选择具有降低心脏毒性风险的化合物的系统及方法

选择具有降低心脏毒性风险的化合物的系统及方法

　　1.相关申请案的交叉引用

　　本申请案主张2013年12月13日申请的美国临时申请案第61/916,093号及2014年8月7日美国临时申请案第62/034,745号的优先权，其中每一个的内容以其全文引用的方式并入本文中。

　　2.技术领域

　　本申请案大体上系关于化合物及心脏毒性及更一般化地关于分析相对于心脏毒性的化合物的处理器实施系统及方法。

　　3.技术背景

　　心脏毒性为临床研究及上市后撤回方面的损耗的主要原因。人类Ether-a-go-go相关基因1(human Ether-a-go-go Related Gene 1；hERG1)K+离子信道牵涉心脏毒性，且美国食品药物管理局(Food and Drug Administration；FDA)要求对于针对hERG1通道的活性筛选候选药物。近期研究表明非hERG心脏离子通道亦牵涉心脏毒性。因此，推荐对于针对心脏离子通道(包括hERG1)的活性筛选候选药物。

　　hERG1离子通道(亦称为KCNH2或Kv11.1)为心肌细胞中的延迟整流钾电流(IKr)的快速分量的关键要素，为心脏动作电位的正常复极化相所需(Curran等人,1995,「A Molecular Basis for Cardiac-Arrhythmia；HERG Mutations Cause Long Qt Syndrome,」Cell,80,795-803；Tseng,2001,「I(Kr):The hERG Channel,」J.Mol.Cell.Cardiol.,33,835-49；Vandenberg等人,2001,「HERGChannels:Friend and Foe,」Trends.Pharm.Sci.22,240-246)。hERG1中的功能丧失突变使心室复极化的持续时间增加，其导致体表心电图的Q波与T波的间的时间间隔延长(长QT症候群-LQTS)(Vandenberg等人,2001；Splawski等人,2000,「Spectrum of Mutations in Long-QT Syndrome Genes KVLQT1,HERG,SCN5A,KCNE1,and KCNE2,」Circulation,102,1178-1185；Witchel等人,2000,「Familial and Acquired Long QT Syndrome and the Cardiac Rapid Delayed Rectifier Potassium Current,」Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.,27,753-766)。LQTS导致严重心血管病症，诸如快速性心律不整及心因性猝死。

　　常见的心脏及非心脏药物，诸如抗生素、抗组织胺药及抗菌药所用的不同类型的有机化合物可减少复极电流IKr(亦即，通过结合至hERG1的孔域的中心腔)且导致心室心律不整(Lees-Miller等人,2000,「Novel Gain-of-Function Mechanism inChannel-Related Long-QT Syndrome:Altered Gating and Selectivity in the HERG1N629D Mutant,」Circ.Res.,86,507-513；Mitcheson等人,2005,「Structural Determinants for High-affinity Block of hERG Potassium Channels,」Novartis Found.Symp.266,136-150；Lees-Miller等人,2000,「Molecular Determinant of High-Affinity Dofetilide Binding to HERG1Expressed in Xenopus Oocytes:Involvement of S6Sites,」Mol.Pharmacol.,57,367-374)。因此，若干审批通过药物(亦即，特非那定(terfenadine)、西沙必利(cisapride)、阿司咪唑(astemizole)及格帕沙星(grepafloxin))已自市场撤回，而诸如硫利达嗪(thioridazine)、氟哌啶醇(haloperidol)、舍吲哚(sertindole)及哌迷清(pimozide)的若干药物由于其对QT时间间隔延长的影响而限制了其用途(Du等人,2009,「Interactions between hERG Potassium Channel and Blockers,」Curr.Top.Med.Chem.,9,330-338；Sanguinetti等人,2006,「hERG Potassium Channels and Cardiac Arrhythmia,」Nature,440,463-469)。

　　所推荐的活体外药物筛选方法包括传统膜片钳技术、放射性标记药物结合分析、86RB-使用分析及来自中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞(Stork等人,2007,「State Dependent Dissociation of HERG Channel Inhibitors,」Br.J.Pharmacol,151,1368-1376)与HEK 293细胞(亦称为293T细胞)的高通量基于细胞的荧光染料与稳定转染hERG1离子通道(Diaz等人,2004,「The[3H]Dofetilide Binding Assay is a Predictive Screening Tool for hERG Blockade and Proarrhythmia:Comparison of Intact Cell and Membrane Preparations and Effects of Altering[K+]o,」J.Pharmacol.Toxicol.Methods.,50(3),187-199)。尽管精心设计的非临床测试显示新颖治疗剂的合理灵敏度且为其建立安全标准，但所有可能候选物的筛选仍极为耗时的且因此增加药物设计的最终成本。

　　分子模拟技术已在针对候选药物对心脏通道蛋白的阻断能力来筛选候选药物方面提供一些导引。举例而言，已公布基于分子对接与分子动力学(molecular dynamics；MD)模拟研究的hERG药物相互作用的基于受体的若干模型(Stansfeld等人,2007,「Drug Block of the hERG Potassium Channel:Insight from Modeling,」Proteins:Struct.Funct.Bioinf.68,568-580；Masetti等人,2007,「Modeling the hERG Potassium Channel in a Phospholipid Bilayer:Molecular Dynamics and Drug Docking Studies,」J.Comp.Chem.,29(5),795-808；Zachariae等人,2009,「Side Chain Flexibilities in the Human Ether-a-go-go Related Gene Potassium Channel(hERG)Together with Matched-Pair Binding Studies Suggest a New Binding Mode for Channel Blockers,」J.Med.Chem.,52,4266-4276；Boukharta等人,2011,「Computer Simulations of Structure-Activity Relationships for hERG Channel Blockers,」Biochemistry,50,6146-6156；Durdagi等人,2011,「Combined Receptor and Ligand-Based Approach to the Universal Pharmacophore Model Development for Studies of Drug Blockade to the hERG1Pore Domain,」J.Chem.Inf.Model.,51,463-474)。然而，此等研究中的MD模拟持续时间短且并不提供关于在电压诱导闸控过渡期间发生的结构重组以及离子通道的构形动力学的重要信息。因此，在此项技术中缺乏对于涉及心脏离子通道(包括hERG1)的心脏毒性问题的精确原子级方法。

　　4.发明内容

　　本文提供膜结合离子通道的第一个综合性计算动态模型，其提供该信道的生理上相关构形状态的原子级详细取样。在某些实施例中，将该模型与计算机模拟测试化合物的原子级详细高通量筛选算法组合来预测心脏毒性或心脏毒性风险且选择具有降低心脏毒性风险的化合物。

　　在某些实施例中，本文所揭示的模型及方法可用于筛选展示心脏毒性化合物为本文所揭示的膜结合离子通道的阻断剂，而证实安全药物并不阻断此等通道的标准化组的药物。在某些实施例中，本文所揭示的模型及方法可用于计算机模拟筛选数千种新候选药物，其大大加快药物研发且使得其更安全及更便宜而不必在生物分析中测试所有化合物。

　　在某些实施例中，本文所揭示的模型及方法可用于预测为心脏毒性或为潜在心脏毒性的化合物或识别该化合物的何种化学部分可能牵涉毒性，以使得药物研发人员可避免使用该分子或可在结构上修改该分子以解决毒性问题。

　　在某些实施例中，用于计算动态模型的离子信道为四聚体蛋白，其由膜、离子、溶剂或生理流体分子及视情况活体内系统的其他成分包围，以模拟通道实际环境。在某些实施例中，计算动态模型的持续时间为足够长(例如大于200ns)以允许取样通道的所有生理上相关构形状态，包括打开状态、关闭状态及非作用中状态。

　　在某些实施例中，通过计算动态模型及高通量筛选算法得到的原子级细节允许判定测试化合物在其较佳结合构形(conformation/conformations)中是否阻断通道。在某些实施例中，在其较佳结合构形中阻断通道的化合物为心脏毒性。

　　在一个态样中，本文提供一种选择具有降低心脏毒性风险的化合物的系统及方法。作为一实例，该系统及方法可包括与计算机模拟高通量筛选组合的计算动态模型，其模拟与心脏毒性相关的离子通道，例如人类Ether-a-go-go相关基因1(hERG1)信道、hNav1.5信道及hCav1.2信道。本文亦提供基于该模型及该高通量筛选重新设计预测为心脏毒性的化合物的处理器实施系统及方法。

　　作为另一实例，处理器实施系统及方法包括以下步骤：a)使用描述心脏离子信道蛋白的结构的结构信息；b)执行该蛋白结构的分子动力学(MD)模拟；c)使用丛集算法自该MD模拟识别该蛋白结构的优势构形；d)选择由该丛集算法识别的该蛋白结构的该优势构形；e)提供描述一或多种化合物的构形异构体的结构信息；f)使用对接算法来对接步骤e)的一或多种化合物的构形异构体与步骤d)的优势构形；g)识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形；h)使用MD优化该较佳结合构形；及i)判定该化合物在该较佳结合构形中是否阻断该蛋白的离子通道；其中步骤a)至步骤i)中的一或多个不必定以所述次序执行。

　　在某些实施例中，该方法的步骤a)至步骤i)中的一或多个以所述次序执行。

　　在某些实施例中，步骤a)的结构信息为三维(3D)结构。在某些实施例中，如本文所揭示，步骤a)的结构信息为X射线晶体结构、NMR溶液结构或同源模型。

　　在某些实施例中，步骤e)包含提供化合物的化学结构及确定该化合物的构形异构体。在某些实施例中，化合物的化学结构界定构形异构体。

　　在某些实施例中，若化合物在较佳结合构形中并不阻断离子通道，则选择该化合物用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。

　　在某些实施例中，该方法的步骤a)至步骤i)在一或多个处理器上执行。

　　在某些实施例中，心脏离子通道蛋白为膜结合蛋白。在某些实施例中，心脏离子信道蛋白为电压闸控的。在某些实施例中，心脏离子通道蛋白为钠、钙或钾离子通道蛋白。在某些实施例中，心脏离子通道蛋白为钾离子通道蛋白。在某些实施例中，钾离子通道蛋白为hERG1。在某些实施例中，hERG1通道经由四个单体次单元的缔合形成为四聚体。在某些实施例中，钾离子通道蛋白为可挠性。在某些实施例中，可挠性钾离子通道蛋白在单体次单元内或在单体的相互作用位点的间具有大于100个可变大小的口袋。在某些实施例中，心脏离子通道蛋白为钠离子通道蛋白。在某些实施例中，钠离子通道蛋白为hNav1.5。在某些实施例中，心脏离子通道蛋白为钙离子通道蛋白。在某些实施例中，钙离子通道蛋白为hCav1.2。

　　在某些实施例中，化合物能够抑制C型肝炎病毒(hepatitis C virus；HCV)感染。在某些实施例中，该化合物为HCV NS3/4A蛋白酶的抑制剂、HCV NS5B聚合酶的抑制剂或HCV NS5a蛋白的抑制剂。

　　在某些实施例中，步骤a)的结构信息为三维(3D)结构。在某些实施例中，步骤a)的结构信息为X射线晶体结构、NMR溶液结构或同源模型。

　　在某些实施例中，在执行步骤b)的MD模拟的前对步骤a)的结构信息执行能量最小化(energy minimization；EM)。在某些实施例中，步骤b)的MD模拟合并内隐或外显溶剂分子及离子分子。在某些实施例中，步骤b)的MD模拟合并具有外显磷脂、溶剂分子及离子分子的水合脂质双层。在某些实施例中，MD模拟使用AMBER力场、CHARMM力场或GROMACS力场。在某些实施例中，步骤b)的MD模拟的持续时间大于200ns。在某些实施例中，步骤b)的MD模拟的持续时间为200ns。

　　在某些实施例中，步骤f)的对接算法为DOCK或AutoDock。

　　在某些实施例中，步骤h)的MD使用NAMD软件。

　　在某些实施例中，该方法进一步包含计算蛋白与化合物的各组合在相应优化较佳结合构形中的结合能的步骤。在某些实施例中，该方法进一步包含以下步骤：为蛋白与化合物的各组合选择优化较佳结合构形中的最低计算结合能，且输出所选择的计算结合能作为蛋白与化合物的各组合的预测结合能。

　　在另一态样中，本文提供一种预测化合物的心脏毒性或心脏毒性风险的方法。

　　在本文所揭示的方法的某些实施例中，若化合物在较佳结合构形中并不阻断离子通道，则预测该化合物具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若预测化合物具有降低的心脏毒性风险，则选择该化合物用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。

　　在本文所揭示的方法的某些实施例中，若化合物在较佳结合构形中阻断离子通道，则预测该化合物为心脏毒性。在某些实施例中，若预测化合物为心脏毒性，则不选择该化合物用于进一步临床研发或用于人类。

　　在另一态样中，本文提供一种用于化学修改预测为心脏毒性的化合物的方法。

　　在本文所揭示的方法的某些实施例中，若化合物在较佳结合构形中的一个中阻断离子通道，则该方法进一步包含使用分子模拟算法来化学修改或重新设计该化合物以使得其在较佳结合构形中的任一个中不阻断离子通道的步骤。在某些实施例中，该方法进一步包含对经修改的化合物重复步骤e)至步骤i)。

　　在另一态样中，本文提供用于在活体外生物分析中或活体内野生型动物或转殖基因动物模型中测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性的生物方法。

　　在某些实施例中，该方法进一步包含在活体外生物分析中测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性。在某些实施例中，活体外生物分析包含高通量筛选离子通道及转运体活性。在某些实施例中，活体外生物分析包含高通量筛选钾离子通道及转运体活性。在某些实施例中，活体外生物分析为hERG1通道抑制分析。在某些实施例中，活体外生物分析为FluxORTM钾离子通道分析。在某些实施例中，对稳定表现hERG1的HEK 293细胞或小鼠心肌细胞细胞株HL-1细胞执行FluxORTM钾通道分析。在某些实施例中，活体外生物分析包含单个细胞中的电生理学量测。在某些实施例中，单个细胞中的电生理学量测包含膜片钳量测。在某些实施例中，单个细胞为经hERG1稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞在某些实施例中，活体外生物分析为Cloe筛选IC50hERG1安全分析。

　　在某些实施例中，该方法进一步包含通过量测野生型动物(例如野生型小鼠)或转殖基因动物模型(例如表现人类hERG1的转殖基因小鼠模型)中的ECG活体内测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性。

　　在另一态样中，本文提供一种处理器实施系统，提供其用于设计化合物以便降低心脏毒性风险。该系统包括一或多个计算机可读媒体、网格计算系统及数据结构。一或多个计算机可读媒体用于储存表示心脏离子信道蛋白的蛋白结构信息及用于储存描述化合物的构形异构体的化合物结构信息。网格计算系统包括多个处理器实施计算节点及一个处理器实施中央协调器，该网格计算系统自一或多个计算机可读媒体接收储存的蛋白结构信息及储存的化合物结构信息。该网格计算系统使用所接收的蛋白结构信息来执行分子动力学模拟以历经大于50ns模拟时长确定靶蛋白可挠性的构形。分子动力学模拟涉及基于近似分子内力的经验力场确定作用于原子上的力的计算节点中的每一个，其中执行数值积分以更新原子的位置及速度。中央协调器基于如通过计算节点中的每一个确定的该原子的更新的位置及速度形成分子动态轨迹。该网格计算系统经结构设计以：将分子动态轨迹丛集成蛋白的优势构形；执行对接算法，其使用化合物的结构信息以便对接化合物的构形异构体与蛋白的优势构形；及基于与对接化合物的构形异构体相关的信息识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形。将数据结构储存于内存中，其包括关于阻断蛋白离子通道的经识别的多个较佳结合构形中的一或多个的信息。基于关于阻断离子信道的信息，重新设计化合物以便降低心脏毒性风险。

　　在另一态样中，本文提供一种用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的计算机实施系统，该系统包括一或多个数据处理器及编码有用于命令该一或多个数据处理器执行某些操作的指令的计算机可读储存媒体。该操作包括：a)使用描述心脏离子信道蛋白的结构的结构信息；b)执行该蛋白结构的分子动力学(MD)模拟；c)使用丛集算法自该MD模拟识别该蛋白结构的优势构形；d)选择由该丛集算法识别的该蛋白结构的该优势构形；e)提供描述一或多种化合物的构形异构体的结构信息；f)使用对接算法来对接步骤e)的一或多种化合物的构形异构体与步骤d)的优势构形；g)识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形；h)使用MD优化该较佳结合构形；及i)判定该化合物在该较佳结合构形中是否阻断该蛋白的该离子通道。若化合物在较佳结合构形中阻断离子通道，则预测该化合物为心脏毒性。若化合物在较佳结合构形中不阻断离子通道，则预测该化合物具有降低的心脏毒性风险。基于化合物具有降低心脏毒性风险的预测来选择化合物。

　　在某些实施例中，用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的计算机实施系统包括：一或多个计算机内存及一或多个数据处理器。该一或多个计算机内存用于储存具有含有蛋白结构信息域、化合物结构信息域及较佳结合构形域且使其相互关连的数据库架构的单个计算机数据库。蛋白结构信息域包含在数据库架构内且经结构设计以储存表示心脏离子信道蛋白的蛋白结构信息。化合物结构信息域包含在数据库架构内且经结构设计以储存描述一或多种化合物的构形异构体的化合物结构信息。较佳结合构形域包含在数据库架构内且经结构设计以储存与蛋白与化合物的各组合的一或多个较佳结合构形相关的信息，其至少部分基于蛋白结构信息域及化合物结构信息域中的信息来确定。该一或多个数据处理器经结构设计以：处理经由与蛋白结构信息域、化合物结构信息域及较佳结合构形域相关的数据操作的数据库查询及通过使用较佳结合构形域中的信息判定一或多种化合物是否为心脏毒性。

　　在某些实施例中，提供非暂时性计算机可读储存媒体用于储存数据以供在数据处理系统上执行的化合物选择程序撷取。储存媒体包括蛋白结构信息数据结构、候选化合物结构信息数据结构、分子动力学模拟数据结构、优势构形数据结构及结合构形数据结构。蛋白结构信息数据结构可撷取储存于数据库中的信息且包括表示心脏离子信道蛋白的蛋白结构信息。候选化合物结构信息数据结构可撷取储存于数据库中的信息且包括描述一或多种化合物的构形异构体的化合物结构信息。分子动力学模拟数据结构可撷取储存于数据库中的信息且包括通过对蛋白结构信息执行分子动力学模拟而确定的靶蛋白可挠性的构形信息。优势构形数据结构可撷取储存于数据库中的信息且通过使用至少部分基于靶蛋白可挠性的构形信息的第一丛集算法来确定。结合构形数据结构可撷取储存于数据库中的信息且包括与蛋白与化合物的一或多种组合、一或多个较佳结合构形相关的信息，该蛋白与化合物的一或多种组合通过使用至少部分基于化合物结构信息及一或多个优势构形的对接算法来确定，该一或多个较佳结合构形通过使用至少部分基于与该蛋白与化合物的一或多种组合相关的信息的第二丛集算法来确定。若化合物在较佳结合构形中不阻断离子通道，则选择该化合物。

　　5.附图说明

　　图1A与图1B：用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的系统方块图。系统方块图(1A)与(1B)中所说明的过程为：靶制备(包括例如hERG的重新组合/同源蛋白模拟)、配位体收集制备(包括例如将配位体的2D信息翻译成3D代表结构)、集合生成(包括例如分子动力学模拟、主成分分析及反复丛集)、对接(包括例如对接及反复丛集)、对所选择复合物的MD模拟(包括例如分子动力学模拟及对接命中的初步排序)、使用MM-PBSA重新计分(包括例如结合自由能计算及重新计分最高命中)及实验测试(包括例如哺乳动物细胞中的hERG1通道抑制研究、哺乳动物细胞中的FluxorTM钾通道分析及用以测试野生型小鼠或表现hERG的转殖基因小鼠中的抗心律不整活性的心电描记法)。来自重新计分步骤的最高命中可充当下一阶段筛选的阳性对照组。集合生成、对接、对所选择复合物的MD模拟及使用MM-PBSA重新计分步骤可在超级计算机，例如罗彻斯特大学计算创新健康科学中心(Health Sciences Center for Computational Innovation,University of Rochester)的「IBM蓝色基因/Q」超级计算机系统上执行(例如，如方块图(1B)中所示)。

　　图2：展示S1-S6螺旋的hERG1单体次单元的表示。

　　图3：完整VGSC的α次单元及β次单元的表示。

　　图4：展示hERG1单体次单元的模型的分子动力学模拟轨迹的快照。在模型中展示的为形成感测跨膜电位且耦合至中央K+-选择性孔域的电压传感器域(voltage sensor domain；VSD)的S1-S4螺旋。亦展示共同协调孔螺旋的外螺旋(S5)与内螺旋(S6)及感测跨膜电位且耦合至中央孔域的选择性过滤器。

　　图5：展示hERG1四聚体模型的分子动力学模拟轨迹的快照；俯视图(5A)及侧视图(5B)。

　　图6：MD单位晶胞中的具有磷脂双层、水合水及离子的hERG1四聚体。

　　图7：hERG1的CαRMSD值对比MD模拟时间的曲线图。

　　图8：非阻断剂的实例：结合至hERG1四聚体的阿司匹林(Aspirin)(8A)；仅展示结合袋的结合阿司匹林(8B)；与结合1-萘酚(红色)匹配的结合阿司匹林(黄色)(8C)展示两种化合物在结合袋中重迭但不阻断通道。

