因子促进或抑制额腺癌骨转移的发生。作为内源存在的非编码双链RNA，miRNA具有一定的组织特异性和分子靶向性，通过外源性调控相关miRNA表达可能比传统的放化疗更安全，可能成为治疗乳腺癌骨转移的新手段，具有良好的应用前景。
miR-124最早在小鼠脑组织中被克隆，随后被证实在人胚胎干细胞中亦有表达。作为脑组织中表达量最高的miRNA之一，已有许多研究表明miR-124主要参与了神经系统的发育，其表达异常与多种神经系统疾病相关。近来有越来越多的研究关注miR-124在恶性肿瘤发生发展中的作用。但目前为止，关于miR-124在乳腺癌骨转移中的作用尚未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，提供miR-124在制备预判乳腺癌骨转移的风险、诊断乳腺癌是否发生转移的工具中的应用。
本发明的第二个目的是，提供一种预判乳腺癌骨转移的风险、诊断乳腺癌是否发生转移的芯片。
本发明的第三个目的是，提供一种预判乳腺癌骨转移的风险、诊断乳腺癌是否发生转移的试剂盒。
本发明的第四个目的是，提供miR-124在制备预防和/或治疗乳腺癌骨转移的药物中的应用。
本发明的第五个目的是，提供miR-124在制备抑制成骨细胞促进破骨细胞分化的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供了miR-124在制备预判乳腺癌骨转移的风险的工具中的应用。
本发明还提供了miR-124在制备诊断乳腺癌是否发生转移的工具中的应用。
本领域人员了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-124功能的条件下，对miR-124进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明的实验证明了miR-124在高转移性乳腺癌细胞及腺癌骨转移组织中的表达下调，因此，与不发生骨转移的乳腺癌组织中的miR-124的水平相比，如果受试者乳腺癌组织中miR-124的水平显著降低，那么则可以判断该受试者乳腺癌发生骨转移的风险高、或者已经发生转移，从而采取预防乳腺癌细胞转移的方案或者为临床治疗方案的制定提供诊断基础。
进一步，上述预判乳腺癌骨转移风险，判断乳腺癌是否发生转移的工具包括但不限于芯片、试剂盒。所述工具包括用于待测样本中miR-124表达水平的试剂。所述试剂可以是针对miR-124的引物或探针。
本发明还提供了一种用于预判乳腺癌骨转移的风险、诊断乳腺癌是否发生转移的芯片，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-124的部分或全部序列。所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于判断乳腺癌是否发生骨转移或者判断乳腺癌转移风险的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针防治在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合判断乳腺癌骨转移的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述固相载体可采用基因芯片技术领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明还提供了一种预判乳腺癌骨转移的风险、诊断乳腺癌是否发生转移的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测受试者乳腺癌组织中miR-124表达水平的试剂，与未发生骨转移的乳腺癌组织中的miR-124表达水平进行比较，若乳腺癌组织中miR-124的表达水平显著降低，则判断该受试者的乳腺癌发生骨转移的风险高、或者已经发生转移。
进一步，所述试剂包括针对miR-124的引物和/或探针。所述试剂还可包括针对现有技术中已经报道的可用于判断乳腺癌骨转移是否发生，或者判断乳腺癌骨转移风险的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合判断乳腺癌骨转移的情况也在本发明的保护范围之内。
本发明的微小RNA可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达微小RNA的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF-Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
miR-124为靶点的药物筛选：在得知了miR-124与乳腺癌骨转移的密切相关性后，可以基于该特征来筛选促进miR-124表达的物质。之后，可从所述的物质中找到对于治疗乳腺癌骨转移真正有用的药物。
