一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、绵羊及牛的导致山羊痘(variolacaprin，Goatpox)、绵羊痘(variolacaprin，Sheeppox)和牛的疙瘩皮肤病(Lumpy skin disease)的一种急性、热性、接触性传染病。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，因其与羊传染性脓疱(俗称羊口疮)存在临床症状上的相似性、血清学反应的交叉性，以及内脏型羊痘的频发给该病的确诊造成更大的困难。单域抗体(VHH)是目前可以获得具有结构稳定、功能完整、可结合抗原的最小结构单元，由于其免疫原性低、易表达、亲和力高、耐热等特点成为当前分子影像研究的重要靶标分子。要建立羊痘早期快速诊断技术，明确羊痘病毒的致病机理，需从病毒的功能性抗体入手，通过病毒新型纳米VHH抗体文库来筛选病毒功能抗体是解决该问题的关键，而构建VHH cDNA文库是解决该问题的基础。
VHH单域抗体可特异识别病毒和其它致病微生物的特殊结构蛋白，协助宿主抗感染免疫防御已得到广泛应用。有研究者将该单域抗体与乳酸杆菌表面蛋白融合，可表达于乳酸杆菌表面，以此喂食小鼠可显著降低由轮状病毒引起的痢疾发病率。由于多数寄生虫可通过虫体表面覆盖的各类糖蛋白逃脱宿主免疫防御，单域抗体也可用于寄生虫感染的诊断和治疗小分子特异单域抗体偶联荧光染料后，可识别寄生虫表面糖蛋白并渗透进入虫体，以此检测血液中的寄生虫感染，若偶联β内酰胺酶则可将头孢菌素等前药转化为毒性药物杀死寄生虫。Kim等研究表明，将超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)和ScFv组成abf-SPIONs，对治疗癌胚抗原(CEA)具有潜在作用。Shanta等指出，应用针对淀粉样前体蛋白(APP)的ScFv抑制阿尔茨海默氏病细胞β-分泌酶的活性，解决了mAb在治疗过程中的困难。Hultberg A等通过9个甘氨酸丝氨酸残基连接的呼吸道合胞体病毒(RespiratorySyncytial Virus，RSV)双特异性纳米抗体RSV-D3/E4(9GS)微量中和RSV病毒的能力是RSV-E4/D3(9GS)的17倍，IC50为6nmol/L。
抗体库的容量和多样性很大程度上影响从中淘选出特异性抗体的概率以及抗体的亲和力。自1976年构建的第一个cDNA文库以来，其方法不断的改进，其中SMART(switching mechanism at 5’end of the RNA transcript)方法构建的cDNA文库能够代表原有样品中mRNA的丰度，保存了生物遗传信息的完整性。而且该方法只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA(RACE),和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。同时酵母双杂交技术能够从构建的宿主细胞cDNA文库中筛选出与已知目的蛋白相互作用的蛋白，因此构建酵母文库显得尤为重要。
综上所述，构建抗羊痘病毒酵母cDNA抗体文库，筛选具有羊痘病毒型特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其单域抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的羊痘病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法，提供一种具备相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达等优势的抗羊痘病毒的双峰驼VHH重链单域抗体酵母cDNA文库及其制备方法。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明的一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法，一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其包括羊痘弱毒苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价。
一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，所述山羊痘弱毒苗免疫骆驼剂量为：首免6头份、二免12头份、三免8头份、四免8头份；所述免疫程序为：卡介苗致敏1周后，山羊痘弱毒疫苗首免、第15天二免、第30天三免、第60天四免；所述血清抗体效价为：空白OD450＝0.049、阴性对照OD450＝0.054、阳性对照OD450＝2.250、四免后血清OD450＝3.055。
一种抗羊痘病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，其包括以下步骤：
(1)骆驼淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化；
(2)CDSⅢ和SMART引物逆转录合成全长cDNA；
(3)设计两套扩增引物，采用同源重组的方法将扩增产物与pGADT7共转染酵母细胞Y187；
