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用于早期确定对疾病的危象反应或威胁生命反应和/或治疗反应的生物标志物

2021-04-07 08:03:12

用于早期确定对疾病的危象反应或威胁生命反应和/或治疗反应的生物标志物

  1、发明领域

  本发明的范围内涵盖新生物标志物和生物标志物组合用于早期确定个体对疾病的危象反应和/或威胁生命反应和/或用于预测所述疾患结果的用途。在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合是不可知的并且与预先鉴定和/或确定疾患原因或性质无关。在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合可以用来监测治疗干预对患有危重疾病的个体的有效性或选择可能对个体有效的治疗干预,不依赖预先鉴定和/或确定疾病原因或性质。

  2、背景技术

  诊断和治疗

  在医学背景下,诊断是通过评价一个或多个因素来鉴定一种或多种健康情况(包括疾病和/或损伤)以鉴定或确定疾病性质和/或原因的行为或过程,所述因素可以包括患者病史、身体检查、评述症状和评述来自一项或多项实验室检验的数据。尽管不可能总是鉴定疾病的确切性质或原因,但是也可以尝试地利用鉴别诊断消除一种或多种可能原因,以便选择最可能的原因。

  一旦已经作出诊断或鉴别诊断,则考虑治疗选择并且选择治疗策略。在一些情况下,治疗可以在诊断已经完成前开始(例如,在收到实验室结果期间治疗)。在其他情况下,疾病的原因可能仍难以找到,然而治疗基于个体呈现的症状选择。当诊断、鉴别诊断或症状显示有可能为危象和/或威胁生命的状况时,管理策略可以包括确保最佳可能临床结果的另外考虑,包括快速分类、转诊、住院、强化监护、送入重症监护室等。

  诊断和治疗的不可知方案

  仅仅基于疾病预定起源或原因选择治疗策略的传统模式具有一些明显缺点。尽管鉴定原因有助于确保选择的疗程是针对疾病、损伤或至少具体的症状,tttt但是经常不能认识到个体对其健康情况的独特反应在限定疾病病程和严重程度中发挥的重要性。它还把重点放在可能与适合的诊断方法相关的有悖于可获得性和/或经济负担的诊断性预定疾病或疾患上。

  治疗的“不可知”方案挑战了基于疾病起源或原因选择治疗策略的传统范例。选择不可知方案并不必然地因为原因或起源是不可知的(如在宗教背景下)或因为诊断不能有帮助,而是因为尽可能早地和/或没有得益于诊断的情况下知道个体是否将以危象和/或威胁生命方式对疾病作出反应可提供更有效和快速方法以分类并选择对该个体定制的适合治疗。

  个体对疾病的反应

  充分认识到并非全部个体均以相同方式对疾病反应。许多个体仅形成轻度和自限性疾病,而一小部分可以发展成危象和/或威胁生命阶段。在进行医疗护理时,难以确定谁将在不干预情况下或仅给予最少干预情况下进展良好和谁需要入院和专门管理以改善临床结果。例如,在H1N1流感大流行的情况下,据估计美国大约6100万个体遭H1N1感染(在2009年4月至2010年4月期间),但这些案例中仅一小部分的结果是死亡。6100万感染个体中,大约274,000名个体接受住院(0.449%),并且出现12,470例死亡(0.012%)(疾病控制中心2010年5月14日发布的新发感染项目数据(Emerging Infection Programs Data);死亡例数四舍五入至最接近的十位。住院数已经四舍五入至最接近的千位并且案例数已经四舍五入至最接近的百万位)。显然,一些个体比其他个体更能够战胜H1N1感染。

  尽管这种反应多样性,然而难以确定哪些具体因素和特征促成这些个体中的差异性结果,甚至用回顾性分析时也是如此。例如,对2009年7月16日之前可获得的全球数据就截止该日期所报道的684例死亡进行一项回顾性研究(瓦兰特·L等人,欧洲监控,第14卷,第33期,第1-6页(2009)(Vaillant,L.et al.,Eurosurveillance,Vol.14,Issue 33,p.1-6(2009))并且按国家检查患者的年龄。在这项研究中,发现尽管总体上大部分死亡例(51%)出现在20-49岁年龄组中,但是年龄的影响和最受影响的年龄组在不同国家中各不相同,这使得难以得出预示性结论。

  具有威胁生命潜力的疾病的另一个例子是脓毒症(sepsis)(败血症(septicemia))。脓毒症是针对推测的感染的全身性炎症反应,并且可以因许多不同的疾病或病因学所致。在一些情况下,严重脓毒症可以形成,其中该综合征还与器官功能障碍、低灌注或低血压相关。

  因为仅一小部分的患病个体发展成出现危象反应和/或威胁生命反应,所以区分需要紧急分类和强化治疗的那些个体与不需要紧急分类和强化治疗的那些个体的能力将具有明显优势。

  当前通过以下方式尝试选择性治疗对疾病最易出现威胁生命反应的个体:首先诊断所述疾病,并且随后基于已知的风险因素(例如年龄、存在共病(co-morbidity)等)对个体预分类和/或通过对个体监测用于提示疾病以威胁生命方式进展的早期指示。例如,一项按2个阶段在巴西2家综合医院实施的前瞻性队列研究发现,通过增加监测住院患者使用现有可度量的脓毒症特异性检测指标并且据此提供治疗,患者的死亡率从61.7%降至38.2%(韦斯特法尔·G·A(Wesphal,G.A.)等人,“用于严重脓毒症早期诊断的草案实施后降低的死亡率(Reduced mortality after the implementation of a protocol for the early detection of severe sepsis)”危重护理杂志(Journal of Critical Care)(2011)26第76-81页)。

  然而,依赖于风险因素大多仍不足以作为手段选择可能出现威胁生命反应的个体(参见瓦兰特·L等人,上文),并且个体正在出现威胁生命反应的现存可度量指标经常需要广泛和昂贵地监测患者并且会耗时太长,以至于无法临床用于管理患者。另外,在监测或提供治疗前依赖诊断可能增加成本并造成不必要的延误。这是棘手的,特别地在资源有限的情况下,如在发展中国家中,但鉴于与危重护理相关的成本,这同样适用于发达国家。

  例如,在治疗H1N1的情况下,德宾(Durben)等人从社会角度对治疗安大略省人群(假定无预防性接种)的成本建模并且确定11亿美元总成本,大约8700万美元分配给医院护理的多个方面(德宾等人(2011)“加拿大安大略省H1N1疫苗策略的成本效益分析”传染病和免疫杂志第3(3)卷第40-49页(Durben et al.(2011)“A cost effectiveness analysis of the H1N1 vaccine strategy for Ontario,Canada”Journal of Infectious Diseases and Immunity Vol.3(3)ttttp.40-49))。对感染更可能出现不利反应的那些个体的早期和精确鉴定和分层可能将资源集中于最可能从这些资源获益的那些个体并且远离无特定医学干预情况下恢复良好的大部分感染个体。假定地,这种策略将相当显著地减少这些预计成本。

  因此,本领域需要一种或多种生物标志物,所述生物标志物比现有模型提供个体发展成疾病危象反应和/或威胁生命反应的风险增加的更大确定性,和/或用于鉴定个体为需要治疗干预,从而为所述个体选择和/或调整适合的治疗方案。优选地,这些生物标志物将尽早识别增加的风险,从而产生治疗干预的最大潜力。如果生物标志物是不可知的并且无论疾病是什么均有用,从而将不必要首先诊断疾病,则这将特别有益。同样,使用一种或多种生物标志物监测治疗方案对威胁生命反应进展的影响的能力将允许必要时调整治疗方案,这也将具有明显益处。

  3、发明概述

  在一个方面,所公开的是提供以下指示的生物标志物和生物标志物组合:个体对疾病反应、该反应的严重程度和个体是否已经形成或正在发展成疾病危象形式和/或威胁生命形式。在另一个方面,生物标志物和生物标志物组合能够提供个体对疾病反应的严重程度的早期指示,所述严重程度不基于首先确定疾病原因或起源预测。在又一个方面,所公开的是可以在诊断或鉴别诊断之前使用或替代它们使用以选择适合治疗方案的生物标志物和生物标志物组合。在又一个方面,所公开的是提供以下早期指示的生物标志物和生物标志物组合:治疗方案对个体的威胁生命反应的风险或进程的影响。

  在另一个方面,所公开的是一种包含一组两种或更多种抗体和合适缓冲剂的组合物,所述组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的至少两种蛋白质生物标志物结合,其中蛋白质生物标志物是在表1中的那些。在另一个方面,组合物是一种包含三种或更多种抗体的组合物,所述组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的至少三种蛋白质生物标志物结合,其中蛋白质生物标志物是在表1中的那些。在另一个方面,组合物包含一组两种或更多种抗体和合适的缓冲剂,组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的tttt至少两种蛋白质生物标志物结合,并且蛋白质生物标志物是C5a、VEGF、sFlt-1、CHI3L1、CRP、Ang-like3、因子D(Factor D)或IL18bpa。在另一个方面,组合物包含一组三种或更多种抗体和合适的缓冲剂,组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的至少三种蛋白质生物标志物结合,并且蛋白质生物标志物是C5a、VEGF、sFlt-1、CHI3L1、CRP、Ang-like3、因子D或IL18bpa。在又一个方面,样品是全血样品、血清样品或血浆样品。在另一个方面,组合物包含一组两种或更多种抗体和合适的缓冲剂,组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的至少两种蛋白质生物标志物结合,并且蛋白质生物标志物是CRP、PCT、CHI3L1、P-选择蛋白(P-Selectin)、vWF、Ang3L1、Tie-2、内皮糖蛋白和IL18bpa。在另一个方面,组合物包含一组三种或更多种抗体和合适的缓冲剂,组合物能够选择性地与来自从受检个体分离的样品的至少三种蛋白质生物标志物结合,并且蛋白质生物标志物是CRP、PCT、CHI3L1、P-选择蛋白、vWF、Ang3L1、Tie-2、内皮糖蛋白和IL18bpa。在又一个方面,样品是全血样品、血清样品或血浆样品。

  在一些实施方案中,该组合物用来(i)检测样品中的两种或更多种蛋白质生物标志物和对其水平定量,(ii)将定量的水平与对照群体中蛋白质生物标志物的对照水平比较,(iii)确定两种或更多种生物标志物存在差异性水平,从而作出判断,与对照群体相比,该个体面临显著增加的对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的风险。在一些实施方案中,检测和定量利用一种或多种装置将样品转化成指示两种或更多种蛋白质生物标志物中每种标志物水平的数据。在一些实施方案中,装置是用来将样品转化成数据的酶联免疫测定法。在一些实施方案中,基于步骤(iii)中的判断,受检个体经历治疗方案。

  在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病并且对该疾病不出现危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是这样的个体群体,其中对照群体的大部分成员并不患有与受检个体相同的疾病。在一些实施方案中,上述人群是无偏人群。

  在一些实施方案中,存在一种确定受检个体出现或将形成疾病的危象反应tttt和/或威胁生命反应的可能性的方法,其中所述方法包括(i)检测样品中两种或更多种蛋白质生物标志物的每种标志物并对其水平定量,其中蛋白质生物标志物是表1中的那些;(ii)将所述蛋白质生物标志物的定量水平与来自对照群体的蛋白质生物标志物的对照水平比较;(iii)基于步骤(ii)中的比较确定两种或更多种生物标志物存在差异性水平,从而作出判断,与对照群体相比时,该个体具有增加的对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的风险。

  在一些实施方案中,作出以下判断:个体面临显著增加的风险。在一些实施方案中,步骤(i)的检测和定量利用一种或多种装置将样品转化成指示两种或更多种蛋白质生物标志物中每种标志物水平的数据。在一些实施方案中,一种或多种装置是酶联免疫测定法。在一些实施方案中,基于所做的判断,个体经历治疗方案。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的无偏群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病并且对该疾病不出现危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是这样的个体群体,其中对照群体的大部分成员并不患有与受检个体相同的疾病。