因此，本发明提供了一种筛选治疗乳腺癌骨转移的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理高转移性的乳腺癌体系，若所述候选物质可促进miR-124的表达或活性，则表明该候选物质是治疗乳腺癌骨转移的潜在物质。所述高转移性的乳腺癌体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。优选地，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于治疗乳腺癌骨转移真正有用的物质。
本发明提供了miR-124在制备抑制乳腺癌骨转移或者预防乳腺癌骨转移的药物中的应用。本发明的实验证明miR-124与乳腺癌骨转移相关，在此基础上，通过提高miR-124的表达可用于抑制乳腺癌骨转移或者降低乳腺癌骨转移的风险。
本发明还提供了miR-124在制备抑制破骨细胞分化的药物中的应用。
进一步，所述药物包括有效剂量的miR-124促进剂。所述miR-124促进剂能够促进细胞内miR-124的表达、或能够促进miR-124的活性、或能够促进miR-124的有效作用时间、或能够促进miR-124的稳定性。所述miR-124促进剂的靶标不限于miR-124本身，还包括miR-124的上下游，例如：编码miR-124的基因组序列，miR-124靶基因、调控miR-124的蛋白或者基因。
进一步，miR-124促进剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。
所述用于寡核苷酸表达的载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF-Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
优选地，所述miR-124促进剂是miR-124本身或者分别携带有miR-124的表达载体。
本发明的抑制乳腺癌骨转移的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述药物可以单独施用；或者与其他能够抑制肺腺癌转移的药物进行组合施用。
所述药物可以离体施用：将miR-124的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。
所述药物可以体内施用：将miR-124的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。
所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细胞。
本发明使用的“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本发明所述的miR-124的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述miRNA促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
分析miRNA表达谱的方法包括但不限于以下几种：反转录聚合酶链式反应方法(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time PCR)、Northern印迹杂交方法(Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析方法(RNase protection assay)、Solexa测序技术(Solexa sequencingtechnology)和生物芯片。
本发明优点在于：
本发明检测miR-124在不同骨转移能力乳腺癌细胞及小鼠乳腺癌骨转移组织中的表达，初步明确它与乳腺癌骨转移的关系，并进一步通过外源性上调或抑制肿瘤细胞中miR-124表达，观察其对成骨细胞和破骨细胞的作用，进一步明确miR-124通过调控乳腺癌细胞和骨微环境之间的相互作用而抑制乳腺癌骨转移。
附图说明
附图1为Real-time PCR检测小鼠乳腺癌正常组织(Normal)和不同乳腺癌细胞株中miR-124表达水平。乳腺癌细胞株vs Normal：*p<0.05，**p<0.01，student t text。
附图2为Real-time PCR检测母代MDA-MB-231细胞(parental cell)和小鼠乳腺癌骨转移组织(bone metastasis tissues,BM tissues)中miR-124表达水。(n＝6，*p<0.05，Mann Whitney test)。
附图3为原位杂交法检测乳腺癌患者原发癌组织(primary lesion)、相应的癌旁组织(normal breast)和骨转移组织标本(bone metastasis)中miR-124表达水平。
