精细调节的超特异性核酸杂交探针
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年12月16日提交的美国临时申请号61/916,321的优先权，其通过引用全文纳入本文。
背景
DNA和RNA序列中的微小差异可导致健康中的巨大差异。例如，细菌基因组中的单碱基改变可导致抗生素抗性，以及人类基因组中的一个单碱基改变可导致癌症缓解。随着基因组学领域的成熟和随之而来的许多核酸生物标志物序列和分子的发现，存在来自生物技术工业的发展可区分单碱基改变的可靠、稳健、廉价和精确的核酸试验的强烈需求。基于酶的区别核酸序列差异的方法难以与各种技术整合，因为酶要求特异性的温度和缓冲条件。
确保了核酸与它们的互补物的高特异性杂交无酶技术传统上依赖于解链温度的优化，但其难以精确地预测和控制。最近，已证实粘性末端杂交探针(toehold hybridization probes)可在宽温度和盐度范围内稳健地识别核酸序列中的单碱基改变。这些探针被设计为在反应标准自由能(ΔGοrxn)接近于零的情况下与它们的预期靶标反应，从而与预期靶标的杂交率接近50％。甚至单一核苷酸造成的靶标的变化也会使其以显著较低的杂交率(中值2％)与探针结合。
为了实现ΔGοrxn≈0这一性能，这些探针平衡了靶特异性的“粘性末端”区域和靶非同源性的“平衡”区域的结合能。DNA探针已经在实验上被证实可稳健地对DNA靶标进行区分，且RNA探针已经在实验上被证实可稳健地对RNA靶标进行区分。
然而，这些探针被一些限制所限。例如，当探针和靶标是不同类型、如当DNA探针被设计为对RNA靶标具有特异性的、2'-O-甲基RNA探针探针被设计为与RNA靶标结合以及LNA探针被设计为特异性地与DNA靶标结合时，不同类型的核酸分子之间的杂交热力学上的差异会导致低特异性或低灵敏度的不良的探针设计。另外，单独的碱基对/堆(stacks)的热力学的结合强度相对大，尤其妨碍了反应ΔGοrxn的精细调节，其进而限制了探针系统特异性和灵敏度之间的权衡的可调节性。此外，已知已公开的DNA和RNA杂交热力学参数在某些条件下是不完全和/或错误的。计算机虚拟设计的探针系统可具有与计算而得的ΔGοrxn显著不同的真实的ΔGοrxn；没有精细调节探针性能的方法，则必须使用迭代试错来实现具有所需的ΔGοrxn的最优探针设计。
发明概述
本发明根据某些例子，提供了高特异性的核酸杂交探针系统，其可靠地区分靶标核酸中的单碱基改变。与现有技术相比，本发明描述的探针系统的优点在于(1)可靠地用DNA、RNA和其他核酸探针来探测DNA、RNA、和修饰的核酸靶标；以及(2)能够进行灵敏度和特异性之间的权衡的精细调节。本发明的组合物和方法可用于基于DNA和RNA探测和定量的分子癌症诊断、传染疾病诊断、食品安全诊断、和研究发现工具。
在一个例子中，提供了一种用于与靶标核酸分子选择性地相互作用的组合物。该组合物包括第一浓度的包含第一区域、第二区域、和第三区域的第一核酸链、以及第二浓度的包含第四区域和第五区域的第二核酸链。靶标核酸包括第六和第七区域的核苷酸序列，其即使不完全也至少部分地分别与第一和第二区域的核苷酸序列互补。第一和第二浓度使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式2(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)])所决定的标准自由能的5kcal/mol以内的式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的标准自由能(ΔGοrxn)，其中式2的[P]0等于第二浓度，式2的[C]0等于第一浓度，R等于通用气体常数8.314J/mol·K，τ等于开尔文温度。在该例子中，式1的ΔGοt-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能；式1的ΔGοnh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能；式1的ΔGοv-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能；式1的ΔGοh-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。计算ΔGο值的方法之后在说明书中进行详述。在某些例子中，靶标核酸的浓度小于第一浓度。在另一些例子中，靶标核酸的浓度大于等于第一浓度。
在另一个例子中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七区域的序列使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的约-4kcal/mol到+4kcal/mol的标准自由能(ΔGοrxn)，其中[ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC]不在-1kcal/mol到+1kcal/mol之间。在另一些例子中，ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC的值都不在彼此的10％内。
在另一个例子中，靶标核酸还包括与第七区域邻近的第八区域，第八区域核苷酸序列不与第三区域核苷酸序列互补，在平衡下第八和第三区域之间的比对核苷酸对少于50％。
在另一个例子中，提供一种产生核酸探针的方法。所述方法包括以下步骤：在核酸分子中选择靶标核苷酸序列，该靶标核苷酸序列包括第六核苷酸子序列和第七核苷酸子序列；选择包括第一核苷酸子序列、第二核苷酸子序列和第三核苷酸子序列的第一核苷酸序列；并选择包括第四核苷酸子序列和第五核苷酸子序列的第二核苷酸序列。在这个例子中，第一、第二和靶标核苷酸序列的步骤的选择基于具有式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的约-4kcal/mol到约+4kcal/mol的标准自由能的相互作用，其中式1的ΔGοt-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能，式1的ΔGοnh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能，式1的ΔGοv-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能，并且式1的ΔGοh-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。该方法还包括合成含有第一核苷酸序列的第一核苷酸链和含有第二核苷酸序列的第二核苷酸链的步骤。
除了基于式1选择相关核苷酸序列以外，该方法可替代地或进一步包括选择第一和第二浓度，以使得式2(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0))所决定的标准自由能在式1(ΔGοrxn)所决定的标准自由能的5kcal/mol以内，其中式2的[C]0和[P]0分别表示第一核苷酸链和第二核苷酸链的预定浓度，R等于通用气体常数8.314J/mol·K，且τ等于开尔文温度。在一个例子中，如果式1所决定的标准自由能不在式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内，则可对第一核酸链或第二核酸链中至少一个的预定浓度进行改进直至其符合该条件。或者，优化可通过重复该方法的步骤并选择改良的核苷酸序列来进行，以使其符合所需的自由能条件。