　　图9：阻断剂的实例：结合至hERG1四聚体的BMS-986094(9A)；仅展示结合袋的结合BMS-986094(9B)。

　　图10：哺乳动物细胞中的hERG1通道抑制(IC50测定)。

　　图11：在用测试化合物培育5分钟的后使用膜片钳分析的CHO细胞中的hERG活性的百分比抑制：(11A)阿司咪唑；(11B)BMS-986094；(11C)1-萘酚(1-NP)；及(11D)2-胺基-6-O-甲基-2'C-甲基鸟苷(methyl guanosine；MG)。

　　图12：哺乳动物细胞中的FluxORTM钾通道分析：(12A)媒剂；(12B)阿司咪唑；(12C)1-萘酚(1-NP)；及(12D)BMS-986094。

　　图13：hERG通道的主要MD模拟的RMSD。

　　图14：hERG通道残基的原子波动。展示对四个单体的分析展现接近C端的残基(残基613至668)与N端区域的残基相比较刚性；而单体1及4的通道外部部分(残基483至553)与其他单体中的彼等部分相比展示较高可挠性。值得注意地，单体4的残基573至603与其余单体相比较刚性。

　　图15：渗透孔残基的原子波动。构成渗透孔与内腔的残基展示几乎相同的行为。

　　图16：历经最后300ns的平均电子密度分布。

　　图17：历经最后300ns的平均电子密度分布。离子的电子密度与水及脂质系统的彼等电子密度相比极其小(参见图15)，然而组中所展示的离子的分布展现与氯相比的钾离子的较大选择性，其中一小团钾处于通道的渗透孔内。

　　图18：主成分分析(Principal component analysis；PCA)特征值集中于半腔。优势特征向量的量值随着优势特征向量按指数律成比例衰减且与其余特征向量相比具有显著较高量值。

　　图19：丛集分析。对来自各单体的用于PCA的相同残基执行丛集分析。为了预测整个500ns MD轨迹的丛集的最佳数目，使用5至300范围内的不同丛集数目的平均连接算法且观测两个丛集度量值DBI及SSR/SST。在SSR/SST中的平线区与DBI局部最小值一致时预期最佳数目。在四十五(45)的丛集计数处观测到此条件。

　　图20：hERG通道的四十五(45)个优势构形。

　　图21：hERG腔的骨干动力学。hERG通道的45个优势构形跨越使用所用丛集方法论捕获的显著骨干构形动力学。

　　图22：构成hERG腔的残基的侧链的定向。类似于其骨干动力学，形成hERG腔的残基的侧链探索显著数目的不同定向。

　　图23：对接协议(阶段1)。第一识别的较佳配位体结合位置使用与涉及整个腔的45个优势构形的基于集合的盲对接。

　　图24：对接协议(阶段2)。阶段1排名最前的命中导引朝向腔的一半的选择，其中使用所有hERG结构执行更精确对接。

　　图25：二十二(22)个测试化合物的距离对比能量。

　　图26：hERG腔内的乙酰胺苯酚(acetaminophen)的结合位置。

　　图27：乙酰胺苯酚的结合模式。最低能量结合模式(约19kcal/mol)为在最接近Thr623残基的约内。

　　图28：阿司咪唑的结合模式。最低结合能(约52kcal/mol)为在最接近Thr623残基的内。

　　图29：BMS-986094的结合模式。最低结合能(约45kcal/mol)为在最接近Thr623残基的内。

　　图30：使用PredictorTM hERG荧光偏振分析的十一(11)种hERG通道阻断剂的浓度-响应曲线。半对数分离的测试化合物的十六(16)种浓度在PredictorTM hERG结合分析中用作竞争者。使用非线性S形剂量-响应分析所有数据(平均值±SEM；n＝12)。各组上方展示测试化合物的IC50计算值：(30A)阿司咪唑；(30B)哌迷清；(30C)西沙必利；(30D)氟哌啶醇；(30E)特非那定；(30F)胺碘酮(amiodarone)；(30G)E-4031；(30H)奎尼丁(quinidine)；(30I)塞内昔布(celecoxib)；(30J)罗非昔布(rofecoxib)；及(30K)BMS-986094。

　　图31：十一(11)种hERG通道阻断剂的hERG电生理学膜片钳浓度-响应曲线。膜片夹持稳定表现hERG的AC 10心肌细胞且量测测试化合物的七(7)种浓度的通过hERG的钾离子电流。将资料(平均值±SEM；n＝6)相对于对照组(0.01％DMSO媒剂)归一化且使用非线性S形剂量-响应(可变斜率)进行分析。各组上方展示测试化合物的IC50计算值：(31A)阿司咪唑；(31B)哌迷清；(31C)西沙必利；(31D)氟哌啶醇；(31E)特非那定；(31F)胺碘酮；(31G)E-4031；(31H)奎尼丁；(31I)塞内昔布；(31J)罗非昔布；及(31K)BMS-986094。

　　图32：使用PredictorTM hERG荧光偏振分析的十一(11)种hERG通道非阻断剂的浓度-响应曲线。半对数分离的测试化合物的十六(16)种浓度在PredictorTM hERG结合分析中用作竞争者：(32A)三甲氧苄二胺嘧啶(trimethoprim)；(32B)白藜芦醇(resveratrol)；(32C)雷尼替丁(ranitidine)；(32D)阿司匹林；(32E)萘普生(naproxen)；(32F)布洛芬(ibuprofen)；(32G)双氯芬酸钠(diclofenac Na)；(32H)乙酰胺苯酚；(32I)鸟苷；(32J)2-胺基-6-O-甲基-2'C-甲基鸟苷(MG)；及(32K)1-萘酚(1-NP)。

　　图33：十一(11)种hERG通道非阻断剂的浓度-响应曲线。膜片夹持稳定表现hERG的AC 10心肌细胞且量测测试化合物的七(7)种浓度的通过hERG的钾离子电流。将资料(平均值±SEM；n＝6)相对于对照组(0.01％DMSO媒剂)归一化。(33A)三甲氧苄二胺嘧啶；(33B)白藜芦醇；(33C)雷尼替丁；(33D)阿司匹林；(33E)萘普生；(33F)布洛芬；(33G)双氯芬酸钠；(33H)乙酰胺苯酚；(33I)鸟苷；(33J)2-胺基-6-O-甲基-2'C-甲基鸟苷(MG)；及(33K)1-萘酚(1-NP)。

　　图34：完整hNav1.5产生的同源模型的3D结构；侧视图(34A)及俯视图(34B)。

　　图35：所产生的Nav1.5模型的无约束MD快照的3D结构俯视图，展示在负电位区域中的内选择性过滤器内捕获的钠离子。

　　图36：hNav1.5的十一(11)种优势构形。

　　图37：hNav1.5中的雷诺嗪(Ranolazine)结合位点。

　　图38：描绘其中使用者可与网格计算环境交互的环境的实例方块图。

　　图39：描绘网格计算环境的硬件与软件组件的实例方块图。

　　图40：由化合物选择系统使用的数据结构的实例示意图。

　　图41：描绘在独立计算机上提供的供用户撷取的化合物选择系统的实例方块图。

　　6.实施方式

　　6.1定义

　　如本文所用，术语「心脏毒性(cardiotoxic/cardiotoxicity)」指对心脏具有毒性作用，例如通过对心脏的作用具有不利影响的化合物，由于毒化心脏肌肉或其传导系统。在某些实施例中，长Q-T症候群或「LQTS」为心脏毒性的一态样。

　　如本文所用，术语「降低心脏毒性」指关于例如本文所揭示的一或多种离子通道蛋白而有利的心脏毒性概况。在某些实施例中，若如本文所定义的「配位体」、「化合物」或「药物」不抑制本文所揭示的一或多种离子通道蛋白(例如钾离子通道蛋白，诸如hERG或hERG1；钠离子通道蛋白，诸如hNav1.5；及钙离子通道蛋白，诸如hCav1.2)，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不抑制「hERG」或「hERG1」，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不抑制「hNav1.5」，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不抑制「hCav1.2」，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞一或多种离子通道蛋白(例如钾离子通道蛋白，诸如hERG或hERG1；钠离子通道蛋白，诸如hNav1.5；及钙离子通道蛋白，诸如hCav1.2)的通道，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为如本文所定义的「阻断剂」，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞如本文所定义的hERG或hERG1通道，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞如本文所定义的hNav1.5通道，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞如本文所定义的hCav1.2通道，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hERG或hERG1的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hNav1.5的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hCav1.2的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性。

　　如本文所用，术语「降低风险(reducing risk/reduced risk」在其应用于心脏毒性(例如「降低心脏毒性风险」)时指倾向于展示关于例如本文所揭示的一或多种离子通道蛋白而改进的心脏毒性概况的可观测结果。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞本文所揭示的一或多种离子信道蛋白的信道，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为阻断剂，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞hERG或hERG1通道，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hERG或hERG1的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞hNav1.5通道，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hNav1.5的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不阻断、阻塞或部分地阻塞hCav1.2通道，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物不为hCav1.2的阻断剂，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若在配位体、化合物或药物抑制本文所揭示的一或多种离子信道蛋白的信道的能力方面存在至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％下降(如例如通过来自活体外生物分析的IC50数据量测)，则风险降低。在某些实施例中，在心脏毒性风险方面的至少约90％降低指示已相对于本文所揭示的一或多种离子通道蛋白消除心脏毒性。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物与如本文所揭示的一或多种离子通道蛋白的如本文所定义的所计算的结合能相当于大于或等于100μM的生理上相关浓度，则其具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若配位体、化合物或药物的如本文所定义的「选择性指数(selectivity index；SI)」大于约100、约1000或约10,000，则其具有降低的心脏毒性风险。

　　如本文所用，如本文所用的术语「LQTS」指长Q-T症候群，即增加因异常心跳所致的猝死风险的病症群。LQTS的QT指用于记录心脏的电活动的共同心电图(electrocardiogram；ECG、EKG)上的两个点(Q与T)的间的间隔。此电活动反过来为离子(诸如钠及钾)穿过心脏细胞周围膜中的离子通道的结果。延长的QT间隔指示在电活动方面的反常，其导致心脏肌肉收缩的不规则。此等不规则中的一个为心脏的较低室的极快速收缩(心动过速)的特异模式，称为尖端扭转型室速，即一种类型的心室心动过速。在泵送血液至身体方面并非有效的快速收缩导致流向大脑的富氧血液减少。此可导致突然意识丧失(晕厥)及死亡。

　　如本文所用，术语「脂质双层」指包含双层磷脂分子的细胞膜的基本结构。脂质双层对离子(诸如钾离子、钠离子及钙离子)而言为特别不可渗透的。

　　如本文所用，术语「水合脂质双层」指在水分子存在下的脂质双层。如本文所用，术语「离子通道」或「离子通道蛋白」指在细胞膜中充当孔(例如渗透孔)且准许离子(诸如钾离子、钠离子及钙离子)选择性通行的膜结合蛋白，电流藉助于其进出细胞。该离子通道蛋白包括例如钾离子通道蛋白，诸如hERG或hERG1；钠离子通道蛋白，诸如hNav1.5；及钙离子通道蛋白，诸如hCav1.2。在某些实施例中，离子信道或离子信道蛋白包含离子穿过的内腔及选择性过滤器(参见例如图4)。在某些实施例中，术语「渗透孔」、「孔」及「通道」可互换使用。

　　一般技术者应理解，如本文所述存在若干将离子信道分成组的可能方式(参见例如表1至表4)。举例而言，(1)通过闸控，其中通道的关闭、打开及未活化的间的构形改变称为闸控，其中(a)电压闸控离子信道通过跨越膜的电压梯度来控制(例如电压闸控钾信道、电压闸控钠信道及电压闸控钙信道等)，及(b)配位体闸控离子通道通过由配位体诱导的构形变化来调节；及(2)通过离子，其中可通过穿过彼等闸的离子种类来分类通道(例如钾离子信道、钠离子信道及钙离子信道等)。

　　如本文所用，术语「转运体活性」在关于「离子通道」或「离子通道蛋白」使用时指离子跨越细胞膜的运动。

　　如本文所用，术语「钾离子通道」或「钾离子通道蛋白」指准许钾离子(K+)的选择性通行的离子通道。

　　如本文所用，术语「钠离子通道」或「钠离子通道蛋白」指准许钠离子(Na+)的选择性通行的离子通道。

　　如本文所用，术语「钙离子通道」或「钙离子通道蛋白」指准许钙离子(Ca+2)的选择性通行的离子通道。

　　如本文所用，术语「膜结合蛋白」指在生理pH及盐浓度下结合至细胞膜的任何蛋白。在某些实施例中，可通过直接结合至磷脂双层或通过结合至与膜结合的蛋白、醣蛋白或其他中间物来结合膜结合蛋白。

　　如本文所用，术语「电压闸控信道」或「电压闸控离子信道」指通过通道附近的电位差异中的变化而活化的一类跨膜离子通道。在某些实施例中，电压闸控离子信道为电压闸控钾信道。在某些实施例中，电压闸控离子信道为电压闸控钠信道。在某些实施例中，电压闸控离子信道为电压闸控钙信道。

　　如本文所用，术语「电压闸控钾信道」、「电压闸控钾离子信道」或「电压闸控钾离子(K+)通道」为对钾具有特异性且对细胞的膜电位中的电压变化敏感的跨膜通道。

　　如本文所用，术语「电压闸控钠信道」、「电压闸控钠离子信道」或「电压闸控钠离子(Na+)通道」为对钠具有特异性且对细胞的膜电位中的电压变化敏感的跨膜通道。

　　如本文所用，术语「电压闸控钙信道」、「电压闸控钙离子信道」或「电压闸控钙离子(Ca+2)通道」为对钙具有特异性且对细胞的膜电位中的电压变化敏感的跨膜通道。

　　如本文所用，术语「人类ERG」、「人类ERG1」、「hERG」或「hERG1」指染色体7q36.1的人类Ether-à-go-go相关基因，其对称为Kv11.1的蛋白、钾电压闸控信道的alpha(α)次单元、子族H(eag相关)、成员2进行编码。一般技术者将已知，hERG或hERG1可亦称为不同名称，诸如erg1、ERG1、KCNH2、Kv11.1、LQT2及SQT1。参见例如「KCNH2potassium voltage-gated channel,subfamily H(eag-related),member 2[Homo sapiens(human)]，」基因ID:3757，2013年11月3日更新，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3757。如本文所用，术语「hERG」或「hERG1」可互换地指基因及基因产物Kv11.1。一般技术者将进一步已知，如本文所揭示，功能hERG1信道由四个相同单体α次单元(例如hERG1单体次单元)的同源四聚体组成。

　　如本文所用，术语「人类Nav1.5」或「hNav1.5」指人类中由SCN5A基因编码的钠离子信道蛋白。一般技术者将已知，如本文所揭示，功能hNav1.5信道由形成次单元及辅助性β次单元的单个孔组成，其中α次单元由指示DI-DIV的四个结构上同源跨膜域组成。

　　如本文所用，术语「人类Cav1.2」或「hCav1.2」指人类中由CACNA1C基因编码的钙离子信道蛋白。一般技术者将已知，如本文所揭示，功能hCav1.2信道由α-1次单元、α-2/δ次单元及β次单元以1:1:1比率组成。

　　如本文所用，术语「蛋白结构」指蛋白的三维结构。蛋白的结构以四种方式表征。一级结构为蛋白链中的不同胺基酸的次序，而二级结构由呈诸如螺旋或片形式的链段的几何形状组成。三级架构蛋白如何折迭于自身上；蛋白的四级架构不同蛋白单体或单体次单元如何相对于彼此折迭。

　　如本文所用，术语「单体」或「单体次单元」指组成大分子的四级结构的蛋白中的一个。

　　如本文所用，术语「四聚体」指由四个单体次单元组成的大分子，例如蛋白大分子。四聚体的一实例为由四个hERG1单体次单元组成的hERG1四聚体。需要四聚组合为四级结构以用于形成功能hERG1通道。

　　如本文所用，术语「结构信息」指大分子、例如蛋白大分子(诸如hERG1)内的原子的三维结构坐标。

　　如本文所用，术语「三维(3D)结构」指对应于大分子、例如蛋白大分子(诸如hERG1)中一个原子与其他原子的空间关系的笛卡耳(Cartesian)坐标。可使用如此项技术中已知的NMR技术或使用如此项技术中已知的X射线晶体学获得结构坐标。替代地，可使用分子替代分析或同源模拟导出结构坐标。各种软件程序允许图形表示一组结构坐标以获得分子或分子复合物的三维表示。

　　如本文所用，术语「动力学」在应用于大分子及大分子结构时指分子结构的一个部分相对于另一部分的相对运动。实例包括(但不限于)：振动、旋转、拉伸、域运动、铰链运动、垂直运动、扭转及其类似者。动力学亦可包括诸如平移、旋转、与其他分子碰撞及其类似者的运动。

　　如本文所用，术语「可挠性(flexible/flexibility)」在应用于由结构坐标定义的大分子及大分子结构时指此等坐标附近的一定程度的内部运动，例如其可允许键拉伸、旋转等。

　　如本文所用，术语「分子模拟算法」指用于大分子的结构预测的计算方法。举例而言，此等方法可包含比较蛋白模拟方法，包括同源模拟方法或蛋白折迭识别(protein threading)模拟方法，且可进一步包含全始或重新蛋白模拟方法或任何该方法的组合。

　　如本文所用，术语「计算动态模型」指系统的基于计算机的模型，其提供该系统的动力学信息。在某些实施例中，当该系统为生物系统、例如大分子或大分子结构时，计算动态模型提供在由模型检查的相关时间标度中通过系统展现的振动、旋转、拉伸、域运动、铰链运动、垂直运动、扭转、平移、旋转、与其他分子碰撞及其类似者的信息。

　　如本文所用，术语「分子模拟」指用于预测系统的功能特性及形态信息的基于计算机的方法，该功能特性包括例如热力学特性、热化学特性、光谱特性、机械特性、转运特性。在某些实施例中，分子模拟为分子动力学(MD)模拟。

　　如本文所用，术语「分子动力学模拟」(MD或MD模拟)指基于计算机的分子模拟方法，其中一组相互作用的原子、原子群或分子(包括大分子)的时间演进通过积分其运动方程式来追踪。允许原子或分子相互作用一定时间段，给出该原子或分子的运动的视图。因此，MD模拟可用于随时间取样构形空间来预测构形集合的最低能量、最密集成员。通常，原子及分子的轨迹通过数值求解相互作用粒子系统的牛顿运动方程式(Newton's equation of motion)来确定，其中粒子的间的力与位能由分子力学力场来界定。然而，合并量子力学及混合经典量子力学模拟的原理的MD模拟亦为可用的且可涵盖于本文中。

　　如本文所用，术语「可扩充的分子动力学」(可扩充的MD)指在应用于大情况(例如在分布式系统情况下的大输入数据集、大量输出或使用者或大量参与节点)时为适当有效且实用的计算模拟方法。在某些实施例中，本文所揭示的方法使用可扩充的MD用于模拟本文所揭示的大系统，例如具有外显磷脂、溶剂及离子分子的水合脂质双层中自由或结合至配位体的hERG1四聚体。

　　如本文所用，术语「能量最小化」(EM)指用于计算相互作用原子、原子群或分子(包括大分子)对应于其位能表面上的全局与局部最小值的稳定状态的计算方法。始于非平衡分子几何形状，EM使用优化数学程序来移动原子以便减小原子上的净力(位能的梯度)直至其变得可忽略。

　　如本文所用，术语「配位体」、「化合物」及「药物」可互换使用，且指能够结合至靶受体、诸如离子通道蛋白(例如hERG1)的任何小分子。在某些实施例中，配位体、化合物或药物为如本文所定义的「阻断剂」。

　　如本文所用，术语「对接(dock/docking)」指使用配位体与受体的模型在足以使配位体的至少一个原子处于受体的至少一个原子的键合距离内的接近度下模拟配位体-受体的缔合。该术语意欲与其在关于分子模拟的技术中的用途一致。该术语中包括的模型可为各种已知分子表示中的任一个，包括例如其三维结构的图形表示、一组坐标、一组距离约束、一组键角约束或一组其他物理或化学特性或其组合。在某些实施例中，配位体为化合物，例如小分子，且受体为蛋白大分子，例如hERG1。

　　如本文所用，术语「对接算法」指用于预测配位体对受体在彼此结合或对接以形成稳定配位体-受体复合物时的能量上较佳定向的计算方法。较佳定向的知识反过来可使用例如计分函数用于预测配位体与受体的间的缔合或结合亲和力的强度。在某些实施例中，配位体为化合物，例如小分子，且受体为蛋白大分子，例如hERG1。

　　如本文所用，术语「药物设计」或「合理药物设计」指基于生物靶的知识发现新药物的过程的方法。在本文所揭示的方法的某些实施例中，生物靶为蛋白大分子，例如hERG1。一般技术者将了解，依赖于生物分子靶三维结构的知识的药物设计亦称为「基于结构的药物设计」。一般技术者将亦理解，药物设计可依赖于计算机模拟技术，该类型的模拟通常称为「计算机辅助的药物设计」。如本文所用，术语「结合构形」指配位体对受体在彼此结合或对接时的定向。

