mRNA片段化方法及基于其构建测序文库的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种使mRNA样本片段化的方法，以及基于该mRNA片段化方法构建测序文库的方法，以及所构建测序文库在高通量测序中的应用。
背景技术
新一代测序技术又称高通量测序技术，其主要特点是测序通量高，测序时间短和测序成本低。RNA-seq又称转录组测序技术，即用高通量测序技术把mRNA、小RNA(smallRNA)、非编码RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列测出来，以检测它们的表达水平。
通常，在构建RNA测序文库时，需要首先纯化mRNA，然后把纯化得到的RNA样本片段化，最后在待测序列片段的两端加测序接头。目前加接头的方法有很多种，可以在mRNA水平或在cDNA水平上通过连接法加接头，也可以在反转录时通过随机引物引入接头。加接头的方法不同，建库流程的繁琐程度及建库成本也将大有差异。
为解决现有的RNA测序文库构建中存在的接头连接步骤过多，整体文库构建时间长等问题，特提出了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提出一种mRNA样本的片段化方法，以及基于该mRNA片段化方法构建RNA测序文库的方法。本发明的mRNA片段化方法在适当比例和投入量的正、反向桥式探针的存在下，通过一步反转录及连接反应即可实现对mRNA样本的打断，不需要对样本进行另外的物理性打断，且在反转录时tttt同时引入两端接头，得到带有两端接头的cDNA文库，省去了传统方法建库中末端修复、先加一端接头、再加另一端接头的繁琐步骤。基于上述mRNA片段化方法所得到的两端带接头的cDNA文库，可直接进行环化反应，得到单链环状核酸的测序文库，实现PCR-free(无需PCR扩增)的测序文库构建；也可先通过PCR扩增上述cDNA文库，再进行环化反应，得到单链环状核酸的测序文库。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种使mRNA样本片段化的方法，其包括：
(1)以所述mRNA样本为模板，以下述正向桥式探针和反向桥式探针的混合物为引物，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应；
所述反向桥式探针的3’端区域含双链DNA接头1，其5’端游离且为由4-9个碱基组成的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，但不延伸；
所述正向桥式探针的5’端区域含双链DNA接头2，其3’端游离且为由4-9个碱基组成的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，并在逆转录酶的作用下向3’端延伸，直至所述反向桥式探针结合处；
(2)在连接酶的作用下，使正向桥式探针经延伸的3’端与反向桥式探针的5’端进行连接反应，形成两端分别带双链DNA接头1、2的cDNA片段。
上述mRNA样本片段化方法中，作为优选，步骤(1)中，所述mRNA样本为经纯化的mRNA样本；
优选地，所述mRNA样本的纯化方法包括如下步骤：
(1’)采用特异性针对rRNA的寡核苷酸探针，使其与总RNA中的rRNA进行杂交，形成DNA:rRNA杂交体；
(2’)使用RNaseH消化步骤(1’)所得DNA:rRNA杂交体中的rRNA；
(3’)使用DNaseI消化步骤(2’)所得产物中的DNA寡核苷酸探针。
上述mRNA样本纯化方法中，优选地，所述寡核苷酸探针是至少10个50nt的短片段的等分子量的混合物，其序列与18S、25S rRNA、28SrRNA、12S mtrRNA、16S mtrRNA和5.8S RNA互补，此外还包括3种针对血液样品中的球蛋白RNA的寡核苷酸探针，可以更好地去除血液中的球蛋白RNA，得到高纯度的原始转录本RNA。
上述mRNA纯化方法，采用寡核苷酸探针与rRNA杂交以去除rRNA、富集mRNA，与传统的oligo-dT磁珠法相比，避免了富集到的mRNA具有3’偏向性，使富集到的mRNA更均一；并且，对样本的质量要求也没那么苛刻，即使样本有轻度的降解，也可以用于后续的测序，获得较好的测序数据。此外，上述纯化mRNA的方法不仅可以富集到带有polyA的mRNA，还可以富集不完整的mRNA及不带polyA的mRNA，甚至可以富集ncRNA、snoRNA等感兴趣而oligo-dT磁珠法难以富集的RNA。该mRNA纯化方法，与oligo-dT磁珠法相比，测序数据有更好的随机性、基因覆盖度、QPCR相关性及基因表达量相关性。
上述mRNA样本片段化方法中，作为优选，所述反向桥式探针或正向桥式探针中的随机序列由6个或9个碱基组成；
优选地，所述反向桥式探针的3’端区域包括标签序列；