附图4为20例乳腺癌骨转移患者骨转移灶中miR-124表达和患者的无骨转移生存期进行相关性分析，结果显示二者呈显著正相关(r2＝0.4769，p＝0.0007，线性回归)。
附图5为BMM细胞经不同处理后的肿瘤细胞的condition medium培养后TRAP染色显示破骨细胞分化情况。(A)显微镜下代表性TRAP阳性细胞图片；(B)统计分析结果。***p<0.001，student t test。
附图6为MDA-MB-231细胞转染miR-124inhibitor和inhibitor NC后收集各组上清培养BMM细胞的TRAP染色结果。(A)显微镜下代表性TRAP阳性细胞图片；(B)统计分析结果。***p<0.001，student t test。
附图7为乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞转染NC和miR-124mimic或NC inhibitor和miR-124inhibitor后收取上清培养3T3E1细胞后，Real-time PCR法检测3T3E1细胞中OPG和RANKL表达(A)以及OPG/RAML比值变化(B)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，student ttest。
附图8为3T3E1细胞分别和转染NC(OC+NC)或miR-124mimic(OC+miR-124mimic)的MDA-MB-231细胞共培养，收取各组上清培养RAW264.7，Real-time PCR法检测RAW264.7细胞中TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表达。**p<0.01，***p<0.001。
附图9为构建psiCHECK-2-IL113′-UTR结合位点突变荧光素酶报告基因质粒流程图。
附图10为hsa-miR-124在IL113′-UTR区的结合位点。
附图11显示多个物种的IL113′-UTR上均含有相同的miR-124的结合位点。
附图12显示体外上调miR-124可下调MDA-MB-231细胞中IL11表达。其中A为Real-time PCR结果，B为Western blot结果。miR-124抑制IL11mRNA(A)和蛋白(B)表达。**p<0.01。
附图13显示体外抑制miR-124作用可促进MDA-MB-231中IL11表达。其中A为Real-time PCR结果，B为Western blot结果。miR-124inhibitor促进IL11mRNA(A)和蛋白(B)表达。***p<0.001。
附图14为miR-124mimic对野生型(WT)和结合位点突变型(MUT)IL113′-UTR报告基因质粒荧光素酶活性的作用。***p<0.001。
附图15为正常乳腺组织和乳腺癌细胞株中miR-124和IL11表达相关性。p＝0.048。
附图16为乳腺癌骨转移模型骨转移灶组织和母代MDA-MB-231细胞中miR-124和IL11表达相关性。p＝0.01。
附图17为免疫组化法检测乳腺癌患者原发癌组织(primary lesion)、癌旁正常组织(normal breast)和骨转移组织标本(bone metastasis)中IL11的表达。
附图18为人乳腺癌骨转移标本中miR-124和IL11表达相关性。p＝0.0023。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1miR-124在乳腺癌骨转移中的作用
一、材料
(一)细胞
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、Hs578t、BT549、BT474、MDA-MB-436、MDA-MB-468、MCF7、T47D细胞均购自武汉博士德生物技术有限公司。小鼠巨噬细胞RAW264.7以及小鼠成骨细胞前体细胞3T3E1由华东师范大学生物工程学院李珍惜博士后赠与。其中MDA-MB-231、Hs578t、BT549、BT474、MDA-MB-436、MDA-MB-468、RAW264.7和3T3E1细胞培养条件为含有10％胎牛血清的DMEM。MCF7和T47D细胞培养条件为含有10％胎牛血清的1640培养液。
(二)动物
实验用雌性BALB/c小鼠购自第二军医大学实验动物中心，清洁级。用于分离正常小鼠乳腺组织和构建小鼠骨转移模型。
(三)临床标本
实验所用5例乳腺癌原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织为在本院进行原发癌切除术及骨转移癌切除术患者的乙醛固定石蜡包埋蜡块。实验所用的20例人乳腺癌骨转移标本取自本科室2014年进行乳腺癌骨转移切除术的患者。纳入标准为：既往已明确诊断乳腺癌，并非以骨转移为首发症状，手术前尚未接受骨调节药物(如唑来膦酸)治疗的患者。