　　如本文所用，术语「优势构形」指配位体对受体在彼此结合或对接时的最高密集定向。在某些实施例中，当应用于本文所揭示的MD模拟的轨迹时，丛集算法用于确定「优势构形」。

　　如本文所用，术语「丛集算法」在应用于本文所揭示的MD模拟的轨迹时指用于将轨迹中的相似构形分成丛集的计算方法。

　　如本文所用，术语「较佳结合构形」指配位体对受体在彼此结合或对接以形成稳定配位体-受体复合物时的能量上较佳定向。

　　如本文所用，术语「优化较佳结合构形」指配位体对受体在彼此结合或对接以形成稳定配位体-受体复合物随后使用MD优化较佳结合构形时的能量上较佳定向。

　　如本文所用，术语「结合能」理解为意谓配位体对受体的「结合自由能」(ΔG°)。在平衡条件下，此结合能等于ΔG°＝ΔH°-TΔS°＝-R T Log(Keq)，其中该符号具有其惯用含义。在某些实施例中，本文所揭示的方法允许计算各种配位体-受体复合物、例如结合至hERG1的各种化合物的结合能。

　　如本文所用，术语「IC50」及「IC90」指使靶的酶活性分别降低(例如抑制)50％与90％的化合物的浓度。术语「IC50」一般描述化合物的抑制浓度。通常，活体外进行IC50与IC90的量测。在其中靶为二级生物靶，例如牵涉心脏细胞毒性的膜结合离子通道(例如hERG1)的某些实施例中，IC50为观测到50％抑制的浓度。可根据一般技术者已知的任何方法量测IC50及IC90。

　　如本文所用，术语「EC50」及「EC90」指使由酶活性产生的细胞效果分别降低(例如抑制)50％与90％的化合物的血浆浓度/AUC。术语「EC50」一般描述化合物的有效剂量。在其中靶为一级生物靶，例如病毒蛋白(例如HCV NS3/4A蛋白酶、HCV NS5B聚合酶或HCV NS5a蛋白)的某些实施例中，EC50为抑制50％病毒复制的化合物的剂量。可根据一般技术者已知的任何方法量测EC50及EC90。

　　如本文所用，术语「CC50」及「CC90」指使活细胞数目与未经处理的对照组相比分别降低50％与90％(例如杀死该细胞)的化合物的浓度。术语「CC50」一般描述对细胞具有细胞毒性的化合物的浓度。在其中靶为一级生物靶，例如病毒蛋白(例如HCV NS3/4A蛋白酶、HCV NS5B聚合酶或HCV NS5a蛋白)的某些实施例中，CC50为对未感染细胞具有细胞毒性的化合物的剂量。在其中靶为二级生物靶，例如牵涉心脏细胞毒性的膜结合离子通道(例如hERG1)的某些实施例中，CC50为对心脏细胞具有细胞毒性的化合物的剂量。在某些实施例中，本文所揭示的方法选择具有降低心脏毒性风险但对其一级靶保留强生物活性的化合物。举例而言，该化合物对于二级生物靶(例如，hERG1)可具有高EC50值，对于未感染细胞可具有高CC50值，但针对一级生物靶标(例如HCV NS3/4A蛋白酶、HCV NS5B聚合酶或HCV NS5a蛋白)具有低EC50值。可根据一般技术者已知的任何方法量测CC50及CC90。

　　如本文所用，术语「选择性指数」(「SI」)指关于二级生物靶(例如hERG1)及未感染细胞的心脏毒性的CC50与关于一级生物靶(例如HCV NS3/4A蛋白酶、HCV NS5B聚合酶或HCV NS5a蛋白)的有效性的EC50相比的比率。在某些实施例中，本文所揭示的方法选择显示大于约100的SI值的化合物。在某些实施例中，本文所揭示的方法选择显示大于约1000的SI值的化合物。在某些实施例中，本文所揭示的方法选择显示大于约10,000的SI值的化合物。

　　如本文所用，术语「阻断剂」指阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道(例如hERG1离子通道)的化合物。在某些实施例中，阻断剂为心脏毒性化合物。

　　如本文所用，术语「非阻断剂」指不阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道(例如hERG1离子通道)的化合物。

　　如本文所用，「高通量筛选」指一种允许研究人员快速进行化学、遗传或药理学测试的方法，其结果为药物设计及理解特定生化过程在生物学中的相互作用或作用提供起点。在某些实施例中，高通量筛选为例如使用基于计算机的方法或基于计算机的模型经由虚拟计算机模拟筛选。

　　如本文所用，术语「处理器」及「中央处理单元」或「CPU」可互换使用且指能够自计算机内存(例如ROM或其他计算机内存)读取程序且根据该程序执行一组步骤的装置。

　　如本文所用，术语「计算机内存」及「计算机内存装置」指由计算机处理器可读的任何储存媒体。计算机内存的实例包括(但不限于)RAM、ROM、计算机芯片、数字视频光盘(digital video disc；DVD)、光盘(compact disc；CD)、硬磁盘驱动器(hard disk drive；HDD)及磁带。

　　如本文所用，术语「计算机可读媒体」指用于储存及提供信息(例如数据及指令)至计算机处理器的任何装置或系统。计算机可读媒体的实例包括(但不限于)DVD、CD、硬磁盘驱动器、磁带及用于经由网络串流媒体的服务器。

　　6.2实施例

　　本文提供膜结合离子通道的第一个综合性计算动态模型，其提供该信道的生理上相关构形状态的原子级详细取样。在某些实施例中，将该模型与计算机模拟测试化合物的原子级详细高通量筛选算法组合来预测心脏毒性及选择具有降低心脏毒性的化合物。

　　作为一实例，此等模型及算法可用于模拟与心脏毒性相关的最重要离子通道中的一个，即人类Ether-a-go-go相关基因1(hERG1)通道。hERG1信道表现于心脏以及各种脑区域、平滑肌细胞、内分泌细胞及广泛范围的肿瘤细胞株中。然而，其在心脏中的作用为出于两个主要原因已经充分表征且广泛地研究的作用。首先，其直接参与长QT症候群(LQTS)，即与增加心室心律不整及最终心因性猝死风险相关的病症。其次，通过处方药阻断hERG1造成药物诱导的QT延长，其共享与LQTS相同的突然心跳骤停风险。

　　hERG1信道经由四个单体次单元的缔合形成为四聚体。在本文所揭示的基于计算机的分子模拟及分子模型中，四聚体结构由膜、离子及水分子包围以模拟通道的实际环境。另外，本文所揭示的基于计算机的分子模拟具有足够时长(例如大于200ns)以允许取样hERG1通道的所有生理上相关构形状态，包括打开状态、关闭状态、非作用中状态及在此等状态的间的任何构形。hERG1通道的此稳固分子模拟允许原子级详细计算机模拟高通量筛选以测试化合物且判定该化合物是否阻断通道且因此可能展现心脏毒性。分子模拟的原子级细节亦允许化学修改或重新设计被发现阻断通道的彼等化合物。可接着使用本文所揭示的方法以反复方式重新测试该重新设计的化合物。

　　本文所揭示的方法(包括基于计算机的分子模拟及分子模型)的概述提供于图1A与图1B中。作为一实例，该方法可包括：使用描述靶蛋白(例如离子信道蛋白)的结构的结构信息；执行该蛋白结构的分子模拟以识别及选择该蛋白结构的优势构形；使用计算机算法来对接一或多种化合物的构形异构体与该蛋白结构的优势构形；识别蛋白与化合物的各组合的较佳结合构形；及使用分子模拟优化较佳结合构形以判定该化合物在该较佳结合构形中是否阻断该离子通道。

　　在某些实施例中，若化合物阻断离子通道，则预测该化合物为心脏毒性。在某些实施例中，若预测化合物为心脏毒性，则不选择该化合物用于进一步临床研发或用于人类。在某些实施例中，可在结构上修改或重新设计化合物以解决心脏毒性。

　　在某些实施例中，若化合物不阻断离子通道，则预测该化合物具有降低的心脏毒性风险。在某些实施例中，若预测化合物具有降低的心脏毒性风险，则选择该化合物用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。

　　现描述本文所揭示的方法的个别要素及步骤。

　　6.2.1离子通道

　　在某些实施例中，该方法包含使用描述靶受体(例如离子信道蛋白)的结构的结构信息的步骤。

　　在某些实施例中，靶受体为调节心脏功能的离子信道，例如本文所揭示的心脏离子通道。在某些实施例中，心脏离子通道为膜结合蛋白。在某些实施例中，心脏离子信道为电压闸控的。在某些实施例中，心脏离子通道为钠、钙或钾离子通道。在某些实施例中，心脏离子信道为钾离子信道。

　　一般技术者将了解，离子通道、例如本文所揭示的心脏离子通道可具有两个基本特性：离子渗透与门控。离子渗透描述经由开放通道的运动。离子通道对特异离子的选择性渗透率为分类离子通道的基础(例如Na+信道、K+信道及Ca2+信道)。闸控为打开及关闭离子通道的机制。电压依赖性闸控为在离子通道中观测到的最常见闸控机制。

　　下表1描述心脏离子通道，其中任一个可与心脏毒性相关。

　　表1：心脏离子通道

　　参见例如Grant,2009,「Cardiac Ion Channels,」Circulation:Arrhythmia and Electrophysiology,2(2):185-194。

　　心脏K+通道分成三大类：电压闸控(Ito、IKur、IKr及IKs)、向内整流通道(IK1、IKAch及IKATP)及背景K+电流(TASK-1、TWIK-1/2)。

　　在某些实施例中，离子通道系选自表1的心脏离子通道中的任一个。

　　在某些实施例中，离子通道为选自表1的钾离子通道蛋白。

　　在某些实施例中，离子通道为选自表1的钠离子通道蛋白。

　　在某些实施例中，离子通道为选自表1的钙离子通道蛋白。

　　在某些实施例中，如本文所揭示，离子通道包含选自由SEQ ID NO:2、4及6组成的群的胺基酸序列。

　　下表2描述钾离子通道，其中任一个可与心脏毒性相关。

　　表2：钾离子通道

　　参见例如钾通道|HUGO基因命名法委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)，www.genenames.org/genefamilies/KCN，上次撷取于2013年11月17日。

　　在某些实施例中，离子通道系选自表2的钾离子通道中的任一个。

　　在某些实施例中，离子通道系选自表2的钾电压闸控信道、子族H(eag相关)的成员1-8中的任一个。

　　在某些实施例中，如本文所揭示，离子通道包含选自由SEQ ID NO:2、7、8、9、10、11、12及13组成的群的胺基酸序列。

　　在某些实施例中，如下文所述，离子通道为人类Ether-a-go-go相关基因1(hERG1)通道。

　　在某些实施例中，如下文所述，离子信道为hNav1.5电压闸控钠信道。

　　在某些实施例中，如下文所述，离子信道为hCav1.2电压闸控钙信道。

　　6.2.2人类Ether-a-go-go相关基因1(hERG1)通道

　　hERG1离子通道(亦称为KCNH2或Kv11.1)为心肌细胞中的延迟整流钾电流(IKr)的快速分量的重要要素，用于心脏动作电位的正常复极化相(Curran等人,1995,「A Molecular Basis for Cardiac-Arrhythmia；HERG Mutations Cause Long Qt Syndrome,」Cell,80,795-803；Tseng,2001,「I(Kr):The hERG Channel,」J.Mol.Cell.Cardiol.,33,835-49；Vandenberg等人,2001,「HERGChannels:Friend and Foe,」Trends.Pharm.Sci.22,240-246)。hERG1中的功能丧失突变使心室复极化的持续时间增加，其导致体表心电图的Q波与T波的间的时间间隔延长(长QT症候群-LQTS)(Vandenberg等人,2001；Splawski等人,2000,「Spectrum of Mutations in Long-QT Syndrome Genes KVLQT1,HERG,SCN5A,KCNE1,and KCNE2」,Circulation,102,1178-1185；Witchel等人,2000,「Familial and Acquired Long QT Syndrome and the Cardiac Rapid Delayed Rectifier Potassium Current」,Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.,27,753-766)。LQTS导致严重心血管病症，诸如快速性心律不整及心因性猝死。

　　hERG的DNA及胺基酸序列分别提供为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。

　　基于X射线晶体学或NMR光谱学的hERG1基因产物的详细原子结构尚不可用，因此hERG1的结构细节系基于与其他离子信道、计算机同源模型、药理学及突变诱发研究的模拟。举例而言，如以下实例1中所述，hERG1的结构系基于如先前所述的重新组合及同源蛋白模拟(Durdagi等人,2012,「Modeling of Open,Closed,and Open-Inactivated States of the HERG1Channel:Structural Mechanisms of the State-Dependent Drug Binding,」J.Chem.Inf.Model.,52,2760-2774)。提供对本文所述的方法有用的结构信息例如作为同源性模型，包括其中该同源性模型由钾离子信道蛋白(例如hERG1)的坐标表示，如在表A(参见例如实例1)中。

　　在同源模型中，hERG1基因产物包含四聚体，其中各单体次单元含有六个跨膜螺旋(参见图2)。hERG1系通过共同组合四个单体α次单元形成，其中每一个具有六个跨越α-螺旋段(S1-S6)的跨膜。在各hERG1次单元内，S1-S4螺旋形成电压传感器域(VSD)，其感测跨膜电位且耦合至中央K+选择性孔域。各孔域由共同协调孔螺旋的外螺旋(S5)与内螺旋(S6)及选择性过滤器组成。孔螺旋及选择性过滤器的羧基端含有高度保守K信道特征序列，其在hERG1中为Thr-Ser-Val-Gly-Phe-Gly。此序列在孔的细胞外端处形成窄的传导路径，其中K离子由特征序列残基的骨干羰基氧原子配位。

　　电压传感器域的移动使孔域能够响应于膜电位的变化而打开及关闭。药物结合位点包含在孔域的中央孔腔内，位于选择性过滤器下方且由四聚体通道的四个S6螺旋(参见图2)侧接。

　　在不受任何理论限制的情况下，在本发明的一个态样中，药物对hERG的中央孔腔或通道的阻断为该药物的心脏毒性的预测。hERG1中的K+离子流的非所要药物阻断可导致长QT症候群，最终诱导纤维性颤动及心律不整。hERG1阻断为许多药物发现程序的过程中经历的显著问题。

　　6.2.3人类Nav1.5电压闸控钠信道

　　Navl.5电压闸控钠信道(voltage gated sodium channel；VGSC)负责启动心肌动作电位且经由突变或其与已与广泛范围的心脏疾病相关的小分子药物或毒素相互作用来阻断Nav1.5。此等疾病包括长QT症候群3(LQT3)、布鲁加达(Brugada)症候群1(BRGDA1)及婴儿猝死症候群(sudden infant death syndrome；SIDS)。

　　hNav1.5的DNA及胺基酸序列分别提供为SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4。

　　基于X射线晶体学或NMR光谱学的hNav1.5基因产物的详细原子结构尚不可用，因此hNav1.5的结构细节系基于与其他离子信道、计算机同源模型、药理学及突变诱发研究的模拟。提供对本文所述的方法有用的结构信息例如作为同源性模型，包括其中该同源性模型由钠离子信道蛋白(例如hNav1.5)的坐标表示，如在表B(参见例如实例16)中。

　　真核VGSC为杂四聚体，其中四个域(DI-IV；参见图3)不同。DI包含CYT1(N端)及TRM1、DII包含TRM2，DIII包含TRM3与CYT4(失活闸)，且DIV包含TRM4及CYT5(C端)。各TRM子域中的选择性过滤器区域以及选择性特异残基朝通道向内定向。各TRM子域由六个长螺旋段(S1-S6)组成。前四个段(S1-S4)在一侧处分在一起且命名为电压感测域(voltage-sensing domain；VSD)。S4段为310螺旋且特征为带正电残基(Lys与Arg)的高度保守胺基酸倾向，通常称为「闸控电荷」。S4上的一些此等带正电残基经由形成具有S1-S3的带负电残基(Asp与Glu)的盐桥在跨膜区域中保持稳定(Tiwari-Woodruff等人,2000,「Voltage-Dependent Structural Interactions in the Shaker K(+)Channel,」J Gen Physiol 115:123-138)。

　　VGSC一般共享共同的活化机制。膜电位中的变化导致构形变化及S4的向外运动，允许通道活化及阳离子穿过通道的孔(Catterall,2014,「Structure and Function of Voltage-Gated Sodium Channels at Atomic Resolution,」Exp Physiol 99:35-51)。来自各域的后两个螺旋段(S5-S6)通常称为孔形成段。S5螺旋段为经由连接符自S4水平延伸且接着垂直通过跨膜区域的长段。环接着将S5连接至命名为孔螺旋的两个短螺旋(P1与P2)。S6段经由短转角连接至P2且朝向通道的细胞内部分垂直延伸。连接P1与P2的短转角含有选择性特异残基，其唯一地保存于VGSC中，其中以下配置(DEKA)展开跨越四个域且称为选择性过滤器(D372、E898、K1419及A1711)。如先前已通过若干实验及计算突变分析展示，此DEKA选择性过滤器负责引入优于其他单价/二价阳离子的钠选择性(Lipkind等人,2008,「Voltage-Gated Na Channel Selectivity:The Role of the Conserved Domain III Lysine Residue,」J Gen Physiol 131:523-529)。已展示使选择性过滤器的残基突变不仅影响通道的选择性，而且亦影响通道的闸控动力学(Hilber等人,2005,「Selectivity Filter Residues Contribute Unequally to Pore Stabilization in Voltage-Gated Sodium Channels,」Biochemistry 44:13874-13882)。

　　在不受任何理论限制的情况下，在本发明的一个态样中，药物对hNav1.5的中央孔腔或通道的阻断为该药物的心脏毒性的预测。hNav1.5中的Na+离子流的非所要药物阻断可导致长QT症候群，最终诱导纤维性颤动及心律不整。hNav1.5阻断为许多药物发现程序的过程中经历的显著问题。

　　6.2.4人类Cav1.2电压闸控钙信道

　　Cav1.2电压闸控钙信道亦负责介导钙离子进入可激发细胞且经由突变或其与已与广泛范围的心脏疾病相关的小分子药物或毒素相互作用来阻断Cav1.2。此等疾病包括长QT症候群3(LQT3)及布鲁加达症候群1(BRGDA1)。

　　hCav1.2的DNA及胺基酸序列分别提供为SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。

　　基于X射线晶体学或NMR光谱学的hCav 1.2基因产物的详细原子结构尚不可用，因此hCav 1.2的结构细节系基于与其他离子信道、计算机同源模型、药理学及突变诱发研究的模拟。提供对本文所述的方法有用的结构信息例如作为同源性模型，包括其中该同源性模型由钙离子信道蛋白(例如hCav1.2)的坐标表示，如在表C中。

　　Cavs的全局架构由四个基本成分组成。α1次单元位于细胞膜且钙离子可穿过。辅助β次单元、CaM次单元及α2δ次单元以高亲和力结合至域I与域II的环。Cavα2δ为通过两个二硫键连接的蛋白形成的单程跨膜次单元(Van Petegem等人,2006,「The Structural Biology of Voltage-Gated Calcium Channel Function and Regulation,」Biochem Soc Trans 34(第5部分):887-93)。

　　跨膜Cav由四个同源重复跨膜域(DI-IV)组成。各重复由六个段(S1-S6)形成。前4个段(S1-S4)为电压段域且后2个段(S5-S6)形成钙选择性孔域。S4段含有带正电残基且充当电压传感器控制闸控。认为信道活化通过电压传感器中导致信道打开的构形变化来触发。

　　在不受任何理论限制的情况下，在本发明的一个态样中，药物对hCav1.2的中央孔腔或通道的阻断为该药物的心脏毒性的预测。hCav1.2中的Ca+2离子流的非所要药物阻断可导致长QT症候群，最终诱导纤维性颤动及心律不整。hCav1.2阻断为许多药物发现程序的过程中经历的显著问题。

　　6.2.5计算态样

　　在某些态样中，本文提供用于选择不太可能为心脏毒性的化合物的计算方法。

　　在某些实施例中，计算方法包含计算动态模型。在某些实施例中，计算动态模型包含随时间取样构形空间的分子模拟。在某些实施例中，分子模拟为分子动力学(MD)模拟。

　　在某些实施例中，该方法包含以下步骤：a)使用描述离子信道蛋白的结构的结构信息；b)执行该蛋白结构的分子动力学(MD)模拟；c)使用丛集算法自该MD模拟识别该蛋白结构的优势构形；d)选择由该丛集算法识别的蛋白结构的优势构形；e)提供描述一或多种化合物的构形异构体的结构信息；f)使用对接算法来对接步骤e)的一或多种化合物的构形异构体与步骤d)的优势构形；g)识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形；h)使用可扩充的MD优化该较佳结合构形；及i)判定在该较佳结合构形中该化合物是否阻断该蛋白的离子通道；其中步骤a)至步骤i)中的一或多个不必以所述次序执行。在某些实施例中，离子通道蛋白为钾离子通道蛋白。

　　在某些实施例中，步骤a)的结构信息为三维(3D)结构。在某些实施例中，如本文所揭示，步骤a)的结构信息为X射线晶体结构、NMR溶液结构或同源模型。

　　在某些实施例中，步骤e)包含提供化合物的化学结构及确定该化合物的构形异构体。在某些实施例中，化合物的化学结构界定构形异构体。

　　在某些实施例中，步骤e)至步骤i)包含高通量筛选化合物以判定其是否为「阻断剂」或「非阻断剂」。

　　在某些实施例中，该方法的步骤a)至步骤i)中的一或多个以所述次序执行。

　　在某些实施例中，该方法的步骤a)至步骤i)在一或多个处理器上执行。

　　6.2.5.1离子信道蛋白的结构信息

　　在某些实施例中，该方法包含使用描述离子信道蛋白的结构的结构信息的步骤。在某些实施例中，离子通道蛋白亦称为「受体」或「靶」且术语「蛋白」、「受体」及「靶」可互换使用。