优选地，所述正向桥式探针与反向桥式探针的加入量之比为10:1～1:20，优选为1:2。
最终的cDNA片段文库中，cDNA片段的大小取决于相邻两个正、反桥式探针的距离，而这取决于正、反向桥式探针的加入量及加入比例。
作为优选，上述mRNA样本片段化方法还包括以下步骤：
(3)用RNase酶处理步骤(2)所得产物，以去除mRNA模板，并对其进行变性处理，形成两端分别带接头序列的单链DNA片段；
优选地，所述RNase酶为RNaseA和/或RNaseH；
优选地，采用碱变性法或高温变性法进行变性处理。
第二方面，本发明提供了一种RNA测序文库的构建方法，其包括：
(1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
(2)将步骤(1)所得单链DNA片段进行环化，形成单链环状核酸产物，即为测序文库；
优选地，利用介导片段实现所述核酸单链的环化，所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端；
优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。
上述RNA测序文库的构建方法中，作为优选，所述反向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
a)5’-N*NNNNN-SEQ ID NO:1-xxxxxxxxxx-SEQ ID NO:2-3’所示核苷酸链，其中，N表示A、C、G或T任一种；*表示硫代修饰；xxxxxxxxxx表示标签序列；
b)SEQ ID NO:3所示核苷酸链；
优选地，所述正向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
a')5’-SEQ ID NO:4-NNNNNN-3’所示核苷酸链，其中，N表示A、C、G或T任一种；和
b')SEQ ID NO:5所示核苷酸链。
SEQ ID NO:1序列(从5’到3’)为：AAGTCGGAGGCCAA；
SEQ ID NO:2序列(从5’到3’)为：GCGGTCTTAGGAAGACAAGCTC；
SEQ ID NO:3序列为：5’-TTGGCCTCCGACTT-3’；
SEQ ID NO:4序列(从5’到3’)为：
GACTCACTGAGATCGGGCTTCGACTGGAGAC；
SEQ ID NO:5序列为：
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTCAGTGAGTC-3’。
本方面所述RNA测序文库的构建方法包括：
取3～5ug总RNA样品，使用探针法去除总RNA中的rRNA以富集mRNA。用正反桥式探针随机杂交到mRNA上，并与溶液I混匀反应，得到带有两端接头、片段大小合适的cDNA，文库插入片段的大小取决于相邻两个正反桥式探针的距离，即可以通过调整两端接头的比例及接头和模板的比例，得到不同大小的cDNA文库。通过桥式寡核苷酸和T4DNA连接酶将cDNA单链环化，用酶消化没有环化的片段。用磁珠纯化环状文库，最后使用高通量测序平台测序。与一般的测序相比，它不需要对文库进行PCR扩增，因此避免了由PCR扩增引入的碱基错误和复制偏差，使测序数据更真实可信。但是PCR-free方案需要更多的总RNA的投入量来提高cDNA的产量。
第三方面，本发明提供了另一种构建RNA测序文库的方法，其包括：
(1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
(2)PCR扩增：
第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤(1)所得单链DNA片段进行扩增，得到其互补链；
第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤(1)所得单tttt链DNA片段和第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)所得PCR产物进行高温变性处理，获得单链核酸；
(4)利用介导片段，将步骤(3)所得单链核酸进行环化，形成单链环状核酸产物，即为测序文库；所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端；
优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。
上述RNA测序文库的构建方法中，作为优选，所述反向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
i)5’-+G+G+GHHNNNN-SEQ ID NO:6-xxxxxxxxxx-SEQ ID NO:7-3’所示核苷酸链，其中，N表示A、C、G或T任一种，H表示A、T或C任一种；xxxxxxxxxx表示标签序列；+表示LNA修饰；