留取骨转移标本过程：手术切除病灶组织后，立即选取含有少量骨质的典型溶骨性破坏标本，无菌生理盐水冲洗后无菌纱布吸干残留水分，将标本置于液氮中速冻后保存于-80℃冰箱保存。
已向以上涉及的患者本人或委托人告知研究内容并取得知情同意。
(四)引物设计
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
二、方法
(一)小鼠正常乳腺组织分离
操作前手术器械进行高压蒸汽灭菌。操作时将8-10周的雌性BALB/c小鼠进行腹部皮肤剃毛，然后行颈椎脱臼法处死并将小鼠四肢固定于鼠板上，碘伏消毒后沿腹部中线剑突下切开，腹中线剪开皮肤，向两侧剥离，用大头钉固定剥离的皮肤，用小剪子和镊子对第四乳腺进行剥离。
(二)小鼠乳腺癌骨转移模型的建立
将荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞用PBS重悬，使其达到1x105/μl的浓度。将重悬后的肿瘤细胞直接注射入4-5周龄的BALB/c nu/nu小鼠的左心室，每只小鼠100μl的肿瘤细胞混悬液。每周用活体成像仪观察小鼠在体荧光信号，约28周后可从活体成像仪上观察到骨转移灶的形成。届时处死小鼠，根据活体成像仪显示的荧光信号位置留取骨转移组织标本，液氮速冻后保存于深低温冰箱。
(三)RNA抽提
(1)抽提细胞RNA：吸去培养基，PBS洗涤2遍，每个小盘(35mm培养皿)加入1mlTrizol，静置5分钟，将Trizol转移至EP管，吹打混匀。抽提组织RNA：提前用DEPC水处理研钵，绿豆大小组织在充满液氮的研钵中研磨成粉，将组织粉末转移至EP管，直接加入1mlTrizol，震荡混匀。
(2)在以上含有Trizol处理的细胞或组织中加入200μl氯仿，涡旋混匀，室温下放置5分钟。
(3)以12000g，4℃，离心15分钟。
(4)取无色上清(约500μl)(注意不要触及中间蛋白层和下面的Trizol层)至新的EP管，加入500μl异丙醇后上下颠倒混匀，室温放置5分钟。
(5)以12000g，4℃，离心10分钟，对光观察管壁可见白色沉淀附着。
(6)小心吸去上清，留下沉淀，加入DEPC水配置的75％乙醇1ml。
(7)以7500g，4℃，离心5分钟。弃上清，加入40μlDEPC水溶解RNA沉淀。
(8)测定RNA浓度后储存于-80℃。
(四)Real-time PCR
1.逆转录细胞及组织cDNA
用于检测mRNA表达的cDNA用TaKaRa逆转录试剂盒(DRR036A)进行逆转录。反应体系如下：
反应条件：37℃15min，85℃5sec，降温至4℃后-20℃保存备用。
用于检测miRNA表达的cDNA则用茎环法逆转录，反应体系如下：
反应条件同上，逆转录产物于-20℃保存备用。
2.Real-time PCR
使用TaKaRa SYBRPremix Ex Taq试剂盒(DRR420A)，反应体系如下：
反应条件：95℃30，(95℃5s，60℃20s)×40个循环，72℃10min，检测溶解曲线。
(五)原位杂交
1、探针制备：miR-124锁核苷酸探针序列(miR-124probe)：GCACAAGUGUCGCCUGGAACUA。
2、试剂盒：microRNAISH Optimi-zation Kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)。
3、实验步骤：用二甲苯对乙醇固定石蜡包埋的组织切片进行脱蜡，脱蜡后PBS洗涤3次，用15mg/mL的蛋白酶K(proteinase K)于37℃孵育8min以增加组织通透性，梯度酒精脱水后切片加入40nmol/L miR-124probe 50℃孵育120min进行杂交反应，反应结束后依次用加热至50℃的5×柠檬酸钠、1×柠檬酸钠和0.2×柠檬酸钠各洗20min，滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物4℃孵育过夜，PBS洗涤4次后滴加显色液，4℃避光孵育过夜，将玻片放在TE溶液中20min以终止反应。依次过梯度酒精、二甲苯，中性树胶封片后于显微镜下观察结果。
(六)miRNC mimic或inhibitor转染
转染前18小时将MDA-MB-231细胞消化并分到6孔板，每个孔大约40％融合度。取4个EP管，每管加入120μl转染buffer(广州锐博生物技术有限公司，C10511-05)，再加入miRNA mimic和inhibitor(mimic NC 5μl、miR-1245μl、inhibitor NC 10μl、miR-124inhibitor 10μl)最后每个EP管各加入12μl riboFECTTM CP转染试剂(锐博公司)，吹打混匀，室温静置孵育15分钟后，均匀滴入6孔板中。转染24小时候更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养液。转染48小时后收集上清以备下一步实验。
(七)BMM细胞分离与培养