  在一些实施方案中,存在一种确定受检个体将形成疾病的危象反应和/或威胁生命反应的可能性的方法,其中所述方法包括(i)检测样品中两种或更多种蛋白质生物标志物的每种标志物并对其水平定量,其中蛋白质生物标志物是表1中的那些;(ii)在分类器中使用来自样品的蛋白质生物标志物中每种蛋白质生物标志物的定量水平,其中使用以下两种群体生成分类器:形成疾病的危象反应和/或威胁生命反应的第一群体和第二对照群体,(iii)对定量水平是否表明该个体更类似于第一群体或第二对照群体作出判断,从而确定该个体是否面临增加的对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的风险。

  在一些实施方案中,作出以下判断:个体面临显著增加的风险。在一些实施方案中,步骤(i)的检测和定量利用一种或多种装置将样品转化成指示两种或更多种蛋白质生物标志物中每种标志物水平的数据。在一些实施方案中,一种或多种装置是酶联免疫测定法。在一些实施方案中,基于所做的判断,个体经历治疗方案。在一些实施方案中,第二对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的无偏群体。

  在一些实施方案中,第二对照群体是患有与受检个体相同疾病并且对该疾病不出现危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,第二对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,第二对照群体是这样的个体群体,其中对照群体的大部分成员并不患有与受检个体相同的疾病。

  在一些实施方案中,在使用如公开的组合物或方法之前尚未诊断或鉴别诊断受检个体患有可能变成危象和/或威胁生命的疾病。

  在一些实施方案中,该组合物用来(i)检测样品中的两种或更多种蛋白质生物标志物和对其水平定量,(ii)将定量的水平与对照群体中蛋白质生物标志物的对照水平比较,(iii)确定两种或更多种生物标志物存在差异性水平,从而作出判断,应当对该个体实施治疗方案。在一些实施方案中,检测和定量利用一种或多种装置将样品转化成指示两种或更多种蛋白质生物标志物中每种标志物水平的数据。在一些实施方案中,装置是用来将样品转化成数据的酶联免疫测定法。

  在一些实施方案中,对照群体是患有适合实施该治疗方案的疾病的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是不必要实施该治疗方案的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是这样的个体群体,其中对照群体的大部分成员是适合实施该治疗方案的那些成员。在一些实施方案中,上述人群是无偏人群。在一些实施方案中,对照群体是患有可以用抗生素治疗的细菌性感染的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是患有抗生素将无效的病毒性感染的个体的群体。

  4、附图说明

  本发明的目的和特征可以结合以下详细描述和附图更好地理解。

  在一个实施方案中,与从死于疟疾的儿童的血浆分离的蛋白质生物标志物水平相比,图1A和图1B比较了从已经诊断为患有疟疾(包括可以再划分为患有脑型疟疾(cerebral malaria,CM)或重度疟疾性贫血(severe malarial anemia,SMA)的个体)并且从疟疾幸存的儿童的血浆所分离的蛋白质生物标志物水平,并且显示两个表型组之间的统计显著差异。图1A显示来自生物标志物Ang-2、sICAM-1、sFlt-1、CHI3L1、IP-10、sTie-2和PCT的结果。图1B显示来自生tttt物标志物sTREM-1的结果。*表示蛋白质水平的统计差异,p值<0.05。**表示p值<0.01。

  在一个实施方案中,图2A显示使用选择的生物标志物sICAM-1、sFlt-1、Ang-2、PCT、IP-10、sTREM-1和CHI3L1生成接受者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线以区分致命性疟疾和非致命性疟疾。虚线参考线代表无区分能力的检验的ROC曲线。每个曲线图中ROC曲线下面积用括号内显示的95%置信区间标示。标示P值*p<0.05,**p<0.01。

  在一个实施方案中,图2B显示单一寄生虫血症(parasetimia)诊断的接受者操作特征(ROC)曲线。虚线参考线代表无区分能力的检验的ROC曲线。每个曲线图中ROC曲线下面积用括号内显示的95%置信区间标示。标示P值*p<0.05。

  在一个实施方案中,图3显示一项用来以宿主生物标志物预测重度疟疾感染结果的分类树分析,其中将六种生物标志物输入CRT,并且使用IP-10、Ang-2和sICAM-1产生的CRT结果如用所测定的截断点(cut-off point)显示。指出先验的存活概率和死亡概率(分别是94.3%和5.7%)。在母节点(parent node)和子节点之间指示通过该分析选择的截断点。每个终端节点(即无进一步分支)下,指示该节点中全部患者的预测分类。该模型产生预测死亡率的100%灵敏度和92.5%特异性(交叉验证的错分率为15.4%,标准误差4.9%)。

  在一个实施方案中,图4A显示来自链球菌中毒性休克综合征(STSS)患者或非STSS患者的急性期血浆和康复期血浆中血管生成素-1(Ang-1)和血管生成素-2(Ang-2)的绝对浓度和中位浓度以及两者之间的比率(Ang-2∶Ang-1,表示为以10为底的对数)。*P<0.05;**P<0.01。

  在一个实施方案中,图4B显示Ang-1、Ang-2各自的接受者操作特征曲线和两者之间的比率,比较处于疾病急性期的STSS患者与也处于疾病急性期的那些非STSS患者。

  在一个实施方案中,图5显示来自侵入性A群链球菌感染(Group A streptococcal infection)和STSS患者的急性期和康复期血浆配对样品中血管生成素-1和血管生成素-2(Ang-1和Ang-2)浓度以及两者之间比率(Ang-2∶Ang-1)。

  在一个实施方案中,图6A是显示死亡率(%)和入院时测量的Ang-1水tttt平之间关系的直方图。

  在一个实施方案中,图6B显示接受者操作特征(ROC)曲线,该曲线显示联合三个变量比较血浆Ang-1水平、MOD评分或年龄时预测28天死亡率的增加的灵敏度和特异性。

  在一个实施方案中,图7A显示Ang-2水平与作为严重脓毒症患者中死亡率预测物的MOD评分的比较。

  在一个实施方案中,图7B显示在评估严重脓毒症患者中MOD评分前一天取得的Ang-2水平的比较。

  在一个实施方案中,图8A显示无并发症性大肠杆菌O157:H7感染儿童(被感染的)、溶血尿毒综合征(HUS)诊断前的儿童(HUS前)和诊断时显示HUS的儿童(HUS)血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)的水平和Ang-2∶Ang-1比率。*p<0.05,**p<0.01。空心圆圈表示离群值(1.5x四分位差[IQR],实心圆圈表示极端离群值(3xIQR)。

  在一个实施方案中,图8B显示如比较无并发症性感染的儿童和处于疾病HUS前期的那些儿童时Ang-1、Ang-2和Ang-1∶Ang-2比率的接受者操作特征(ROC)曲线,无效假设为Ang-1的曲线下面积是0.5(p=0.01)。

  在一个实施方案中,图9显示来自表10的对实施例15模型1的CRT分析,其中显示生物标志物CRP、内皮糖蛋白和P-选择蛋白1区分患肺炎儿童(如通过胸部X光(chest x-ray)证实)和特征为根据WHO标准患有“临床”肺炎、但根据胸部X光标准未患肺炎的儿童的能力,还显示当置于前述生物标志物决策树上时每种生物标志物的递增效益。

  5、发明详述

  5.1定义

  为以下书面描述中使用的具体术语提供以下定义。

  如本文所用,“多肽的氨基末端区域”指蛋白质生物标志物的多肽序列。如本文所用,“氨基末端区域”指位于多肽的氨基末端附近并且不短于3个氨基酸长度及不长于350个氨基酸长度的连续或几乎连续的氨基酸片段。多肽的“氨基末端”区域的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和tttt200个氨基酸。

  术语“抗体”涵盖单克隆抗体和多克隆抗体并且还涵盖抗体的抗原结合片段。如本文所用,术语抗体的“抗原结合片段”(或简化为“抗体部分”或“抗体片段”)指全长抗体的一种或多种片段,所述片段保留与本发明生物标志物的基因之一编码的多肽特异性结合的能力。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段,一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段(沃德等人,(1989)自然341:544-546(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546);和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。另外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码,但是使用重组方法,可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成接头连接,在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv);见例如伯德等人(1988)科学242:423-426(Bird et al.(1988)Science 242:423-426)和休斯顿等人(1988)美国国家科学院院刊85:5879-5883(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这种单链抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”范围内。使用本领域技术人员已知的常规技术,获得这些抗体片段,并且利用与完整抗体相同的方式筛选所述片段。抗体可以是单一特异性的,例如,单克隆抗体或其抗原结合片段。术语“单一特异性抗体”指对特定目标(例如,表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。这个术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”,如本文所用,它们指单一分子组成的抗体或其片段的制备物。

  如本文所用,“阵列”仔细考虑固定至载体上的一套蛋白质生物标志物、或与蛋白质生物标志物互补的抗体或其组合。阵列还可以包含固定至载体上的蛋白质生物标志物的片段或抗体片段,其中所述片段仍然允许蛋白质或抗体片段与其互补性结合配偶体选择性结合。

  如本文所用,“多肽的羧基末端区域”指蛋白质生物标志物的多肽序列。如本文所用,“羧基末端区域”指位于多肽羧基末端附近并且不短于3个氨基tttt酸长度及不长于350个氨基酸长度的连续或几乎连续的氨基酸片段。多肽“氨基末端”区域的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。“羧基末端”区域正常情况下不包括聚腺苷酸尾(polyA tail),如果它在蛋白质生物标志物中存在的话。

  如本文所用,术语“分类器”包括根据在个体的疾病反应方面其区分至少两种不同特征的能力所生成的数学模型。分类器可以包括逻辑回归、分类和/或回归树分析,或其他已知的数学模型,并且使用至少两个群体生成,其中群体的表型已知。在一些实施方案中,已经证实第一群体为显示疾病的危象反应和/或威胁生命反应,并且第二群体是如本文定义的对照群体。如此生成的分类器可以随来自受检个体的数据一起使用,以产生数值输出,所述数值输出表示该个体是否面临出现疾病的危象反应和/或威胁生命反应的风险(或已经正在出现疾病的危象反应和/或威胁生命反应),或不与这种数据一起使用。

  如本文所用,术语“互补性结合配偶体”包括这样的化合物,所述化合物选择性地与蛋白质生物标志物结合并且包括核酸适配体(aptamer)、肽适配体、肽体(peptibody)、拟似物(mimetic)、抑制剂和在体内与蛋白质生物标志物结合的任何化合物、抗体,包括单克隆和/或多克隆抗体。

  如本文所用,术语“对照群体”相对于受检个体认定,因为受检个体中生物标志物和生物标志物组合的水平必须与对照群体中的水平比较以确定受检个体出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性,和/或预测反应的结果。对照群体可以是阴性对照群体或阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是阴性对照群体,受检个体已经诊断患有疾病,并且对照群体是已经患有受检个体的疾病并且尚未形成危象反应或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,受检个体已经诊断患有疾病并且对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,受检个体已经诊断患有疾病并且对照群体是患有所述疾病的个体的无偏群体。在一些实施方案中,对照群体是阳性对照群体,受检个体已经诊断患有疾病,并且对照群体是已经患有该疾病并且已经形成危象反应或威胁生命反应的个体的群体。在以上实施方案的任一项中,对照群体可以是无偏群体。