ii)如SEQ ID NO:8所示核苷酸链；
优选地，所述正向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
i')5’-SEQ ID NO:9-+G+G+GNNN-3’所示核苷酸链，其中，N表示A、C、G或T任一种；+表示LNA修饰，用于提高引物与模板结合的紧密度，阻止链置换；
ii')如SEQ ID NO:10所示核苷酸链。
SEQ ID NO:6(从5’到3’)序列为：GTCTCCAGTCGAAGCCCGA；
SEQ ID NO:7(从5’到3’)序列为：TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACC*T*T；
SEQ ID NO:8序列为：5’-TCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’；
SEQ ID NO:9(从5’到3’)序列为：GCTTGGCCTCCGACTT；
SEQ ID NO:10序列为：5’-AAGTCGGAGGCCAAGC-3’。
上述第二方面或第三方面的构建方法构建的均为单链环状RNA测序文库，tttt然而本发明所述的mRNA样本片段化方法也可用于普通双链文库的构建，只需要把接头序列改成相应的测序平台的接头序列即可，因此，本发明还要求保护如下第四方面所述的技术方案。
第四方面，本发明提供了一种RNA测序文库的构建方法，其包括：
(1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
(2)PCR扩增：
第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤(1)所得单链DNA片段进行扩增，得到其互补链；
第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤(1)所得单链DNA片段和第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库；
优选地，所述接头序列为相应测序平台的接头序列。
第五方面，本发明提供了一种RNA测序文库，其由第二方面、第三方面或第四方面所述构建方法制得。
第六方面，本发明提供了如第五方面所述的RNA测序文库在高通量测序中的应用。
本发明基于正、反向桥式探针对mRNA样本进行打断，而不需要对RNA进行另外的物理性打断，并且在同一管中建立反转录和连接反应体系，通过一步反转录和连接反应就能同时引入两端接头，得到带有两端接头的cDNA文库；从mRNA到单链环化或PCR扩增之前只需要一步即可完成，省去了传统方法建库中末端修复、先加一端接头、再加另一端接头的繁琐步骤。
反转录后有两种建库方案：(1)PCR-free的建库：不需要对cDNA进行PCRtttt扩增，直接进行环化反应，实现了PCR-free的建库技术，流程见图2；由于无需对文库进行PCR扩增，一方面避免了由于PCR引入的复制偏差和复制时的碱基错误，提高了数据的真实可靠性，另一方面也简化了建库流程，缩短了建库周期，同时还可以在反转录时引入标签序列(实施例中称为barcode)，在环化时可以实现多样本同时环化，大大降低了建库成本，可自动化，易操作，可以用于大批量建库。(2)PCR扩增建库：由于在反转录时引入两端接头及任选地标签序列(实施例中称为barcode)，只需要一步反转录就能得到带两端接头的单链cDNA文库，再经PCR扩增以富集带有两端接头的cDNA，省去了第二链合成的步骤，简化了实验流程，流程见图2。由于反转录时标签序列(即barcode)的引入，在PCR扩增时可以实现多样本同时PCR，降低建库成本。PCR扩增的方法可以减少总RNA的投入量，使少量的RNA样本也可以实现建库。
附图说明
图1是本发明所采用的富集mRNA的方法示意图；
图2是本发明的RNA测序文库构建流程图；
图3是PCR-free RNA测序文库的尿素变性胶检测结果；
图4是UHRR样品PCR产物分布；
图5是HBRR样品PCR产物分布；
图6是小鼠RNA样品PCR产物分布；
图7是YH RNA样品PCR产物分布；
图8是8个样本混合文库片段分布。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
样品来源：人细胞RNA(UHRR)、人脑参考RNA(HBRR)、人血液细胞tttt系(YH)RNA与小鼠RNA，共4种RNA标准品，每个标准品做2个平行。
寡核苷酸探针序列：参考专利申请“富集原始转录本信息的RNA文库的建库方法及其应用”(申请号：2014105057932)中披露的探针序列。
实施例1无需PCR扩增(PCR free)的RNA测序文库构建
1、纯化mRNA
(1)DNA探针与总RNA中的rRNA杂交
反应条件：95℃2min，0.1℃/秒(梯度降温)，22℃，5min.