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)被视为破骨前体细胞，它可在细胞因子刺激下分化为多核破骨细胞。本部分内容拟从小股骨分离BMM，具体流程如下：
1、选取6周龄左右的BALB/c小鼠，处死后放入75％酒精浸泡，10分钟后将小鼠置于无菌培养皿，用无菌手术器械剔除下肢所有毛皮及肌肉组织，暴露双侧股骨，尽力刮除股骨上残余组织，尽量使游离下来的股骨保持完整；
2、将分离好的股骨先后浸泡于75％的酒精和PBS溶液中，各5分钟；
3、配制培养基：α-MEM 9ml、胎牛血清1ml、青霉素和链霉素混合液100μl、M-CSF5nmol；
4、将1个直径80μm的滤网置于10mm无菌培养皿，无菌剪去除股骨两端，一手用无菌镊子固定小鼠股骨，另一手持1ml注射器吸取已配好的培养基从股骨一端向另一端冲洗，将骨髓腔中的内容物冲洗至滤网中，反复数次；
5、移除滤网，将刚才操作过的培养皿盖好盖子，放入37℃，5％二氧化碳的培养箱培养过夜；
6、取过夜后的上清放入15ml离心管中，900rpm，室温离心5分钟，弃上清；
7、再次准备培养基：含10％胎牛血清的α-MEM培养基加入20nmol/ml的M-CSF，将离心后的细胞均匀混悬于准备好的培养基中，接种于24孔板中，每孔500μl，培养48h后可以继续实验。
(八)TRAP染色
抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色在本部分用于检测BMM向破骨细胞分化的程度。TRAP染色试剂盒购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司，具体操作步骤如下：
1、取出含有BMM细胞的24孔板，吸去每孔的培养基，PBS洗涤3次；
2、取出冻存的固定液，融化至室温，每孔加入固定液0.5ml，静置30s；
3、弃去固定液，去离子水洗涤3次；
4、配置染色液：0.1ml快速石榴红GBC底液+0.5ml亚硝酸钠溶液，温和混匀，避光静置2min，再加入去离子水9ml+萘酚AS-BI phosphqte 0.1ml+醋酸盐溶液0.4ml+酒石酸盐溶液0.2ml，混匀后加热至37℃；
5、弃去去离子水，每孔加入0.5ml染色液，37℃避光孵育1h；
6、弃去染色液，去离子水洗涤3次，苏木紫复染2min；
7、自来水冲洗数次，晾干，显微镜下观察。
三、统计学处理
所有实验至少重复3次。数据以X±SD，即均数±标准差表示，用SPSS17.0统计软件进行统计分析。t检验用于方差齐性的两组比较，非参数检验用于方差非齐性的两组比较。相关性分析采用Pearson相关性分析。分别计算P值，P<0.05为具有显著性差异。
四、结果
1.miR-124在乳腺癌细胞中表达下降
分离正常大鼠乳腺组织和培养不同恶性程度的乳腺癌细胞，抽提组织和细胞RNA，Real-time PCR结果显示乳腺癌细胞中miR-124表达较正常小鼠乳腺组织显著下调(乳腺癌细胞株与正常乳腺组织相比p均小于0.05)，且骨转移性较高的三阴乳腺癌细胞株BT549、MDA436、MDA468、MDA-MB-231和Hs578t细胞中表达较转移性较低的细胞株MCF7、T47D和BT474显著减少(P＝0.007)(图)。
2.小鼠乳腺癌骨转移组织中miR-124表达下调
小鼠左心室注射MDA-MB-231细胞制备乳腺癌骨转移模型。Real-time PCR结果显示与母代细胞相比，小鼠乳腺癌骨转移组织中miR-124的表达显著下调(图2)。
3.人乳腺癌骨转移组织中miR-124表达下调，且表达低的患者无骨转移生存期短
收集乳腺癌患者原发癌组织、相应的癌旁组织和骨转移组织标本，原位杂交法检测miR-124表达，结果显示与癌旁组织相比，患者乳腺癌组织中miR-124表达明显减少，而骨转移组织中miR-124表达较乳腺癌组织进一步减少(图3)。Real-time PCR法检测20例人乳腺癌骨转移标本中miR-124表达，分析其表达与患者无骨转移生存期(Bone-metastasis-free survival，BM-free survival)的相关性，结果显示miR-124表达与患者无骨转移生存期呈显著正相关(r2＝0.4769，p＝0.0007)，即miR-124表达高者BM-free survival较长，而miR-124表达低者BM-free survival较短(图4)。以上结果提示miR-124表达下调是乳腺癌患者发生骨转移过程中的重要事件，并有可能预测乳腺癌患者发生骨转移时间。
4.体外调控乳腺癌细胞中miR-124表达可促进破骨细胞分化
4.1乳腺癌细胞中的miR-124可抑制BMM细胞向破骨细胞分化
MDA-MB-231细胞转染miR-124mimic和NC或miR-124inhibitor和inhibitor NC后收集各组上清培养BMM细胞，TRAP染色结果显示miR-124mimic组破骨细胞分化较NC组显著减少，而miR-124inhibitor组破骨细胞分化较inhibitor NC组显著增加(图5、图6)。