　　在某些实施例中，描述离子信道蛋白的结构的结构信息来自同源模型。

　　在某些实施例中，描述离子信道蛋白的结构的结构信息来自NMR溶液结构。用于确定大分子的结构及动力学的多维杂核NMR技术为一般技术者所已知(参见例如Rance等人,2007,「Protein NMR Spectroscopy:Principles and Practice,」第2版,Boston:Academic Press)。

　　在某些实施例中，描述离子信道蛋白的结构的结构信息来自X射线晶体结构。用于确定大分子的结构的X射线晶体学技术亦为一般技术者所已知(参见例如Drenth等人,2007,「Principles of Protein X-Ray Crystallography,」第3版,Springer Science)。

　　下表3描述心脏离子信道的结构，其中任一个可用于本文所揭示的方法。

　　表3：心脏离子信道的结构

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　　在某些实施例中，描述离子信道蛋白的结构的结构信息系选自表3的结构中的任一个。

　　下表4描述钾离子信道的结构，其中任一个可用于本文所揭示的方法。

　　表4：钾离子信道的结构

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　　模型：

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　　N3)http://swissmodel.expasy.org/repository/？pid＝smr03&query_l_input＝Q16322&zid＝async

　　在某些实施例中，描述离子信道蛋白的结构的结构信息系选自表4的结构中的任一个。

　　在某些实施例中，例如其中离子信道为钾离子信道蛋白hERG1，基于X射线晶体学或NMR光谱学的详细原子结构尚不可用。因此，结构细节系基于与其他离子信道、计算机同源模型、药理学及突变诱发研究的模拟。

　　hERG1同源模型可包含比较蛋白模拟方法，其包括可非限制性地使用「Modeller」计算机程序(Fiser及Sali,2003,Methods Enzymol.374,461-91)或「Swiss-Model」应用程序(Arnold等人,2006,Bioinformatics 22,195-201)执行的同源模拟方法(参见例如Marti-Renom等人,2000,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29,291-325)；或可非限制性地使用「Hhsearch」程序(Soding,2005,Bioinformatics 21,951-960)、「Phyre」应用程序(Kelley及Sternberg,2009,Nature Protocols 4,363-371)或「Raptor」程序(Xu等人,2003,J.Bioinform.Comput.Biol.1,95-117)执行的蛋白折迭识别模拟方法(参见例如Bowie等人,1991,Science 253,164-170；Jones等人,1992,Nature 358,86-89)；可进一步包含使用各种算法的全始或重新蛋白模拟方法，其可非限制性地使用公开分布式「ROSETTA」平台(Simons等人,1999,Genetics37,171-176；Baker 2000,Nature 405,39-42；Bradley等人,2003,Proteins 53,457-468；Rohl 2004,Methods Enzymol.383,66-93)、「I-TASSER」应用程序(Wu等人,2007,BMC Biol.5,17)或使用基于物理的预测(参见例如Duan及Kollman 1998,Science 282,740-744；Oldziej等人,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,7547-7552)来执行；或任何该方法的组合。本文中可适用于生物分子结构预测的计算方法每年在如公布于CASP论文集(http://predictioncenter.org/)中的蛋白结构关键技术评估(Critical Assessment of Techniques for Protein Structure；CASP)实验内进行评估。有利地，保存关于诸如肽、多肽及蛋白的许多生物分子的计算上预测构形及结构的信息的数据经由各别公开可用储存库而可获得(参见例如Kopp及Schwede,2004,Nucleic Acids Research 32,D230-D234)。

　　在某些实施例中，本文所揭示的方法最佳与不易受通过X射线晶体学或NMR光谱方法确定结构的影响的复合膜结合系统一起运行。

　　6.2.5.2化合物(配位体)的结构信息

　　在某些实施例中，该方法包含提供描述一或多种化合物或配位体的构形异构体的结构信息。如本文所用，术语「化合物」及「配位体」为可互换的。

　　一般技术者应理解，由于原子围绕一键旋转，化合物可采用不同三维(3-D)形状或「构形异构体」。构形异构体可因此通过围绕单键旋转相互转变而无断裂。配位体的特定构像可为离子通道蛋白的孔(例如渗透孔)提供互补几何形状且促进结合。

　　在某些实施例中，描述一或多种化合物或配位体的构形异构体的结构信息系自化合物或配位体的化学结构获得。

　　在某些实施例中，化合物的结构信息系基于由大学、医药公司或个别发明人研究或研发的病毒化合物。通常，化合物将为具有900原子质量单位以下的分子量的小有机分子。化合物的结构信息可使用ChemDraw或简单结构绘图以2D或3D形式，或通过输入化合物的化学名称来提供。化合物的基于计算机的模拟可用于将该化合物的化学名称或2D信息翻译成3D代表性结构。

　　来自套件的软件LigPrep(Release 2013-2:LigPrep,2.7版本，LLC,New York,NY,2013)可用于将化合物(配位体)的2D信息翻译成提供结构信息的3D代表性结构。LigPrep亦可用于产生具有不同互变异构特性、立体化学特性及离子化特性的相同化合物(配位体)的变体。可使用LigPrep中所包括的能量最小化协议在构形上松弛所有产生的结构。

　　在某些实施例中，化合物系选在临床试验中失败或由于心脏毒性而在临床试验中停止的一系列化合物。

　　在某些实施例中，化合物系选自以下表5：

　　表5：心脏危险药物

　　在某些实施例中，化合物为抗癌剂，诸如蒽环霉素(anthracycline)、米托蒽醌(mitoxantrone)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)及曲妥珠单抗(trastuzumab)。在某些实施例中，化合物为免疫调节药物，诸如干扰素-α-2(interferon-α-2)、介白素-2(interleukin-2)、英利昔单抗(infliximab)及依那西普(etanercept)。在某些实施例中，化合物为抗糖尿病药物，诸如罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)及曲格列酮(troglitazone)。在某些实施例中，化合物为抗偏头痛药物，诸如麦角胺(ergotamine)及二甲麦角新碱(methysergide)。在某些实施例中，化合物为食欲抑制剂，诸如芬氟拉明(fenfulramine)、右芬氟拉明(dexfenfluramine)及苯丁胺(phentermine)。在某些实施例中，化合物为三环抗抑郁剂。在某些实施例中，化合物为抗精神病药，诸如氯氮平(clozapine)。在某些实施例中，化合物为抗帕金森病药物，诸如培高利特(pergolide)及卡麦角林(cabergoline)。在某些实施例中，化合物为糖皮质激素(glucocorticoid)。在某些实施例中，化合物为抗真菌药物，诸如伊曲康唑(itraconazole)及两性霉素B(amphotericin B)。在某些实施例中，化合物为NSAID，包括选择性环加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2；COX-2)抑制剂。

　　在某些实施例中，化合物为天然产物中的活性成份。在某些实施例中，化合物为毒素或环境污染物。

　　在某些实施例中，化合物为抗病毒剂。

　　在某些实施例中，化合物系选自由以下组成的群：蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、趋化因子抑制剂、核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂及进入抑制剂。

　　在某些实施例中，化合物能够抑制C型肝炎病毒(HCV)感染。

　　在某些实施例中，化合物为HCV NS3/4A丝胺酸蛋白酶的抑制剂。

　　在某些实施例中，化合物为HCV NS5B RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。

　　在某些实施例中，化合物为HCV NS5A单体蛋白的抑制剂。

　　在某些实施例中，化合物为以下三个申请案中的一个中所揭示的化合物：2013年3月13日申请的名称为「Hepatitis C Virus NS5B Polymerase Inhibitors and Methods of Use」的美国临时专利申请案第61/780,505号；2013年3月14日申请的名称为「Hepatitis C Virus NS5B Polymerase Inhibitors and Methods of Use」的美国临时专利申请案第61/784,584号；及2013年3月14日申请的名称为「Hepatitis C Virus NS5A Monomer Inhibitors and Methods of Use」的美国临时专利申请案第61/786,116号。此等临时申请案中的每一个的内容以其全文引用的方式并入。

　　在某些实施例中，化合物系选自由以下组成的群：阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Aciclovir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿丹弗(Adefovir)、三环癸胺、安普那韦(Amprenavir)、安普利近(Ampligen)、阿比朵尔(Arbidol)、阿扎那韦(Atazanavir)、巴拉福韦(Balavir)、波普瑞韦尔特(Boceprevirertet)、西多福韦(Cidofovir)、地瑞那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、地达诺新(Didanosine)、多可沙诺(Docosanol)、依度尿苷(Edoxudine)、依法韦仑(Efavirenz)、安卓西他宾(Emtricitabine)、恩夫韦地(Enfuvirtide)、因提弗(Entecavir)、泛昔洛韦(Famciclovir)、福米韦生(Fomivirsen)、夫萨那韦(Fosamprenavir)、膦甲酸盐(Foscarnet)、膦乙酸盐(Fosfonet)、更昔洛韦(Ganciclovir)、伊巴他滨(Ibacitabine)、异丙肌苷(Imunovir)、碘苷(Idoxuridine)、咪喹莫特(Imiquimod)、茚地那韦(Indinavir)、肌苷(Inosine)、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定(Lamivudine)、洛匹那韦(Lopinavir)、洛韦胺(Loviride)、马拉维若(Maraviroc)、吗啉脒胍(Moroxydine)、美替沙腙(Methisazone)、奈非那韦(Nelfinavir)、奈韦拉平(Nevirapine)、雷沙韦(Nexavir)、奥司他韦(Oseltamivir)(达菲(Tamiflu))、聚乙二醇干扰素α-2a(Peginterferonα-2a)、喷昔洛韦(Penciclovir)、帕拉米韦(Peramivir)、普可那利(Pleconaril)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、雷特格韦(Raltegravir)、病毒唑(Ribavirin)、金刚乙胺(Rimantadine)、利托那韦(Ritonavir)、普拉咪定(Pyramidine)、沙奎那韦(Saquinavir)、索非布韦(Sofosbuvir)、司他夫定(Stavudine)、特拉匹韦(Telaprevir)、田诺弗(Tenofovir)、田诺弗双索酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韦(Tipranavir)、曲氟尿苷(Trifluridine)、曲利志韦(Trizivir)、曲金刚胺(Tromantadine)、特鲁瓦达(Truvada)、伐昔洛韦(Valaciclovir/Valtrex)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)、维克利诺(Vicriviroc)、阿糖腺苷(Vidarabine)、韦拉咪定(Viramidine)、扎西他滨(Zalcitabine)、扎那米韦(Zanamivir)(瑞乐沙(Relenza))及齐多夫定(Zidovudine)。

　　在某些实施例中，化合物为达拉他韦(Daclatasvir)(BMS-790052)，其化学名称为「[(2S)-l{(2S)-2-[5-(4'-{2-[(2S)-l{(2S)-2-[(甲氧羰基)胺基]-3-甲基丁酰基}2-吡咯啶基]-1H-咪唑-5-基}4-联苯基)-1H-咪唑-2-基]-1-吡咯啶基}3-甲基-1-侧氧基-2-丁基]胺基甲酸甲酯」。以下提供达拉他韦的结构：

　　在某些实施例中，化合物为BMS-986094，其化学名称为「(2R)-2-(((((2R,3R,4R)-5-(2-胺基-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(萘-l-基氧基)磷酰基)胺基)丙酸新戊酯」。以下说明BMS-986094的结构：

　　6.2.5.3能量最小化

　　在某些实施例中，在执行MD模拟的前对X射线晶体结构、NMR溶液结构、同源模型、分子模型或本文所揭示的产生的结构执行能量最小化(EM)。

　　EM的目的为寻找位能函数的局部能量最小值。位能函数为允许自分子系统三维结构计算分子系统位能的数学方程式。能量最小化算法的实例包括(但不限于)最陡下降、共轭梯度、牛顿-拉普森法(Newton-Raphson)及采用基础的牛顿-拉普森法(Molecular Modeling:Principles and Applications,作者A.R.Leach,Pearson Education Limited/Prentice Hall(Essex,England),第2版(2001)第253-302页)。有可能互换地使用若干方法。

　　6.2.5.4分子模拟

　　在某些实施例中，该方法包含执行离子信道蛋白的结构的分子模拟的步骤。

　　因此，本文提供根据本文所述的方法取样离子通道蛋白的构形空间的分子模拟。在某些实施例中，分子模拟为分子动力学(MD)模拟。

　　分子模拟可用于监测本文所揭示的大分子及大分子复合物的时间依赖性过程，以便通过根据物理学法则求解运动方程式来研究其结构、动力学及热力学特性，例如，可允许蛋白内的化学键如在化学与物理学法则允许的情况下挠曲、旋转、弯曲或振动。此运动方程式提供关于给定分子的位置及速度方面的时间依赖性及波动量值的信息。亦可在MD模拟中模拟诸如静电力、疏水力、凡得瓦尔力相互作用、与溶剂的相互作用及其他的相互作用。MD模拟的直接输出为在相同时间间隔或取样间隔下获取的一组「快照」(坐标及速度)。视所需的精确性水平而定，待求解的运动方程式可为经典的(牛顿)运动方程式、随机运动方程式、布朗(Brownian)运动方程式或甚至组合(Becker等人编,Computational Biochemistry and Biophysics.New York 2001)。

　　一般技术者应理解，MD模拟的直接输出，亦即在MD模拟的取样间隔下获取的「快照」将合并在平衡下发生于系统中的热波动，例如系统与其平均状态的随机偏差。

　　在某些实施例中，使用哈佛大学化学大分子模拟(Chemistry at Harvard for Macromolecular Modeling；CHARMM)模拟套件进行分子模拟(Brooks等人,2009,「CHARMM:The Biomolecular Simulation Program,」J.Comput.Chem.,30(10):1545-614)。在某些实施例中，使用不(仅)另一分子动力学程序(Not(just)Another Molecular Dynamics program；NAMD)模拟套件进行分子模拟(Phillips等人,2005,「Scalable Molecular Dynamics with NAMD,」J.Comput.Chem.,26,1781-1802；Kalé等人,1999,「NAMD2:Greater Scalability for Parallel Molecular Dynamics,」J.Comp.Phys.151,283-312)。熟习此项技术者应理解可以组合形式使用多个套件。可根据本文所揭示的方法使用此项技术中已知的进行MD模拟的多种方法论中的任一个。以下出版物(其以引用的方式并入本文中)描述可使用的多种方法论：构建有能量改进的辅助模型(Assisted Model Building with Energy Refinement；AMBER)(Case等人,2005,「The Amber Biomolecular Simulation Programs,」J.Comput.Chem.26,1668-1688；amber.scripps.edu)；CHARMM(Brooks等人,2009,J.Comput.Chem.,30(10):1545-614；charmm.org)；化学模拟格罗宁根机(GROningen MAchine for Chemical Simulations；GROMACS)(Van Der Spoel等人,2005,「GROMACS:Fast,Flexible,and Free,」J.Comput.Chem.,26(16),1701-18；gromacs.org)；格罗宁根分子模拟(GROningen MOlecular Simulation；GROMOS)(Schuler等人,2001,J.Comput.Chem.,22(11),1205-1218；igc.ethz.ch/GROMOS/index)；大型原子/分子大规模并行模拟器(Large-scale Atomic/Molecular Massively Parallel Simulator；LAMMPS)(Plimpton等人,1995,「Fast Parallel Algorithms for Short-Range Molecular Dynamics,」J.Comput.Chem.,117,1-19；lammps.sandia.gov)；及NAMD(Phillips等人,2005,J.Comput.Chem.,26,1781-1802；Kalé等人,1999,J.Comp.Phys.151,283-312)。

　　在其中该方法要求MD模拟的情况下，可使用选自包含或由AMBER、CHARMM、GROMACS、GROMOS、LAMMPS及NAMD组成的群的模拟套件进行该模拟。在某些实施例中，模拟套件为CHARMM模拟套件。在某些实施例中，模拟套件为NAMD模拟套件。

　　在其中该方法要求MD模拟的情况下，该模拟可具有任何持续时间。在某些实施例中，MD模拟的持续时间大于200ns。在某些实施例中，MD模拟的持续时间大于150ns。在某些实施例中，MD模拟的持续时间大于100ns。在某些实施例中，MD模拟的持续时间大于50ns。在某些实施例中，步骤的MD模拟的持续时间为约50ns、60ns、70ns、80ns、90ns、100ns、110ns、120ns、130ns、140ns、150ns、160ns、170ns、180ns、190ns、200ns、210ns、220ns、230ns、240ns、250ns或250ns。

　　在某些实施例中，分子模拟合并溶剂分子。在某些实施例中，分子模拟合并内隐或外显溶剂分子。一般技术者应理解，内隐溶合(亦称为连续介质溶合)为一种将溶剂表示为连续介质而非最常用于MD模拟及其他分子力学应用的个别「外显」溶剂分子的方法。在某些实施例中，分子模拟合并水分子。在某些实施例中，分子模拟合并内隐或外显水分子。在某些实施例中，分子模拟合并外显离子分子。在某些实施例中，分子模拟合并脂质双层。在某些实施例中，脂质双层合并外显脂质分子。在某些实施例中，脂质双层合并外显磷脂分子。在某些实施例中，脂质双层合并溶合的脂质双层。在某些实施例中，脂质双层合并水合脂质双层。在某些实施例中，水合脂质双层合并外显磷脂分子及外显水分子。

　　6.2.5.5主成分分析

　　在某些实施例中，该方法视情况包含MD轨迹的主成分分析(PCA)的步骤。在某些实施例中，在使用丛集算法识别离子信道蛋白的优势构形(参见下文)的前执行PCA。在某些实施例中，使用软件AMBER-ptraj执行PCA(Case等人,2012,AMBER 12,University of California,San Francisco；Salomon-Ferrer等人,2013,「An Overview of the Amber Biomolecular Simulation Package,」WIREs Comput.Mol.Sci.3,198-210；Amber Home Page.Assisted Model Building with Energy Refinement.可在以下的处获得：http://ambermd.org，2013年10月26日撷取)。PCA朝向覆盖系统基本动力学的有限组的独立主成分降低系统维度。

　　6.2.5.6RMSD的计算

　　在某些实施例中，该方法视情况包含计算Cα原子相对于离子信道蛋白的参考结构的均方根偏差(root mean square deviation；RMSD)的步骤。在某些实施例中，在使用丛集算法识别离子信道蛋白的优势构形(参见下文)的前执行RMSD的计算来观测MD轨迹的整体行为。

　　6.2.5.7丛集算法

　　在某些实施例中，该方法包含使用丛集算法自MD模拟识别离子通道蛋白的优势构形及选择由该丛集算法识别的蛋白结构的优势构形的步骤。

　　丛集算法已为一般技术者所熟知(参见例如Shao等人,2007,「Clustering Molecular Dynamics Trajectories:1.Characterizing the Performance of Different Clustering Algorithms,」J.Chem.Theory&Computation.3,231)。

　　在某些实施例中，选择50或50个以上的优势构形。在某些实施例中，选择100或100个以上的优势构形。在某些实施例中，选择150或150个以上的优势构形。在某些实施例中，选择200或200个以上的优势构形。在某些实施例中，选择250或250个以上的优势构形。在某些实施例中，选择300或300个以上的优势构形。

　　6.2.5.8对接算法

　　在某些实施例中，该方法包含使用对接算法对接一或多种化合物的构形异构体与自分子模拟确定的离子信道蛋白的结构的优势构形的步骤。

　　各种对接算法已为一般技术者所熟知。可容易获得的该算法的实例包括：GLIDE(Friesner等人,2004「Glide:A New Approach for Rapid,Accurate Docking and Scoring.1.Method and Assessment of Docking Accuracy,」J.Med.Chem.47(7),1739-49)、GOLD(Jones等人,1995,「Molecular Recognition of Receptor Sites using a Genetic Algorithm with a Description of Desolvation,」J.Mol Biol,245,43)、FRED(McGann等人,2012,「FRED and HYBRID Docking Performance on Standardized Datasets,」Comp.Aid.Mol.Design,26,897-906)、FlexX(Rarey等人,1996,「A Fast Flexible Docking Method using an Incremental Construction Algorithm,」J.Mol.Biol,261,470)、DOCK(Ewing等人,1997,「Critical Evaluation of Search Algorithms for Automated Molecular Docking and Database Screening,」J.Comput.Chem.,18,1175-1189)、AutoDock(Morris等人,2009,「Autodock4and AutoDockTools4:Automated Docking with Selective Receptor Flexiblity,」J.Computational Chemistry,16,2785-91)、IFREDA(Cavasotto等人,2004,「Protein Flexibility in Ligand Docking and Virtual Screening to Protein Kinases,」J.Mol.Biol,337(1),209-225)及ICM(Abagyan等人,1994,「ICM-A New Method for Protein Modeling and Design:Application to Docking and Structure Prediction from the Distorted Native Conformation,」J.Comput.Chem.,15,488-506)以及许多其他算法。

　　在某些实施例中，对接算法为DOCK或AutoDock。

　　6.2.5.9较佳结合构形的识别

　　在某些实施例中，该方法包含识别化合物(配位体)与离子通道蛋白(受体)各组合的多个较佳结合构形的步骤。

　　在某些实施例中，使用如上所述的丛集算法来识别化合物与蛋白的各组合的较佳结合构形。在某些实施例中，较佳结合构形为具有最大丛集群及最低结合能的彼等结合构形。在某些实施例中，较佳结合构形为对接至蛋白(受体)的化合物(配位体)的能量上较佳定向以形成稳定复合物。在某些实施例中，对接化合物仅存在一个较佳结合构形。