提供一种用于鉴定样品中具有靶标核苷酸序列的核酸分子的存在与否或其量的方法。该方法包括将探针应用于可能含有靶标核酸分子的样品并在温度约4℃到约75℃、约25℃到约70℃、或约37℃到约65℃、或这之间的任意温度下进行杂交反应，以在靶标核酸分子存在于样品中的情况下允许探针与靶标核酸分子的杂交。在这个例子中，该探针包括第一核酸链和第二核酸链。第一核酸链含有第一区域、第二区域和第三区域，其中第一区域具有与靶标核酸分子的第六区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二区域具有与靶标核酸分子的第七区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第二核酸链含有第四区域和第五区域，其中第四区域具有与靶标核酸分子的第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第五区域具有与靶标核酸分子的第三区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个例子中，该靶标核酸分子是RNA。
一种用于从样品中选择性扩增靶标核酸序列的方法，所述方法包括将探针作为酶引物应用于含有样品、DNA或RNA聚合酶、和核苷酸三磷酸混合物的混合物。在一些例子中，该混合物还含有额外的DNA或RNA引物或额外的酶如切割酶、重组酶、解旋酶、限制性内切酶、核酸酶或连接酶。在一些例子中，允许在1分钟到72小时下进行等温反应来进行探针和混合物的结合。在一些例子中，允许在多次温度循环(在5到200次循环之间)下反应来进行探针和混合物的结合。
本发明的特点和优点对本领域的技术人员而言通过阅读例子的说明即容易理解。
附图说明
本发明的一些具体示例性例子可通过在某种程度上参考以下的说明书和所附附图来理解。
图1提供了一种用于本发明的合适的核酸探针系统10的实施方式。探针系统10包括关于靶标核酸T(在此也称为“靶标核酸分子”或“靶标核酸链”)设计互补链C(在此也称为“第一链”)和保护链P(在此也称为“第二链”)。互补物链C包括靶标-粘性末端-互补区域1(在此也称为“第一区域”)、靶标-同源互补区域2(在此也称为“第二区域”)、以及靶标-非同源-互补区域3(在此也称为“第三区域”)。保护链包括靶标-同源区域4(在此也称为“第四区域”)和靶标-非同源区域5(在此也称为“第五区域”)。靶标包括靶标-粘性末端区域6(在此也称为“第六区域”)和靶标-验证区域7(在此也称为“第七区域”)。在某些实施方式中，靶标可还包括靶标上游区域8、和/或额外的未命名的上游和下游区域。保护链P的靶标同源区域4可在序列中与靶标T的靶标验证区域7不同，例如在例子中保护链P和靶标T为不同类型的核酸(例如，RNA对DNA)。这里所用的术语“区域”在涉及探针系统或靶标核酸时是指作为杂交和分离中的功能单元起作用的一组连续的核苷酸碱基。
图2A提供了一种典型的探针系统10及其与靶标核酸T的反应，且图2B提供了一种典型的探针系统10及其与在靶标验证区域7中与靶标T有单碱基差异12的变体靶标V的反应。现在参考图2A，探针系统10被设计为探针系统10与预期靶标T(ΔGοrxn)的杂交反应的标准自由能与(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0))(式2)大致相同，并且确保互补链C与靶标T结合的中至高的产率。现在参考图2B，探针系统10与变体靶标V以标准自由能ΔGοV进行反应，ΔGοV比ΔGοrxn大ΔΔGοSNP(即，ΔGοV＝ΔGοrxn+ΔΔGοSNP)，其中ΔΔGοSNP表示单个碱基改变的相应热力学罚分。与预期靶标T相比，由于单个碱基错配12，探针系统10中的此结果具有非常低的与变体靶标V的结合产率。
图3提供了本发明中使用的结合区域组分的多种标准自由能以计算反应标准自由能(ΔGοrxn)。
图4提供了不同温度下的46个不同的BRAF表达的(外显子)mRNA的50nt无重叠子序列的(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)值的分布，假设第一核酸分子和第二核酸分子均为DNA。如同所见，最大值比最小值大20kcal/mol的情况广泛存在。考虑到ΔGοrxn中的1.4kcal/mol的差异会导致特异性或灵敏度中10倍的差异，此处的结果证实ΔGοv-TC-ΔGοh-PC应被视作本文中描述的探针的设计，从而改进了现有技术设计参数。
图5提供了不同标记热力学(ΔGοlabel＝ΔGοF-ΔGοFQ)的标准自由能贡献。在该例子中，保护链P的标记是淬灭剂Q，其对互补链C的荧光团F而言具有特异性。
图6是用于调整探针系统的行为的本发明的方法的一个方面的示意。具体而言，除了通过加入或移除碱基堆(调整式1的值)来调节反应标准自由能(ΔGοrxn)，可利用调整化学计量(P与C的浓度之比)来控制探针的特异性和灵敏度之间的权衡并提供一种这样做的更有效的方法(调整式2的值)。这里，假设靶标浓度小于第一浓度，且灵敏度计算为预期靶标的平衡结合率[TC]/([T]+[TC])，而且特异性计算为1减去靶标变体的结合率1-[VC]/([V]+[VC])＝[V]/([V]+[VC])。在该图中，变体与靶标的区别是单个碱基，且在37℃下ΔΔGοSNP＝+2kcal/mol。在计算机虚拟中通过用与计算而得的ΔGοrxn相差多至5kcal/mol的实际的ΔGοrxn来纠正探针系统不能使ΔGοrxn精确计算的情况下，调整P与C之比的化学计量也是有益的。
图7表示变体探针系统设计。图7A表示相反的5’/3’取向的探针系统。图7B表示区域1嵌入在区域2中、或区域1存在于区域2和3之间的探针系统。图7C表示区域2和4不完全互补、或区域3和5不完全互补的探针系统。
图8提供了不同的所需的靶标结合率、以及特异性和灵敏度之间的权衡的示意图。如果式1(或在使用标记的情况下的式3)所决定的反应标准自由能ΔGοrxn以自由能偏差X而偏离(式2或-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)])，则靶标结合的产率也同样改变。对于正值X，特异性(针对靶标变体V)将提高，但灵敏度(率)将下降。对于负值X，灵敏度将提高，但特异性将下降。对于特定的应用，特异性和灵敏度更为重要，并能够通过本发明中改进了现有技术的方法来精细调节热力学。
图9提供了一种示例性的本发明(实施例1)的探针，其在核苷酸11-30、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为+0.15kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝0.78以使X＝0。在([P]0-[C]0)/[C]0＝7.8的情况下X为+1.42kcal/mol，在([P]0-[C]0)/[C]0＝0.10的情况下X为-1.27kcal/mol。
图10提供了一种示例性的本发明(实施例2)的探针，其在核苷酸71-90、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.61kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝2.69以使X＝0。
图11提供了一种示例性的本发明(实施例3)的探针，其在核苷酸131-160、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-1.54kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝12.14以使X＝0。
图12提供了一种示例性的本发明(实施例4)的探针，其在核苷酸191-220、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.46kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝2.11以使X＝0。