  在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合的使用与受检个体的疾病原因或起源无关。对照群体仍然可以是阴性对照群体或阳性对照群体。在一tttt些实施方案中,受检个体在检验生物标志物和/或生物标志物组合之前尚未诊断和/或鉴别诊断患有疾病。在一些实施方案中,在检验之前,尚未诊断和/或鉴别诊断个体患有可为危重和/或威胁生命的疾病。在一些实施方案中,对照群体是已经患有疾病和尚未形成危象反应和/或威胁生命反应的个体的阴性对照群体。在这些实施方案中,疾病不必要与受检个体的疾病相同(如果该疾病已经诊断和/或鉴别诊断)。在一些实施方案中,对照群体的成员均不患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,对照群体的大部分成员尚未患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的对照群体未患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的对照群体患有与受检个体相同的疾病。在一些实施方案中,受检个体在检验生物标志物和/或生物标志物组合之前尚未诊断患有疾病并且对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中,受检个体在检验之前尚未诊断患有疾病,并且对照群体是已经患有某疾病并且已经对所述疾病形成危象反应或威胁生命反应的个体的阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体的成员均不患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,对照群体的大部分成员尚未患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的对照群体未患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的对照群体患有与受检个体相同的疾病。在另外的其他实施方案中,没有对照群体的成员已经诊断和/或鉴别诊断患有危象和/或威胁生命的疾病。在另外的其他实施方案中,对照群体的大部分成员尚未诊断和/或鉴别诊断患有危象和/或威胁生命的疾病。在另外的其他实施方案中,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的对照群体成员尚未诊断或鉴别诊断患有危象和/或威胁生命的疾病。在另外的其他实施方案中,对照群体是尚未诊断和/或鉴别诊断患有可能为危象和/或威胁生命的疾病的个体的群体。在另外的其他实施方案中,对照群体是尚未诊断和/或鉴别诊断患有可能是危象和/或威胁生命的任何疾病的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体选自试验对象可比较的区域或地理区域并且基于该区域或地理区域固有的疾病确定对照tttt群体在危重疾病和/或威胁生命疾病方面的状态。在以上实施方案的任一项中,对照群体可以是无偏群体。

  如本文所用,“诊断”指通过评价一个或多个因素,鉴定一种或多种健康情况(包括疾病和/或损伤)以鉴定或确定疾病性质和/或原因的行为或过程,所述因素可以包括患者病史、身体检查、评述症状和评述来自一项或多项实验室检验的数据。

  如本文所用,“诊断患有疾病”指已经通过确定造成由所述个体显示的一种或多种症状的作用剂、疾病或损伤和/或已经利用一种或多种诊断试验和/或基准,证实疾病性质和/或原因,其中认定所一种或多种述诊断试验和/或基准是最佳条件(如典型的北美医院中存在的条件所定义)下可获得的用来诊断所述疾病的最适合检验,并且已经采用所述一种或多种诊断试验和/或基准作为这种医院确定这种疾病的“金标准”检验。

  如本文所用,“鉴别诊断患有疾病”指已经充分缩小疾病的性质和/或原因以确保患者将接受,如果确定已知或利用一种或多种诊断试验和/或基准诊断出疾病的性质和/或原因,则患者本来就要接受的相同治疗,其中认定所述一种或多种诊断试验和/或基准是最佳条件(如典型的北美医院中存在的条件所定义)下可获得的用来诊断所述疾病的最适合检验,并且已经采用所述一种或多种诊断试验和/或基准作为这种医院确定这种疾病的“金标准”检验。

  如本文所用,“疾病”指以危象结果和/或威胁生命结果(包括死亡)作为一个可能结果的健康情况。在一些实施方案中,疾病涵盖内皮细胞功能紊乱。在一些实施方案中,疾病是因感染如寄生虫感染、病毒感染、细菌感染所致和/或因生物活性分子(包括微生物毒素)所致的一种疾病。在一些实施方案中,疾病包括其中健康情况原因之一是重大烧伤或身体创伤的健康情况。在其他实施方案中,疾病包括暴露于生物威胁剂(biothreat agent)如炭疽。在其他实施方案中,疾病包括暴露于可以造成急性肺损伤的物质,如烟。在其他实施方案中,疾病可以包括由武器化微生物和/或生物威胁剂引起的疾患,在一些实施方案中,所述疾患不能使用传统诊断技术诊断。例如,微生物和/或生物威胁剂的毒力因子或毒素已经被修改并插入无害载体细菌、病毒或其他载体因子(特洛伊木马效应(Trojan horse effect))。疾病的例子包括但不限于肺炎和下呼tttt吸道感染、流感、大肠杆菌感染和其并发症如溶血尿毒症综合征、菌血症、立克次氏体(Rickettsia)感染、沙门氏菌病、链球菌感染、葡萄球菌感染、疟疾、脓毒症、登革热、西尼罗河病毒、中毒性休克综合征、钩端螺旋体病、造成病毒性出血热(例如,埃博拉出血热、马堡出血热)的传染因子,和微生物剂或生物威胁剂,包括已经加以改变以使传统诊断难以判断的那些。

  “差异性水平”指与对照群体中蛋白质生物标志物的水平比较时显示水平统计显著差异的蛋白质生物标志物水平,其中相对于对照群体中的水平,蛋白质水平差异是至少10%或更大,例如20%、30%、40%、或50%、60%、70%、80%、90%或更大或1.5倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍或更多倍。

  “差异性升高的水平”指与对照群体中蛋白质生物标志物的水平比较时显示统计显著升高水平的蛋白质生物标志物水平,其中相对于对照群体中的水平,水平升高是至少10%或更大,例如20%、30%、40%、或50%、60%、70%、80%、90%或更大或1.5倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍或更多倍蛋白质水平升高。

  “差异性降低的水平”指与对照群体中蛋白质生物标志物的水平比较时显示统计显著降低水平的蛋白质生物标志物水平,其中相对于对照群体中的水平,水平降低是至少10%或更大,例如20%、30%、40%、或50%、60%、70%、80%、90%或更大或1.5倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍或更多倍蛋白质水平降低。

  如本文所用,“个体的疾病反应”表示个体内获得资源以控制和/或战胜疾病并判断疾病病程的个体能力。个体的疾病反应可以受其天然免疫反应和获得性免疫反应、遗传背景、病史、健康状态、年龄、性别和先前存在或共存的疾病和/或治疗影响。此外,疾病的病程还受针对疾病本身所用的治疗方案影响。无论影响个体的疾病反应的具体因素是什么,该反应均影响该个体中疾病的病程。

  如本文所用,“疾病的危象反应和/或威胁生命反应”表示个体对疾病反应,以致与患有该疾病的个体的无偏群体中的死亡风险相比,该个体面临增加的死亡风险。在一些实施方案中,增加的死亡风险是“显著增加的风险”,其意指与患有该疾病的个体的无偏群体相比,风险增加大于50%、60%、70%、tttt80%、85%、90%、95%或更多。

  如本文所用,“多肽的内部区域”指蛋白质生物标志物的多肽序列。如本文所用,“内部区域”指位于多肽内部区域内并且不短于3个氨基酸长度及不长于350个氨基酸长度的连续或几乎连续的氨基酸片段。多肽“内部”区域的其他可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

  如本文所用,“正常”指尚未如本文定义的疾病的任何症状和/或未患有疾病的一位个体、一组个体或一群个体。

  如本文所用,“患者”或“个体”指人。

  如本文所用,“蛋白质生物标志物”指被表达和可能加工并且以足够量和足够时间存在,从而能够使用与该蛋白质选择性结合的化合物在人体中被测量的蛋白质形式,包括片段。生物标志物或许能够单独使用或与其他生物标志物联合、叠加或协同地使用以提供关于个体对疾病反应的信息。如本文所用,“蛋白质生物标志物片段”可以包括“多肽的氨基末端区域”、“多肽的羧基末端区域”或“多肽的内部多肽区域”。

  如本文所用,在蛋白质生物标志物和/或互补性结合配偶体(例如,肽、多肽、蛋白质或抗体)的背景下,术语“纯化”指这样的化合物,所述化合物基本上不含细胞物质并且在一些实施方案中基本上不含来自衍生所述化合物的细胞或组织源的异源物质(即,掺杂性蛋白质(contaminating protein)),或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。语言“基本上不含细胞物质”包括蛋白质的制备物,在所述制备物中蛋白质与从中分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分开。因此,基本上不含细胞物质的化合物包括具有少于约30%、20%、10%或5%(以干重计)的异源蛋白(例如,蛋白质、多肽、肽或抗体;也称作“掺杂性蛋白质”)的化合物的制备物。当化合物重组产生时,它还优选地基本上不含培养基,即培养基占蛋白质制备物的体积少于约20%、10%或5%。当化合物通过化学合成产生时,它优选地基本上不含化学前体或其他化学品,即,它与参与合成化合物的化学前体或其他化学品分离。因此,化合物的这类制备物具有少于约30%、20%、10%、5%(按干重计)除目的化合物之外的化学前体或化合物。

  如本文所用,术语“选择性结合”指在蛋白质生物标志物和能够以特异性tttt方式及相对于其他蛋白质偏好地与蛋白质生物标志物相互作用的互补性结合配偶体之间的特异性相互作用。蛋白质生物标志物和互补性结合配偶体的选择性结合包括抗体与蛋白质生物标志物的特异性相互作用,包括与非特异性结合相比,单克隆抗体和/或多克隆抗体偏好地与蛋白质生物标志物结合。选择性结合还可以包括在蛋白质生物标志物和核酸或肽适配体、肽体等之间的结合。例如,第一蛋白质分子的区域、部分或结构识别并相对于非特异性第三蛋白质的结合偏好地结合至第二蛋白质分子上的区域、部分或结构。如术语“选择性结合”在本文所用,“选择性结合”意指分子按照比它结合非特异性分子高至少2倍的亲和力和优选地高至少10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍的亲和力结合其特异性结合配偶体。

  如本文所用,术语“疑似疾病”意指尚未被诊断和/或鉴别诊断的疾病。

  如本文所用,术语“治疗性方案”或“治疗方案”指个体接受的治疗和/或监护策略,并且可以作为传统诊断、鉴别诊断、鉴定症状的结果和/或作为使用本发明蛋白质生物标志物的结果并且可以包括应用一种或多种药物疗法或策略、医学监护,所述医学监护可以包括强化护理、住院或看门诊、进入重症监护室和或它们的组合。

  如本文所用,“无偏群体”意指患有特定疾病,但尚未基于特定疾病反应的一个或多个已知风险因素(例如,年龄、性别、现存共病等)预先被选择的个体的群体。

  如本文所用,“多个”或“一组”指多于两个,例如,3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、或10或更多等。

  如本文所用,术语“治疗(treat)”、“疗法(treatment)”和“治疗着(treating)”指减少或减轻疾病发作和/或症状的进展、严重程度和/或持续时间。

  5.2发明详述

  我们已经评述病因学明显各自不同的各种疾病,然而,所述疾病共同具有发展成危象和/或威胁生命阶段的可能性。这些疾病之间的另一个共性是以下tttt事实:并非全部个体,尽管恰当地得以诊断,均发展成疾病的危象形式和/或威胁生命形式。尽管已知疾病的个体反应在疾病进展中发挥显著作用,但是尚难以精确预测哪些个体将显示危象反应和/或威胁生命反应,甚至已经诊断疾病的情况下也是如此。我们已经令人惊讶地鉴定到某些蛋白质生物标志物(它们当中许多参与内皮活化和/或炎症),其中发现与将不显示疾病的危象反应和/或威胁生命反应的个体中存在的这些生物标志物相比,所述蛋白质生物标志物在发展成疾病危象阶段和/或威胁生命阶段的个体的血液中以不同的水平循环。这些生物标志物经常甚至在疾病的很早阶段中并且经常在可以测量疾病严重程度的其他已知指标之前就以不同的水平存在。更令人惊讶地,我们已经发现,这些生物标志物具有跨多种疾病群的用途,从而提示即便个体尚未诊断或鉴别诊断患有特定疾病,这些生物标志物仍可用,从而使得应用这些生物标志物在以下情况特别有用:诊断是不可能的(如在已经设计成防止鉴定的武器化微生物或生物威胁剂情况下),诊断可能太昂贵(如在发展中国家),诊断可能延误适合的治疗,或诊断导致治疗负担过重。因此,我们已经鉴定到代表以下早期指示的蛋白质:个体不能对疾病作出有效反应并且将发展成疾病的危象阶段和/或威胁生命阶段。因为这些蛋白质在这类多样性疾病之间差异性存在,所以它们具有诊断前使用的能力,从而允许比本来将可获得的干预更及时和成本有效。