　　在某些实施例中，预测在其较佳结合构形中的一个中阻断通道的化合物为心脏毒性。在某些实施例中，预测在其较佳结合构形中的任一个中不阻断通道的化合物为非心脏毒性。

　　在某些实施例中，在其较佳结合构形中的一个中阻断通道的化合物为心脏毒性。在某些实施例中，在其较佳结合构形中的任一个中不阻断通道的化合物具有降低的心脏毒性风险。

　　6.2.5.10优化较佳结合构形

　　在某些实施例中，如上所述，该方法包含使用MD优化较佳结合构形的步骤。

　　在某些实施例中，MD为可扩充MD。

　　在某些实施例中，MD使用NAMD软件。

　　6.2.5.11结合能的计算，ΔGcalc

　　在某些实施例中，该方法包含计算化合物(配位体)与蛋白(受体)的各组合在相应优化较佳结合构形中的结合能ΔGcalc的步骤。

　　使用分子力学与溶合模型的组合计算结合能为一般技术者所熟知(参见例如Kollman等人,2000,「Calculating Structures and Free Energies of Complex Molecules:Combining Molecular Mechanics and Continuum Models,」Ace.Chem.Res.3B,889-897)。

　　在某些实施例中，该方法进一步包含对蛋白与化合物的各组合输出所选择的计算结合能ΔGcalc且将其与生理上相关浓度进行比较。就此而言，可使用关系：ΔGcalc＝RT lnKi将由例如活体外生物分析量测的IC50(在该浓度下观测到50％抑制)值转化为观测到的结合自由能变化ΔGobs(cal mol-1)，其中R为气体常数，R＝1.987cal K-1mol-1，T为绝对温度，及Ki近似为特定化合物i量测的IC50。因此，对于蛋白与化合物的各组合，ΔGcalc可与ΔGobs及生理上相关浓度(IC50)相比较。

　　6.2.5.12心脏毒性的预测及化合物的选择

　　在某些实施例中，该方法包含基于以下来预测心脏毒性且选择化合物：(i)将化合物分类为「阻断剂」与「非阻断剂」；及/或(ii)所计算的结合能。

　　(i)将化合物分类为「阻断剂」与「非阻断剂」：

　　在其中化合物在其较佳结合构形中的任一个中不阻断离子通道的某些实施例中，该化合物识别为「非阻断剂」。在该情况下，预测「非阻断」化合物具有降低的心脏毒性风险，且选择该化合物用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。在某些实施例中，进一步临床研发可包含使用本文所揭示的方法用其他离子通道进一步测试心脏毒性。

　　在某些实施例中，其中在其较佳结合构形的一个中化合物阻断离子通道，该化合物识别为「阻断剂」。在该情况下，预测该化合物为心脏毒性，且不选择该化合物用于进一步临床研发或用于人类。然而，在该情况下，该方法可进一步包含使用分子模拟算法来化学修改或重新设计化合物的步骤以使得在其较佳结合构形中其不阻断离子通道且保持对其一级生物靶的生物活性，如以下部分6.2.3.13及6.2.3.14中分别描述。作为化合物修改/重新设计的可能替代，新化合物亦可选自化学品或化合物库的集合，例如由有机或药物化学家产生作为药物发现程序的一部分的新候选药物库，如以下部分6.2.3.15中所述。

　　(ii)计算的结合能：

　　在某些实施例中，其中较佳结合构形的计算结合能ΔGcalc相当于大于或等于100μM的生理上相关化合物浓度，预测结合亲和力弱。在该情况下，预测该化合物在治疗上相关浓度具有降低的心脏毒性风险。可选择该化合物用于进一步研发或可能用于人类，或用作用于进一步药物设计的化合物。在某些实施例中，进一步临床研发可包含使用本文所揭示的方法用其他离子通道进一步测试心脏毒性。

　　在某些实施例中，其中较佳结合构形的计算结合能ΔGcalc相当于小于或等于1μM的生理上相关化合物浓度，预测结合亲和力为中度至强。预测该化合物在治疗上相关浓度为心脏毒性，且不选择该化合物用于进一步临床研发或用于人类。然而，在该情况下，如上所述，该方法可进一步包含以下步骤：使用分子模拟算法来化学修改或重新设计化合物，或自化学品或化合物库的集合选择新化合物作为可能的替代，如以下部分中所述。

　　6.2.5.13化合物的修改/重新设计

　　在某些实施例中，该方法进一步包含使用分子模拟算法来化学修改或设计化合物的步骤以使得其在其较佳结合构形中的任一个中不阻断离子通道。

　　在某些实施例中，该方法包含对经修改或重新设计的化合物重复步骤e)至步骤i)。

　　举例而言，若发现识别为「阻断剂」的化合物的化学部分负责阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道，则可使用本文所揭示或一般技术者已知的分子模拟算法中的任一个计算机模拟修改彼化学部分。接着可通过重复本文所揭示的方法的步骤e)至步骤i)重新测试经修改的化合物。

　　重新测试的后，若经修改的化合物在其较佳结合构形中的任一个中不阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道，则该经修改的化合物现可识别为「非阻断剂」。该经修改的化合物现可表征为具有降低的心脏毒性风险且选择其用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。通过该修改/重新设计，可挽救处于QT间隔延长风险下的潜在心脏毒性化合物用于进一步临床研发。

　　在某些实施例中，如以下部分6.2.3.14中所述，经修改或重新设计的化合物在其较佳结合构形中不阻断离子通道，但保持选择性结合至所需生物靶。

　　6.2.5.14修改/重新设计化合物以选择性结合至一级生物靶

　　在某些实施例中，经修改或重新设计的化合物保持或甚至增加与一级生物靶的选择性结合。在某些实施例中，化合物或经修改/重新设计的化合物结合至一级生物靶阻断C型肝炎病毒(HCV)产生。在某些实施例中，一级生物靶为HCV NS3/4A丝胺酸蛋白酶、HCV NS5B RNA依赖性RNA聚合酶或HCV NS5A单体蛋白。

　　在某些实施例中，在活体外生物分析中测试经修改或重新设计的化合物与其生物靶的选择性结合。

　　在某些实施例中，使用本文所揭示的计算模型或筛选算法中的任一个计算机模拟测试经修改或重新设计的化合物与其生物靶的结合。

　　在某些实施例中，经修改或重新设计的化合物以高亲和力结合至其生物靶及/或保持生物活性。在其中一级生物靶为HCV NS3/4A丝胺酸蛋白酶、HCV NS5B RNA依赖性RNA聚合酶或HCV NS5A单体蛋白的某些实施例中，经修改或重新设计的化合物保持抗病毒活性。

　　在某些实施例中，本文所揭示的用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的计算模型或筛选算法可与一般技术者已知的任何计算模型或筛选算法组合，用于模拟化合物或经修改/重新设计的化合物与其一级生物靶的结合。

　　6.2.5.15自化学库选择新化合物

　　作为化合物修改/重新设计的替代，新化合物亦可选自化学品或化合物库的集合，例如由有机或药物化学家产生作为药物发现程序的一部分的新候选药物。

　　举例而言，一旦本文所揭示的方法将原始测试化合物的化学部分识别为负责阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道的「阻断剂」，可自化学库选择新化合物，其中(例如)该新化合物不包含发现负责阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道的部分。

　　接着可通过重复本文所揭示的方法的步骤e)至步骤i)重新测试新化合物的心脏毒性。

　　重新测试的后，若新化合物在其较佳结合构形中的任一个中不阻断、阻塞或部分地阻塞离子通道，则该新化合物可识别为「非阻断剂」。该新化合物可表征为具有降低的心脏毒性风险且选择其用于进一步研发或可能用于人类或用作用于进一步药物设计的化合物。通过该自化学库选择新化合物，可通过复位向程序至安全先导化合物来挽救具有处于QT间隔延长风险下的潜在心脏毒性化合物的整个药物发现程序以用于进一步临床研发。

　　对于经修改/重新设计的化合物，亦可测试选自化学库的新化合物与所需生物靶、例如如以上部分6.2.3.14所述的一级生物靶的选择性结合。

　　6.2.6生物态样

　　视情况，本文所揭示的方法包括使用活体外生物分析或动物模型中活体内的结果检查计算机模拟预测的心脏毒性。本文所揭示的方法亦可包括使用活体外生物分析的结果或使用动物模型中活体内研究的结果验证或确认计算机模拟预测的心脏毒性。

　　因此，在某些态样中，本文提供用于测试、检查、验证或确认预测的心脏毒性的生物方法。

　　在某些实施例中，该方法包含使用一般技术者已知的标准分析技术来测试、检查、验证或确认化合物或经修改的化合物的预测的心脏毒性。

　　在某些实施例中，该方法包含在活体外生物分析中测试、检查、验证或确认化合物或经修改的化合物的预测的心脏毒性。

　　在某些实施例中，活体外生物分析包含高通量筛选离子通道及转运体活性。

　　在某些实施例中，活体外生物分析为hERG1通道抑制分析，例如FluxORTM钾离子通道分析，或为如以下解释的单个细胞中的电生理学量测。

　　在某些实施例中，该方法包含在动物模型中活体内测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性。

　　在某些实施例中，如以下所解释，通过量测野生型小鼠或表现人类hERG的转殖基因小鼠模型中的ECG活体内测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性。

　　6.2.6.1FluxORTM钾离子通道分析

　　在某些实施例中，活体外生物分析为FluxORTM钾离子通道分析(参见例如Beacham等人,2010,「Cell-Based Potassium Ion Channel Screening Using FluxORTMAssay,」J.Biomol.Screen.,15(4),441-446)，其允许高通量筛选钾离子通道及转运体活性。

　　FluxORTM分析监测钾通道对铊(Tl+)离子的渗透率。在将铊与打开通道的刺激物一起添加至细胞外溶液中时，铊沿其浓度梯度流至细胞，且用在细胞溶质荧光方面增加的专有指示剂染料侦测通道或转运体活性。因此，FluxORTM系统中报导的荧光为允许铊进入细胞的任何离子通道活性或转运过程的指示剂。

　　在某些实施例中，对稳定表现hERG1的HEK 293细胞或小鼠心肌细胞细胞株HL-1细胞执行FluxORTM钾通道分析。

　　在某些实施例中，对表现hERG1的人类成年心肌细胞细胞株执行FluxORTM钾通道分析。

　　6.2.6.2单个细胞中的电生理学量测

　　在某些实施例中，活体外生物分析包含电生理学量测，例如膜片钳电生理学量测，其使用高通量单个细胞平面膜片钳方法(参见例如Schroeder等人,2003,「Ionworks HT:A New High-Throughput Electrophysiology Measurement Platform,」J.Biomol.Screen.8(1),50-64)。

　　在某些实施例中，电生理学量测在单个细胞中。在某些实施例中，单个细胞为经hERG1稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO-hERG)。在某些实施例中，单个细胞来自表现hERG1的人类成年心肌细胞细胞株。

　　将该细胞分配至PatchPlate中。两性霉素用作穿孔剂来获得细胞电接入。在添加测试化合物的前通过穿孔膜片钳量测hERG尾电流。在添加测试化合物(通常0.008μM、0.04μM、0.2μM、1μM、5μM及25μM，每浓度n＝4个细胞，最终DMSO浓度＝0.25％)的后，执行hERG电流的第二次记录。

　　化合物后hERG电流通常表示为化合物前hERG电流的百分比(对照电流％)且针对各化合物的浓度进行标绘。在其中观测到浓度依赖性抑制的情况下，使用希尔(Hill)方程式来拟合数据的S形线且测定IC50(在该浓度下观测到50％抑制)。

　　6.2.6.3Cloe筛选IC50hERG安全分析

　　在某些实施例中，活体外生物分析为Cloe筛选IC50hERG安全分析，例如，如由公司CYPROTEX提供(参见例如http://www.cyprotex.com/toxicology/cardiotoxicity/hergsafety/)。

　　在某些实施例中，使用IonworksTM HT平台(使用CHO hERG细胞株的Molecular Devices)执行Cloe筛选IC50hERG安全分析，该平台使用自动膜片钳系统同时量测来自多个细胞的全细胞电流。

　　通常，hERG安全分析使用高通量单个细胞平面膜片钳方法。将CHO-hERG细胞分配至PatchPlate中。两性霉素用作穿孔剂来获得细胞电接入。在添加测试化合物的前通过穿孔膜片钳量测hERG尾电流。在添加测试化合物(通常0.008μM、0.04μM、0.2μM、1μM、5μM及25μM，每浓度n＝4个细胞，最终DMSO浓度＝0.25％)的后，执行hERG电流的第二次记录。化合物后hERG电流通常表示为化合物前hERG电流的百分比(对照电流％)且针对各化合物的浓度进行标绘。在其中观测到浓度依赖性抑制的情况下，使用希尔(Hill)方程式来拟合数据的S形线且测定IC50(在该浓度下观测到50％抑制)。

　　在某些实施例中，使用IonworksTM HT系统的hERG安全分析产生与传统单个细胞膜片钳量测类似的数据。

　　6.2.6.4转殖基因小鼠模型中的心电描记法研究

　　在某些实施例中，该方法包含通过量测表现人类hERG1的转殖基因小鼠模型中的ECG活体内测试化合物或经修改的化合物的心脏毒性。

　　可使用先前公布的协议(Royer等人,2005,「Expression of Human ERG K+Channels in the Mouse Heart Exerts Anti-Arrhythmic Activity,」Cardiovascular Res.65,128-137)执行用以测试表现hERG的转殖基因小鼠、具体言的心脏中的抗心律不整活性、特定言的QT延长的心电描记法。

　　替代地或另外，可执行用来测试野生型小鼠中的抗心律不整活性、特定言的QT延长的心电描记法。

　　包括以下实例以展示本发明的较佳实施例。一般技术者应了解，以下实例中所揭示的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中运行良好的技术，且因此可视为构成其实践的较佳模式。然而，根据本发明，一般技术者应了解，在不背离本发明的精神及范畴的情况下可对所揭示的特定实施例作出许多改变且仍获得相同或相似结果。

　　7.实例

　　图1A与图1B描绘用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的系统方块图。系统方块图(1A)与(1B)中所说明的过程为：靶制备(包括例如hERG的重新组合/同源蛋白模拟，如例示于以下实例1中)、配位体收集制备(如例示于以下实例2中)、集合生成(包括例如分子动力学模拟、主成分分析及反复丛集，如例示于以下实例3-5中)、对接(包括例如对接及反复丛集，如例示于以下实例6中)、对所选择复合物的MD模拟(包括例如分子动力学模拟及对接命中的初步排序，如例示于以下实例7与实例8中)、使用MM-PBSA重新计分(包括例如结合自由能计算及重新计分最高命中，如例示于以下实例9与实例10中)及实验测试(包括例如哺乳动物细胞中的hERG通道抑制研究、哺乳动物细胞中的FluxorTM钾通道分析及用以测试表现hERG的转殖基因小鼠中的抗心律不整活性的心电描记法，如例示于以下实例10-12中)。来自重新计分步骤的最高命中可充当下一阶段筛选的阳性对照组。在某些实施例中，如方块图(1B)中所示，集合生成、对接、对所选择复合物的MD模拟及使用MM-PBSA重新计分步骤可在超级计算机，例如罗彻斯特大学计算创新健康科学中心的「IBM蓝色基因/Q」超级计算机系统或其等效系统上执行。靶制备及配位体收集制备步骤可在本地机器上执行(例如在分子操作环境(Molecular Operating Environment；MOE)中)。

　　在某些实施例中，本文所揭示的MD模拟包含至少200,000个原子及其坐标(蛋白、膜、水及离子)的模拟。在某些实施例中，至少200ns的平衡过程等效于采取1000亿个步骤(1011个步骤)，在此等步骤中的每一个中更新系统中的各原子的位置坐标及速度。在某些实施例中，使用当前最先进超级计算机、例如「IBM蓝色基因/Q」超级计算机系统的MD模拟需要与可用的计算硬件的大小成大致线性比例的1000万CPU小时等效时间。

　　7.1实例1：重新组合/同源蛋白模拟

　　本文所揭示的方法在应用于钾离子信道时可如实例1-15中所述来执行。

　　如先前所述执行hERG1信道蛋白的重新组合及同源蛋白模拟(Durdagi等人,2012,「Modeling of Open,Closed,and Open-Inactivated States of the HERG1Channel:Structural Mechanisms of the State-Dependent Drug Binding,」J.Chem.Inf.Model,52,2760-2774)。图4及图5分别呈现hERG1单体次单元及hERG1四聚体的分子模型。

　　简言的，保存在K+通道中的具有已知晶体结构的hERG1结构的部分的同源模拟使用通过ClustalW算法执行的靶-模板序列比对(Thompson等人,1994,「Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,」Nucleic Acids Res.22(22),4673-4680)。通过ROSETTA中的比较模拟模块产生同源模型(Raman等人,2009,「Structure Prediction for CASP8with All-Atom Refinement using Rosetta,」Proteins,77,89-99；Chivian等人,2006,「Homology Modeling using Parametric Alignment Ensemble Generation with Consensus and Energy-Based Model Selection,」Nucleic Acids Res.34(17),e112)以产生具有约骨干CαRMSD的相当良好的模型。由于孔域(PD)含有在选择性过滤器上方形成8-12个残基螺旋的罕见地长S5-孔连接符或小塔，通过ROSETTA中的环模拟执行模型中的连接符及缺失部分的重新模拟(Wang等人2007,「Protein-Protein Docking with Backbone Flexibility,」J.Mol.Biol,373(2),503-519；Canutescu等人,2003,「Cyclic Coordinate Descent:A Robotics Algorithm for Protein Loop Closure,」Protein Sci.,12(5),963-972)。五个步骤用于蛋白模拟：(i)序列比对以基于一或多个模板结构生成比对，(ii)折迭识别以通过复制比对区域上方的坐标基于模板结构产生初始模型，(iii)环模拟以使用重新模拟重建缺失部分，(iv)基于来自生物化学、生物物理学及电生理学研究的报导的实验数据选择模型及(v)使用所有原子分子动力学(MD)进行改进，其对自在hERG1通道上执行的电生理学与突变诱发实验获得的盐桥接相互作用对的原子间距离具有所报导的约束。

　　使用先前公布的序列比对(Subbotina等人,2010,「Structural Refinement of the HERG1Pore and Voltage-Sensing Domains with ROSETTA-Membrane and Molecular Dynamics Simulations,」Proteins,78(14),2922-2934)用于在打开、关闭及未活化状态下模拟hERG1通道。分别基于改进的Kv1.2模型(其来源于Kv1.2晶体结构)(PDB ID 2A79)及Kv1.2关闭状态蛋白模型模拟打开与关闭状态S1-S6TM模型(Chivian等人,2006,Nucleic Acids Res.34(17),e112；Long等人,2005,「Crystal Structure of a Mammalian Voltage-Dependent Shaker Family K+Channel,」Science,309(5736),897-903)。来自小家鼠(Mus musculus)的打开状态Kv1.2、关闭状态Kv1.2,15及打开未活化KcsA PD(PDB ID 3F5W)用作模板结构。来自可用PDB坐标文件的诸如抗体轻链及重链的细胞内(IC)及细胞外(EC)域被修剪掉以在S1-S6打开与关闭状态下及S5S6打开未活化状态下产生hERG1的初始不完全模型。

　　对于hERG1的最佳环预测，实施ROSETTA的基于片段的环模拟(Wang等人,2007,J.Mol.Biol.,373(2),503-519；Canutescu等人,2003,Protein Sci.,12(5),963-972)。执行基于片段的构形搜索，其使用循环坐标下降(cyclic coordinate descent；CCD)及运动环闭合(kinematic loop closure；KLC)算法以用于插入来自PDB片段库的蛋白结构的3个与9个残基长的片段，且通过PSIPRED产生二级结构预测(McGuffin等人,2000,「The PSIPRED Protein Structure Prediction Server,」Bioinformatics,16(4),404-405)。使用环模拟产生打开、关闭及打开未活化状态的超过20,000个模型。选择具有位于选择性过滤器的外口的8-12个残基螺旋的模型用于进一步用Molsoft ICM程序进行分析(Abagyan等人,1994,「ICM-A New Method for Protein Modeling and Design-Applications to Docking and Structure Prediction from the Distorted Native Conformation,」J.Comput.Chem.,15(5),488-506)。遵守公布的实验约束的稳定模型用于后续所有原子MD模拟。

　　由以上实例1中所述的同源模拟产生的hERG1的坐标提供于所附表A中。此等坐标用作以下实例3中所述的MD模拟的输入。

　　7.2实例2：化合物(配位体)制备

　　使用来自Chemical Computing Group(CCG)的软件分子操作环境(MOE)(http://www.chemcomp.com/press_releases/2010-11-30.htm)将化合物(配位体)的2D信息翻译成3D代表性结构。MOE亦产生相同配位体的具有不同互变异构特性、立体化学特性及离子化特性的变体。使用MOE中所包括的能量最小化协议在构形上松弛所有产生的结构。

　　替代地或另外，来自套件的软件LigPrep(Release 2013-2:LigPrep,2.7版本，LLC,New York,NY,2013)可用于将化合物(配位体)的2D信息翻译成3D代表性结构。LigPrep亦可用于产生相同配位体的具有不同互变异构特性、立体化学特性及离子化特性的变体。可使用LigPrep中所包括的能量最小化协议在构形上松弛所有产生的结构。

　　7.3实例3：分子动力学模拟

　　在分子操作环境(MOE)中使用NAMD(不(仅)另一分子动力学程序)(Phillips等人,2005,「Scalable Molecular Dynamics with NAMD,」J.Comput.Chem.,26,1781-1802；Kalé等人,1999,「NAMD2:Greater Scalability for Parallel Molecular Dynamics,」J.Comp.Phys.151,283-312)进行所选择的模型的所有原子MD模拟。