4.2上调乳腺癌细胞中miR-124表达可增加成骨细胞OPG/RANKL比值，而抑制miR-124作用降低OPG/RANKL比值
OPG是成骨细胞成熟过程中分泌并抑制破骨细胞分化的蛋白，而RANKL是成骨细胞分泌并促进破骨细胞分化的蛋白，故OPG/RANKL比值增加表示成骨细胞抑制破骨细胞分化的能力较强，而该比值减少表明成骨细胞促进破骨细胞分化的能力较强。我们将miR-124mimic和NC转染至MDA-MB-231细胞后收集condition medium培养成骨细胞前体细胞3T3E1细胞，Real-time PCR结果显示miR-124mimic上清组3T3E1细胞中OPG与RANKL比值增加。反之，MDA-MB-231细胞转染miR-124inhibitor或inhibitor NC后收集上清培养3T3E1细胞，Real-time PCR结果显示miR-124inhibitor上清组3T3E1细胞中OPG与RANKL比值降低(图7)。
4.3上调乳腺癌细胞miR-124表达抑制成骨细胞及促进破骨细胞分化的能力
MDA-MB-231细胞转染miR-124mimic或NC后分别和3T3E1细胞共培养，收上清培养RAW264.7细胞，Real-time PCR结果显示miR-124mimic组上清培养的RAW264.7细胞中与破骨细胞分化相关的指标TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表达显著下调。
五、讨论
本发明通过原位杂交法检测miR-124在人乳腺癌和癌旁组织中表达，结果提示miR-124在乳腺癌标本中表达下调。同时，本发明首次检测miR-124在乳腺癌骨转移组织中的表达，并发现miR-124在乳腺癌骨转移组织中较乳腺癌组织表达进一步下调，且其表达与患者无骨转移生存期相关，即miR-124表达高者，从原发乳腺癌到发生骨转移的时间较长，反之，miR-124表达低者，从原发癌到骨转移时间较短，提示miR-124可以作为判断乳腺癌患者发生骨转移时间的重要指标。同时也进一步提示miR-124表达下调是乳腺癌骨转移过程中的重要事件。
本发明首次关注乳腺癌细胞中的miR-124对骨微环境的作用，并通过gain-of-function和loss-of-function实验证实体外调控miR-124表达可直接抑制破骨细胞分化或抑制成骨细胞诱导的破骨细胞分化。乳腺癌细胞要到达骨骼并形成转移灶需经过增殖、迁移、侵袭、粘附等环节到达骨微环境，并和骨微环境中的成骨细胞、破骨细胞等细胞发生相互作用。因此本部分研究内容为miR-124在乳腺癌疾病发展过程中的作用填补了重要一环，即乳腺癌患者癌组织中miR-124因甲基化等原因表达下调后，肿瘤细胞大量增殖，发生上皮间质转型，迁移和侵袭能力增强，到达骨微环境后又促进了破骨细胞分化导致溶骨性骨转移灶的形成。综上所述，miR-124不仅可能成为判断乳腺癌患者预后的重要指标，还可能成为乳腺癌治疗的新靶点。
实施例2miR-124抑制乳腺癌骨转移的分子机制
一、材料
(一)细胞株
人胚胎肾脏(HEK)293细胞株，由华东师范大学生物工程学院提供。
(二)引物设计
所有引物均是针对人基因设计，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
二、实验方法
(一)Real-time PCR
参照实施例部分相关实验。
(二)Western blot
主要用于检测乳腺癌细胞中IL11蛋白表达。
1、电泳：取适量RIPA裂解液裂解细胞，测定蛋白浓度后，配置10％的PAGE胶，各组分分别取50μg总蛋白上样电泳。根据marker电泳情况判断目的蛋白已充分分离后停止电泳。
2、转膜(湿转法)：取出凝胶，根据marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，准备好与PAGE胶大小相同的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电缓冲液中。按照黑色版-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色版依次放好，将黑色板夹紧后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。转膜条件：200mA，70min。
3、封闭：用含5％脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。
4、一抗：用封闭液稀释IL11一抗(Santa cruz Biotechnology，USA)(1:500稀释)，将PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。