  本发明的实施将部分地使用处于本领域技术人员能力范围内的蛋白质化学和分子生物学常规技术。这类技术在文献中充分解释。参见,例如,萨姆布鲁克,弗里奇&马尼亚蒂斯,1989年,分子克隆:实验室手册,第二版(Sambrook,Fritsch&Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M·J·盖特(M.J.Gai)编著,1984);核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B·D·哈尼斯和S·J·希金斯(B.D.Harnes and S.J.Higgins)编著,1984);分子克隆的实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)(B·佩尔波(B.Perbal),1984);和系列丛书酶学方法(Methods in Enzymology)(学院出版社(Academic Press,Inc.));短分子生物学技术(Short Protocols In Molecular Biology),(奥苏贝尔(Ausubel)等人编著,1995)。本文此前和以下提到的全部专利、专利申请和出版物因而通tttt过引用的方式完整并入。

  5.3对照和试验样品

  在一些实施方案中,所需要的全部就是一滴血。这滴血可以例如从简单的针刺获得。在一些实施方案中,采集任何量的血液,所述的量足以检测表1中1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或更多种基因的表达。在一些实施方案中,采集的血液量是1μl或更小、0.5μl或更小、0.1μl或更小、或0.01ul或更小。在一些实施方案中,可获得更多血液并且在一些实施方案中,更多血液可以用来实施本发明的方法。因而,在各种具体实施方案中,从受试者采集0.001ml、0.005ml、0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml或更多血液。在另一个实施方案中,从受试者采集0.001ml至15ml、0.01ml至10ml、0.1ml至10ml、0.1ml至5ml、1ml至5ml血液。

  在一些实施方案中,利用全血。在本发明的一些实施方案中,将采集自受试者的全血分级(即,分离成组分)并且仅利用特定级分。在一些实施方案中,仅使用血清,其中通过分离已经被允许凝集的血液的液态部分,将血清与剩余的血液样品分离。在一些实施方案中,使用血浆样品,其中血液已经用抗凝血剂如EDTA、柠檬酸钠(包括缓冲的或未缓冲的)、肝素等预处理并且采集和利用上清液。在一些实施方案中,血液经历聚蔗糖-泛影葡胺(法玛西亚)(Ficoll-Hypaque(Pharmacia))梯度离心并且使用外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。也可以使用其他级分和/或本领域已知的分级技术,例如,可以使用荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)例如卡玛奇,1987,酶学方法,151:150-165(Kamarch,1987,Methods Enzymol 151:150-165)分选血细胞。

  5.4生物标志物和生物标志物组合

  表1提供了可作为生物标志物单独或组合使用的一系列蛋白质。

  生物标志物可以用来确定个体在其出现疾病的危象反应和/或威胁生命反应方面的状态。在一些情况下,生物标志物单独可用于帮助评估个体出现疾病tttt的危象反应和/或威胁生命反应的可能性。在一些情况下,生物标志物可用于帮助评估个体是否面临显著增加的危象反应和/或威胁生命反应风险。在另外其他情况下,生物标志物可用于辅助评估个体是否不面临显著增加的出现危象反应和/或威胁生命反应的风险。在另外其他情况下,生物标志物可用于确定适合的治疗方案。在另外其他情况下,生物标志物可用于评估治疗方案对个体的影响,其中所述个体具有显著增加的危象反应和/或威胁生命反应风险。在一些情况下,生物标志物可用于确定个体显示其危象反应和/或威胁生命反应改善的可能性。认为这些生物标志物可用作危重疾病和/或威胁生命疾病的早期指示,因为它们中许多在内皮活化和血管渗漏、血管生成、血栓形成和炎症中发挥作用。

  表1

  本发明生物标志物的组合包括表1中所列的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或全部生物标志物的任何组合,并且均可以使用。例如,上表1中n种蛋白质的子集m的可能组合的数目在费勒,概率论介绍,第三版,第1卷,1968年,J·威利编著(Feller,Intro to Probability Theory,Third Edition,volume 1,1968,ed.J.Wiley)中,使用下式描述:

  m!/(n)!(m-n)!

  在本发明的一个实施方案中,在n是2并且m是14的情况下,选自表1的蛋白质标志物的组合数目是:

  独特双基因组合。

  在本发明的另一个实施方案中,在n是2并且m是18的情况下,选自表1的蛋白质标志物的组合数目是:

  以加合方式,这些双基因组合中每种组合的基因表达的测量可以如本文所述那样使用。在另一个实施方案中,存在14!/3!(14-3)!或364种独特双基因组合并且以加合方式,这些三基因组合中每种组合的测量可以如本文所述那样使用。

  5.5生物标志物定量

  经常使用本领域技术人员熟知的技术,首先从样品分离待定量的蛋白质生物标志物。蛋白质分离方法可以例如是如在哈洛和雷恩(E·哈洛和D·雷恩,抗体:实验手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1988)(Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold ttttSpring Harbor,NewYork(1988))中描述的那些。

  样品中生物标志物的量或水平的检测可以在所述样品中直接进行或当使用本领域已知的一种或多种技术进一步分离或纯化提取的蛋白质时进行,所述的技术包括密度梯度离心、超离心、浓缩、透析、层析、沉淀、电泳、流制备电泳(flow preparation electrophoresis)、选择性结合等。从样品(包括血液)纯化蛋白质的市售产品也是本领域熟知的,包括凯杰的AllPrep DNA/RNA/蛋白质小量试剂盒(AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit)和分子研究中心的(Molecular Research Centre,)三试剂BD-RNA/DNA蛋白质分离血液衍生物(BD-RNA/DNA Protein Isolation Blood Derivative)。

  使用这类标准技术如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),可能与免疫印迹法组合,也可以在纯化或部分纯化时区分样品的蛋白质生物标志物。可以使用本领域已知的技术确定蛋白质生物标志物的量。确定这类水平的可用方式包括但不限于免疫印迹法(Western blot)、蛋白质微阵列(protein microarray)和酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,“ELISA”)等。众多不同类型的计量蛋白质生物标志物存在的其他可用测定法是本领域熟知的。免疫测定法可以是均相的,即在单一相中进行,或是多相的,其中当进行测定法时,抗原或抗体与不溶性固相支持物连接。可以进行夹心或竞争性测定法。反应步骤可以同时或依次进行。可以进行阈值测定法,其中在测定法进行前使用捕获试剂,从样品移除预定量的分析物并且仅检出高于指定浓度的分析物水平。分析模式包括但不限于,例如,在试管、孔中或在免疫层析试纸条(immunochromatographic test strip)上进行的测定法以及试纸条(dipstick)、横向流或迁移样式免疫测定法。这类例子不意在限制用于确定样品中蛋白质生物标志物水平的潜在手段。

  用于检测蛋白质生物标志物的试剂可以利用能够与目的蛋白结合的互补性结合配偶体。合适的互补性结合配偶体可以包括已知在体内或体外与蛋白质生物标志物特异性相互作用的核酸适配体、肽适配体、肽体、拟似物、多克隆抗体、单克隆抗体或任何其他蛋白质或核酸、或它们的片段,或它们的组合。

  互补性结合配偶体,包括抗体,可以缀合于非限制材料如磁性化合物、顺tttt磁化合物、其他蛋白质如抗生物素蛋白和/或生物素、核酸、抗体片段、或它们的组合和/或可以布置在允许检测的适合表面上,所述表面包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿NPV膜、塑料,包括意在作为试纸条使用的支持物或可用于微阵列的支持物。

  用于蛋白质生物标志物定量的一种或多种互补性结合配偶体可以有效地连接(通过共价方法或非共价方法连接)至可检测标志物。用于连接所述可检测标志物至互补性结合配偶体的方法是本领域熟知的(参见,例如王·S·S,蛋白质结合和交联的化学,CRC出版社1991(Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press 1991);伯克哈特等人,氨基交联剂或氨基塑料的化学和应用,约翰威利&父子公司,纽约市,纽约,1999(Burkhart et al.,The Chemistry and Application of Amino Crosslinking Agents or Aminoplasts,John Wiley&Sons Inc.,New York City,N.Y.,1999)。

  可用标记物可以包括而不限于荧光团(例如,荧光素(FITC)、藻红蛋白、若丹明)、化学染料、荧光染料或具有放射性、化学发光性、磁性、顺磁性、促磁性(promagnetic)的化合物,或产生产物的酶,所述产物可以具有颜色、化学发光性或磁性。信号是通过任何合适手段可检测的,所述合适手段包括光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的手段。在某些情况下,信号是通过两种或更多种手段可检测的。

  全部蛋白质生物标志物均从血液轻易地纯化,并且可以使用本领域熟知的传统抗体生成技术,轻易地用来产生单克隆抗体和/或多克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法(如米尔斯坦和科勒,自然,256:495(1975)(Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975))描述的那些方法)制备,或可以通过重组DNA方法产生(美国专利号4,816,567)。还参见歌德丁,单克隆抗体的原则和实践(纽约:学术出版社,1986),第59-103页(Goding,Monoclonal Antibodies Principles and Practise,(New York:Academic Press,1986),pp.59-103);科兹波,免疫杂志,133:3001(1984)(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984));布洛德尔等人,单克隆抗体制备技术和应用(马塞尔德克公司,纽约,1987)第51-63页(Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production ttttTechniques and Applications(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)pp.51-63)。

  本文表2中公开了已经使用或已知作为可能可用的互补性结合配偶体可用于检测蛋白质生物标志物的单克隆抗体和/或多克隆抗体。

  表2

  5.6生物标志物和生物标志物组合的用途

  如本文中教导,一种或多种生物标志物或生物标志物组合可以用来确定受检个体对疾病出现或不出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性。在一个方面,在使用生物标志物或生物标志物组合之前,受检个体已经诊断或鉴别诊断。在另一个方面,在使用生物标志物或生物标志物组合之前,受检个体尚未经诊断或鉴别诊断。在其他方面,在使用生物标志物或生物标志物组合之前,受检个体已经诊断具有表示患有疾病的一种或多种症状,但疾病的起源或原因和/或适合的治疗仍未知。

  在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合确定,受检个体具有增加的出现危象反应和/或威胁生命反应风险。在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合确定,受检个体具有减少的出现危象反应和/或威胁生命反应风险。在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合确定,受检个体面临显著增加的出现危象反应和/或威胁生命反应风险。在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合确定,受检个体具有显著减少的出现危象反应和/或威胁生命反应风险。增加的风险或减少的风险是与对照群体相比而言。在一些实施方案中,对照群体是疾病的危象反应和/或威胁生命反应风险不增加的个体的阴性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是疾病的危象反应和/或威胁生命反应风险增加的个体的阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是已经患有受检个体的疾病并且尚未形成危象反应或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是是正常个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是已经患有该疾病并且已经形成危象反应或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中,对照群体是尚未诊断或鉴别诊断为患有可能是危象或威胁生命的任何疾病的个体的群体。在一些实施方案中,该群体相对于前述任一种是无偏的。

  在一些实施方案中,生物标志物和生物标志物组合可以用来确定受检个体将从特定治疗方案获益。在一些实施方案中,受检个体未诊断或鉴别诊断为患有保证治疗方案有效的疾病,然而,生物标志物和/或生物标志物组合可以用来确定受检个体将从应用该治疗方案获益的可能性增加。在一些实施方案中,受检个体未诊断或鉴别诊断为患有保证治疗方案有效的疾病,然而,生物标志tttt物和/或生物标志物组合可以用来确定受检个体将不从应用该治疗方案获益的可能性增加。在一些实施方案中,对照群体是患有将不从治疗方案获益的疾病的个体的阴性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是患有将从治疗方案获益的疾病的个体的阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的阳性对照群体。在一些实施方案中,对照群体是下述个体的阳性对照群体,所述个体患有与受检个体不同的疾病,然而患有将从治疗方案获益的疾病。在一些实施方案中,对照群体是患有将不从治疗方案获益的疾病的个体的阴性对照群体。