图13提供了一种示例性的本发明(实施例5)的探针，其在核苷酸251-280、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-1.49kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝11.2以使X＝0。
图14提供了一种示例性的本发明(实施例6)的探针，其在核苷酸311-350、τ＝52℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.22kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝1.43以使X＝0。
图15提供了一种示例性的本发明(实施例7)的探针，其在核苷酸431-460、τ＝65℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF的表达mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为+1.03kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝0.19以使X＝0。
图16提供了一种示例性的本发明(实施例8)的另一方向的探针，其在核苷酸491-520、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.27kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝1.55以使X＝0。
图17提供了一种示例性的本发明(实施例9)的在保护链的靶标-同源区域(第四区域)中含有有意单核苷酸错配的探针，其在核苷酸551-580、τ＝37℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.37kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝1.82以使X＝0。
图18提供了一种示例性的本发明(实施例10)的探针，其在核苷酸611-630、τ＝25℃、[Na+]＝1M下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-0.66kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝3.0以使X＝0。
图19提供了一种示例性的本发明(实施例11)的探针，其在核苷酸671-700、τ＝25℃、[Na+]＝1M、30％甲酰胺下靶向BRAF表达的mRNA子序列。基于文献参数以及假设1％甲酰胺相当于0.6℃的温度升高，ΔGοrxn计算为0.32kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝0.58以使X＝0。
图20提供了一种示例性的本发明(实施例12)的探针，其在核苷酸671-700、τ＝62℃、[Mg+]＝3mM下靶向DNA序列。基于文献参数，ΔGοrxn计算为-3.07kcal/mol且推荐([P]0-[C]0)/[C]0＝100以使X＝0。
图21提供作为引物使用本发明的探针的热点多重PCR的示意性视图。将含有所需的靶标核酸分子22的样品20与酶23、正向引物24和反向引物组10a-10d混合。靶标核酸分子22包括位于与另一个基因座邻近的基因座(“热点”)的单碱基突变，且典型地通过标准PCR引物来探测。由于本发明的探针沿着引物的全长对单一核苷酸错配具有特异性，因此本发明的探针在热点多重PCR引物中有独特的优势。另外，将本发明的探针作为PCR引物(主要是双链)的应用将抑制常常限制PCR的多重扩增能力的引物二聚体的形成。通过使用不同的荧光通道(1、2、3和4)，每个靶标可用非常少的不希望的交叉相互作用来定量。
图22提供一种示例性的热点多重PCR反向引物组，其使用本发明的探针靶向四种不同的NRAS密码子61突变。序列设计和能量计算基于以上对设计的说明，而且对每个引物系统计算理论上使X＝0的[P]0/[C]0比例。
图23提供通过改变[P]0/[C]0比例来精细调节针对DNA靶标的探针。该图中的探针被设计为在不同的反应标准自由能下与相同的DNA靶标结合。在每个保护链在5'被Iowa Black RQ淬灭剂修饰的情况下，每个互补链在3'被TAMRA荧光团修饰。杂交率在实验上通过荧光取自不同的([P]0-[C]0)/[C]0比例。结果表明该图中示出的每个探针在特异性和灵敏度上是可调节的。所有的实验用1X PBS在25℃下进行。
图24提供通过改变[P]0/[C]0比例来精细调节靶向RNA序列(合成miR-122)的探针。探针设计方法除了使用RNA-DNA结合参数以外与图22类似。实验程序与DNA靶标相同。结果表明探针针对RNA靶标的灵敏度/特异性权衡也是可调节的。
图25提供作为自报告引物使用本发明的探针来选择性扩增靶标核酸分子的示意性视图。引物10的第一核酸链在一个末端上含有荧光团F，且引物的第二核酸链在另一个末端上含有淬灭剂Q。在扩增过程30中，与所需的靶标核酸分子25杂交后，荧光信号随着引物P的第二核酸链的扩散而增高，表明扩增子26的形成。
图26提供了作为荧光团标记的探针使用本发明的探针来扩增靶标核酸分子，以定量扩增中形成的所需的扩增子的量的示意性视图。样品可包括所需的靶标核酸分子22，其与酶23、正向引物27、反向引物(未显示)和荧光团标记的探针10混合。探针C的第一核酸链被内部的荧光团F和3’末端的淬灭剂功能化，因此由于荧光团和淬灭剂的紧密接近，探针天然昏暗(natively dark)。正向引物和探针C的第一核酸链与所需的靶标核苷酸分子在退火过程31中杂交，同时第二核酸链被靶标核酸分子置换。在扩展过程32中，具有核酸外切酶活性的酶23延伸引物并切割第一核酸链的磷酸二酯键，导致荧光信号的增强。
虽然本发明具有各种修改和替代形式，但在附图中已示出了具体示例性例子并且在本文中对这些实施方式做出了更详细的描述。然而，应该理解的是对具体示例性例子的描述并非意图将本发明局限于所公开的具体形态，但相反本公开将覆盖部分地由所附权利要求说明的所有修改和等同物。
发明描述
本文所述的核酸探针系统与以往描述的系统相比提供多种优势。第一，本文所述的方法和组合物提供更经济的DNA探针以试验特异性序列的RNA靶标；因为RNA杂交通常特异性低于DNA杂交，因此针对RNA靶标的DNA探针还可展示出改进的特异性。另外，受益于稳健的单一核苷酸特异性，本文的方法和组合物允许经修饰的核酸探针，如将其与2'-O-甲基核苷酸或锁核酸(LNA)合并；这些经修饰的核酸探针可具有理想的特性如核酸酶抗性。第二，通过探针系统中保护物和互补物的相对浓度的修改，本文所述的方法和组合物提供可被精细调节的特异性和灵敏度性能。另外，探针系统还具有另外两个理想的特征：本文所述的探针非常特异且本文所述的探针可在宽温度和盐浓度范围内操作，且因此在许多不同的实验条件下在功能上可靠。例如，在温度10℃到70℃中，单碱基改变导致结合率中约30倍的差异。最后，本文所述的探针动力学上快速。例如，本发明的探针与靶标核酸分子相互作用十倍于杂交。
与本发明一致的探针系统10与其预期靶标T进行反应的概况示于图2A和B。在该例中，探针系统10由保护寡核苷酸/链P和互补寡核苷酸/链C以保护链P超过互补物C存在的方式组成。保护链P和互补物C可杂交形成部分双链复合物；无论保护链P和互补物C是否被分别被导入靶标T或者发生预反应以形成复合物，皆是如此。另外，在一些例子中，除了部分保护链和互补物的双链复合物以外，超量的互补物C或保护链P使超量的链可作为单链分子存在。在图2A中，以使靶标T和探针系统10之间的反应具有等于(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)])的反应标准自由能(ΔGοrxn)的方式选择浓度比[P]0/[C]0。这导致在一些例子中，在平衡状态下样品中所有靶标分子T的一半与互补链C结合。参见图2B，序列中与靶标T可能由于单个碱基而在靶标-验证7或靶标-粘性末端6区域不同的靶标变体V会以更高的正标准自由能(ΔGοV)结合且具有显著较低的平衡产率(例如2％)。