5、二抗：TBST充分洗涤PVDF膜5次，5min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗---1:50000稀释，将膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2h。
6、显色曝光：TBST充分洗涤PVDF膜5次，5min/次。每张膜滴加适量的ECL底物液，孵育5min。待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。
(三)构建psiCHECK-2-IL113′-UTR荧光素酶报告基因质粒
(1)PCR获取IL113′UTR片段
反应条件：(98℃10s+68℃1.5min)×30个循环
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定其为1562bp的单一条带。
(2)酶切
对上一步的PCR产物进行酶切：
反应条件：37℃孵育2h。
对psicheck2质粒进行酶切：
反应条件：37℃孵育2h后加入去磷酸化酶1μl孵育1h。
(3)DNA片段钝化：购买Takara公司DNA片段纯化试剂盒，按其说明书进行操作。纯化后取适量DNA进行电泳鉴定明确psicheck2质粒是否酶切完全。
(4)连接：将酶切后的片段质粒和骨架质粒进行连接(
反应条件：16℃孵育过夜。
(5)转化：按DH5α感受态细胞说明书进行。
(6)酶切鉴定
转化14小时后含氨苄霉素的琼脂糖平板长出多个克隆，随机挑取6个克隆，放入LB培养基中震荡过夜。14小时后用质粒抽提试剂盒抽提质粒。质粒定量后用NotI酶和XhoI酶再次进行双酶切，酶切产物进行电泳，选取阳性克隆送上海生工公司测序。保存好测序正确的质粒备细胞学实验用。
(四)构建psiCHECK-2-IL113′-UTR结合位点突变型荧光素酶报告基因质粒
采用重叠延伸PCR法对IL113′-UTR上miR-124结合位点进行突变，具体如下：
(1)进行2次PCR扩增出两种DNA片段。第一次PCR使用的引物a为构建IL113′-UTR全长报告基因质粒时使用的Forward引物，而引物b为将IL113′-UTR上miR-124结合位点突变设计的反向引物；第二次PCR使用的引物d为构建IL113′-UTR全长报告基因质粒时使用的Reverse引物，而引物c为将IL113′-UTR上miR-124结合位点突变设计的正向引物。
反应条件：(98℃10s+68℃1.5min)×30个循环
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定为大小正确的单一目的条带。
第三次PCR以前两次PCR扩增出的DNA片段为模板进行再次PCR。
反应条件：(98℃10s+68℃1.5min)×30个循环
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定获得单一目的条带。
第三次PCR的产物经NotI和XhoI双酶切，并与双酶切后的psicheck2质粒连接、转化、酶切鉴定及测序，具体方法与实施例1相同。实验流程见图9。
(五)检测IL113′-UTR报告基因质粒活性
(1)将HEK-293细胞分到24孔板(1.5×105/孔)。
(2)用lipofectamine 2000将NC和miR-124mimic与IL113′-UTR报告基因质粒(野生型和突变型)转染至HEK-293细胞。分组如下：NC+IL113′-UTR wild type、miR-124mimic+IL113′-UTRwild type、NC+IL113′-UTR mutant、miR-124mimic+IL113′-UTRmutant。
(3)双报告基因试剂盒(E2920，Promega，USA)检测报告基因活性
用胰酶消化细胞后将细胞收集至EP管。吹打混匀后吸取细胞悬液加入384孔板(15μl/孔)。每孔加入15μl Dual-GLO I，吹打混匀。室温避光孵育10min，酶标仪读数后计算并比较各组的荧光素酶数值。
(六)免疫组织化学
利用免疫组织化学法检测IL11。
1、组织切片常规脱蜡至水。
2、3％过氧化氢室温孵育10min。蒸馏水洗3次。
3、抗原修复：将蛋白酶K储存液用稀释液1：:20稀释配制工作也，滴于玻片上，湿盒内37℃孵育30min，PBS洗涤3次。
4、用10％山羊血清室温封闭30min，弃去多余液体。
5、按1:100稀释IL11抗体，滴于切片上，4℃孵育过夜。
6、吸掉一抗，PBS洗涤3次，每次2min。
7、滴加二抗，室温孵育30min。PBS洗涤4次，每次5分钟。
8、显色：滴加DAB显色液，室温下显微镜下观察组织切片，达到合适显色程度时终止反应。
9、苏木素复染。脱水，透明，封片，拍照观察。
三、统计学处理