  为了确定个体出现疾病的一种危象反应和/或威胁生命反应的可能性,检测样品中表1的一种或多种蛋白质生物标志物并对其水平定量以及与对照群体中所述一种或多种蛋白质生物标志物的定量对照水平比较。为了确定个体从应用有效用于危重疾病和/或威胁生命疾病的治疗方案获益的可能性,检测样品中表1的一种或多种蛋白质生物标志物并对其水平定量以及与对照群体中所述一种或多种蛋白质生物标志物的定量对照水平比较。

  对于每种单独的蛋白质生物标志物,在受检个体中蛋白质生物标志物与对照群体中该蛋白质生物标志物的水平有显著差异(其中显著差异意指统计显著差异)的情况下,它有助于确定与对照个体相比,受检个体可能对疾病具有不同的危象反应和/或威胁生命反应。在一些实施方案中,来自单一生物标志物的结果可能足以确定,受检个体面临增加或减少的对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应风险。单一生物标志物是否足以确定受检个体面临增加或减少的对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应风险将取决于检验结果的所需灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中,灵敏度是大于51%及特异性大于51%将足够用。在其他实施方案中,检验结果的灵敏度必须大于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或必须是100%。在一些实施方案中,检验结果的特异性必须大于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或必须是100%。

  在一些实施方案中,为了实现检验结果的所需灵敏度和/或特异性,必须联合使用2种或更多种生物标志物、3种或更多种生物标志物、4种或更多种生物标志物、5种或更多种生物标志物、6种或更多种生物标志物、7种或更tttt多种生物标志物、8种或更多种生物标志物、9种或更多种生物标志物、10种或更多种生物标志物、11种或更多种生物标志物、12种或更多种生物标志物、13种或更多种生物标志物、14种或更多种生物标志物、15种或更多种生物标志物、16种或更多种生物标志物、17种或更多种生物标志物或全部生物标志物。

  在一些实施方案中,将2种或更多种生物标志物、3种或更多种生物标志物、4种或更多种生物标志物、5种或更多种生物标志物、6种或更多种生物标志物、7种或更多种生物标志物、8种或更多种生物标志物、9种或更多种生物标志物、10种或更多种生物标志物、11种或更多种生物标志物、12种或更多种生物标志物、13种或更多种生物标志物、14种或更多种生物标志物、15种或更多种生物标志物、16种或更多种生物标志物、17种或更多种生物标志物或全部生物标志物中每种生物标志物均等加权以对于受检个体的状态作出判断。

  在一些实施方案中,为了实现所需的灵敏度和/或特异性,可以将组合中所述生物标志物的每一者差异性加权,如通过使用至少两个群体的分类器所确定,其中至少一个群体已经预定出现疾病的危象反应和/或威胁生命反应并且至少一种群体已经预定不出现疾病的危象反应和/或威胁生命反应。

  在一些实施方案中,使用逻辑回归作为数学模型建立分类器。在其他实施方案中,使用分类和/或回归树分析。

  5.7试剂盒

  本发明提供用于测量至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17本发明蛋白质生物标志物的或其任何或全部组合的水平的试剂盒。这类试剂盒包含为测量这类蛋白质生物标志物的水平所需要的材料和试剂。因而,试剂盒提供一种或多种互补性结合蛋白以测量所述组合的所述生物标志物的水平。在一些实施方案中,互补性结合蛋白是单克隆抗体,并且试剂盒包括与待测量的每种生物标志物特异性结合的抗体。试剂盒可以另外地包含在各种方法中使用的一种或tttt多种另外试剂,如(1)一种或多种可以结合所述试剂盒中互补性结合蛋白的标记抗体或非标记抗体(例如抗小鼠抗体(1)标记试剂((2)一种或多种缓冲介质,例如,杂交缓冲液和洗涤缓冲液;(3)蛋白质纯化试剂;(4)信号生成和检测试剂,例如,链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(streptavidin-alkaline phosphatase conjugate)、化学荧光或化学发光底物等。在具体的实施方案中,试剂盒包含用作对照的预标记质量控制蛋白质。

  在一些实施方案中,基于抗体的试剂盒可以包含例如:(1)与特定蛋白质生物标志物结合的至少一种第一抗体(其可以连接至或可以不连接至支持物);(2)与蛋白质生物标志物或第一抗体结合并且缀合于可检测标记物(例如,荧光标记物、放射性同位素或酶)的不同第二抗体。基于抗体试剂盒还可以包含用于实施免疫沉淀的珠。基于抗体试剂盒的每种组分通常位于其自身的合适容器内。因此,这些试剂盒通常包含适用于每种抗体的不同容器。另外,基于抗体试剂盒可以包含实施测定法的说明书和用于解读并分析因实施测定法产生的数据的方法。在一个具体实施方案中,试剂盒含有用于确定个体面临增加的疾病危象反应和/或威胁生命反应风险的可能性的说明书。

  5.8实施例

  实施例1预测先前诊断的疟疾中结果的单独生物标志物

  在坎帕拉的梅勒高医院(Mulago Hospital)实施一项回顾性病例对照研究(retrospective case-control study),研究患有疟疾作为疾病的儿童。招募年龄在6个月和12岁之间呈现疟疾临床体征和症状的儿童,其中通过利用显微分析检测恶性疟原虫(P.falciparum)感染的存在,证实诊断。排出患有共病如镰状细胞性状/疾病、HIV共感染或严重营养不良的儿童。使用入库的血浆样品时,分离并测量来自大约100名乌干达儿童的血浆中的各种蛋白质生物标志物,其中证实诊断为脑型疟疾(CM)或重度疟疾性贫血(SMA)(两种疾病可以发展成威胁生命的疾病)。测量入库血浆样品中特定蛋白质生物标志物选项中每种蛋白质生物标志物的水平并且如同与死亡的儿童中这些蛋白质生物标志物的水平比较那样,在已知幸存于疟疾的儿童之间比较。

  柠檬酸钠抗凝血剂处理后,将血浆样品从全血分离并且在检验之前贮存于tttt-20℃。ELISA用来对所述样品中各种潜在生物标志物的水平定量,所述生物标志物包括Ang-2、CRP、sTREM-1、IP-10、sFlt-1、sICAM-l和PCT。根据制造商的说明书伴随以下改变实施ELISA:测定法以50μL/孔的体积进行;将血浆样品在4℃温育过夜;并且使用-碱性磷酸酶(西格码(Sigma),1∶1000稀释,45分钟温育),使ELISA显色,随后添加磷酸对硝基苯酯底物(p-Nitrophenyl phosphate substrate)(Sigma)并且在405nm读取光密度。测定体系用四甲基联苯胺显色,用H2SO4终止,并且在450nm读数。指定浓度低于检测限的样品为2倍于背景水平。从每块平板上所含的空白孔(添加分析缓冲液而非样品)确定背景信号,并且在分析之前从全部样品和标准物扣除背景光密度。光密度低于最低可检测标准物的样品赋予该标准物的数值。

  GraphPad Prism v4、SPSS v18和MedCalc软件用于分析。对于临床变量和人口统计变量,使用卡方检验(分类变量)或克鲁斯卡尔-沃利检验(Kruskal-Wallis test)联合邓恩的多重比较事后检验(Dunn’s multiple comparison post-hoc test)(连续变量)评估组间差异。曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)用来比较组间生物标志物水平,并且使用霍尔姆的修正法(Holm’s correction)修正多重比较的p值。

  与死于疟疾的儿童相比,比较幸免于疟疾的儿童之间蛋白质生物标志物的水平并且显示为如图1A中所示的带中位数的点图。图1B显示相同群体的生物标志物TREM-1结果,并且点图将个体划分为存活或死亡。对每次比较进行曼惠特尼U检验以确定两个群体之间水平差异的统计显著性,并且在图1A、图1B中以*(p<0.05)或**(p<0.01)显示在两个群体之间显现统计显著差异的那些生物标志物。在这种小样本容量内部,sTie-2未达到统计显著性。然而,鉴于sTie-2(作为Ang-2的受体)之间的密切相互作用,Ang-2的确显示统计显著反应的事实并且鉴于对sTie-2所观察到的差异性趋势(尽管未达到统计显著性),我们合理地预测,用人数更多的样本群体检验时,这种生物标志物将显示实用性。

  使用德龙(Delong)等人的非参数方法(德龙ER,德龙DM,克拉克-皮尔森DL(1988)在两个或更多个相关接受者操作特征曲线:非参数方法。tttt生物测定学44:837-845(DeLong ER,DeLong DM,Clarke-Pearson DL(1988)Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves:a nonparametric approach.Biometrics 44:837-845),生成接受者操作特征曲线。在图2A中显示生物标志物sICAM-1、sFlt-1、Ang-2、PCT、IP-10和sTREM-1的数据。如将理解,ROC曲线下面积指示每种生物标志物区分个体濒死和不濒死的可能性的能力。在虚线参考线中显示无区分能力的检验的ROC曲线。指出ROC曲线下面积并且其统计显著性显示为*p<0.05或**p<0.01。括号中是曲线下面积的95%置信区间。图2B显示了目前所依赖以评估个体对疟疾反应的寄生虫血症ROC曲线。寄生虫血症预测血液中寄生虫的定量性含量并且用作生物中寄生虫载量的量度和活动性寄生虫感染程度的指示。如可以见到,显示的每种生物标志物比目前利用的寄生虫血症指数更好地预测死亡。

  为了进一步评价生物标志物,约登指数(Youden index)用来获得每种生物标志物的截断点,并且评价这些二分生物标志物的临床表现测定(表3)。表3中所呈现的全部参数均随括号内所示的95%置信区间一起显示。使用约登指数(J-max[灵敏度+特异性-1]),确定全部切点。对于每种生物标志物,显示正似然比PLR、负似然比NLR、正预测值PPV和负预测值NPV。PPV和NPV基于以下估计:5.7%在梅勒高医院确诊的CM患者和SMA患者死于疟疾感染。sTREM-1实现最高的灵敏度(95.7%),但是具有低特异性(43.8%),而IP-10以最高总体准确度预测出死亡(82.6%灵敏度,85%特异性)。

  表3生物标志物在重度疟疾儿童当中预测死亡率的临床表现

  实施例2预测先前诊断的疟疾中死亡情况的生物标志物组合

  如实施例1中所述那样获得数据。生物标志物组合的使用改善了疟疾中预测个体出现威胁生命反应的可能性的能力。在这个实施例中,使用多变量逻辑回归分析排除研究中适中的死亡例数以用超过2-3个自变量产生分类器(小哈勒尔·FE,李·KL,马克·DB(1996)多变量预测模型:在发展模型、评估假设和充分性并测量和减少错误的问题,医学统计学15:361-387(Harrell FE,Jr.,Lee KL,Mark DB(1996)Multivariable prognostic models:issues in developing models,evaluating assumptions and adequacy,and measuring and reducing errors.Stat Med 15:361-387))。因此,如其他状况下所进行那样(莫罗·DA,布朗沃尔德·E(2003)在急性冠状动脉综合征中生物标志物的前景:多重标记策略,循环108:250-252(Morrow DA,Braunwald E(2003)Future of biomarkers in acute coronary syndromes:moving toward a multimarker strategy.Circulation 108:250-252);比努埃萨·CA,乔汉·SP,巴克·L,亨德里克斯·NW,斯卡多·JAtttt(2000)预测简单评分系统试产成功,生殖医学杂志45:332-336(Vinueza CA,Chauhan SP,Barker L,Hendrix NW,Scardo JA(2000)Predicting the success of a trial of labor with a simple scoring system.J Reprod Med 45:332-336)),将六种生物标志物(Ang-2、sICAM-1、sFlt-1、PCT、IP-10和TREM-1)组合成单一评分。对于每种标志物,如果测定值大于相应的截断点,则记一分,并且如果它小于相应的截断点,则记零分。通过加总全部六种标志物的分数,计算每位患者的累积性“生物标志物评分”。没有两个二分生物标志物是高度相关的(斯皮尔曼秩相关系数(Spearman’s rho)<0.6;数据未显示),这提示每种生物标志物将向评分贡献独特信息,原因是不相关的生物标志物表明与单独的单一生物标志物相比,这些生物标志物各自添加新信息。