(4)构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库；
(5)计算文库库容量；
(6)扩增cDNA文库进行质量评价。
所述步骤(1)中分离淋巴细胞中Total RNA浓度为4329ng/ul，纯度OD260/OD280为1.98。
所述步骤(3)中第一轮扩增引物为：
SEQ ID NO.1：5'-GTCCTGGCTGCTTCTACAAGG-3’，
SEQ ID NO.2：5'-GGTACGTGGTTGAACTGTTCC-3’。
第二轮扩增引物为：
SEQ ID NO.3：5'-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAAGTGGGAGTCTGGGGGAGG-3’，
SEQ ID NO.4：5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT-3’。
所述步骤(4)中构建酵母cDNA文库库容为2.0x106cfu/ml。
本发明涉及淋巴细胞的分离：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等，其体积、形态和密度与其它细胞不同，根据这一原理，利用淋巴细胞分离液，经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离，将分离到的淋巴细胞重悬于RNAlater，该RNAlater是防止RNA降解的淋巴细胞保存剂，避免RNA由于长期保存或使用不当引起降解从而达不到建库要求。
本发明涉及全部VHH cDNA的制备，普通情况下，mRNA以oligo(dT)为引物，在普通逆转录酶作用下进行逆转录，其合成的cDNA长度是有限的，往往涵盖不了mRNA的丰度，这样得到的文库不具备广谱性。本发明以一种改造的oligo(dT)寡苷酸作为引物(CDSⅢ)，在MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆转录酶催化作用下合成第一链，在合成cDNA的反应时由于事先加进的3’末端带Oligo(dG)的SMART(RNA5’端转录切换机构)引物，当合成cDNA到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC)，SMART引物的Oligo(dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的cDNA是高质量、高产量的全长cDNA，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接构建cDNA文库、扩增基因、已知序列钓全长cDNA(RACE)和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。
本发明构建的酵母cDNA文库具有相对分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展前景。另外，本发明针对羊痘病毒构建的cDNA文库是一种具备型特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立敏感羊痘病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。
本发明的优点是：本发明提供了一种具备相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达等优势的抗羊痘病毒的双峰驼VHH重链单域抗体酵母cDNA文库及其制备方法。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1为总RNA完整性电泳检测图，其中DNA分子量marker：Lambda EcoT14I digest；250bp DNA Ladder marker；
图2为pGADT7-cDNA文库质粒验证结果图；
图3为pGADT7-cDNA文库插入片段扩增验证结果图，其中DNA分子量marker：LambdaEcoT14I digest；250bp DNA Ladder marker。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明进行详细说明。
实施例1
羊痘弱毒苗免疫骆驼实验
选取两月龄母骆驼，先采血制备阴性血清，然后前腿三角肌外侧皮内注射卡介苗进行致敏并进行观察，1w后于骆驼另一侧尾根内侧及股内侧皮内分点进行免疫：首次免疫剂量为6头份羊的免疫量；第15天进行二免，剂量为12头份；第30天进行三免，剂量为8头份；第60天进行四免，剂量为8头份；第70天于颈静脉采集骆驼血，分离血清，羊痘抗体检测试剂盒(美国Q&D公司)检测血清抗体效价。
检测结果为：空白OD450＝0.049；阴性对照OD450＝0.054；阳性对照OD450＝2.250；第四次免疫后骆驼血清OD450＝3.055。可见，血清抗体效价比较好。
实施例2
分离淋巴细胞，制备总RNA并纯化mRNA
1.制备抗凝剂：480mg/100ml；柠檬酸钠1.32g/100ml，葡萄糖1.47g/100ml，高压灭菌后备用，抗凝剂用量为17.5％。
2.分离淋巴细胞