数据以X±SD表示，用SPSS17.0进行统计分析。方差齐性的两组比较采用t检验，方差非齐性的两组比较采用非参数检验，分析miR-124和IL11表达相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为具有显著性差异。
四、结果
1.IL11为miR-124的潜在靶基因
为明确miR-124抑制乳腺癌骨转移的分子机制，我们利用TargetScan软件预测其靶基因，并从中挑选可能与肿瘤和骨微环境相关的miRNA，结果显示白介素11(Interleukin11，IL11)的3′-UTR区含有miR-124的结合位点(图10)，且该位点在多个物种中高度保守(图11)。
2.miR-124可负调控IL11的表达
2.1体外上调miR-124可下调MDA-MB-231细胞中IL11表达
我们将NC和miR-124mimic转染至MDA-MB-231细胞，Real-time PCR结果显示miR-124mimic可显著下调IL11的mRNA水平(p<0.01)；Western blot结果显示miR-124mimic使IL11蛋白表达明显减少(图12)
2.2体外抑制miR-124作用可促进MDA-MB-231中IL11表达
为进一步明确miR-124对IL11的调控作用，我们将miR-124inhibitor和NCinhibitor转染至MDA-MB-231，Real-time PCR结果显示miR-124inhibitor可显著上调IL11的mRNA水平(p<0.05)；Western blot结果显示miR-124inhibitor使IL11蛋白表达明显增加(图13)。
3.双报告基因实验证实IL11是miR-124直接靶基因
为进一步明确miR-124是否通过结合IL11的3′-UT而抑制其表达，我们构建了含有miR-124结合位点的IL113′-UT荧光素酶报告基因质粒psiCHECK2-IL11-3′UTR(WT)。将野生型报告基因质粒(WT)与miR-124mimic共转染至HEK-293细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-124mimic组荧光素酶活性较NC组下降54％(P<0.001)。我们又构建了miR-124结合位点突变的荧光素酶报告基因质粒psiCHECK2-IL11-3’UTR-mutant(MUT)报告基因质粒。将其与miR-124mimic共转染入细胞后，报告基因检测结果显示NC组合miR-124mimic组报告基因活性无显著差别(图14)，证实miR-124可结合于IL11的3’-UTR区。
4.乳腺癌细胞核骨转移组织中miR-124和IL11表达呈负相关
(1)正常乳腺组织和乳腺癌细胞中IL11与miR-124的水平呈负相关
Real-time PCR法检测正常小鼠乳腺组织和乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表达，相关性分析结果显示IL11与miR-124表达呈显著负相关，r2＝0.4497(P＝0.048，线性回归)(图15)。
(2)小鼠乳腺癌骨转移组织中IL11和miR-124表达呈负相关
Real-time PCR法检测乳腺癌骨转移模型骨转移灶组织和母代MDA-MB-231细胞中IL11表达，相关性分析结果显示IL11与miR-124表达呈显著负相关，r2＝0.5011(P＝0.01，线性回归)(图16)。
(3)人乳腺癌骨转移组织中IL11和miR-124表达相关性
免疫组化法检测乳腺癌患者原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织标本中IL11的表达，结果显示与癌旁组织相比，人乳腺癌组织中IL11表达明显增加，在骨转移标本中表达进一步增加(图17)，提示IL11在乳腺癌发生发展过程中表达趋势与miR-124相反。
(4)采用Real-time PCR法检测20例人乳腺癌骨转移标本(与实施例1相同)中IL11mRNA表达，相关性分析结果显示IL11的表达与miR-124表达呈显著负相关，r2＝0.4111(P＝0.0023，线性回归)(图18)
五、讨论
本实施例实验通过软件预测和报告基因实验首次证实IL11是miR-124的靶基因。miR-124可通过直接抑制破骨细胞分化或通过成骨细胞调控破骨细胞分化，以上作用与IL11在骨代谢中的作用相吻合，表明IL11可能部分介导了乳腺癌细胞中的miR-124在骨转移溶骨性病变产生中的作用。我们进一步分析了miR-124与IL11在乳腺癌细胞、小鼠乳腺癌骨转移组织以及人乳腺癌骨转移组织中表达的相关性，结果显示二者呈显著负相关，进一步提示了miR-124在乳腺癌进展过程中通过调控IL11的表达参与了骨转移的发生。综上，miR-124这一重要的抑癌基因和IL11这一重要的促骨转移细胞因子之间形成的新的相互作用将为乳腺癌骨转移的诊断和治疗提供新的思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