  生物标志物评分高度地与死亡风险正相关(数据未显示;斯皮尔曼秩相关系数=0.96,p=0.003)。与幸存者相比,死亡例当中评分升高(中位数(四分位差)分别是:5(4-6)和1(0-2.5),数据未显示)。

  在单变量逻辑回归模型中,生物标志物评分是死亡的显著预测物,比值比(odds ratio)为7.9(95%CI 4.6-54.4)(表4,模型1)。在调整以排除已经与疟疾死亡率相关作为预测因子的寄生虫血症和年龄后,该评分仍保持显著,调整的比值比为7.8(4.7-134)(表4,模型2)。

  如上那样对多种生物标志物组合进行ROC曲线分析和截断点确定,以确定它们作为疾病结果的预测性指示物的实用性。表5显示从一些检验的生物标志物组合产生的数据。全部组合均显示作为疾病结果的预测性指示物的某种实用性。在表6和表6A和表6B中显示另外的组合。这些表中的全部参数均随括号中的95%CI一起呈现。使用约登指数(J=max[灵敏度+特异性-1]),确定截断点。PLR表示正似然比;NLR表示负似然比;PPV是正预测值;并且NPV是负预测值。

  对Ang-2、sICAM-1、sFlt-1、PCT、IP-10和TREM-1六种生物标志物组合使用逻辑回归时,AUC是0.96(0.90-0.99)(数据未显示),并且发现评分≥4对于所检验样本中预测死亡具有95.7%灵敏度和88.8%特异性(表5,第1行)。对于逻辑回归,通过将Box-Tidwell变换纳入该模型并且确保该条件是不显著的,评估自变量的线性度连同因变量的优势对数(log odds)。自助法tttt(Bootstrapping)(1000次样本抽取)用来产生截断点的方差估计值。通过Hosmer-Lemeshow检验和校正斜率分析评估模型拟合优度(施泰埃尔贝格·EW,艾克曼·MJ,小哈瑞尔·FE,霍贝玛·JD(2001)用逻辑回归分析建模:在小数据集寻找一个合理的策略,医学决策制定21:45-56(Steyerberg EW,Eijkemans MJ,Harrell FE,Jr.,Habbema JD(2001)Prognostic modeling with logistic regression analysis:in search of a sensible strategy in small data sets.Med Decis Making 21:45-56))。使用经显微术证实的CM病例和SMA病例的已报告病例死亡率5.7%,计算正预测值和负预测值。(Hosmer DW,Lemeshow S.应用逻辑回归,第2版,纽约,威利约翰威利&父子公司,2000(Hosmer DW,Lemeshow S.Applied Logistic Regression.2nd ed.New York:John Wiley&Sons,Inc,2000)。PPV和NPV基于以下估计:5.7%在取得样本的梅勒高医院的CM患者和SMA患者死于疟疾感染。尽管六种生物标志物组合的正预测值是低(33.9%),鉴于死亡率为5.7%,负预测值(NPV)是99.7%,这表明评分≤3的儿童将可能对标准治疗方案良好反应。

  表4.重度疟疾儿童中生物标志物评分与结果的相关性:逻辑回归。a

  a参比分类是“存活”。bPseudo-R2(Cox&Snell)为0.473并且校正斜率为0.98。cPseudo-R2(Cox&Snell)为0.474并且校正斜率为1.0。d生物标志物评分和对数寄生虫血症具有显著但低的相关性(斯皮尔曼秩相关系数为0.292,p<0.01)。e将寄生虫血症对数转换以用因变量的优势对数实现线性度。SE,标准误差;OR,比值比。

  表5.生物标志物组合在重度疟疾儿童当中预测死亡率的临床表现。a

  表6.选择的生物标志物组合在重度疟疾儿童当中预测死亡率的临床表现。a

  表6A

  表6B

  实施例3-分类树分析作为预测先前诊断的疟疾中死亡率的备选性分类器的用途

  为了探索其中每种生物标志物的加权可以变动的其他协同性组合策略,使用分类树分析,所述分析选择自变量并且将其构造成最佳预测因变量测量的决策树。首先,生成基于IP-10和sTREM-1的模型,其具有预测死亡的43.5%灵敏度和100%特异性(图3)。因为在一些情况下高灵敏度将特别重要,所以将死亡者错分为幸存者的成本加权为比幸存者错分为死亡者的成本大10倍。产生基于IP-10、Ang-2和sICAM-1的模型,其具有预测结果的100%灵敏度和92.5%特异性(交叉验证的错分率为15.4%,标准误差为4.9%)。总之,使用评分系统或分类树合并二分生物标志物在我们的患者群体中以高准确度预测出重度疟疾死亡率。

  实施例4预测侵袭性化脓性链球菌(S.pyogenes)病患者中患者形成中毒性休克综合征的单独生物标志物和生物标志物组合

  在加拿大安大略省通过强制性实验室报告来自正常情况下无菌部位的化脓性链球菌分离株进行一项前瞻性、基于群体的侵袭性A群链球菌疾病监测,并且该研究中包括1999年和2009年之间招募的37名患者。获得知情同意书以采集细菌分离株和血浆样品,以及从主治医生会面和患者图表评述采集详细的临床数据。如果患者符合指示症状现有共识,包括:低血压合并至少以下两者:凝血病、急性肾衰竭、血清氨基转移酶升高、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、皮疹或坏死性筋膜炎,则认定患者患有导致链球菌中毒性休克综合征(STSS)tttt(化脓性链球菌感染的危象和/或威胁生命形式)的化脓性链球菌感染。37名患者中,认定16名患有侵袭性链球菌感染和中毒性休克(STSS),而确定21名仅患有侵袭性链球菌感染(非STSS)。基础性感染源在两个组之间相似,两个中的大部分患者具有皮肤和软组织感染(7名STSS患者(44%)和12名单独侵袭性链球菌感染患者(57%))。剩余患者中表现的A群链球菌感染包括呼吸道感染、起源未定的菌血症、产后感染和腹膜炎,并且在各组间无显著差异。两个组仅在STSS的对症诊断标准方面有显著差异;低血压存在于100%的STSS患者及33%的非STSS患者中(P<0.0001)。如与1名单独侵袭性感染患者死亡相比,5名侵袭性感染合并STSS患者死亡(31%对5%,P=0.06)。

  急性期血浆样品在研究入选时采集并贮存在-70℃直至使用。根据制造商的说明书,通过ELISA(R&D Systems,明尼阿波利斯(Minneapolis),MN)测量血管生成素-1和血管生成素-2的血浆浓度。该测定法的检测上限和下限对于Ang-1分别是10,000pg/mL和9.77pg/mL,并且对于Ang-2分别是2520pg/mL和2.46pg/mL。将样品稀释于分析稀释剂中(Ang-1,1∶20并且Ang-2,1∶4)以落入标准曲线的范围内。

  与个体患有侵袭性A群链球菌病不伴有STSS的可能性相比,血管生成素失调(相关的Ang-1水平下降和Ang-2水平升高)与个体患有侵袭性A群链球菌病伴有STSS的可能性增大相关(图4A和图4B)。疾病急性期期间预先诊断患有侵袭性感染伴STSS的患者中的Ang-1中位血浆浓度比预先诊断仅患有侵袭性链球菌感染的那些患者低(13,915pg/mL与29,084pg/mL),而Ang-2中位血浆浓度较高(5752pg/mL与1337pg/mL)。因此,如与仅患有侵袭性链球菌感染的那些患者相比,正常情况下低的Ang-2∶Ang-1比率在侵袭性感染伴STSS患者中显著较高(0.437与0.048,P<0.05)。

  生成Ang-1、Ang-2和Ang-2∶Ang-1比率的接受者操作特征(ROC)曲线,并且ROC曲线下面积显示,Ang-1/2失调幅度精确地区分那些STSS个体与那些非STSS个体(图4B)。尽管血浆Ang-1浓度的ROC曲线并未与偶然有显著差异(AUC:0.683,P=0.07),但是血浆Ang-2的ROC曲线(AUC:0.759,P=0.009)和Ang-2∶Ang-1比率的ROC曲线(AUC:0.791,P=0.003)的ROC曲线揭示,二者均区分STSS患者和单独侵袭性链球菌感染(非STSS)患者,tttt并且预计当样本容量增加时,血浆Ang-1的ROC曲线也将具有区分性,原因在于血浆Ang-1浓度的ROC曲线趋向于统计差异,尽管未达到统计差异(AUC:0.683,P=0.07)。

  实施例5预测患有A群链球菌病的患者中反应的单独生物标志物和生物标志物组合

  使用如实施例4中概述的样品和方法,随着患者康复,我们进一步测量生物标志物Ang-1、Ang-2和Ang-1/Ang-2比率以显示生物标志物作为治疗反应指示物发挥作用的潜力。在两组患者中观察到Ang-1/2失调消退,与康复相符(图4A)。在STSS患者队列中,Ang-1中位血浆浓度从13,519pg/mL升至21,115pg/mL,Ang-2中位血浆浓度从5752pg/mL降至378pg/mL(P<0.01),并且中位Ang-2∶Ang-1比率从0.437跌至0.019(P<0.05)。

  另外,在各个STSS患者中,急性期和康复期配对血浆Ang-2浓度和Ang-2∶Ang-1比率也显著差异(图5)。在患有侵袭性链球菌病不伴STSS的患者队列中观察到相同的模式,Ang-1/2浓度发生变化,不过这些变化更轻微。这个组中,Ang-1中位血浆浓度从29,084pg/mL增至31,743pg/mL,而Ang-2浓度从1337pg/mL降至535pg/mL,并且Ang-2∶Ang-1比率从0.048降至0.027。

  实施例6预测先前诊断的脓毒症中结果的单独生物标志物和生物标志物组合

  对前瞻性采集的生物学数据和临床数据进行多中心回顾性分析,从而鉴定显示患者因严重脓毒症濒死的可能性增加的分子标记物。从属于加拿大哈密尔顿的哈密尔顿总医院(Hamilton General Hospital)的三所三甲医院重症监护室(ICU)采集样品。

  70名严重脓毒症患者在进入ICU的24小时内入选并追踪直至第28天、出院或死亡。在入院时可获得全部患者的临床数据和血浆样品,并且可获得70名患者中的43名患者持续1周每天、此后每周的临床数据和血浆样品。

  如果患者符合本领域已知的美国胸科医师学会/重症医学会(American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine)脓毒症改良标准(伯纳德·GR,文森特·J-L,拉特瑞·P-F等人,用于严重脓毒症的重组人活性tttt蛋白的效果和安全性,新英格兰医学杂志2001,344(10):699-709(Bernard GR,Vincent J-L,Laterre P-F,et al.Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis.N Engl J Med 2001;344(10):699-709);博恩·RC,席博德·WJ,施普龙·CL,脓毒症和器官衰竭的ACCP-SCCM公论会),胸1992,101(6):1481-1483(Bone RC,Sibbald WJ,Sprung CL.The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure.Chest 1992;101(6):1481-1483.))诊断他们患有严重脓毒症。如果患者出现已知感染或疑似感染以及4项SIRS改良标准中至少三项和5项器官功能障碍标准中至少一项,则纳入患者。