保护链P和互补链C序列基于预期靶标T的序列来设计。如图1所示，每条链在概念上分为多个无重叠区域。需要注意的是，均与靶标-同源-互补区域2(在此也称为“第二区域”)部分或完全互补的靶标-验证区域7(在此也称为“第七区域”)和靶标-同源区域4(在此也称为“第四区域”)可具有不同的序列。例如，RNA靶标可具有包括尿嘧啶的靶标-验证区域7而DNA保护链P可在靶标-同源区域4中包括胸腺嘧啶。作为另一个例子，区域4可部分地在某些位点与区域2错配，而区域7与区域2完美配对。作为另一个例子，区域4和区域7均可部分地与区域2错配，但位于不同的核苷酸碱基。
没有标记的探针系统的反应标准自由能由ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)提供，其也被本文和权利要求作为“式1”引用。具有功能化团或标记的探针系统的反应标准自由能由ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)+ΔGο标签提供，其也被本文和权利要求作为“式3”引用。应当理解的是，本文所有使用的标准自由能术语在组合物应用于靶标核酸分子的温度和缓冲液条件下评价。
如图3和5所示，式1和3由多个表示保护/互补/靶标核酸链的各种区域之间的杂交的标准自由能的部分组成。如上所示，术语ΔGοt-TC表示探针系统10的靶标核酸T的靶标-粘性末端区域6和互补链C的靶标-粘性末端互补区域1之间的杂交的标准自由能。这些区域可部分互补或完全互补。在这个例子中，术语“部分互补”被定义为第一区域中的核苷酸与第六区域的比对核苷酸互补超过60％。然而，应当理解的是，术语“部分互补”在其他配对序列中可具有不同的含义。
术语ΔGοnh-PC表示保护链P的靶标-非同源区域5和互补链C的靶标-非同源-互补区域3之间的杂交的标准自由能。在这个例子中，术语“部分互补”被定义为第三区域中的核苷酸与第五区域的比对核苷酸互补超过60％。
术语ΔGοv-TC表示靶标核酸T的靶标-验证区域7和互补链C的靶标-同源-互补区域2之间的杂交的标准自由能。在这个例子中，术语“部分互补”被定义为第二区域中的核苷酸与第七区域的比对核苷酸互补超过60％。
术语ΔGοh-PC表示保护链P的靶标-同源区域4和互补链C的靶标-同源-互补区域2之间的杂交的标准自由能。这些区域可部分互补物或完全互补。在这个例子中，术语“部分互补”被定义为第二区域中的核苷酸与第四区域的比对核苷酸互补超过60％。
术语ΔGοlabel等于互补链上的标记的标准自由能(ΔGοF)减去标记和保护链之间的相互作用的标准自由能，包括保护链上的任意其他功能化团。在图5的例子中，保护链的标记(Q)是一种对互补链的荧光团(F)特异的淬灭剂。
仍然参考图1，在某些例子中，探针系统序列的设计使得(1)靶标-粘性末端-互补区域1中几乎没有二级结构，并且(2)靶标-上游区域8和靶标-非同源-互补区域3之间几乎没有结合。此处，靶标-粘性末端-互补区域中“几乎没有二级结构”被定义为在评估的最小自由能结构中，区域中的为双链状态的核苷酸少于50％，在工作温度和盐度条件下进行计算。此处，靶标-上游区域和靶标-非同源-互补区域3之间“几乎没有结合”被定义为在评估的最小自由能结构中，靶标-非同源-互补区域3中的为双链状态的核苷酸少于50％，在工作温度和盐度条件下进行计算。
除了测定的反应标准自由能(ΔGοrxn)，例如，根据式1，本发明的探针设计还包括考虑探针的保护链和互补链的相对浓度。这就能够独立于探针的序列设计之外，通过改变保护链与互补链之比来精细调节反应。因此，在一个例子中，本发明的核酸杂交探针系统的设计基于：
ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)＝-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
或
ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)+ΔGοlabel＝-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)+X
其中X是-5kcal/mol到+5kcal/mol之间的值。随着更高的正X值有助于更高的特异性，X值还允许使用者控制高分子灵敏度和高分子特异性之间的权衡。
应当理解的是，ΔGο的值仅被近似地基于当前可获得的文献值进行计算，而权利要求的探针被真实的ΔGο所描述和限定。基于我们的ΔGο值的实验研究，基于当前可获得的参数和软件的计算与真实值有多至3kcal/mol或15％的差异，无论哪个更大。
相比之下，WO2012/058488描述了核酸杂交探针的设计，其中主要设计约束是ΔGοt-TC≈ΔGοnh-PC，用本发明的方式表述，“约等于”被定义为相互间相差10％以内。在一种实施方式中，由于所需的X值与0的差异明显，因此本发明的探针的标准自由能ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC差异大于10％。在另一种实施方式中，由于(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)与0的差异明显，因此本发明的探针的标准自由能ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC差异大于10％。在另一种实施方式中，由于([P]0-[C]0)/[C]0与1的差异明显，因此本发明的探针的标准自由能ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC差异大于10％。在另一种实施方式中，由于ΔGοlabel与0的差异明显，因此本发明的探针的标准自由能ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC差异大于10％。
因此，本发明的探针系统在ΔGοv-TC、ΔGοh-PC、ΔGοlabel、X和的考虑上与现有技术有差异。在许多核苷酸序列的区域4和区域7为不同的设置中，对术语ΔGοv-TC、ΔGοh-PC的疏忽会导致不良的探针设计，在使用荧光团或其他标记时对术语ΔGοlabel的疏忽会导致不良的探针设计，对X的疏忽妨碍了特异性和灵敏度之间的不同权衡，以及对化学计量比的疏忽妨碍了独立于序列设计的探针系统行为的精细调节序列，此外还引起探针在某些P和C的化学计量比下表现不佳。这些均会在以下更详细地加以讨论。
第一，返回参考图2A，靶标T的靶标-验证区域7和保护链P的靶标-同源区域4在序列和热力学性能上由于多种理由而不同，这在T和P为不同核酸类型的例子中是重要的。例如，靶标T可以出于科学/临床上的兴趣是RNA分子，而保护链P出于经济/合成能力是DNA分子。作为另一个例子，保护链P可包括经修饰的核酸，如2'-O-甲基核苷酸或锁核酸(LNA)。作为另一个例子，区域4和区域7可以均为DNA，但在核苷酸序列中存在差异以受益于动力学的提高或不希望的生物学响应的降低。
在靶标T的靶标-验证区域7和保护链P的靶标-同源区域4不同时，ΔGοv-TC和ΔGοh-PC也不相等，并且必须在驱动探针系统设计过程的ΔGοrxn中加以考虑。ΔGοv-TC-ΔGοh-PC值可显著偏离0。现在参考图4，示出了46个不同的BRAF转录本RNA的无重叠子序列(每个长50nt)对比与DNA互补物结合的同源DNA序列的这些值的分布，使用从Sugimoto等[7]得到的RNA-DNA杂交热力学值以及从SantaLucia和Hicks[8]得到的DNA-DNA杂交热力学值。如其所见，不仅ΔGοv-TC-ΔGοh-PC值的范围为-20kcal/mol到+20kcal/mol，该值还取决于温度。相比之下，甚至ΔGοrxn中1kcal/mol的差异也会导致灵敏度和/或特异性的显著改变。