骆驼第4次免疫后1周，颈静脉采集骆驼抗凝血100ml，等量加入全血稀释液，混匀；以5:9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm,18-22℃,20min；小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机1000rpm,18-22℃,10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1000rpm,18-22℃,10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，将其悬浮于RNAlater中，置-70℃保存备用。
3.细胞总RNA收获
吸取上述淋巴细胞液400ul，加入1mlTRizol，混匀，4℃静置5min；加入200ul三氯甲烷，混匀，室温静置3min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取750ul上清，加等量异丙醇，室温静置10min，10000r/min，4℃，离心10min；轻弃上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；20ul无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总RNA，ND2000测得Total RNA浓度为4329ng/ul，纯度OD260/OD280为1.98。其电泳检测见图1
4.mRNA纯化
细胞Total RNA中mRNA利用Oligotex mRNA Mini Kit分离纯化方法进行分离纯化，将上述总RNA稀释至500ul体积，加入500μLOBB缓冲液，混匀，70℃水浴中孵化3min，25℃静置10min，12000r/min，4℃，2min；吸弃上清，400μL OW1缓冲液重悬沉淀，全量上柱，12000r/min，4℃，1min；弃滤液，400μL OW2缓冲液洗柱，12000r/min，4℃，1min；将柱置于新的1.5mL无RNA酶离心管，吸50μLOEB缓冲液到柱上，室温静置1min，12000r/min，4℃，1min，所得为纯化的mRNA，其浓度为101.3ng/ul，纯度OD260/OD280为1.96；28S、18S、5S 3条带清晰，28S:18S约为2:1，说明RNA和mRNA纯度较高，满足文库构建的需要。完整性验证的变性琼脂糖凝胶电泳如图1。
实施例3
全长cDNA合成、cDNA合成双链及纯化
1.全长cDNA合成
在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：
点击混匀，将离心管放置于72℃金属浴，孵育2min，立即置冰上，冷却2min，点击收集，依次加入下列组分：
点击混匀，将离心管放置于42℃金属浴，反转录1h，室温冷却，加入1ulRNA酶抑制剂(2u/ul)，得到的产物为全长cDNA,置-20℃保存备用。
2.cDNA合成双链及纯化
在0.2ml的PCR第一轮扩增管中依次加入下列组分：
上述扩增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min。将扩增产物电泳，凝胶纯化回收900bp产物，-20℃保存备用。
在0.2ml的PCR第二轮扩增管中依次加入下列组分：
上述扩增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min。扩增产物电泳，凝胶
回收试剂盒从凝胶中纯化收集400bp产物，置-20℃保存备用。
实施例4
cDNA文库的构建、质量评价及鉴定:
1.cDNA文库构建
采用PEG/LiAc法制备酵母Y187感受态细胞。每600uL感受态细胞转化20ul双链cDNA和6ul pGADT7-Rec，将转化的菌液均匀涂布于直径100mm的和150mm的SD/-Leu平板上，30℃倒置培养3-5d直至克隆出现。再次将平板置于4℃冰箱，放置3-4h。给每块平板加入5mL冻存液(含25％甘油的YPDA液体培养基)，并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液，所得产物为酵母cDNA初级文库，质粒鉴定结果如图2。
2.文库的质量评价
取共转化产物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀释，分别涂100ul稀释液至100mmSD/-Leu平板，30℃倒置培养3-5d直至克隆出现，对生长的单菌落计数，依公式：板子克隆数/铺板体积(ml)X稀释倍数＝菌斑形成单位/ml。计算得文库库容为2.0x106cfu/ml。
3.文库扩增鉴定
随机挑取16个单菌落，用pGADT-Rec通用测序引物进行菌落PCR，分析文库插入片段的大小以及重组率。PCR反应参数:94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取7ul PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳分析。图3电泳结果显示cDNA文库的覆盖范围为400-2000bp，平均插入片段约为1000bp。由菌落PCR结果可以得知文库的重组率为100％。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