  从留置导管采集的静脉血(4.5ml)转移入15ml含有0.5ml 0.105M缓冲柠檬酸三钠(pH 5.4)和100μl 1M苯甲脒HC1的聚丙烯管并以1,500g离心10分钟(20℃)。用于分析的血浆按等分贮存在-80℃。商业酶联免疫测定法(ELISA)用来测量生物标志物的水平。从第1至第7天、第14天和第28天对可获得的样品测量Ang-1和Ang-2(R&D Systems,明尼阿波利斯,MN,美国)。在第1和第3天测量ESEL(R&D Systems,明尼阿波利斯,MN,美国)、sICAM-1(R&D Systems,明尼阿波利斯,MN,美国)和vWF(抗体:达科,卡平特里亚,加利福尼亚,美国(Dako,Carpinteria,CA,USA);标准物:美国诊断,斯坦福德康涅狄格州,美国(American Diagnostica,Stamford,CT, USA)的水平。全部标准物、对照和试验样品均一式两份测定并且在解读之前平均化。从使用人重组蛋白标准曲线生成的四条参数对数拟合曲线内插得到浓度。

  确定入院时Ang-1血浆水平低(≤5.5ng/mL)的患者存活的可能性比Ang-1血浆水平高(≥5.6ng/mL)的患者低(相对风险0.49[95%CI:0.25-0.98],p=0.046)(图6A)。

  使用已知的死亡风险增加临床指标时,Ang-1水平≤5.5ng/mL仍是多元逻辑回归模型中28天时死亡的重要预测物(调整的比值比为0.282[95%置信区间(CI):0.086-0.93],p=0.037)。年龄是导致死于脓毒症的可能性增加的已知风险因素。类似地,多器官功能障碍(MOD)评分作为测量和定量器官功能障碍的现行方法存在,或者作为死亡的风险因素、疾病严重程度的量度或病态风险随时间推移增加的量度存在。多元逻辑回归模型使用的年龄(p=0.008)和MOD评分(p=0.014)作为另外的临床生物标志物,提示Ang-1提供超越tttt单纯年龄和MOD评分意外的独立预后信息。

  这项研究结果受到接受者操作特征(ROC)曲线分析支持(图6B),所述分析显示当血浆Ang-1水平(ROC曲线下面积(AUROC):0.62[95%CI:0.50-0.76])、MOD评分(AUROC:0.64[95%CI:0.51-0.77])或年龄(AUROC:0.68[95%CI:0.55-0.80])与这三种变量的组合(AUROC:0.79[95%CI:0.67-0.90])比较时,预测28天死亡的灵敏度和特异性明显增加。

  实施例7作为脓毒症患者中死亡风险的早期预测物的单独生物标志物和生物标志物组合

  如所示,用于确定个体死于脓毒症的可能性增加的现行标准是多器官功能障碍(MOD)评分。使用如实施例6中所述的样品和方法,测量Ang-2水平并且使其与所检验个体的群体之间的MOD评分相关。如图7A中所示,与作为死亡预测物的MOD评分(如x轴上标示)相比时,显示Ang-2水平(如y轴上以ng/mL为单位标示)与p<0.0001的统计显著性相关,如使用Ang-2水平作为单一生物标志物所检验。通过类似地比较如借助MOD评分所确定而评价患者之前一天取自患者的Ang-2水平(ng/ml),分析了Ang-2水平充当更早期死亡预测物的能力。如可以在图7B中见到,在第x日测量的Ang-2水平预测了下一个住院日(即第x+1日)时的临床状况。与下一个住院日时的MOD评分相比,在第x日取得的各个Ang-2水平之间存在强烈统计相关性(P<0.0001)(第x+1日),显示Ang-2是比现行标准MOD评分更早的疾病进展和死亡风险指示物。

  实施例8预测患者患有因大肠杆菌感染所致溶血尿毒症综合征的单独生物标志物和生物标志物组合

  在华盛顿州、俄勒冈州、爱达荷州和怀俄明州通过强制性实验室报告阳性粪便培养物实施一项基于群体的年龄小于10岁儿童中大肠杆菌O157:H7感染监测研究。在1998年和2005年间入选的78名儿童用于这项分析,其中在疾病前7天内从所述儿童获得阳性粪便培养物。在入选时和此后如临床适用,实施静脉切开术。HUS诊断为溶血性贫血(血细胞比容<30%伴外周血涂片上裂tttt红细胞(schistocyte)证据)、血小板减少(血小板计数<150,000/mm3)和肾功能不全(血清肌酸酐高于年龄调整的正常上限);认定截止疾病第14天尚不符合这些标准的参与者已经出现无并发症型感染。

  检验84份血清样品:26份来自HUS确诊当日的患者,8份来自随后将诊断为患有HUS但尚不符合诊断标准(前HUS)的患者,并且50份来自无并发症型感染患者。对六名患者在HUS确诊之前(前HUS)和当日均取得样品。

  血清样品等分贮藏在-80℃直至使用。为了测量细胞培养上清液中的血管生成素水平,将HMVEC在6孔板的完全培养基中培养至汇合(confluence)。在毒素处理当日,将完全培养基更换为缺少血清和生长因子的基础培养基。4小时后添加志贺毒素或媒介物,并且在添加毒素后,在24小时取得等分的培养基,离心以除去死细胞,并同样贮存在-80℃直至使用。

  按照制造商的说明书,通过ELISA(Systems,明尼阿波利斯MN)测量Ang-1和Ang-2的血清浓度和上清液浓度。Ang-1和Ang-2的技术性检测上限分别是10,000pg/mL和2520pg/mL,对于测定法中使用的稀释物,分别产生有效的检测上限200,000pg/mL和10,080pg/mL。Ang-1和Ang-2的测定法检测下限分别是9.77pg/mL和2.46pg/mL。

  发现血管生成素失调(Ang-1减少和Ang-2增加)与疾病严重程度相关。无并发症型感染患者中的Ang-1中位血清浓度显著地高于那些HUS患者(77,357pg/mL[四分位差(IQR):53,437-114,889pg/mL]与10,622pg/mL[IQR:3464-43,523pg/mL]),P<0.001(图8A)。相反,Ang-2中位血清浓度在那些无并发症型感染患者中比那些HUS患者显著更低(1140pg/mL[IQR:845-1492pg/mL]与1959pg/mL[IQR:1057-2855pg/mL]),P<0.005。最后,无并发症型感染患者中Ang-2∶Ang-1比率是0.014(IQR:0.011-0.023)并且在0.18(IQR)时超过10倍更高。

  此外,前往医院时Ang-1血清浓度有效地区分了两个临床上无法区分的儿童群体:1)那些无并发症出血性结肠炎患儿和2)最终将出现HUS的那些出血性结肠炎患儿(接受者操作特征(ROC)曲线下面积[AUC]:0.785,95%置信区间(CI):0.641-0.923;P=0.01)(图8B)。

  本文对无并发症型感染患儿所报告的血清Ang-1和Ang-2浓度与健康儿童tttt和成人的血清中存在的那些相对应浓度相当,并且与这些患者中几乎不存内皮活化的临床观察一致。相反,HUS患儿中发现的Ang-1相对匮乏和Ang-2过量存在与这些患者中所预计的重要内皮细胞活化一致。

  实施例9先前诊断的疟疾中结果的单独生物标志物和与结果的其他临床指标联合使用

  对发热时送至马拉维布兰太尔伊丽莎白女王中心医院的儿童进行回顾性病例-对照研究。儿童具有6个月和14岁之间的年龄并且在1997年和2009年之间入选。取得知情同意书后,获得EDTA血浆样品。儿童基于其脑型疟疾(CM)方面的状态并且还基于视网膜指标如出血、视网膜白化或血管异常表征。从血浆样品分离的EDTA蛋白质进行ELISA以定量多种潜在生物标志物(包括Ang-2、Ang-1和sTie-2)的水平。

  使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney Utest)和斯皮尔曼秩相关系数比较连续变量。使用皮尔逊卡方检验(Person chi-square test)、线性趋势相关性(linear by linear association)或费希尔精确检验(Fisher’s exact test),进行比例的比较。使用皮尔逊卡方或逻辑回归模型计算比值比(OR)以调整协变量。邦弗朗尼校正(Bonferroni adjustmens)用来解释多重比较。

  使用与蛋白质生物标志物组合的常规临床参数,利用逻辑回归和CRT分析生成预后模型。生成临床预测性死亡模型,仅使用轻易可获得的临床参数(年龄、BCS、呼吸窘迫、严重贫血),并且来自这个临床模型的概率用来生成0.73的c-指数(等同于接受者操作特征曲线下面积)(95%置信区间[CI],0.65-0.79)(数据未显示)。

  使用这些临床模型作为基础,增加单独或组合的生物标志物检验以确定生物标志物是否将显著改善单独的临床参数模型的预测准确度。当临床模型与全部三种生物标志物Ang-1、Ang-2和sTie-2组合时,所产生的模型具有比单独临床模型显著更好(p=0.03)的c-指数0.79(95%置信区间[CI],0.72-0.84)(数据未显示)。

  实施例10使用预测危象反应和/或威胁生命反应的生物标志物组合诊断受检tttt个体。

  与正常个体的对照群体中蛋白质生物标志物Ang-2,IP10和CHI3L1的检测水平相比,使用对疾病显示危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体中蛋白质生物标志物Ang-1、Ang-2、IP10和CHI3L1的检测水平,生成本发明的分类器。应用逻辑回归以区分两个群体并且产生灵敏度为90%和特异性为95%的等式。

  使用标准ELISA检验对来自受检个体的血清样品测定蛋白质生物标志物Ang-2、IP10和CHI3L1的水平,其中所述受检个体可能已经潜在地暴露于大肠杆菌感染,但是尚未诊断患有大肠杆菌感染。根据从如所述对分类器生成的逻辑回归方程,将受检个体划归为对疾病出现或不出现危象反应和或威胁生命反应。

  实施例11使用预测危象反应和/或威胁生命反应的生物标志物组合,确定受检个体对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性,即便受检个体尚未经诊断或鉴别诊断。

  在来自个体的群体的全血样品检测表1中所示的生物标志物的蛋白质水平,其中所述个体患有选自疟疾、中毒性休克综合征、A群链球菌病、脓毒症和大肠杆菌感染的危重疾病,但是其中所述个体对危重疾病不形成危象反应或威胁生命反应。还在来自个体的第二群体的全血样品检测表1中所示的生物标志物的蛋白质水平,其中所述个体对选自疟疾、中毒性休克综合征、A群链球菌病、脓毒症和大肠杆菌感染的疾病形成危象反应。使用从两个群体生成的数据,生成分类器,尤其使用表2中所示的抗体,对每个群体的每名个体的全血样品进行ELISA检验,并且应用逻辑回归以区分这两个群体。对于生成的每个方程,在曲线下面积显示大于90%的灵敏度和大于90%的特异性情况下,利用分类器确定以下可能性:疑似患有疟疾的受检个体可能出现危象反应或威胁生命反应并且应当如同该个体患有重度疟疾那样进行治疗。根据如北美洲医院规定的金标准重度疟疾疗法,将鉴定的那些个体用药物和流体静脉内治疗。

  实施例12使用预测性生物标记组合连同疑似患有疟疾的受检个体,确定受检tttt个体对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性

  血清样品取自疑似已经暴露于疟疾并表现出流感样症状的受检个体。使用表2中所示的每种抗体,对血清样品进行ELISA检验。ELISA检验结果与表5和表6中所示的生物标志物组合联合使用,并且对于每种生物标志物组合,如实施例2中所做那样,使用生物标志物组合的每种生物标志物的1分,确定生物标志物评分,其中如果测量值大于如实施例2中所确定的相应截断点,则记该分值。每种生物标志物组合的结果指示(伴随程度变动的灵敏度和特异性)受检个体是否具有患重度疟疾的增加可能性并且应当据此治疗。

  实施例13使用疑似患有肺炎的受检个体,确定受检个体对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性。

