弓形虫检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种弓形虫检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma)中医叫三尸虫，属于顶端复合物亚门，孢子虫纲，真球虫目，等孢子球虫科、弓形体属，是细胞内寄生虫。寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。弓形虫是一种可通过水源和食源传播的寄生虫病，对人和动物健康具有极大潜在危险，它们寄生于宿主细胞内，可以感染包括人在内的所有恒温脊椎动物。弓形虫感染人在某些情况下，后果非常严重甚至有生命危险，例如妊娠期间的胎儿和免疫缺陷的人群。动物感染弓形虫会造成母畜流产、木乃伊胎、死胎，猪场爆发本病，死亡率更是高达60％以上。但是，目前检测弓形虫的方法比较常用的方法是ELISA法，普遍存在敏感性低、特异性差、存在假阳性的缺点。弓形虫的感染影响着人口素质，与优生优育有重要关系。
生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类，可以分为基因芯片和蛋白质芯片等两大类。相较于蛋白质芯片，基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用，特异性强，重现性好。基因芯片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的弓形虫检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
本发明实现其目的的技术方案为：
一种弓形虫检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。
一种弓形虫检测基因芯片，包括固体相和权利要求1所述的探针组。
作为优选地，所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。
一种弓形虫检测试剂盒，包括前述的基因芯片。
在上述弓形虫检测试剂盒中，还包括弓形虫靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.4、5所示。
作为优选地，所述引物对的下游引物的5’端含有生物素标记。
作为优选地，上述弓形虫检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。
在上述技术方案中，10μL的PCR反应体系包括：50～150ng/μL的扩增模板0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8～12μM的上、下游引物各0.2μL。
一种弓形虫检测方法，使用前述的弓形虫检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染弓形虫；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。
作为优选地，PCR扩增反应程序为95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。
本发明的有益效果是：设计三条高特异性的探针，当3条探针均检测出阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳性问题；本发明通过PCR技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过生物素标记，显色液进行显色后，可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读，直观的表现检测结果，检测操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断弓形虫感染提供可靠的实验依据。
附图说明
图1为检测弓形虫的基因芯片示意图。
图2为待测样品弓形虫基因扩增后PCR产物电泳条带图；Y-T：弓形虫；M:10000bp marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂及生产者：
氨基修饰的玻璃基片(武汉阳达生物科技有限公司)，病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒(货号DP438，天根生化科技(北京)有限公司)，亲和素(辣根过氧化物酶标记)(碧云天生物技术研究所)，TMB显色液(上海生工生物工程有限公司)，Premix Taq(TAKARA公司，日本):成分为PrimeSTAR HS DNAPolymerase,dNTP Mixture,PrimeSTARBuffer。
引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。
实施例1目的片段引物与探针设计
查找NCBI数据库中弓形虫的基因序列，选择高特异性的基因序列作为靶序列(ID号为：AF179871.1)，设计引物与探针。靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计弓形虫靶基因的扩增引物与探针，为了使芯片结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读，在弓形虫靶基因扩增引物的R引物5’端用生物素进行标记，具体序列如下：
弓形虫(TOX)靶基因扩增引物：
F引物(TOX-F):5’-CGTATTGTCGAGTAGATCAG-3’(SEQ ID NO.4)，
R引物(TOX-R):5’-biotin-TCGCTGCGGA GACAGCGAAG(SEQ ID NO.5)-3’。
TOX并联探针：
TOX探针1：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACATCCGTTCATGAGTATAAG-3’(SEQ IDNO.1)，
TOX探针2：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGACGCTAATGTGTTTGCA-3’(SEQ IDNO.2)，
TOX探针3：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGAAATTCATGAGTATCT-3’(SEQ IDNO.3)。
实施例2芯片的制备
将实施例1中TOX的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上，得到含有探针的基因芯片(如图1所示)。探针浓度为30μM，每个点0.2μL，然后80℃孵育1.5小时。
表1弓形虫检测芯片探针排列顺序
实施例3检测方法
1、待测样品基因组提取
使用病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基因组作为扩增模板。
2、PCR扩增目的片段
经过大量实验摸索，确定TOX检测的靶基因PCR扩增体系和PCR反应程序。
总体积为10μL的PCR扩增体系含有如下试剂：
PCR反应程序为：95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。
3、PCR产物与芯片杂交
按照如下步骤操作：
a.在实施例2中制备好的基因芯片上，将待测样品的PCR扩增产物点样到3个探针的检测孔中，具体步骤为：PCR产物95℃解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产物与杂交缓冲液(50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS)等体积混合，每孔点10微升混合液，在湿盒中，于60℃杂交孵育2小时。
b.取出孵育后的基因芯片，用洗涤液(0.3×SSC缓冲液)清洗3次，晾干芯片。
c.将亲和素(辣根过氧化物酶标记)加到晾干的芯片上，室温孵育10min。
d.用洗涤液(0.3×SSC缓冲液)清洗3次后晾干。
e.在晾干的基因芯片上点样TMB显色液，反应15分钟，拍照，统计结果，检测对象为阳性的样品TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色。
实施例4检测待测样品
从第三军医大学获取感染了弓形虫的样本20份(阴道分泌物)，按照实施例1和3中的引物和方法分别提取待测样品的基因组，进行PCR扩增后，使用实施例2中的基因芯片进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带表明本发明设计的弓形虫靶序列扩增引物特异性高，能特异、灵敏地扩增出目标基因(如图2所示)。
对于感染了弓形虫的样品，TMB显色反应后溶液颜色由蓝色变为黄色，表明样品为阳性，感染了该病原体，检测中设置阳性和阴性对照。判断检测结果时，当三个探针均显示阳性时才判断该样品感染了病原体，如果其中某一个或者两个探针显示阴性，则应对该检测样品重新检测，三个探针结果须一致才能采信该检测结果。三个探针检测结果不一致时，也可使用现有其它技术(比如Elisa方法)进一步检测验证。
使用本发明方法检测的20份已知阳性样品中，有19份样品检测时，基因芯片上的3个并联探针均显示阳性，与实际情况相符；另外1份样品的检测结果显示，3个并联探针中2个探针显示阳性、1个探针显示阴性，对这份可疑样品利用本发明的基因芯片重新检测，3个探针均显示阳性，并且利用Elisa方法对该样品进一步检测确认，Elisa结果显示该样品为感染弓形虫阳性。本发明的探针、基因芯片、试剂盒，特异性高、结果非常准确，检测快速、工作效率高，操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断弓形虫感染提供可靠的实验依据。