使用DNA探针(P和C)的RNA靶标T的探测仅为必须考虑ΔGοv-TC-ΔGοh-PC的一种应用。因为T和P为不同类型的核酸(RNA、DNA、LNA、PNA、硫代磷酸酯DNA、2'-甲氧基核酸等)或由于序列中的微小改变，在保护链P的靶标-同源区域与靶标T的靶标-验证区域存在差异的情况下还存在探针系统的其他变化，这将在以下详细讨论。
通过忽略ΔGοv-TC-ΔGοh-PC，必须假设该项的总值为0kcal/mol。该假设仅当保护链P的靶标-同源区域4与靶标T的靶标-验证区域7为相同特征和序列，例如使用DNA保护链的DNA靶标的应用与区域7和4具有相同的核苷酸序列。
第二，核酸的探测或成像的许多应用使用标记以帮助靶标核酸的存在或量化的可视化。这些标记可以是有机荧光团、金属纳米颗粒或招募抗体的半抗原。通常，这些标记可具有显著的热力学效果，使核酸杂交稳定化或失去稳定。使用标记的探针系统的合适的设计应考虑图5中示出的标记与保护链和与靶标的标准自由能差异。
第三，如上所述，保护链P和互补物C的相对浓度对本发明的探针系统起到重要的调节参数的作用，其独立于探针系统的序列设计而存在。鉴于DNA和RNA杂交热力学和标记热力学目前的理解是不完善的，对设计和合成后的特定探针系统的性能进行调节的能力对涉及这些探针系统的实际应用而言非常重要。
为了理解调节探针系统的性能中的P和C的相对浓度的作用，应当考虑靶标和探针系统之间的反应的平衡。整个化学反应可以如下表述。
典型地，靶标(生物DNA或RNA分子)的浓度比探针成分P和PC低得多；P和PC的更高浓度有助于驱动反应快速达到平衡。用于判断反应的行为的一种有用的指标是探针系统对靶标T的产率或灵敏度，可以表示为当灵敏度为约50％，即当未结合T的平衡浓度等于与C结合的T的平衡浓度([T]＝[TC])，对于变体靶标V的倍数变化区别([TC]/[VC])最好是在2倍以内。平衡常数Keq的值可通过[T]＝[TC]用以下的式来分析求出。
反应的标准自由能可通过以下的式与反应平衡常数联系起来。
在以上等式中，[P]0表示保护链的初始浓度并且[C]0表示互补物的初始浓度。因为靶标浓度[T]通常比保护链或探针的浓度都低，[P]和[PC]的平衡浓度可分别近似为[P]0-[C]0和[C]0。尺度不变，因此用于[P]0和[C]0的浓度可为加入到样品中的高原料浓度，或者通过将样品稀释后得到的最终浓度。需要注意的是[P]0和[C]0是指P和C的总浓度，包括存在于部分双链的PC种类中的那些。另一种表述该式的方法是([Pfree]0/[PC]0)，其中[Pfree]0表示游离P的初始浓度且[PC]0表示PC的初始浓度。
为了本发明的探针系统的使用，[P]0的浓度可低于、相同或高于但通常高于[C]0的浓度。例如，[P]0的浓度可以是[C]0的约1.01倍到约10000倍、[C]0的约1.1倍到约1000倍、或[C]0的约1.2倍到约100倍且包括任意上述设置范围之间的任意中间范围。
在一个例子中，探针的行为可以通过设计探针系统来调节为达到约50％灵敏度，使得ΔGοrxn接近于0、或约-5kcal/mol到约+5kcal/mol，再调整[P]0和[C]0以满足重要的是，由于通过添加或移除碱基对/堆调整ΔGοrxn所产生的粗粒度性质，不通过[P]0和[C]0来调节探针系统，几乎不可能得到50％灵敏度(或任意其他所需的灵敏度)。
图6表明在37℃、1M Na+下单个额外的碱基对使ΔGοrxn的值在-0.6kcal/mol到-2.2kcal/mol之间变化。
因此在本发明中，提供了通过保护链P和互补物C的化学计量比来精细调节ΔGοrxn的新概念。P和C的化学计量比的精度仅受液体处理系统(例如移液器精度)的精度的限制，并且通常可控制在2％以内。该2％的化学计量的精度进而导致调节探针性能–Rτln(1.02)＝-0.012kcal/mol的精度与ΔGοrxn的分辨率的精度相同。因此，通过P和C的化学计量比来调节热力学比与现有技术的通过添加碱基对来调节热力学的方法相比，细粒度超过50倍(-0.012kcal/mol对比-0.60kcal/mol)。P和C的化学计量比的调节可在设计阶段实现，或动态地作为用于特定应用的探针而被迭代地优化。
图22和图23所提供的实验结果表明了为了调节特异性/灵敏度权衡而调整比例([P]0。-[C]0)/[C]0的有效性。图22示出了定向至DNA靶标的四个不同的探针的序列设计(每个被设计为具有不同ΔGοrxn)，以及该DNA靶标就不同([P]0-[C]0)/[C]0值对每个探针的观察到的产率。图23描述了五个不同的针对RNA靶标的探针的序列设计(每个被设计为ΔGοrxn)，以及该RNA靶标就不同([P]0-[C]0)/[C]0值对每个探针的观察到的产率。如之前教导的，较大的([P]0-[C]0)/[C]0使靶标和探针之间的杂交产率单调降低。
在另一个方面，本发明提供一种探针系统，其中不满足而是提供一种细微的变化，其中所述值不相等，以实现特异性和灵敏度之间的不同权衡。为此，本发明的探针系统的热力学特性可用如下表述：
其中X偏离0。在一个例子中，X的值为约-5kcal/mol到约+5kcal/mol。对于正的X值，特异性(针对靶标变体V)将提高，但灵敏度(产率)将下降。对于负的X值，如图8所示灵敏度将提高但特异性将下降。在实践中，某些应用(如涉及稀有等位基因)可能在灵敏度的成本上要求更高的特异性，反之亦然。本发明的精细调节热力学的方法对这些要求灵敏度和特异性的复杂调节的应用中特别有用(也参见变体)。
在又一方面，本发明提供靶标-验证和靶标-同源区域之间的微小序列差异。(靶标T的)靶标-验证区域和(保护链P的)靶标-同源区域都意图与(互补物C的)靶标-同源-互补区域互补。然而，可能存在希望在靶标-验证和/或靶标-同源区域中具有微小的序列修饰的情况，以使得靶标-验证和/或靶标-同源区域仅部分地与靶标-同源-互补区域互补。为此，在靶标-同源-互补区域中超过60％的碱基与靶标-验证区域互补、以及靶标-同源-互补区域中超过60％的碱基与靶标-同源区域互补的例子中，所得到的探针与本文所述的探针结构的原理保持一致。
另外，本发明提供一种探针系统，如图7所示，其中保护链和互补物的5’到3’取向与非同源和粘性末端区域的位置相反。现代核酸合成以从3’末端到5’末端的方式进行，导致了截断和缺失集中于5’末端。因此，预计图1-6所示的原始取向是理想的，因为保护链和互补物上的截断将趋向于积极地彼此平衡，保持所需的ΔGοrxn。与此相反，在图7所示的设计取向中，保护链和互补物中的截断均趋向使ΔGοrxn更负，降低探针系统的可靠性和特异性。在保护链和互补物寡核苷酸在合成后通过高压液相色谱(HPLC)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化的情况下，这些效果得到减轻。
在反应标准自由能(ΔGοrxn)的分析中，非结构化的寡核苷酸的形成的ΔGο的标准自由能被定义为0。靶标T和探针系统(P和C)之间的反应的平衡常数(Keq)可直接通过以下式由反应的标准自由能ΔGοrxn算出：
其中R＝8.314J/mol，K是理想气体常数(或称玻尔兹曼常数)，且τ为开尔文温度下的环境温度。
在本发明的探针系统的设计中，反应ΔGοrxn被分解为多个ΔGο的总和，ΔGο表示互补链向靶标链和互补链向保护链的各区域的杂交标准自由能(例如ΔGοnh-PC表示靶标-非同源区域向靶标-同源互补区域的杂交)。这些项的值可通过添加以下详述的碱基堆的标准自由能来大致计算，尽管目前的文献提供的标准自由能的值不完整且精度有限。需要实验测试来确定每个探针的真实的ΔGοrxn值，但文献指导值提供了粗略的(通常在3kcal/mol或15％以内)ΔGοrxn的估计。