(2)RNaseH消化与DNA探针杂交的rRNA
反应条件：37℃30min
(3)DNaseI消化DNA探针
反应条件：37℃30min
(4)反应结束后，用1.2×RNA Clean XP磁珠纯化。
2、逆转录和连接反应
下述3T、5T及分别与之互补的序列3B、5B订购于invitrogen。
3T序列如下：
5’-N*NNNNNAAGTCGGAGGCCAAxxxxxxxxxxGCGGTCTTAGGAAGACAAGCTC-3’；此处下划线部分为SEQ ID NO:1，斜体部分为SEQ ID NO:2；
3B序列如下：
5’-TTGGCCTCCGACTT-3’(SEQ ID NO:3)；
5T序列如下：
5’-GACTCACTGAGATCGGGCTTCGACTGGAGACNNNNNN-3’；此处下划线部分为SEQ ID NO:4；
5B序列如下：
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTCAGTGAGTC-3’(SEQ ID NO:5)。
注：N表示A、C、G或T；xxxxxxxxxx表示标签序列；*表示硫代修饰，作用是防止外切酶消化。
具体地，适用于各样品的标签序列如下：
标签序列-25：AGCCCCAGGG(SEQ ID NO:14，适用的样品名及编号：UHRR-1)；
标签序列-26：CACTTGAAAC(SEQ ID NO:15，适用的样品名及编号：UHRR-2)；
标签序列-27：CCAACCCAGA(SEQ ID NO:16，适用的样品名及编号：HRR-1)；
标签序列-28：TTAGAGCTCC(SEQ ID NO:17，适用的样品名及编号：HRR-2)；
标签序列-29：TTTCATCACA(SEQ ID NO:18，适用的样品名及编号：YH-1)；
标签序列-30：TTAGGGGCTA(SEQ ID NO:19，适用的样品名及编号：YH-2)；
标签序列-31：AATTTGTATT(SEQ ID NO:20，适用的样品名及编号：MOUSE-1)；
标签序列-32：GTGTTAACTA(SEQ ID NO:21，适用的样品名及编号：MOUSE-2)。
将序列3T、5T、3B、5B均稀释到100μM，然后按如下比例分别配制成40μM AdA3'、AdA5'接头。
AdA3'接头：
AdA5'接头：
AdA mix(AdA5':3'＝1:2)：
向5μl已纯化的mRNA中加0.6μl 10μM AdA mix(接头)，25℃孵育5min；加溶液I：4μl第一链缓冲液，2μl 0.1M DTT，0.3μl 10mM dNTP，4μl 50％PEG8000，0.5μl 10mM ATP，0.5μl Super ScriptⅡ(200U/μl)，0.5μl T4DNA连接酶(600u/μl),0.5μl RNase抑制剂，补水至总体积20μl，混匀，在PCR仪上按照以下程序进行反应：
步骤125℃5min
步骤237℃1h
步骤312℃保持
反应结束后，向以上反应体积中加2μl RNaseA、2μl RNaseH,37℃30min～1h，95℃变性5min，立即置于冰上2min.