  血清样品取自疑似患有肺炎的受检个体。使用表2中所示的每种抗体并且确定与血清样品中抗体选择性杂交的蛋白质的水平,对血清样品进行ELISA检验。所得到的数据与实施例4中所示的生物标志物组合联合使用,并且将试验样品中的蛋白质水平与已经确定患有肺炎并且尚未形成威胁生命反应的个体的群体中和已经确定患有肺炎并且已经形成威胁生命反应的个体的群体中生物标志物组合的每种生物标志物的蛋白质水平比较。将所述受检个体的生物标志物水平与该组合的每种生物标志物的两个对照群体中所述生物标志物水平比较,并且分析合并结果,以确定受检个体是否类似于患有肺炎并且不出现威胁生命反应的对照群体和已经诊断为患有肺炎并出现威胁生命反应的对照群体,其中更类似于患有肺炎并出现威胁生命反应的对照群体的结果表示受检个体具有增加的对肺炎出现或形成威胁生命反应的可能性。

  实施例14使用疑似患有大肠杆菌感染的受检个体,确定受检个体对疾病出现危象反应和/或威胁生命反应的可能性。

  全血样品取自疑似因暴露于受污染供水而患有大肠杆菌感染的受检个体。由于检验设施不够用,受检个体就溶血尿毒症综合征进行诊断,并且没有接受检验以证实大肠杆菌感染。使用表2中所示的抗体并且确定样品中与表1中所示生物标志物相对应的每种蛋白质的水平,对血清样品进行ELISA检验。表1tttt中所示的生物标志物的蛋白质水平随分类器一起利用,其中通过比较如从两个独立群体(患有大肠杆菌感染、但未形成溶血尿毒症综合征的个体的群体和患有大肠杆菌感染并出现溶血尿毒症综合征的个体的群体)所测定的所述生物标志物水平生成所述分类器。选择灵敏度大于90%和特异性大于90%的分类器。如果分类器的结果显示样品充分类似于形成溶血尿毒症综合征的个体的群体,则受检个体按溶血尿毒症综合征受到治疗。

  实施例15如与使用WHO标准时患有临床肺炎的儿童相比,通过区分表现咳嗽和发热的肺炎(CXR+)患儿的能力所示,单独和组合使用不可知性生物标志物确定受检个体患有肺炎的可能性。

  对具有发热和上呼吸道症状的出现在非洲社区健康设施的儿童实施前瞻性研究。使用针对以下选自表1的9种生物标志物小组的抗体,对来自这些儿童的血清样品进行ELISA检验:CRP、PCT、sTie-2、内皮糖蛋白、P-选择蛋白、vWF、CHI3L1、IL18bpa和血管生成素样蛋白3。检验单独和组合的9种生物标志物区分以下两类儿童的能力:使用胸部X光北美洲金标准稍后诊断为患有肺炎(CXR+肺炎)(n=30)的儿童或者通过应用WHO临床肺炎标准稍后诊断为患有肺炎,但按胸部X光并未显示肺炎(CXR-肺炎n=90)的儿童。确定肺炎的WHO标准依赖于确定呼吸急促,如考虑儿童年龄时,通过测量呼吸速率如下所确定:<2月龄儿童中呼吸速率>60次呼吸/分钟、2月龄至12月龄儿童中>50次呼吸/分钟、和在≥1岁儿童中>40次呼吸/分钟。未患CXR+肺炎或CXR-肺炎的儿童划归为患有并非肺炎的上呼吸道感染(URTI)(n=90)。

  表7中显示出现发热和上呼吸道症状的全部儿童的人口统计特征和临床特征。

  表7

  CXR+肺炎、CXR-肺炎患儿的人口统计/临床特征

  连续变量表述为:中位数(范围)

  +表示根据WHO儿童疾病综合管理(IMCI)标准视为“严重”的症状。

  单独检验每种生物标志物其的能力区分CXR+肺炎(通过胸部X光证实的肺炎)和CXR-临床肺炎(根据WHO标准划归为肺炎,但是如通过胸部X光确定为肺炎阴性)。表8中显示二元分析结果。

  &作为连续变量处理和使用逻辑回归检验。对于s内皮糖蛋白以外的全部生物标志物,使用对数变换的变量。

  %粗体的P值表示统计显著的标志物(p<0.05)。在考虑假设生物标志物的多重比较后,用*标记p-值≤0.0056(0.05/9)。

  #分析年龄、温度、发热持续时间、心率、呼吸速率、血红蛋白、WBC、ALT、性别、部位、惊厥、脱水、黄疸、手掌苍白、胸部凹陷、鼻煽、呼噜音、胸部听诊、哮鸣、日期、HIV状态。

  单独地,通过单变量分析和通过区分两组儿童的曼-惠特尼(Mann Whitney)(数据未显示)均找到生物标志物CRP、PCT、CHI3L1和P-选择蛋白。表9显示如通过接受者操作曲线(ROC曲线)所确定的CRP、PCT、CHI3L1和P-选择蛋白的每一种的诊断性截断点和单独生物标志物的灵敏度及特异性。显示该组合的灵敏度(Sens)和特异性(Spec),连同正似然比(PLR)、负似然比(NLR)、正预测值(PPV)和负预测值(NPV)。

  表9

  *AUC=ROC曲线下面积

  **基于约登指数的截断点:J=max{灵敏度+特异性-1}

  另外,进行分类和回归树分析(CRT)以显示检验的9种生物标志物的生物标志物组合的实用性。尽管预计多种组合和变化具有实用性,但是设立多个标准,包括从中选择最佳组合的生物标志物的数目、是否为任何给定生物标志物选择特定截断点(例如二分)或是否允许连续范围;避免过度拟合的每个树最少节点数和最大层级,及设定错分成本以偏好避免例如错误从而选出优选性生物标志物组合的能力。表10和表11显示基于变动的输入所选择的组合模型的各种例子,并且显示组合的灵敏度(Sens)和特异性(Spec),连同正似然比(PLR)、负似然比(NLR)、正预测值(PPV)和负预测值(NPV)。类似地,图9以树形式显示表10中模型1组合的CRT分析,其中显示由每种生物标志物在区分两种群体(如与临床肺炎(或CXR-肺炎)相比的CXR+肺炎)方面增加的组合幂(combinatorial power)。

  表10

  *二分CRP(40μg/mL)和PCT(0.5ng/mL),因为POC检验已经在这些截断点处存在

  **错分成本总有利于CXR+肺炎的灵敏度增加

  ***2次分裂后的截短模型1

  表11

  1错分成本总有利于CXR+肺炎的灵敏度增加

  2模型中未选用的其他生物标志物。

  3全部标志物:Chi3L1、CRP、PCT、内皮糖蛋白、P-选择蛋白、vWVF、Ang3L1、Tie-2、IL18bpa

  42次分裂后的截短模型1

  5二分CRP(40μg/mL)和PCT(0.5ng/mL),因为POC检验已经在这些截断点处存在

  实施例16如与患有其他上呼吸道感染(URI)的儿童相比,通过区分表现咳嗽和发热的肺炎(CXR+)患儿的能力所示,单独和组合使用不可知性生物标志物确定受检个体患有肺炎的可能性。

  如实施例15中所述,对具有发热和上呼吸道症状的出现在非洲社区健康设施的儿童实施前瞻性研究。使用针对以下选自表1的9种生物标志物小组的抗体,进行来自这些儿童的血清样品进行ELISA检验:CRP、PCT、sTie-2、内皮糖蛋白、P-选择蛋白、vWF、CHI3L1、IL18bpa和Ang3L1。单独和组合检验9种生物标志物区分以下两类儿童的能力:使用胸部X光北美洲金标准稍后诊断为患有肺炎(CXR+肺炎)(n=30)的儿童或者年龄,性别、临床部位和日期匹配的患有未证实为肺炎的上呼吸道感染的儿童(n=90)。评价和比较单一参数生物标志物区分(a)CXR+肺炎与CXR-临床肺炎和(b)CXR+肺炎与其他上呼吸道感染(URTI)伴随排除细支气管炎排(ARI)的能力。表12中显示结果。

  表12

  &作为连续变量处理。对于s内皮糖蛋白以外的全部标志物,使用对数变换的变量。

  CXR+与CXR-分析中的患者是匹配的,并且使用逻辑回归。对于CXR+与URTI分析,使用条件性逻辑回归,原因是患者在年龄、性别、部位和日期方面匹配。

  $排除细支气管炎

  %粗体的P值表示统计显著的标志物(p<0.05)。在考虑多重比较后,p-值≤0.0056(0.05/9)标记为*。

  #分析年龄、温度、发热持续时间、心率、呼吸速率、血红蛋白、WBC、ALT、性别、部位、惊厥、脱水、黄疸、手掌苍白、胸部凹陷、鼻煽。

  与其他上呼吸道感染相比,相似的单独生物标志物能够区分CXR+肺炎,所述生物标志物包括生物标志物CRP、PCT和CHI3L1。当通过曼惠特尼(p=0.044)分析时,还确定P-选择蛋白为统计显著的单独生物标志物(数据未显示),但利用克鲁斯卡尔-沃利(Kruksill Wallis)分析连同邓恩的事后检验(Dunn’s post test)分析时则否(数据未显示)。在全部情况下,使用单独的生物标志物,URTI和CXR-临床肺炎是不可区分的(数据未显示)。表13显示当比较CXR+肺炎与URTI时,如通过接受者操作曲线(ROC曲线)所确定的CRP、PCT、CHI3L1和P-选择蛋白的每一种的诊断性截断点和单独生物标志物的灵敏度及特异性。显示该组合的灵敏度(Sens)和特异性(Spec),连同正似然比(PLR)、负似然比(NLR)、正预测值(PPV)和负预测值(NPV)。

  表13

  如同实施例15中,进行分类和回归树分析(CRT)以显示检验的9种生物标志物的生物标志物组合的选择作用。表14显示基于变动的输入所选择的组合模型,并且显示组合的灵敏度(Sens)和特异性(Spec),连同正似然比(PLR)、负似然比(NLR)正预测值(PPV)和负预测值(NPV)。

  表14

  *二分CRP(40μg/mL)和PCT(0.5ng/mL),因为POC检验已经在这些截断点处存在

  **错分成本总有利于CXR+肺炎的灵敏度增加

  实施例17确定单独和组合的不可知性生物标志物是否能够区分患有抗生素可治疗的细菌性感染的个体和患有抗生素可能无效的病毒性感染的个体

  对具有发热和上呼吸道症状的出现在非洲社区健康设施的一组儿童(n=15)实施前瞻性研究。使用针对以下选自表1的9种生物标志物小组的抗体,进行来自这些儿童的血清样品进行ELISA检验:CRP、PCT、sTie-2、内皮糖蛋白、P-选择蛋白、vWF、CHI3L1、IL18bpa和Ang3L1。稍后确定这些儿童(i)患有因大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、tttt沙门氏菌、链球菌、流感嗜血杆菌(H.Influenzae)或不动杆菌(Acinetobacter)之一所致的菌血症(n=16)或(ii)患有因Epstein Barr病毒+(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、细小病毒或腮腺炎病毒之一所致的病毒性感染。当细菌性感染包括肺炎克雷伯氏菌时观察到类似结果(数据未显示)。

  单独检验每种生物标志物区分患有抗生素可治疗的细菌性感染的儿童和患有将不响应于抗生素的病毒性感染的儿童的能力。表15中显示二元分析的结果。

  表15

  通过应用分类和回归树分析(CRT),对9种生物标志物的组合检验其区分患有(用抗生素可治疗的)细菌性感染的儿童和患有(无法从抗生素获益的)病毒性感染的儿童的能力。对于每种生物标志物,如果生物标志物的数值高于设定的截断点(如使用约登指数所确定),则记一个分数。计算全部分数的总和以确定“生物标志物评分”。表16显示基于最佳评定截断点选出的选择的组合模型。显示该组合的灵敏度(Sens)和特异性(Spec),连同正预测值(PPV)和负预测值(NPV)。

  表16

《用于早期确定对疾病的危象反应或威胁生命反应和/或治疗反应的生物标志物.doc》
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