在一个例子中，本发明的探针系统的区域之间的杂交的标准自由能基于碱基对堆积的方法来计算。在该方法中，两个相邻的碱基对包括一个堆，其具有规定的焓(ΔHο)和熵(ΔSο)值。在特定温度τ(开尔文温度)下每个堆的标准自由能(ΔGο)可由等式ΔGο＝ΔHο-τΔSο计算。数个堆的标准自由能可以相加以评估结合区域的标准自由能。例如，与‘GAG’区域配对的‘CTC’区域的标准自由能是堆‘CT/GA’的标准自由能加上堆‘TC/AG’的标准自由能。在37℃、1M Na+下，堆‘CT/GA’的标准自由能为-1.28kcal/mol且堆‘TC/AG’的标准自由能为为-1.30kcal/mol，因而与‘GAG’区域配对的‘CTC’区域的标准自由能为-2.58kcal/mol。
DNA-DNA堆的ΔHο和ΔSο值基于SantaLucia和Hicks发表的研究，示于表1。RNA-DNA堆的标准焓变和标准熵变基于Sugimoto等发表的研究，示于表2。RNA-RNA堆的标准焓变和标准熵变基于Turner等发表的研究，示于表3。碱基堆的ΔHο值均相同地以不考虑盐度的方式被文献所接受。与此相反，碱基堆的ΔSο通过0.368*ln([Na+])cal/mol*K被调整，由于阳离子的静电屏蔽特性而不考虑核苷酸碱基相同性。另外，二价阳离子(如Mg2+)也可用于反应溶液；二价阳离子在碱基配对热力学中的效果在文献(如Owczarzy，《生物化学(Biochemistry)》，2008)中有描述。最后，可以使用甲酰胺这样的变性剂来促进杂交反应，尤其在原位杂交应用中。据文献报道，以核酸碱基配对热力学为目的，被甲酰胺有效替代的每一个百分点的水(％)提高了0.6℃的温度，参见Blake和Delcourt，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，1996。
表1.1M NaCl中的DNA Watson-Crick配对的热力学参数。
表2.1M NaCl中的RNA-DNA双链体配对的热力学参数。
表3.1M NaCl中的RNA-RNA双链体配对的热力学参数。
在一个例子中，本发明的探针系统的各个区域的杂交的反应标准自由能(来自式1或3的ΔGοrxn)如下计算。
ΔGοt-TC(靶标-粘性末端-区域(区域6)向靶标-粘性末端-互补区域(区域1)的杂交)由将所有粘性末端区域核酸堆、邻接的堆和起始能量损失(ΔGοini)(由于为了杂交而定向两个核酸分子造成的熵损失)的标准自由能相加而成。ΔGοini值可通过ΔGο＝ΔHο-τΔSο由ΔHοini和ΔSοini计算
ΔGοt-TC＝ΔGο邻近+Δοini+ΣΔGοt-推
对于表1所提供的DNA-DNA杂交，ΔHοini＝0.2kcal/mol且ΔSοini＝-5.7cal/(mol·K)。对于表2所提供的RNA-DNA杂交，ΔHοini＝1.9kcal/mol且ΔSοini＝-3.9cal/(mol·K)。对于表3所提供的RNA-RNA杂交，ΔHοini＝0.0kcal/mol且ΔSοini＝-10.8cal/(mol·K)。
在一个例子中，本发明所述的探针在工作条件下具有约-2kcal/mol到约-16kcal/mol、约-5kcal/mol到约-13kcal/mol、约-7kcal/mol到约-10kcal/mol的ΔGοt-TC。
ΔGοnh-PC(保护链P的靶标-非同源区域5向互补物C的靶标-非同源-互补区域3的杂交)由将非同源区域中的所有堆、同源区域中的邻接堆和杂交起始能量ΔGοini的标准自由能相加而成。每个堆标准自由能和起始标准自由能基于以上所讨论的方法来进行计算。
ΔGοv-TC(靶标T的靶标-验证区域7向互补物C的靶标-同源-互补区域2的杂交)等于靶标-验证区域中的所有核酸堆之和。每个标准自由能都基于以上讨论的方法进行计算。在这个例子中，起始能量ΔGοini没有被用于该项的计算中。
ΔGοh-PC(保护链P的靶标-同源区域4向互补物C的靶标-同源-互补区域2的杂交)等于靶标-同源区域中的所有核酸堆之和。每个标准自由能都基于以上讨论的方法进行计算。在这个例子中，起始能量ΔGοini没有被用于该项的计算中。
在一个例子中，靶标-粘性末端-互补区域(区域1)和靶标-粘性末端区域(区域6)之间和靶标-同源-互补区域(区域2)和靶标-验证区域(区域7)之间的杂交的标准自由能之和(ΔGοt-TC+ΔGοv-TC)比-7kcal/mol更负，例如为约-7kcal/mol到约-70kcal/mol、约-7kcal/mol到约-50kcal/mol、以及-7kcal/mol到约-30kcal/mol。在该例子或其他例子中，靶标-非同源-互补区域(区域3)和靶标-非同源区域(区域5)之间和靶标-同源区域(区域4)和靶标-同源-互补区域(区域2)之间的杂交的标准自由能之和(ΔGοnh-PC+ΔGοh-PC)比-10kcal/mol更负，例如为约-10kcal/mol到约-70kcal/mol、约-10kcal/mol到约-50kcal/mol、以及-10kcal/mol到约-30kcal/mol。
除了无酶核酸探测系统以外，本发明的探针在PCR应用或其他等温扩增系统中作为引物是有用的，例如在热点多重PCR反应中。在将探针用于PCR反应中时，在认真设计和精细调节后可将不希望的扩增最小化。因此，可将两种或以上的用于非相同靶标的引物系统相结合用于热点多重PCR。热点多重PCR的示意图示于图21。由于引物系统的高特异性特征，一个多重组的靶标序列可高度类似。引物组中每个引物系统的设计方法与如上所述的探针相同。每个引物系统的特异性和灵敏度可根据实验结果进行调整。用于热点多重PCR的引物系统的例子示于图22。
在一个实施方式中，PCR或其他等温扩增系统的信号生成方法使用荧光团-修饰互补物和淬灭剂-修饰保护链。保护链作为扩增所得从互补物中分离，因此荧光信号与扩增的靶标的拷贝数成正比。不同的靶标可同时通过使用光谱无重叠的荧光团来定量。图25示出了一种类似的使用荧光团-修饰互补物和淬灭剂-修饰保护链作为自报告引物的信号生成方法。图26示出了与传统TaqMan探针类似的另一种信号生成方法，使用荧光团-和淬灭剂-修饰互补物和非修饰保护链作为探测探针。在多种设置中，承载不同荧光团的探针可被用于不同的所需的靶标。不像传统的TaqMan探针那样仅可被用于所需的靶标高度不同的情况下，以使得每个TaqMan探针仅特异性地与一个靶标结合且不干涉其他靶标的反应，说明书中本发明的类TaqMan探针独特地在区别类似靶标中有优势。
每个本发明所述的探针系统可由DNA、RNA或其类似物和/或其组合构成。在某些例子中，探针系统包括一个或多个的非天然核苷酸。引物中的非天然核苷酸的整合可进一步提高探针系统的性能，如通过提供改进的每个碱基结合亲和性和提高核酸酶抗性。
本发明所述的探针系统也可应用于启动酶促反应的环境中；在这样的环境中，探针系统被作为引物系统而引入，但作用的组合物和方法是相同的。说明书中所述的引物系统具有高特异性和和精细调节性能的能力，在核酸的酶促试验中有优势。
在某些例子中，本发明所述的引物作为聚合酶延伸的起点起作用，包括但不限于用于复制DNA模板的聚合酶链式反应，从DNA模板转录RNA产物，从RNA模板反向转录DNA产物，等温DNA和RNA扩增方法如基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、等温指数扩增反应(EXPAR)、切割酶扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)和转录介导扩增(TMA)。本发明所述的引物的高特异性性质使它们适于研究和临床应用，其中核酸与特定序列的子集被延伸和扩增。