3、纯化：用1.0X Ampure XP磁珠纯化，用EB或纯水回溶。
取1μl样品用HS Qubit定量。按照测定的浓度调整下一步反应使用的样本tttt起始量(不超过400ng)，使用ddH2O将总体积补为60μl。
4、取60μl上述步骤的DNA(200～400ng)到PCR管中，95℃变性5min，立即置于冰上2min。
5、单链环化
5.1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
其中，ON1587为介导引物，其具体序列为：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(即SEQ ID NO:11)。
5.2将上述混合液震荡充分混匀
5.3提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：
5.4将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的EP管中加入连接酶反应混合液50μl，震荡10s混匀，离心。
5.5置于孵育箱中37℃孵育1.5h。
6.酶切消化(ExoI和ExoIII)
6.1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
6.2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的120μl的样品中分别加入8μl的酶反应混合液；
6.3震荡10s混匀离心，置于孵育箱中37℃孵育30min。
6.4酶切30min完成后，向样品中加入6μl 500mM EDTA终止酶反应。
6.5上述样品用1.3X PEG32beads/tween20纯化，方法如下：
将上步骤样品转移到1.5ml不粘管中，加入170μl的PEG32磁珠/tween20(预先室温平衡30min)，室温结合15min，期间吹打混匀一次；
6.6将不粘管置于磁力架上3-5min后弃去上清，用700μl 75％乙醇洗涤两次，洗涤时将不粘管前后方向反转，使得磁珠在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3次；
6.7室温下晾干后用40μl 1XTE回溶，溶解时间共计15min，中间混匀一次；
6.8把上清转移到一个新的1.5ml EP管中，将最终得到产物用QubitTMssDNA Assay Kit测定浓度。
6.9取5μl样品至PCR管中与5μl 2x RNA loading buffer混匀，同时取2μl low Range RNA ladder到PCR管，将样品与ladder置于PCR仪中95℃变性2min，迅速转移至冰上冷却2min，再进行6％的尿素变性胶检测。在此列举样品UHRR-1的结果，如图3所示。
实施例2需要PCR扩增的RNA测序文库构建
1.纯化mRNA
(1)DNA探针与总RNA杂交
反应条件：95℃2min，0.1℃/sec(梯度降温)，22℃，3min。
(2)RNaseH消化与DNA探针杂交的rRNA
反应条件：37℃30min
(3)DNaseI消化DNA探针
反应条件：37℃30min
(4)反应结束后，用1.2X RNA Clean XP磁珠纯化
2、逆转录和连接反应
LNA修饰的接头序列3T、5T及分别与之互补的序列3B、5B：探针订购于invitrogen。
3T序列如下：
5’-+G+G+GHHNNNNGTCTCCAGTCGAAGCCCGAxxxxxxxxxxTCGAGCTTGTCTTCCTAAGACC*T*T-3’；其中，N表示A、C、G或T任一种；*表示硫代修饰；+表示LNA修饰，xxxxxxxxxx表示标签序列；此处的下划线部分为SEQID NO:6，斜体部分为SEQ ID NO:7。
具体地，适用于各样品的标签序列如下：
标签序列-1：TGTCATAAAT(SEQ ID NO:22，适用的样品名：UHRR-1)；
标签序列-2：TTAATTAAGG(SEQ ID NO:23，适用的样品名：UHRR-2)；
标签序列-3：GACTCACTGA(SEQ ID NO:24，适用的样品名：HBRR-1)；
标签序列-4：ATAAGGCAGT(SEQ ID NO:25，适用的样品名：HBRR-2)；
标签序列-5：TTGATAGATT(SEQ ID NO:26，适用的样品名：YH-1)；
标签序列-6：CCTTCCTGGT(SEQ ID NO:27，适用的样品名：YH-2)；
标签序列-7：AATATCTCTC(SEQ ID NO:28，适用的样品名：mouse-2)；
标签序列-8：CATGTTTCCC(SEQ ID NO:29，适用的样品名：mouse-2)。
3B序列如下：
5’-TCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’(SEQ ID NO:8)；
5T序列如下：
5’-GCTTGGCCTCCGACTT+G+G+GNNN-3’；其中，N表示A、C、G或T任一种；+表示LNA修饰；此处的下划线部分为SEQ ID NO:9。
5B序列如下：
5’-AAGTCGGAGGCCAAGC-3’(SEQ ID NO:10)。
将序列3T、5T、3B和5B均稀释到100μM，然后按如下比例分别配制成40μMAdA3'、AdA5'接头。
AdA3'接头：