　　对蛋白使用全氢AMBER99SB力场(Hornak等人,2006,「Comparison of Multiple Amber Force Fields and Development of Improved Protein Backbone Parameters,」Proteins 65,712-725)及对配位体使用一般性AMBER力场(generalized AMBER force field；GAFF)(Wang等人,2004,「Development and Testing of a General Amber Force Field,」J.Comput.Chem.25,1157-1174)在300K与生理pH(pH 7)及1标准大气压下进行MD模拟。

　　类似于K通道的先前MD模拟(Chivian等人,2006,「Homology modeling using parametric alignment ensemble generation with consensus and energy-based model selection.」Nucleic Acids Res.,34,17)，粒子网格埃瓦尔德(particle mesh Ewald；PME)算法用于静电相互作用。根据先前研究(Chivian等人，2006)，在选择性过滤器处的K离子用作S0:S2:S4位置处的占用离子。使用CHARMM-GUI膜构建器协议将蛋白模型嵌入1-十六酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；POPC)膜双层中(Kumar等人,2007,「CHARMM-GUI:A Graphical User Interface for the CHARMM users,」Abstr.Pap.Am.Chem.Soc.233,273-273；Jo等人,2008,「Software news and updates-CHARMM-GUI:A Web-Based Graphical User Interface for CHARM,」J.Comput.Chem.29(11),1859-1865)。模拟盒在细胞内腔中含有1个蛋白、416个POPC分子、3个K+离子、孔水分子，由0.15M KCl盐水溶液溶合。模拟系统中的总原子为大致176716个原子。图6呈现模拟系统的快照，其展示单位晶胞中的具有磷脂双层、水合水及离子的hERG1四聚体。

　　结构最小化持续200,000个步骤，加热2ns，接着平衡20ns。在最小化及加热期间，在很大程度上限制骨干原子运动，而在平衡期间彼等限制强有力地减少(亦即，对于骨干以100.0kcal mol-1进行加热及最小化，且在平衡期间逐渐降低至10kcal mol-1)。接着在无限制的情况下对系统进行200ns生产运作。

　　每隔10ps将原子坐标保存至轨迹，产生20,000个快照。如以下所解释，接着计算原子波动(B-因子)及对参考结构的均方根偏差(RMSD)。

　　7.4实例4：RMSD计算

　　如下计算Cα原子相对于参考结构的均方根偏差(RMSD)：

　　$RMSD\left(t\right)={\left[\frac{1}{N^2}\underset{i,j}{\Sigma }{|r_{ij}\left(t\right)-r_{ij}^{ref}|}^2\right]}^{1/2};---\left(1\right)$

　　其中N为原子数目，及rref为参考结构且呈现于图7中。此曲线图中的各点表示hERG结构的不同组的坐标。y轴中的两个点的间的间隔表示相应蛋白结构的间的偏差。如图中所示，hERG通道几乎在25ns模拟的后达到平衡，其中RMSD点围绕波动。图7中的上部组提供在MD模拟的不同持续时间处的RMSD的放大。此等组说明在开始MD模拟时限制骨干原子以及展示在移除此等限制的后由hERG结构跨越的构形转变且允许系统自由移动的效果。通过观测hERG轨迹的整体行为，吾人可注意到信道的巨大量的动态转变，其可归因于蛋白结构内的可挠性环的重组。此允许hERG结构探索宽构形空间，允许如下所述在对接程序内引入蛋白可挠性。

　　7.5实例5：反复丛集

　　接着执行MD轨迹的反复丛集以提取hERG1的优势构形。先前已描述丛集程序(Barakat等人,2010,「Ensemble-Based Virtual Screening Reveals Dual-Inhibitors for the P53-MDM2/MDMX Interactions,」J.Mol.Graph.&Model.28,555-568；Barakat等人,2011,「Relaxed Complex Scheme Suggests Novel Inhibitors for the Lyase Activity Of DNA Polymerase Beta,」J.Mol.Graph.&Model.29,702-716)。使用平均连接算法将200ns轨迹中的相似构形分成丛集。对于5至600范围内的不同丛集计数，通过观测戴维斯-堡丁指数(Davies-Bouldin index；DBI)的值(参见例如Davies等人,1979,「A Cluster Separation Measure,」IEEE Trans.Pattern Anal.Intelligence 1,224)及由资料(SSR/SST)解释的数据的百分比(参见例如Shao等人,2007,「Clustering Molecular Dynamics Trajectories:1.Characterizing the Performance of Different Clustering Algorithms,」J.Chem.Theory&Computation.3,231)估计丛集的最佳数目。在最佳数目的丛集下，预期SSR/SST中的平线区匹配DBI中的局部最小值(Shao等人，2007)。使用此方法论，识别细胞内hERG通道的三百(300)个相异构形。

　　7.6实例6：对接

　　对接：所有对接模拟使用软件AutoDock，4.0版本(Morris等人,2009,「Autodock4and AutoDockTools4:Automated docking with selective receptor flexiblity,」J.Computational Chemistry,16,2785-91)。对接方法及参数与先前所用的方法及参数类似(Barakat等人,2009,「Characterization of an Inhibitory Dynamic Pharmacophore for the ERCC1-XPA Interaction Using a Combined Molecular Dynamics and Virtual Screening Approach,」J.Mol.Graph.Model 28,113-130)。经由使测试化合物与由上述丛集方法论产生的300个hERG结构对接，筛选方法采用无约束复合方案(relaxed complex scheme；RCS)(Lin等人,2002,「Computational Drug Design Accommodating Receptor Flexibility:The Relaxed Complex Scheme,」J.Am.Chem.Soc.124,5632-33)。所有对接模拟使用：使用拉马克遗传算法(Lamarckian Genetic Algorithm；LGA)，对接参数包括400个随机个体的初始群；10,000,000最大数目能量评估；100个试验；40,0000最大世代及仅一个个体可存活至下一世代的要求。其余参数设定为默认值。

　　反复丛集：对接结果的丛集遵循与先前使用的一个相同的适应性程序(Barakat等人，2009)。简言的，对于各对接模拟，AMBER的PTRAJ模块的修改版本(Case等人,2005,「The Amber Biomolecular Simulation Programs,」J.Comput.Chem.26,1668-1688)丛集对接试验。每一次产生多个丛集，计算两个丛集度量值(例如DBI及方差百分比(Shao等人,2007,「Clustering Molecular Dynamics Trajectories:1.Characterizing the Performance of Different Clustering Algorithms,」J.Chem.Theory and Comput.3,2312))以分析丛集的质量。一旦达到此等度量值的可接受值，丛集协议在预测的丛集计数处提取丛集。接着筛选协议通过最密集丛集的最低结合能分类对接结果。目标为提取对于各配位体具有来自所有hERG结构的最大丛集群及最低结合能的对接解决方案。在此上下文中，对于各配位体，独立地丛集个体结构的对接结果。接着比较丛集结果且考虑最高40个命中用于进一步分析。AutoDock计分函数(方程式2)为化合物提供初步排序：

　　$\begin{array}{c}\Delta G={\mathrm{\Delta G}}_{vdW}\underset{i,j}{\Sigma }(\frac{A_{ij}}{r_{ij}^{12}}-\frac{B_{ij}}{r_{ij}^6})+{\mathrm{\Delta G}}_{hbond}\underset{i,j}{\Sigma }E\left(t\right)(\frac{C_{ij}}{r_{ij}^{12}}-\frac{D_{ij}}{r_{ij}^{10}})\\ +{\mathrm{\Delta G}}_{elec}\underset{i,j}{\Sigma }\frac{q_i{q}_j}{ϵ{\left(r_{ij}\right)}^2}+{\mathrm{\Delta G}}_{tor}{N}_{tor}+{\mathrm{\Delta G}}_{sol}\underset{i,j}{\Sigma }\left(S_i{V}_j\right)e^{(-r_{ij}^2/2{\sigma }^2)}\end{array}---\left(2\right)$

　　此处，在右侧的五个ΔG项为常数。该函数包括三个真空相互作用项：即兰纳-琼斯(Lennard-Jones)12-6分散/斥力项；定向12-10氢键项，其中E(t)为基于探针与靶原子的间的角度t的定向重量；及筛选的库仑静电位。另外，不利的熵贡献与配位体中的可旋转键的数目成比例且溶合效果由成对基于体积的项表示，通过求和所有配位体原子的通过指数函数加权的其周围蛋白原子的片段体积且接着乘以配位体原子的原子溶合参数(Si)来计算该项。

　　7.7实例7：关于所选择的复合物的分子动力学

　　各配位体的最低40个能量姿态以及其代表性hERG1结构用作MD模拟的起始结构设计。AMBER99SB力场(Hornak等人,2006,「Comparison of Multiple AMBER Force Fields and Development of Improved Protein Backbone Parameters,」Proteins 65,712-725)用于蛋白参数化，而一般性AMBER力场(GAFF)为配位体提供参数(Wang等人,2004,「Development and Testing of a General AMBER Force Field,」J.Comput.Chem.25,1157-1174)。对于各配位体，使用AMBER 10的前室(Antechamber)模块通过AM1-BCC方法计算部分电荷。使用程序PDB2PQR计算所有可电离残基的质子化状态。使用NAMD程序在300K及pH 7下执行所有模拟(Kalé等人,1999,「NAMD2:Greater Scalability for Parallel Molecular Dynamics,」J.Comp.Phys.151,283-312)。参数化的后，将蛋白-配位体复合物浸没于TIP3P水分子的立方体的中心中。选择立方体尺寸以提供各系统周围至少水分子缓冲区。在需要时，添加氯化物或钠抗衡离子来通过替换在其氧原子上具有最高静电能量的水分子以中和复合物的总电荷。接着最小化充分溶合的系统且随后在较大程度地限制所有骨干原子的情况下将该系统加热至模拟温度。加热的后，使用周期性边界条件平衡该系统100ps且能量限制在MD模拟的连续步骤中减少至零。该模拟接着持续2ns，在其期间每隔2ps将原子坐标保存至轨迹用于后续结合能分析。

　　7.8实例8：结合自由能计算及最高命中的重新计分

　　分子力学泊松-波兹曼(Poisson-Boltzmann)表面积(MM-PBSA)技术用于重新计分初步排序的对接命中(Kollman等人,2000,「Calculating Structures and Free Energies of Complex Molecules:Combining Molecular Mechanics and Continuum Models,」Acc.Chem.Res.3B,889-897)。此技术组合分子力学与连续溶合模型。总自由能估计为平均分子机械气相能量(EMM)、溶合自由能(Gsolv)及结合反应的熵贡献(-TS溶质)的总和。

　　G＝EMM+Gsolv-TS溶質 (3)

　　使用AMBER 10的SANDER模块计算各快照的分子机械(EMM)能量，其中包括的所有成对相互作用使用1.0介电常数(ε)。溶合自由能(Gsolv)估计为静电溶合自由能与非极性溶合自由能的总和，静电溶合自由能通过适应性泊松-波兹曼解法(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver；APBS)中的泊松-波兹曼方程式的有限差分解来计算，非极性溶合自由能由溶剂可达表面积(solvent-accessible surface area；SASA)算法来计算。溶质熵使用正常模式分析来近似。为各蛋白-配位体复合物施加热力循环，使用以下方程式计算结合自由能：

　　此处，表示配位体-蛋白复合物在真空中(气相)在代表性温度下的非共价缔合的每莫耳自由能，而(-ΔGsolv)代表将分子自其溶液构形转移至真空中相同构形所需的功(假定配位体-蛋白复合物的结合构形在溶液中与在真空中相同)。

　　所计算的结合可直接与生理上相关浓度相比较。就此而言，使用以下方程式将由例如活体外生物分析量测的IC50(在该浓度下观测到50％抑制)值转化为观测的结合自由能变化ΔGobs(cal mol-1)：

　　${\mathrm{\Delta G}}_{obs}^o=RTln{K}_i---\left(5\right)$

　　其中R为气体常数，R＝1.987cal K-1mol-1，T为绝对温度，及Ki近似为对特定测试化合物i量测的IC50。因此，将计算机模拟所计算的结合能ΔGcoalc与活体外观测的结合能ΔGobs(例如来自抑制研究)相比较，且因此亦与化合物与蛋白(例如hERG)的各组合的生理上相关浓度(IC50)相比较。

　　测试化合物的所计算的结合能亦可与已知对照组(来自标准化药物组的已知的hERG阻断剂)的所计算的结合能相比较。使用以下方程式：

　　${\mathrm{\Delta G}}_1-{\mathrm{\Delta G}}_2=RTln\left(\frac{K_{i1}}{K_{i2}}\right)---\left(6\right)$

　　其中Ki1及Ki2分别为测试化合物及对照组的莫耳浓度。

　　7.9实例9：通道阻断的分类

　　VMD(视觉MD)(Humphrey等人,1996,「Visual Molecular Dynamics,」J.Mol.Graphics,14(1),33-38)用于视觉分析所选择的复合物的MD轨迹的结果用以对接命中的初步排序。

　　通道阻断剂在腔内结合以使得钾离子穿过选择过滤器的通道被阻断。在另一方面，化合物可以其不干扰钾通行的方式结合至通道。考虑到此，且通过视觉检查结合结构，吾人可将测试小分子分类为「阻断剂」，例如阻断hERG1离子通道的化合物，或分类为「非阻断剂」，例如不阻断hERG1离子通道的化合物。图8呈现结合至hERG1四聚体的非阻断剂的实例阿司匹林及1-萘酚并不阻断离子通道。图9呈现结合至hERG1四聚体的阻断剂的实例BMS-986094阻断离子通道。

　　7.10实例10：将化合物重新设计为非阻断剂

　　BMS-986094((2R)-2-(((((2R,3R,4R)-5-(2-胺基-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(萘-1-基氧基)磷酰基)胺基)丙酸新戊酯)为处于肝炎治疗阶段II研发中的核苷酸聚合酶(NS5B)抑制剂。BMS-986094为在临床试验中的九名患者必须住院且其中一个由于对QT间隔延长的影响而死亡的后，由FDA安排在临床上暂停的化合物的实例。以下说明BMS-986094的结构，其中突出显示部分对应于「基于胺基酸的前药」：

　　如实例9与图9中所展示，BMS-986094为hERG1通道的阻断剂，该发现进一步通过下述实例11与实例12的活体外生物分析的结果来确认。

　　根据自本文所揭示的方法识别的BMS-986094的较佳结合构形，BMS化合物中阻断hERG离子通道的部分为悬挂在5员糖左侧的基于胺基酸的前药。在不受任何理论限制的情况下，咸信通过修改或若需要移除化合物的前药部分，经修改的BMS化合物将不再阻断hERG离子通道但将保留抗HCV活性。

　　7.11实例11：哺乳动物细胞中的HERG1通道抑制(IC50测定)

　　将表现hERG1钾通道的哺乳动物细胞分配至384孔平面数组中且通过全细胞电压钳量测hERG尾电流。接着将一系列浓度(TBD)的测试化合物添加至该细胞中且进行hERG电流的第二次记录。计算hERG电流中的变化百分比。在其中观测到浓度依赖性抑制的情况下，通过拟合S形函数至浓度响应数据导出IC50值。

　　在IonWorksTMHT仪器(Molecular Devices Corporation)上执行该实验，其在专门的384孔板(PatchPlateTM)中同时自动地在48个单个细胞中执行电生理学量测。所有细胞悬浮液、缓冲液及测试化合物溶液在实验期间处于室温下。

　　所用细胞为经hERG(自Cytomyx，UK获得的细胞株)稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在细胞外溶液(具有钙及镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)，pH 7-7.2)中制备单个细胞悬浮液且自动地添加等分试样至PatchPlateTM的各孔。接着通过在板下方施加真空将细胞置于各孔底部处的小洞上方以形成电密封。经由填充有细胞内溶液(用HEPES缓冲至pH 7.2)的所有孔的共同单隔室施加真空。经由细胞内隔室中的共同接地电极及置放至上部孔中的每一个中的个别电极量测各密封的电阻。

　　接着通过在PatchPlateTM下面循环穿孔剂两性霉素来实现细胞电接入且接着量测化合物前hERG电流。电极位于细胞外隔室且施加-80mV保持电位持续15sec。接着通过施加去极化步骤来活化hERG通道至+40mV持续5sec且接着在-50mV下夹持4sec以引出hERG尾电流，随后返回至-80mV持续0.3s。

　　接着将测试化合物自含有一系列浓度的各化合物的96孔微量滴定板自动添加至PatchPlateTM的上部孔。通过将测试化合物的DMSO溶液稀释至细胞外缓冲区中来制备溶液。保持测试化合物与细胞接触300sec，随后使用与化合物前扫描中相同的电压步骤协议记录电流。包括确定的hERG抑制剂奎尼丁作为阳性对照组且包括含有0.25％DMSO的缓冲液作为阴性对照组。若奎尼丁的IC50值或阴性对照组结果超出质量控制限制，则拒绝板上的所有化合物的结果且重复实验。

　　在PatchPlateTM上的4个复制孔中测试各浓度。然而，仅密封电阻大于50MOhm且化合物前电流为至少0.1nA的细胞用于评估hERG阻断。

　　接着将化合物后电流表示为化合物前电流的百分比且针对各化合物的浓度进行标绘。在其中观测到浓度依赖性抑制的情况下，将数据拟合至以下方程序且计算IC50值：

　　$Y=\frac{Y_{\max }-Y_{min}}{1+(X/X_{50})s}+Y_{min}---\left(7\right);$

　　其中Y＝(化合物后电流/化合物前电流)×100，x＝浓度，X50＝抑制50％电流所需的浓度(IC50)及s＝曲线的斜率。

　　若观测到浓度依赖性抑制，则报导IC50。亦报导IC50模型的标准误差(standard error；SE)及用于测定IC50的数据点数目。结果呈现于下表6中及图10与图11中。根据资料，阿司咪唑与BMS-986094均抑制钾通道。

　　7.12实例12：哺乳动物细胞中的FLUXORTM钾通道分析

　　对稳定表现hERG1的人胚肾293细胞(HEK 293)细胞或小鼠心肌细胞细胞株HL-1细胞(来自Dr.William Claycomb，Louisiana，USA的礼物)执行FluxORTM钾通道分析。简言的，FluxORTM加样缓冲液由用20mM HEPES缓冲且用NaOH将pH调节至7.4的汉克氏平衡盐水溶液(Hank's Balanced Saline Solution；HBSS)来制成。如由套组指导使用PowerloadTM浓缩与水可溶丙磺舒来分别增强染料溶解度及保持力。自细胞板手动移除培养基，且将含有FluxORTM染料混合物的20μL加样缓冲液施加至各孔中。一旦进入细胞内部，FluxORTM染料的非荧光AM酯形式通过内源性酯酶裂解成铊敏感性指示剂。在室温下加载染料60min且接着手动移除。随后用无染料分析缓冲液洗涤细胞板一次，随后添加含有水可溶丙磺舒的最终体积为20μL的分析缓冲液。细胞板接收每孔2μL筛选化合物，且接着对于HEK 293细胞在室温(23-25℃)下培育30min以允许培养物中的测试化合物平衡或对于HL-1细胞在37℃下培育24h。在注入的前，自套组中所提供的5×无氯化物缓冲液、铊及硫酸钾试剂制备刺激缓冲液以含有10mM游离铊(5mM Tl2SO4)及50mM游离钾(25mM K2SO4)。此等浓度在将刺激物缓冲液注入至已加载有FluxORTM染料的细胞中时以1:5稀释的后产生2mM游离Tl+及10mM游离K+的最终添加浓度。向各孔中添加20μL刺激缓冲液且每隔1sec进行荧光量测持续180sec总时间。分别使用490/525nm激发波长与发射波长使用Perkin Elmer EnSpire多模式板读取器(Massachusetts，USA)进行荧光量测。

　　图12呈现媒剂(12A)、阿司咪唑(12B)、1-萘酚(1-NP)(12C)及BMS-986094(12D)的HEK 293细胞中的FluxORTM钾通道分析的结果。阿司咪唑与BMS-986094均阻断钾通道的电导。

　　7.13实例13：用以测试表现HERG的转殖基因小鼠中的抗心律不整活性的心电描记法

　　可使用先前公布的协议(Royer等人,2005,「Expression of Human ERG K+Channels in the Mouse Heart Exerts Anti-Arrhythmic Activity,」Cardiovascular Res.65,128-137)执行用以测试表现hERG1、具体言的在心脏中表现hERG1的转殖基因小鼠的抗心律不整活性的心电描记法。

　　7.14实例14：使用化合物的测试组预测及验证HERG阻断

　　本文所揭示的计算模型及方法用于识别具有高灵敏度及特异性的化合物的测试组的药物介导的hERG阻断活性。使用hERG结合分析及膜片钳电生理学验证此等计算机模拟结果。如以下实例中所展示，本文所揭示的计算模型及方法可区分有效阻断剂、弱阻断剂及非hERG阻断剂且首次实现在药物研发过程早期高通量筛选及修改具有降低心脏毒性的化合物。