用于本发明所述的探针系统的“靶标”可以是任意的单链核酸，如单链DNA和单链RNA，包括双链DNA和RNA通过热休克、不对称扩增、竞争性结合和其他的本领域标准方法所得的单链。用于引物系统的“靶标”可以是任意的单链(ss)或双链(ds)核酸，例如DNA、RNA或RNA逆转录的DNA产物。在一些例子中，靶标可以是DNA和RNA的混合物(嵌合体)。在另一些例子中，靶标包括人工核酸类似物，例如，肽核酸(Nielsen等，Science，254(5037)：1497-500(1991))或锁核酸(Alexei等，Tetrahedron，54(14)：3607-30(1998))。在一些例子中，靶标可以天然产生(例如，基因组DNA)或可被合成(例如，来自基因组库)。本文所使用的“天然产生”的核酸序列是存在于自然界中存在的没有人为干预的生物体或病毒的核酸分子中的序列。在一些例子中，靶标是基因组DNA、信使RNA、核糖体RNA、微小RNA、前微小RNA、亲微小RNA、长非编码RNA、小RNA、表观遗传修饰DNA、表观遗传修饰RNA、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在某些例子中，靶标核酸是生物体或病毒中天然产生的核酸。在一些例子中，靶标核酸是致病生物体或病毒的核酸。在某些例子中，受试者中靶标核酸的存在或缺失指示受试者有疾病或失调，或者易患疾病或失调。在某些例子中，受试者中靶标核酸的存在或缺失指示受试者对药物等用于治疗疾病或失调的处理的应答良好或不良。在某些例子中，受试者中靶标核酸的存在或缺失指示该受试者先前接受过癌症治疗以及处于有复发风险的缓解期。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构，且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区域、由连锁分析定义的基因座(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。多核苷酸可进一步被修饰，如通过与标记组分结合。术语“重组”多核苷酸意指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然中不产生或在非自然排列中被连接到另一种多核苷酸。术语“分离核酸”意指天然或合成来源的多核苷酸或它们的一些组合，其(1)不与在自然中发现“分离核酸”的细胞相关联，和/或(2)操作性连接至在自然中不与其连接的多核苷酸。
核酸还可包括单和双链DNA和RNA，以及另外的包含修饰的碱基、糖和主链的核酸的任意和所有形式。术语“核酸”因此被理解为包括但不限于单或双链DNA或RNA(且它们的形式可以是部分单链或部分双链)、cDNA、适体、肽核酸(“PNA”)、2’-5’DNA(具有缩短的主链的合成材料，具有与DNA的A构象匹配的碱基间隔；2’-5’DNA通常不与B型的DNA杂交，但容易与RNA杂交)、和锁核酸(“LNA”)。核酸类似物包括具有相似或改善的结合、碱基配对杂交性质的已知的天然核苷酸的类似物。嘌呤和嘧啶的“类似物”形式是本领域公知的，且包括但不限于氮丙啶胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N.sup.6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸和2,6-二氨基嘌呤。本文提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基、磷酸盐、烷基磷酸三酯、氨基磺酸、3’-硫缩醛、亚甲基(甲基亚胺基)、3’-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯、和肽核酸(PNAs)、甲基膦酸酯连接或甲基膦酸酯和磷酸二酯交替连接(Strauss-Soukup，1997，Biochemistry，36:8692-8698)、和苄基膦酸酯连接，如美国专利6,664,057中所讨论的；还参见《寡核苷酸和类似物，实践方法(OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES,A PRACTICAL APPROACH)》，F.Eckstein编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)IRL出版社(IRL Press)(1991)；《反义策略(Antisense Strategies)》，《科学纽约科学院年鉴(Annals of the New York Academy of Sciences)》，第600卷，Baserga和Denhardt编辑(NYAS 1992)；Milligan，1993，J.Med.Chem.36:1923-1937；《反义研究与应用(Antisense Research and Applications)》(1993，CRC出版社(CRC Press))。此处的核酸可从细胞提取或根据公知的本领域技术人员的任何手段进行合成制备；例如，核酸可以化学合成或从cDNA或mRNA转录或逆转录。
此处使用的靶标核酸可以是任意的核酸，例如人类核酸、细菌核酸或病毒核酸。靶标核酸样品或含有靶标核酸的样品例如可以是来自一个或多个生物样品的核酸样品，所述生物样品包括但不限于全血、提取自全血的核酸、血浆、提取自血浆的核酸、唾液、粪便、尿液、颊或鼻拭子、细胞、组织或体液。靶标生物样品可源自任意来源，包括但不限于真核生物、植物、动物、脊椎动物、鱼类、哺乳动物、人、非人类、细菌、微生物、病毒、生物来源、血清、血浆、血液、尿、精液、淋巴液、脑脊髓液、羊水、活检、针吸活检、癌症、肿瘤、组织、细胞、细胞裂解物、粗细胞裂解物、组织裂解液、组织培养细胞、口颊拭子、漱口水、粪便、木乃伊组织、法医源、尸体解剖、考古源、感染、医院内感染、生产源、药物制剂、生物分子制品、蛋白制剂、脂质制剂、碳水化合物制剂、无生命的物体、空气、土壤、树液、金属、化石、出土材料和/或其他陆地或陆地外材料和来源。样品还可以包含来自一个源或不同来源的材料的混合物。例如，感染的细菌或病毒的核酸在当来自这样的被感染的细胞或组织的核酸被使用本发明的方法来扩增时可随着人类核酸而被扩增。有用的靶标样品的类型包括真核样品、植物样品、动物样品、脊椎动物样本、鱼类样本、哺乳动物样品、人样品、非人类样品、细菌样品、微生物样品、病毒样品、生物样品、血清样品、血浆样品、血液样品、尿样品、精液样品、淋巴液样品、脑脊髓液样品、羊水样品、活检样品、针吸活检样品、癌样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞裂解物样品、粗细胞裂解物样品、组织裂解物样品、组织培养细胞样品、口颊拭子样品、漱口水样品、粪便样品、木乃伊组织样品、尸检样品、考古样品、感染样本、医院内感染样品、生产样品、药物制备样品、生物分子制品样品、蛋白制剂样品、脂质制剂样品、碳水化合物制剂样品、无生命的物体样品、空气样品、土壤样品、树液样品、金属样品、化石样品、出土材料样品和/或其他陆地或陆地外样品。在一些例子中，此处所使用的靶标核酸包括重复序列、二级结构和/或高G/C含量。
在某些例子中，感兴趣的靶标核酸分子长约19到约1000000核苷酸(nt)。在一些例子中，靶标长约19到约100、约100到约1000、约1000到约10000，约10000到约100000、或约100000到约1000000。在一些例子中、靶标长约20、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约30000、约40000、约50000、约60000、约70000、约80000、约90000、约100000、约200000、约300000、约400000、约500000、约600000、约700000、约800000、约900000、或约1000000核苷酸。可以理解的是靶标核酸可在更长的核酸的环境中被提供(例如，如染色体或染色体片段中的编码序列或基因)。
在某些例子中，感兴趣的靶标为线性，而在另一些例子中，靶标为环状(例如，质粒DNA、线粒体DNA或质体DNA)。
在一些例子中，此处提供的是引物-靶标系统。引物-靶标系统包括一个或多个核酸靶标、聚合酶、以及一个或多个引物(例如，引物双链体)。术语“引物”包括任一种本文所述的引物或引物系统。在某些例子中，本文所述的引物-靶标系统包括多个不同的引物。在一些例子中，引物-靶标系统可包括至少两个引物，其可用于识别以及例如扩增靶标核酸分子。靶标核酸分子能够例如以单拷贝或者低拷贝数存在于多个非靶标核酸分子中。任意一个本文所述的引物-靶标系统可包括与核酸扩增或测序反应类似的条件(例如，类似的试剂、反应温度等)。