AdA5'接头：
AdA mix(AdA5':3'＝1:2)：
向5μl已纯化的mRNA中加0.6μl 10μM AdA mix(接头)，25℃孵育5min；加溶液I:4μl第一链缓冲液，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP，4μl 50％PEG8000，0.5μl 10mM ATP，0.5μl SuperscriptⅡ(200U/μl)，0.5μl T4连接酶(600u/μl),0.5μl RNase抑制剂，补水至总体积20μl，混匀，在PCR仪上按照以下程序进行反应：
步骤1 25℃ 5min
步骤2 37℃ 1h
步骤3 12℃ 保持
反应结束后，向以上反应体积中加1μl RNaseA、1μl RNaseH,37℃30min～1h，95℃变性5min，立即置于冰上2min。
3、纯化：用Ampure XP磁珠纯化，Elution Buffer或纯水回溶。
4、PCR扩增及纯化
向反转录得到的18.6μl cDNA中加2.5μl 10xPfx缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 50mM MgSO4，0.5μl 20μM P1,1μl 10μM P2，0.4μl Platinum Pfx DNA polymerase聚合酶，总体积25μl。
其中，P1和P2为用于PCR扩增的两条引物的代号，其序列分别为：
P1(即SEQ ID NO:12)：5’-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT-3’；
P2(即SEQ ID NO:13)：5’-AAGGTCTTAGGAAGACAAGCTCGA-3’。
反应程序设置如下：
其中，步骤2～4，13个循环
纯化方法：首先加0.7X Ampure XP磁珠结合PCR产物，然后上清液再用0.5X Ampure XP磁珠结合，用Elution Buffer或纯水回溶。回收产物中，每个平行样品随机选取一个使用高敏芯片Agilent 2100检测，其结果如图4-7所示。
取1μl样品用HS Qubit测定浓度。按照测定的浓度调整下一步反应使用的样本起始量不超过400ng，使用ddH2O将总体积补为60μl。
5、取60μl上述步骤的DNA(200～400ng)到PCR管中，95℃变性5min，立即置于冰上2min。
6、单链环化
6.1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
其中，ON1587为介导引物，其具体序列为：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(即SEQ ID NO:11)。
6.2将上述混合液震荡充分混匀
6.3提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：
6.4将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的EP管中加入连接酶反应混合液50μl，震荡10s混匀，旋转离心。
6.5置于孵育箱中37℃孵育1.5h。
7.酶切消化(ExoI和Exo III)
7.1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
7.2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的120μl的样品中分别加入8μl的酶反应混合液；
7.3震荡10s混匀离心，置于孵育箱中37℃孵育30min。
7.4酶切30min完成后，向样品中加入6μl 500mM EDTA终止酶反应。
7.5上述样品用1.3X PEG32磁珠/tween20纯化，方法如下：
将上步骤样品转移到1.5ml不粘管中，加入170μl的PEG32磁珠/tween20(预先室温平衡30min)，室温结合15min，期间吹打混匀一次；
7.6将不粘管置于磁力架上3-5min后弃去上清，用700μl 75％乙醇洗涤两次，洗涤时将不粘管前后方向反转，使得磁珠在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3tttt次；
7.7室温下晾干后用40μl 1XTE回溶，溶解时间共计15min，中间混匀一次；
7.8把上清转移到一个新的1.5ml EP管中，将最终得到产物用QubitTMssDNA Assay Kit测定浓度。
7.9取5μl最终产物至PCR管中与5μl 2x RNA loading buffer混匀，同时取2μl low Range RNA ladder到PCR管，将最终产物与ladder置于PCR仪中95℃变性2min，迅速转移至冰上冷却2min，再进行6％的尿素变性胶检测。
7.10每个最终产物各取1ul充分混合后，使用高敏芯片Agilent 2100检测，其结果如图8所示。
对于不同样品建库，各个样品的PCR产物均集中在180～220bp左右，片段比较集中。环化后的文库，片段大小集中在212nt左右，有很好地重复性和实验稳定性。
由上述结果可以看出，本发明所述RNA测序文库的构建方法重复性好，稳定性高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