　　A.1.分子动力学(MD)模拟：

　　使用先前公布的以其打开状态作为初始结构设计的hERG信道同源结构(Durdagi等人,2012,「Modeling of Open,Closed,and Open-Inactivated States of the Herg1Channel:Structural Mechanisms of the State-Dependent Drug Binding,」J.Chem.Inform.&Model.52,2760-2774)。使用CHARMM-GUI膜构建器协议(Barakat等人,2010,「Ensemble-based Virtual Screening Reveals Dual-Inhibitors for the p53-MDM2/MDMX Interactions,」J.Mol.Graph.&Model.28,555-568)将蛋白结构嵌入416POPC膜脂质双层、宽水分子缓冲液及0.15M KCl盐浓度中。三个钾离子位于选择性过滤器内。使用两个力场，对于蛋白结构使用AMBER99SB力场(Hornak等人,2006,「Comparison of Multiple Amber Force Fields and Development of Improved Protein Backbone Parameters,」Proteins 65,712-725)及对于膜结构使用amber脂质11力场(Skjevik等人,2012,「LIPID 11:a Modular Framework for Lipid Simulations using Amber,」J.Phys.Chem.B 116,11124-11136)。总体而言，使用NAMD程序(Hornak等人，2006)在310K下进行155个MD模拟。对无配位体处于口袋内的膜结合结构进行初始模拟500ns以探索hERG腔的构形动力学及为后续对接分析提取优势构形。

　　MD模拟的协议使用对蛋白骨干及脂质分子具有很大程度的限制的200,000个最小化步骤，在相同限制的情况下经由1000个步骤逐步加热1ns，在限制比加热的限制减弱至百分之一的情况下进行10ns平衡，随后在进一步降低至先前步骤中所用限制的十分之一的情况下进行10ns额外平衡阶段，且最后，在无限制的情况下运行系统持续剩余500ns。剩余154个MD模拟用于松弛自对接模拟获得的hERG-配位体复合物且产生用于结合能分析的蛋白-配位体结构的集合。此等MD模拟遵循与先前所述的彼等者相同的程序(Jordheim等人,2013,「Small Molecule Inhibitors of ERCC1-XPF Protein-Protein Interaction Synergize Alkylating Agents in Cancer Cells,」Mol.Pharmacol.84,12-24；Barakat等人,2010,「Ensemble-based Virtual Screening Reveals Dual-Inhibitors for the p53-MDM2/MDMX interactions,」J.Mol.Graph.&Model.28,555-568；Barakat等人,2012,「Virtual Screening and Biological Evaluation of Inhibitors Targeting the XPA-ERCC1Interaction,」PloS one 7,e51329(2012)10.1371/journal.pone.0051329)。

　　对于配位体结合系统，使用一般性amber力场(GAFF)获得配位体参数(Wang等人,2004,「Development and Testing of a General Amber Force Field,」J.Comput.Chem.25,1157-1174)。对于各配位体，使用AMBER 10的前室模块用AM1-BCC方法计算部分电荷。使用PTRAJ公用程序经模拟时间的持续时间计算均方根偏差(RMSD)及B因子。使用如VMD中所实施的密度分布工具计算最后300ns的1-D电子密度分布(Barakat等人,2012,「DNA Repair Inhibitors:the Next Major Step to Improve Cancer Therapy,」Curr.Topics Med.Chem.12,1376-1390)。

　　A.2.丛集分析：

　　使用平均连接算法执行RMSD构形丛集，该算法使用5至300个丛集范围内的丛集计数。使用来自各单体的残基623、624、651、652、653、654、655及656对500ns MD模拟执行丛集分析。历经整个500ns模拟时间以10ps间隔提取结构。所有Cα原子均经RMSD拟合至最小化初始结构以便移除整体旋转及平移。通过计算两个丛集度量值、即戴维斯-堡丁指数(DBI)(Davies等人,1979,「A Cluster Separation Measure,」IEEE Trans.Pattern Anal.Mach.Intelligence 1,224)与「肘形标准(elbow criterion)」(Shao等人,2007,「Clustering Molecular Dynamics Trajectories:1.Characterizing the Performance of Different Clustering Algorithms,」J.Chem.Theor.&Comp.,2312)预期丛集质量。在DBI经历与所用丛集数目对比的局部最小值时预期高质量丛集方案。在另一方面，使用肘形标准，由数据解释的方差百分比预期超过最佳丛集数目的丛集计数进入平线区(Shao等人，2007)。使用此等度量值及改变丛集数目，对于充分丛集，吾人应预期DBI的局部最小值及方差百分比的水平线，该水平线由资料(参见以下结果)展现。

　　A.3.主成分分析：

　　PCA可将来自大MD模拟的相关变量的原始空间转换成包含系统基本动力学的独立变量的约化空间(Barakat等人,2011,「Relaxed Complex Scheme Suggests Novel Inhibitors for the Lyase Activity of DNA Polymerase Beta,」J.Mol.Graph.&Model.29,702-716)。对于典型蛋白，系统的维度进而自数万自由度减少至少于50自由度。

　　为了执行N原子的一子集的PCA，将整个MD轨迹RMSD拟合至参考结构，以便移除所有旋转及平移。接着如下自其笛卡耳原子坐标计算协方差矩阵：

　　σij＝<(ri-<ri>)(rj-<rj>)> (8)

　　其中ri表示三个笛卡耳坐标(xi、yi或zi)的一个且协方差矩阵的特征向量构成运动的基本向量。

　　A.4.对接：

　　所有丛集的45个代表用作对接模拟的刚性靶。使用AUTODOCK(Osterberg等人,2002,「Automated Docking to Multiple Target Structures:Incorporation of Protein Mobility and Structural Water Heterogeneity in Autodock,」Proteins 46,34-40)，4.028版本执行所有对接运行。对于各配位体，在整个腔内针对45个优势构形执行初始对接模拟。使用来自AUTODOCK的具有截断的RMSD丛集来丛集来自此集合对接程序的结果，随后排序对接结合能。接着在由来自初始对接模拟的最高命中选择的较佳半腔内执行针对45个优势构形的更全面的对接模拟。

　　对于初始运行，对接盒在各方向上跨越126网格点，每两个相邻点的间具有间距，足以覆盖整个口袋的两倍。对于更集中的对接模拟，盒大小限制为52 82 126，其中点的间具有相同间距，然而，移动盒中心以更集中于所选择的半口袋的残基。对于所有对接模拟，参数类似于先前所述的彼等参数(Barakat等人,2012,「Virtual Screening and Biological Evaluation of Inhibitors Targeting the XPA-ERCC1Interaction,」PloS one 7,e51329(2012)10.1371/journal.pone.0051329)；Barakat等人,2013,「A Computational Model for Overcoming Drug Resistance Using Selective Dual-Inhibitors for Aurora Kinase A and Its T217D Variant,」Mol.Pharm,10,4572-4589)。简言的，使用拉马克遗传算法(LGA)，对接参数包括350个随机个体的初始群；25,000,000最大数目能量评估；100个试验；34,000最大世代；0.02突变率；0.80交叉率及仅一个个体可存活至下一世代的要求。

　　A.5.计算距通道口的最短距离：

　　使用VMD计算测试化合物至hERG通道口处Thr623残基中的一个的间的最短距离以构造四苏胺酸残基及测试化合物20A内的所有接触原子的表。计算各原子对的距离且分类所有距离以提取最短距离。

　　A.6.结合能分析：

　　使用MM-PBSA技术(Kollman等人,2000,「Calculating Structures and Free Energies of Complex Molecules:Combining Molecular Mechanics and Continuum Models,」Acc.Chem.Res.3B,889-897)预测结合能。类似于文献(Barakat等人,2010,「Ensemble-Based Virtual Screening Reveals Dual-Inhibitors for the P53-MDM2/MDMX Interactions,」J.Mol.Graph.&Model.28,555-568；Barakat等人,2013,「A Computational Model for Overcoming Drug Resistance Using Selective Dual-Inhibitors for Aurora Kinase A and Its T217D Variant,」Mol.Pharm.10,4572-4589；Barakat等人,2013,「Detailed Computational Study of the Active Site of the Hepatitis C Viral RNA Polymerase to Aid Novel Drug Design,」J.Chem.Inform.&Model.53,3031-3043)；Friesen等人,2012,「Discovery of Amall Molecule Inhibitors that Interact with Gamma-Tubulin,」Chem.Biol.&Drug Design 79,639-652)中先前所述的工作，各系统的总自由能估计为平均分子机械气相能量(EMM)、溶合自由能(Gsolv)及结合反应的熵贡献(-TS溶质)的总和：

　　G＝EMM+Gsolv-TS溶質 (9)

　　使用AMBER10的SANDER模块计算各快照的分子机械(EMM)能量。溶合自由能(Gsolv)估计为静电溶合自由能与非极性溶合自由能的总和，静电溶合自由能通过适应性泊松-波兹曼解法(APBS)中的泊松-波兹曼方程式的有限差分解来计算，非极性溶合自由能由溶剂可达表面积(SASA)算法来计算：

　　所用参数包括蛋白-配位体复合物的介电常数1、水的介电常数80、离子浓度0.15M及具有零表面偏移的表面张力0.005来估计溶合能的非极性贡献。

　　选择来自各轨迹的两千(2000)个快照来预测分子力学及溶合贡献；选择来自各轨迹的五十(50)个快照来预测熵。快照频率的选择系基于估计相关时间类似于由Genheden及Ryde(Genheden及Ryde,2010,「How to Obtain Statistically Converged MM/GBSA Results,」J.Comput.Chem.31,837-846)所述的工作。亦即，将来自整个MD轨迹(X)的ΔMM-PBSA能量点分成相等时间间隔(τ)的块(Yi)。接着根据以下方程序计算函数Φ：

　　$\Phi =\frac{\tau ·{\sigma }^2{\left(Y\right)}_{\tau }}{{\sigma }^2\left(X\right)}---\left(11\right)$

　　其中σ2(X)为整个轨迹ΔMM-PBSA能量点的方差及σ2(Y)τ为长度τ的块内的能量数据点的平均值的方差(例如，对于各块，计算平均Δ能量，接着所产生的n个块的方差接着在方程式11中用作某一τ的σ2(Y)τ)。接着改变块长度(τ)，且预测在块平均值在统计上为独立时计Φ值为常数，且在该点处可估计时间相关性。

　　A.7.电生理学缓冲液及化合物：

　　杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水购自Corning。细胞内(IC)缓冲液由(mM)乙二醇四乙酸EGTA(11)、MgCl2(2)、KCl(30)、KF(90)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(10)及K2-ATP(5)组成，且用KOH将pH调节至7.3。细胞外(EC)缓冲液由(mM)CaCl2(2)、MgCl2(1)、HEPES(10)、KCl(4)、NaCl(145)组成，且用NaOH将pH调节至7.4。阿司咪唑、哌迷清、西沙必利、罗非昔布、塞内昔布、氟哌啶醇、特非那定、奎尼丁、胺碘酮、E-4031、三甲氧苄二胺嘧啶、白藜芦醇、雷尼替丁盐酸盐、乙酰柳酸、萘普生、布洛芬、双氯芬酸钠、乙酰胺苯酚、鸟苷及1-萘酚系自Sigma-Aldrich获得。2-胺基-6-O-甲基-2'C-甲基鸟苷(MG)购自Carbosynth(Berkshire，UK)。BMS-986094由Syninnova(Edmonton,AB)本地合成。在二甲亚砜(dimethylsulfoxide；DMSO)中连续稀释化合物且接着在0.01％DMSO恒定浓度下添加至EC缓冲液。亦将减少由于黏附/吸附至板所致的化合物损失的试剂(料号910-0049，FLreagent；Fluxion Biosciences)添加至化合物溶液(1:100比率)。

　　A.8.PredictorTM hERG荧光偏振分析：

　　结合至hERG通道蛋白的化合物系通过其置换示踪剂(PredictorTM hERG Tracer Red)及降低荧光偏振的能力来识别。将Tracer Red配位体储存于100％DMSO中且在实验当天在分析缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM MgCl2、10mM KCl、0.05％普洛尼克(Pluronic)F127，pH 7.4，4℃)中稀释至8nM。以半对数间隔在分析缓冲液中将测试样品及对照组稀释为16种浓度。自-80℃冷冻器移除细胞膜且在解冻的后置放于冰上。膜工作溶液蛋白浓度为0.3mg/mL。通过添加5μL测试化合物或对照缓冲液、5μL Tracer Red配位体及10μL细胞膜至黑色384孔板(Corning，目录号3677)汇集分析。混合该板且培育6h，随后在Perkin Elmer EnVision板读取器(激发531/25nm，发射579/25nm)上读取。在其中观测到浓度依赖性抑制的情况下，通过拟合S形函数至浓度响应数据导出IC50值。计算所有IC50数据且使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software)进行分析。

　　A.9.细胞培养及转染：

　　在转染前一天，在37℃及5％CO2下将AC10成年人类心肌细胞(ATCC目录号PTA-1501)接种于具有5％胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的完全生长培养基中的6孔板中。根据制造商的协议进行转染。简言的，xμg慢病毒ORF表现质体DNA及yμl Lenti-Pac HIV混合物首先在一个管中混合于Opti-MEM I中。在独立管中，用Opti-MEM I稀释zμl EndoFectin Lenti。将经稀释的EndoFectin Lenti试剂逐滴添加至含有DNA的管中。在室温下培育混合物以允许DNA-EndoFectin复合物形成。接着将复合物混合物直接添加至各孔且轻轻地打漩板。在37℃及5％CO2下培育12-16h的后，轻轻地移除含有混合物的培养基且添加新鲜生长培养基。转染后48小时后，将含有假病毒的培养基收集于无菌加盖管中且离心。经由0.45μM低蛋白结合过滤器过滤上清液。

　　A.10.AC10细胞的转导：

　　在病毒感染的前两天将AC10细胞涂铺至24孔板中，以使得该细胞在转导时达到70-80％融合。对于各孔，在凝聚胺存在下在完全培养基中稀释病毒悬浮液。用含有凝聚胺的稀释的病毒悬浮液感染细胞。在37℃下于5％CO2中培育细胞隔夜。将细胞以1:5分至6孔板上且持续48小时培育成细胞特异性培养基。通过由流动式细胞测量术短暂表现转殖基因及用荧光显微镜分析经感染的靶细胞。为了选择稳定转导细胞，每3-4天用含有适当选择药物的新鲜选择性培养基替换旧培养基直至耐药性群落变得可见。

　　A.11.膜片钳细胞培养：

　　组成性表现hERG通道的AC10细胞及其相应阴性对照细胞在IonFlux16(Molecular Devices)上进行内部验证。培养基由10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素及89％杜尔贝科氏改质伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)/F12(Invitrogen Corporation)组成。细胞在T175组织培养烧瓶中生长，用胰蛋白酶/乙二胺-四乙酸(0.05％；Invitrogen Corporation)在70％-90％融合度下分裂，且在37℃及5％CO2下维持。在指定用于实验时，将继代细胞移至28℃后持续至少24h。用0.05％胰蛋白酶/乙二胺-四乙酸执行4min采集，且使分离细胞集结且在23℃下再悬浮于97.5％不含血清培养基(Gibco号12052；Invitrogen)与2.5％HEPES缓冲溶液(Gibco号15630；Invitrogen)的溶液中0.5-2.5h。紧接在实验的前，在EC缓冲液中洗涤细胞一次。

　　A.12.自动膜片钳IonFlux软件及实验协议：

　　如上所述稀释化合物且手动分布至化合物孔中(每孔250μL)。将细胞分布至指定孔且将板插入IonFlux系统中。根据以下协议来准备板3min：(1)捕获物与化合物在8psi下持续t＝0-160s及在1.6psi下持续t＝160-175s；(2)捕获物但无化合物在1.6psi下持续t＝175-180s及(3)主要通道在1psi下持续t＝0-160s及在0.2psi下持续160-180s。在以5-8×106个细胞/毫升进行细胞引入的后，重新准备板：(1)捕获物与化合物在5psi下持续t＝0-15s及在2psi下持续t＝15-55s，(2)捕获物但无化合物在2psi下持续t＝55-60s及(3)主要通道在1psi下持续t＝0-20s、在0.5psi下持续t＝20-40s及在0.2psi下持续t＝40-60s。接着，将细胞引入主要通道中且通过以下捕获协议在横向捕获位点捕获：(1)6mmHg捕获真空持续t＝0-30s及4mmHg捕获真空持续t＝30-85s，(2)0.1psi主要通道压力持续t＝0-2s，随后15次重复矩形脉冲0-0.2psi，其中基线持续时间为4.5s及脉冲持续时间为0.5s，随后0.1psi下持续8s。执行一个至五个断裂协议且在化合物测试的前稳定电流。在持续5min至15min灌注的化合物的前测试阴性对照组(具有0.01％DMSO的EC缓冲液)。最后，用EC缓冲液洗涤细胞。当前研究中所用的电压命令协议类似于hERG电流的习知膜片钳中使用的彼等协议，Vh为-80mV且初始步骤至+50mV持续800ms未活化通道，随后1-s步骤至-50mV以引发所量测的向外尾电流。

　　A.13.自动膜片钳数据分析：

　　通过自完全阻断(例如阳性对照组)的电流减去电流水平且接着除以无阻断(例如阴性对照组)与完全阻断的差值(阴性对照组减阳性对照组)计算电流剩余百分比(Remaining percentage of current；REM)。将半最大抑制浓度(IC50)及化合物浓度的希尔(Hill)斜率(H)拟合至下式以得到dps：

　　REM＝I100+[(I0-I100)/(1+([C]＝IC50^H))] (12)

　　其中I0及I100分别指无阻断及完全阻断。使用IonFlux软件(Molecular Devices)、GraphPad Prism(GraphPad Software)及Microsoft Excel(Microsoft)来分析及呈现IC50值、电流及密封。

　　A.14.膜片钳数据纳入准则：

　　在温度(33℃-35℃)下自七点浓度响应曲线计算IC50值，其中在各浓度下的最小值为n＝6。若数据点通过以下纳入准则，则接受该数据点：(1)在化合物培育期间及在阳性对照组的前可接受的电流上升/下降(<10％)，(2)与相同细胞捕获物相关的阴性对照组不展示电流阻断及(3)与相同细胞捕获物相关的阳性对照组展示完全电流阻断。监测在清除化合物期间的电流恢复速率，且排除离群值以滤出丢失的记录。

　　使用明确溶合的膜结合hERG通道、IBM蓝色基因/Q超级计算机及自动无约束复合方案(RCS)对接算法执行500ns分子动力学(MD)模拟(Barakat等人,2013,「A Computational Model for Overcoming Drug Resistance Using Selective Dual-Inhibitors for Aurora Kinase A and Its T217D Variant,」Mol.Pharm.10,4572-4589)。该协议涉及六个步骤：(1)提取hERG的内腔的优势(45个)构形；(2)在该内腔内针对此45个构形执行盲对接模拟以识别最高亲和力结合位置；(3)执行集中配位体对接至名列第一的位置；(4)使用具有外显溶剂及离子的所有原子MD模拟来重新计分最高命中；(5)计算改进的复合物的分子力学泊松-波兹曼表面积(MM-PBSA)结合能；(6)基于配位体的最低结合能及至通道的孔的最短距离估计通道阻断的可能性。由于大部分hERG阻断剂在通道的打开状态下在hERG内腔内结合(Mitcheson等人,2000,「A Structural Basis for Drug-Induced Long QT Syndrome,」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,12329-12333；Spector等人,1996,「Class III Antiarrhythmic Drugs Block HERG,a Human Cardiac Delayed Rectifier K+Channel.Open-Channel Block by Methanesulfonanilides,」Circ.Res.78,499-503)，打开状态模型(Durdagi等人,2012,「Modeling of Open,Closed,and Open-Inactivated States of the Herg1Channel:Structural Mechanisms of the State-Dependent Drug Binding,」J.Chem.Inform.&Model.52,2760-2774)在提取代表性内腔结构用于对接的前用作MD模拟的初始结构设计。

　　图13说明在模拟期间的均方根偏差(RMSD)。在移除骨干限制大致20ns的后，系统开始平衡且在其的后波动超过B因子分析展示每残基的hERG通道的热波动(参见图14)，确认以下报导(Jiang等人,2005,「Dynamic Conformational Changes of Extracellular S5-P Linkers in the HERG Channel,」J.Physiol.569,75-89)：可挠性最大区域包括S5-P连接符(残基613-668)及残基70-140(主要位于S3螺旋与S4螺旋)，其中单体1及4与单体2及3相比具有较高可挠性。相反，渗透孔及内腔残基(618-658)在所有单体中在相同范围内波动(参见图15)。

　　为了确认模型的可重现性，计算脂质双层的头部及尾部、蛋白、水及离子的电子密度分布。脂质头基的平均电子密度分布的质心的间的距离确定膜边界，其说明内部成分分布。如图16中可见，水主要集中在膜外部，除渗透孔内提供离子水合壳的微小部分以外。尽管离子电子密度与蛋白、水或脂质系统相比极其小，但通过比较此等离子历经最后300ns模拟的平均电子密度分布可见钾的hERG通道选择性优于氯。将hERG选择性过滤器内的可见的钾密度峰值与氯的几乎为零的密度进行比较(参见图17)。

　　取样通道的构形空间允许提取优势hERG构形用于对接。主成分分析(PCA)帮助减小保持基本动力学的系统的维度(参见以上材料的方法)。优势特征向量按指数律成比例衰减且最大特征值表示具有沿正交方向的最大标准偏差的相关hERG运动。图18投影由hERG腔的四个优势主成分跨越的平面上的轨迹。渗透孔残基采用极少构形，其与原子波动结果匹配(参见图15)。MD轨迹形成几个丛集，指示对有利折迭构形的吸引域。使用平均连接算法及最佳丛集数目算法(参见上文)通过丛集MD轨迹发现hERG的内腔的四十五(45)个优势构形(参见图19)。45个优势构形的结构反映hERG打开状态的大部分实际描述(参见图20)。构形跨越巨大骨干动力学(参见图21)及显著侧链定向(参见图22)。使用此蛋白结构集合将配位体对接至hERG腔精确解释了蛋白可挠性，解决具有挑战性的hERG阻断预测问题。