本发明提供的试剂盒包括(1)至少一个具有靶标-同源-互补区域(区域2)、靶标-非同源-互补区域(区域3)和靶标-粘性末端-互补区域(区域1)的互补链，以及(2)至少一个具有靶标-同源区域(区域4)和靶标-非同源区域(区域5)的保护链。本发明提供的包括至少一个引物双链体的试剂盒包括(1)至少一个具有靶标-同源-互补区域、靶标-非同源-互补区域和靶标-粘性末端-互补区域的互补链，以及(2)至少一个具有靶标-同源区域和靶标-非同源区域的保护链。
本文所述的试剂盒中的任一个可进一步包括聚合酶，包括逆转录酶。本文所述的试剂盒中的任一个可进一步包括一个或多个选自缓冲液的试剂(例如，KC1、MgCl2、Tris-HCl)、dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，和水。本文所述的试剂盒中的任一个可包括保护链，其是摩尔过量的引物。本文提供的试剂盒中的任一个可进一步包括说明或用于获得说明的指南(例如，从网站)以使用试剂盒的组分。本文提供的试剂盒的任一个可进一步包括至少一个反应管、孔、腔等。
除非另有说明，否则本说明书和权利要求书所用的表示各成分含量、诸如分子量等性质、反应条件等等的所有数值应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则，在本说明书和所附权利要求书中所述的数值参数是近似值，可根据本发明试图获得的所需性质而变化。丝毫不是为了将等同原则的应用限制在权利要求的范围，每个数值参数至少应根据所记录的有效数字的位数并考虑到运用了常用的四舍五入规则进行解释。
术语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一或多于一个”的意思一致。本文中所用的“另一种/个”可指至少第二种/个或更多种/个。
考虑本说明书中所讨论的任何例子可以用任何本发明的方法或组合物实现，反之亦然。另外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。
权利要求书中术语“或”的使用是指“和/或”，除非明确表示仅为替代品或替代品是相互排斥的。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的包含，例如“含有”和“含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”，例如“有”和“拥有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形式的“含有”，例如“含入”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外的未提到的元素或方法步骤。
为了便于更好地理解本发明，给出了一些特定情况的实施例。以下实施例决不应被理解成限制或限定本发明的全部范围。
实施例
图9-20示出了DNA探针系统与RNA靶标的十二个实施例。
以下实施例展示了设计原则，阐明了不同区域的反应标准自由能(ΔGο)计算的数学运算，并例举了本发明所述的的方法所产生的典型的探针系统。这些代表性实施例覆盖了一系列不同的生物靶标序列，在许多不同的工作温度和盐度下被计算。此外实施例11还示出了意图在一变性甲酰胺浓度下工作的探针的设计。还给出了满足式1等于式2的标准自由能值标准自由能值所需的化学计量比[P]0/[C]0。
表4：实施例1-12的探针的标准自由能和化学计量数据。
实施例1
实施例1提供了一种指向靶标核酸BRAF 11-30的探针，如图9所示。37℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。最后，X值提供了式2的变化，以获得在给定相应化学计量比下与式1相等的值，且分别为0.00、1.42、和-1.27kcal/mol。
实施例2
实施例2提供了一种指向靶标核酸BRAF 71-90的探针，如图10所示。37℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例3
实施例3提供了一种指向靶标核酸BRAF 131-160的探针，如图11所示。37℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例4
实施例4提供了一种指向靶标核酸BRAF 191-220的探针，如图12所示。52℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例5
实施例5提供了一种指向靶标核酸BRAF 251-280的探针，如图13所示。65℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例6
实施例6提供了一种指向靶标核酸BRAF 311-350的探针，如图14所示。52℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例7
实施例7提供了一种指向靶标核酸BRAF 431-460的探针，如图15所示。65℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例8
实施例8提供了一种指向靶标核酸BRAF 491-520的探针，如图16所示。37℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοv-TC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例9
实施例9提供了一种指向靶标核酸BRAF 551-580的探针，如图17所示。37℃、1M Na+时探针向靶标杂交的ΔGο以下值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例10
实施例10提供了一种指向靶标核酸BRAF 611-630的探针，如图18所示。25℃、1M Na+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例11
实施例11提供了一种指向靶标核酸BRAF 670-700的探针，如图19所示。25℃、1M Na+时在30％甲酰胺中探针向靶标杂交的以下ΔGο值，在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
实施例12提供了一种指向DNA靶标核酸的探针，如图20所示。62℃、3mM Mg2+时探针向靶标杂交的以下ΔGο值在表4中提供：(1)互补链C的靶标同源互补区域2向保护链P的靶标同源区域4的杂交(ΔGοh-PC)；(2)互补链C的靶标-非同源-互补区域3向保护链P的靶标-非同源区域5的杂交(ΔGοnh-PC)；(3)互补链C的靶标-同源互补区域2向靶标T的靶标-验证区域7的杂交(ΔGοv-TC)；(4)互补链C的靶标-粘性末端-互补区域1向靶标T的靶标-粘性末端区域6的杂交(ΔGοt-TC)；以及(5)ΔGοrxn为ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)(式1)。此外，使根据式1的ΔGοrxn提供的值与式2提供的值相等的化学计量比([P]0/[C]0)也提供于表4。
虽然限定本发明宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值是尽可能准确记录的。然而，任何数值不可避免地包含由其各自的测量过程中存在的标准偏差所必然造成的某些误差，在文献报告的值以及实验误差也相同。
因此，本发明非常适于实现上述的以及其中所固有的目的和优点。本领域技术人员可作出许多包括在本发明的所示的精神(部分地由所附权利要求示出)内的改变。