　　巨大搜索空间及由于hERG对称性的许多冗余对接解决方案造成额外挑战。因此，将腔分成四半用于两个基于集合的配位体筛选模拟。首先识别的较佳配位体结合位置使用与涉及整个腔的45个优势构形的基于集合的盲对接(参见图23)。最高命中导引朝向腔的一半的选择，其中使用所有hERG结构执行更精确对接(参见图24)。使用外显溶剂MD随后MM-PBSA改进由集中筛选产生的hERG结合配位体以确定精确结合自由能。

　　最后，使用结合能及至渗透孔的距离定量配位体对hERG的阻断程度。由于配位体可远离渗透孔紧密结合以对离子的通道通行产生微小影响，结合亲和力单独产生假阳性。由于大的热波动，接近渗透孔微弱地结合可能为非永久的。因此，单独使用结合能或距渗透孔的最短距离为不足的。

　　为了确定hERG阻断剂的参数临限值，使用包括hERG阻断剂与非阻断剂(参见下表7)的22种化合物的组(亦参见图25)。hERG阻断剂以-30kcal/mol以下的结合能及小于的至Thr623残基的距离表征，其邻近于选择性过滤器的GFG特征主结构。相反，结合比远或结合能高于-30kcal/mol的化合物不表征为hERG阻断剂。

　　表7：22种化合物的组的IC50值、结合能及至渗透孔的距离(距Thr623的最短距离)

　　来自表7的三个实例为特别说明性的：乙酰胺苯酚(非hERG阻断剂)、阿司咪唑(强力hERG阻断剂)及BMS-986094(强力HCV复制抑制剂，其造成患者猝死及严重心脏毒性)(Sheridan,2012,「Calamitous HCV trial casts shadow over nucleoside drugs,」Nat.Biotechnol.30,1015-1016)。图26说明乙酰胺苯酚在hERG腔内的结合位置：最低能量结合位置(约-19kcal/mol)在最接近Thr623残基的约内(参见图27)，而最接近Thr623残基中的任一个的结合位置(约)具有极弱结合能(约-7kcal/mol)。因此，乙酰胺苯酚识别为非hERG阻断剂。相比的下，阿司咪唑(参见图28)及BMS-986094(参见图29)具有其在Thr623的内的最低结合能(分别为约-52kcal/mol及约-45kcal/mol)，且因此识别为强力hERG阻断剂。类似于阿司咪唑，BMS-986094与对结合大部分hERG阻断剂至关重要的许多残基相互作用，该残基包括Thr623、Ser624、Val625、Val659、Tyr652及Phe656。

　　为了验证此等计算预测，接着使用PredictorTM分析及使用稳定表现hERG通道的AC10心肌细胞的膜片钳电生理学测试22种化合物的hERG结合(参见图30及图31)。PredictorTM分析探测化合物的置换hERG结合染料的能力，而膜片钳电生理学检查该化合物是否影响通道的电生理学(参见上文)。

　　与计算机模拟预测及先前报导的实验资料一致，除BMS-986094以外的10种已知hERG阻断剂置换hERG结合染料。举例而言，此10个阳性对照组据报导在活体外电生理学及结合分析中阻断hERG，具有与此处获得的彼等IC50值相似的IC50值(Wible等人,2005,「A Novel Comprehensive High-Throughput Screen for Drug-Induced Herg Risk,」J.Pharmacol.Toxicol.Methods 52,136-145)；Deacon等人,2007,「Early Evaluation of Compound QT Prolongation Effects:A Predictive 384-Well Fluorescence Polarization Binding Assay for Measuring HERG Blockade,」J.Pharmacol.Toxicol.Methods 55,238-247；Diaz等人,2004,「The[3H]Dofetilide Binding Assay is a Predictive Screening Tool for HERG Blockade and Proarrhythmia:Comparison of Intact Cell and Membrane Preparations and Effects of Altering[K+]o,」J.Pharmacol.Toxicol.Methods 50,187-199)。相比的下，无已知非hERG阻断剂置换染料，其亦不影响hERG尾电流，意味着阴性对照组并未充分接近地结合至通道渗透孔来阻断(参见图32及图33)。此等结果确认阴性对照组的计算上识别的结合位点并不显著影响hERG功能。

　　7.15实例15：测试化合物及其代谢物的HERG阻断的识别及测试化合物的修改

　　本文所揭示的计算模型及方法用于识别BMS-986094及其代谢物的药物介导的hERG阻断活性。

　　根据先前实例中的方法以计算及实验方式检查BMS-986094及其代谢物(1-萘酚(1-NP)、2-胺基-6-O-甲基-2'C-甲基鸟苷(MG)及鸟苷)。与此等计算方法及模型的结果一致，实验展示BMS-986094为完全置换染料的强力hERG阻断剂(其中IC50＝0.003μM)(参见图30)，但其代谢物对hERG阻断不具有可侦测的影响(参见图32)。为了展示BMS-986094的hERG结合影响电生理学，自动膜片钳展示与吾人的结合数据一致。BMS-986094有力地阻断hERG尾电流(其中IC50＝0.2663μM)，意味着BMS-986094对hERG的阻断为潜在的心脏毒性(参见图31)。相比的下，无BMS-986094代谢物展示hERG腔结合或电生理学变化(参见图33)。此等结果表明BMS-986094但非其代谢物有力地结合至hERG且阻断hERG且提供所报导的心脏毒性的机理解释。就此而言，累积证据展示BMS-986094抑制葡萄糖驱动与脂肪酸驱动粒线体呼吸，其与ATP耗竭、细胞凋亡活化、人类心肌细胞中的mtRNA聚合酶驱动mRNA转录(POLRMT)的抑制一致。认为此等毒性事件归因于存在于BMS-986094中的2'-C-甲基鸟苷残基。然而，根据自本文所揭示的计算模型及方法识别的BMS-986094的较佳结合构形，认为BMS-986094中阻断hERG离子通道的部分为如以下所描绘的悬挂在5员糖左侧的基于胺基酸的前药：

　　使用本文所述的方法，可如实例10中所述修改BMS-986094。举例而言，以上描绘的BMS-986094结构中的基于胺基酸的前药可修改为新前药部分，诸如烷氧烷基(Ciesla等人,2003,「Esterification of Cidofovir with Alkoxyalkanols Increases Oral Bioavailability and Diminishes Drug Accumulation in Kidney,」Antiviral Res.59,163-171；Hostetler,2009,「Alkoxyalkyl Prodrugs of Acyclic Nucleoside Phosphonates Enhance Oral Antiviral Activity and Reduce Toxicity:Current State of the Art,」Antiviral Res.82,A84-98)，如以下实例15a至实例15d中所示：

　　7.16实例16:额外同源蛋白模拟

　　本文所揭示的方法在应用于钠离子信道时可如实例16至实例19中所述执行。

　　如下执行人类Nav1.5的α次单元的同源蛋白模拟。

　　自Uniprot数据库(Magrane等人,2011,「Uniprot Knowledgebase:A Hub of Integrated Protein Data,」数据库2011)下载人类Nav1.5(Uniprot访问代码：Q14524-1)的α次单元的全长胺基酸序列(2016个胺基酸残基)。最初，将完整Nav1.5序列剥离成九个子域，即四个跨膜域(TRM1-TRM4)及五个细胞质域(CYT1-CYT5)。基于ExPASy生物信息资源门户(Artimo等人,2012,「ExPASy:SIB Bioinformatics Resource Portal,」Nucleic Acids Res 40:W597-603)上的ProtParam工具(Wilkins等人,1999,「Protein identification and analysis tools in the ExPASy server,」Methods Mol.Biol.112:531-552)进行剥离。剥离的后，使用基于NavAB细菌钠通道(Payandeh等人,2012,「Crystal Structure of a Voltage-Gated Sodium Channel in two Potentially Inactivated States,」Nature 486:135-139)的I-Tasser生物信息软件(Roy等人,2010,「I-TASSER:a unified platform for automated protein structure and function prediction,」Nat.Protoc.5:725-738)分别产生各子域的10个完整模型作为TRM域的主要模板。NavAB晶体结构表示信道(PDB代码：3RVY、3RVZ、3RW0及4EKW)的关闭未活化状态(Payandeh等人,2011,「The Crystal Structure of a Voltage-Gated Sodium Channel,」Nature 475:353-359)。两个状态的解析的晶体结构极相似，除接近四个S6螺旋的细胞内端的极微小移位的外。VGSC的此两种状态负责结合共同的Nav1.5阻断剂，包括抗心绞痛药雷诺嗪(未活化状态)(Sokolov等人,2013,「Proton-Dependent Inhibition of the Cardiac Sodium Channel Navl.5by Ranolazine,」Front Pharmacol 4:78)及抗心律不整药美西律(关闭状态)(Undrovinas等人,2006,「Ranolazine Improves Abnormal Repolarization and Contraction in Left Ventricular Myocytes of Dogs with Heart Failure by Inhibiting Late Sodium Current,」J Cardiovasc Electrophysiol,17增刊1:S169-S177)。已展示Nav1.5通道的打开状态结合VGSC活化剂(Tikhonov等人,2005,「Sodium Channel Activators:Model of Binding Inside the Pore and a Possible Mechanism of Action,」FEBS Lett 579:4207-4212)及很少阻断剂、诸如抗心律不整氟卡尼(Ramos等人,2004,「State-Dependent Trapping of Flecainide in the Cardiac Sodium Channel,」J Physiol 560:37-49)。已展示氟卡尼强有力地结合至通道的打开活化状态(IC50 7μM)且仅极微弱地结合至关闭/未活化状态(IC50 345μM)。下表8中给出选自主要Nav1.5序列的各子域的胺基酸序列。

　　表8:自主要Nav1.5序列剥离的九个子域的胺基酸序列连同最佳I-Tasser识别模型的I-Tasser产生的TM分值

　　经反复折迭识别组合改进(I-Tasser)的完整同源模拟循环以使用软件LOMET的多折迭识别程序开始，随后在所选择的模板上自PDB解析的NMR或X射线晶体结构的集区比对查询蛋白。在此广泛折迭识别及比对程序的后，使用PSIPRED工具预测查询蛋白域的二级结构。接着组合正确预测的域且经由全始模拟预测未比对区域、诸如环。经由修改的复本交换蒙特卡罗模拟(Monte Carlo simulation)进行结构组合。通过统计以及高能电位导引该模拟。继此的后为产生的模型的最终排序及改进阶段。对于Nav1.5，使用I-Tasser的ModRefiner算法进行最终模型改进(Xu等人,2011,「Improving the Physical Realism and Structural Accuracy of Protein Models by a Two-Step Atomic-Level Energy Minimization,」Biophys J 101:2525-2534)。ModRefiner提高产生的模型的整体质量，产生具有最佳侧链填充及最小空间冲突数目的模型。表8亦展示各域的最佳模型的I-Tasser计算的TM分值且所有TRM域具有高TM分值(>0.5)(Zhang等人,2004,「Scoring Function for Automated Assessment of Protein Structure Template Quality,」Proteins 57:702-710)。认为TRM1的相对低的TM分值系因长环所致(84个残基，Leu276-Ala359)。在将此环并入最终模型中的前，首先切除其且接着通过I-Tasser分别模拟，随后使用短的所有原子溶合的MD模拟(约等于1ns)进行结构改进。最后，通过迭加在NavAb野生型晶体结构(PDB代码：4EKW)上来组装TRM域且再次用片段导引的分子动力学模拟FG-MD改进最终模型(Zhang等人,2011,「Atomic-Level Protein Structure Refinement using Fragment-Guided Molecular Dynamics Conformation Sampling,」Structure 19:1784-1795)。

　　为了加速模拟，通道的N端(CYT1)与C端(CYT5)、失活闸(CYT4)及四个跨膜域(TRM1-TRM4)包括于最终模型中。将人类Nav1.5的已结晶小段添加至模型中而无需修改。自Nav1.5的C端(残基：1773-1940)的钙调蛋白结合主结构的两个可用的X射线晶体结构提取此等结构。在分辨率下解析第一结构(PDB代码：4DCK)(Wang等人,2012,「Crystal Structure of the Ternary Complex of a Nav C-Terminal Domain,a Fibroblast Growth Factor Homologous Factor,and Calmodulin,」Structure 20:1167-1176)及在分辨率下解析第二结构(PDB代码：4JQ0)(Wang等人,2014,「Structural Analyses of Ca(2)(+)/CaM Interaction with NaV Channel C-termini Reveal Mechanisms of Calcium-Dependent Regulation,」Nat Commun 5:4896)。另一晶体结构可用于在原子分辨率下解析的活化闸中的残基1491-1522(PDB代码：4DJC)(Sarhan等人,2012,「Crystallographic basis for calcium regulation of sodium channels,」Proc Natl Acad Sci USA 109:3558-3563)。在最终模型中，在使用Schrodinger软件套件的蛋白制备向导模块进行简单蛋白改进的后包括4DCK及4DJC。自最终模型省略CYT2(残基417-709)与CYT3(941-1198)以加速模拟以及使得与其他同源蛋白的低序列相似性适当。因此，Nav1.5的最终模型包括1465个残基，该残基拓扑地细分成7个子域，即4个跨膜(TRM1、TRM2、TRM3及TRM4)子域与三个细胞质域(CYT1、CYT4及CYT5)。

　　为了实现既定的四倍对称性，基于解析的NavAb晶体结构以顺时针方式组合Nav1.5的四个域。通过如在UCSF嵌合体(Pettersen等人,2004,「UCSF Chimera--a Visualization System for Exploratory Research and Analysis,」J.Comput Chem 25:1605-1612)中所实施使用具有的90％分值二级结构及反复临限值的史密斯-沃特曼局部比对(Smith-Waterman local alignment)(Smith等人,1981,「Identification of Common Molecular Subsequences,」J Mol Biol 147:195-197)算法将该域迭加在4EKW晶体结构上进行组合。作为最终改进步骤且为了移除潜在的严重空间冲突，最后使用Schrodinger中的蛋白制备向导最小化系统，不允许重质原子移动超过

　　由以上实例16中所述的同源模拟产生的hNav1.5的坐标提供于表B中。此等坐标用作以下实例17中所述的MD模拟的输入。

　　7.17实例17：分子动力学模拟

　　使用CHARMM-GUI例程进行MD模拟的系统准备及设置程序以构建膜蛋白。在生理pH 7.4下处理可滴定残基的离子化状态。接着将蛋白嵌入各层中的400个1-十六酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)脂质的双重双层中。使用TIP3P水域的上部(距蛋白的厚度为)与下部(距蛋白的厚度为)水层及150mM离子浓度的NaCl溶液。使用截断来计算短程静电相互作用。粒子网格埃瓦尔德求和方法用于计算长程静电相互作用。使用钠离子与带电羧酸盐相互作用的NBFIX校正。

　　在生产模拟的前将多级加热及平衡阶段应用于模型松弛及改进。首先以50,000个最小化步骤来最小化系统，其中仅脂质尾部自由地移动且该系统的其余部分保持固定。在自系统的其余部分(蛋白与脂质头部)逐渐移除约束的情况下及在水分子与离子自由移动的情况下进行25,000个步骤的四个额外最小化步骤。约束逐渐自100kcal/mol、50kcal/mol、5kcal/mol及1kcal/mol释放。亦约束二面角脂质尾部且该约束逐渐自100kcal/mol、50kcal/mol、5kcal/mol及1kcal/mol释放。接着使用1fs积分时间步长在蛋白骨干上存在1kcal/mol约束的情况下将系统逐渐加热至310K后持续5ns，通过1fs且接着2fs时间步长且在蛋白骨干上存在弱的0.5kcal/mol约束的情况下平衡以持续额外2*10ns模拟。

　　接着使用TRM子域的Cα碳上的0.1kcal/mol约束进行生产模拟100ns。郎的万(Langevin)恒温器(Palovcak等人,2014,「Evolutionary Imprint of Activation:The Design Principles of VSDs,」J Gen Physiol 143:145-156；Tiwari-Woodruff等人,2000,「Voltage-Dependent Structural Interactions in the Shaker K(+)Channel,」J Gen Physiol 115:123-138)及各向异性压力控制用于分别将温度保持在310K及及将压力保持在1巴下。总系统大小为573,763个原子。使用蓝色基因Q超级计算机上的NAMD 2.9进行所有模拟。每隔10ps将原子坐标保存至轨迹。根据以上实例4的方法论计算原子波动(B因子)及对参考结构的均方根偏差(RMSD)。

　　图34显示Nav1.5的产生的模型的无约束MD快照的3D结构的侧视图及俯视图。该图展示通道的整体架构，其由三个区域组成：细胞外、细胞内及跨膜。自膜的细胞内(细胞质)侧，经由细胞质子域连接跨膜子域。相对于由在四个域上方张开的四个DEKA序列组成的选择性过滤器区域包覆四个域。此DEKA序列对应于同源四聚体细菌NavAb离子通道模板中的EEEE序列。

　　图35展示Nav1.5的产生的模型的无约束MD快照的3D结构的俯视图。如此图中可见，已在负电位区域中的内选择性过滤器内捕获钠离子(如通过线性化泊松-波兹曼算法确认及测试)。对于产生的模型，严格评估其将选择性过滤器残基并入校正位置、即并入连接P1-P2螺旋的短转角区域的能力。就此而言，组合域展现在四个域Asp372(DI)、Glu898(DII)、Lys1419(DIII)及Ala1711(DIV)上方张开的四个选择性过滤器残基的特征顺时针配置。

　　接着根据以上实例5的方法论执行MD轨迹的反复丛集以提取Nav1.5的优势构形。使用此方法论，如图36中所示识别细胞内VGSC通道的十一(11)个相异构形。

　　7.18实例18：对接、结合自由能计算及最高命中的重新计分

　　随后执行对接模拟。测试三种市售心血管药物：(1)一种具有5.9μM IC50的强Nav1.5阻断剂(雷诺嗪，抗心绞痛药)(Sokolov等人,2013,「Proton-Dependent Inhibition of the Cardiac Sodium Channel Navl.5by Ranolazine,」Front Pharmacol 4:78)；(2)一种具有300μM IC50的弱阻断剂(多非利特(Dofetilide)，抗心律不整药)(Roukoz等人,2007,「Dofetilide:a New Class III Antiarrhythmic Agent,」Expert Rev Cardiovasc Ther 5:9-19)；及(3)一种已知Nav1.5非阻断剂(纳多洛尔(Nadolol)，抗高血压)(Wang等人,2010,「Propranolol Blocks Cardiac and Neuronal Voltage-Gated Sodium Channels,」Front Pharmacol 1:144)。以下提供此三个化合物的化学结构：

　　针对所选择的十一(11)个优势构形对接该化合物。使用Schrodinger套件的滑移对接模块(滑移SP)的标准精度模式进行对接。经由由各配位体的三个短200ps MD模拟产生的60个快照用AMBER-MMGBSA重新计分名列第一的姿态。下表9中给出对接及计分结果。

　　表9：来自针对Nav1.5的一些所选择的化合物的对接及结合能分值

　　如表9中所示，该模型能够正确识别雷诺嗪为名列第一的化合物。对所选择的快照的AMBER/GBSA基于所选择的化合物的相应IC50值提升其排序，以使得再现以实验方式观测到的活性趋势(雷诺嗪>多非利特>纳多洛尔)。

　　如图37中所示，雷诺嗪在通道的选择性过滤器下方直接结合且形成与DIV的S6中的疏水性残基(F1760、Y1767)的直接相互作用，已展示该残基对于结合共同的Nav1.5阻断剂(包括雷诺嗪)极为重要(Wang等人,1998,「A Common Local Anesthetic Receptor for Benzocaine and Etidocaine in Voltage-Gated Mu1Na+Channels,」Pflugers Arch.435:293-302)。如图37中所示，雷诺嗪形成与F1760的直接、夹层型π-π堆栈相互作用及与Y1767的倾斜T状型π-π堆栈相互作用。

　　7.19实例19：通道阻断的分类及将化合物重新设计为非阻断剂

　　对于hERG离子信道，如以上实例9中所述执行将化合物分类为「阻断剂」，例如阻断hNav1.5离子通道的化合物；或分类为「非阻断剂」，例如不阻断hNav1.5离子通道的化合物。

　　对于hERG离子信道，如以上实例10中所述执行将hNav1.5离子通道阻断剂重新设计为非阻断剂。

　　7.20实例20：额外同源蛋白模拟

　　本文所揭示的方法在应用于钙离子信道时可如实例20至实例23中所述来执行。

　　如下执行人类Cav1.2的α-1次单元的同源蛋白模拟。

　　自Uniprot数据库(Magrane等人,2011,「Uniprot Knowledgebase:A Hub of Integrated Protein Data,」数据库2011)下载人类Cav1.2(Uniprot访问代码：Q13936)的α-1次单元的全长胺基酸序列(2138个胺基酸残基)。最初，将完整Cav1.2序列剥离成子域、跨膜域及细胞质域。基于ExPASy生物信息资源门户(Artimo等人,2012,「ExPASy:SIB Bioinformatics Resource Portal,」Nucleic Acids Res 40:W597-603)上的ProtParam工具(Wilkins等人,1999,「Protein identification and analysis tools in the ExPASy server,」Methods Mol.Biol.112:531-552)进行剥离。剥离的后，使用基于NavAB细菌钠通道(Payandeh等人,2012,「Crystal Structure of a Voltage-Gated Sodium Channel in two Potentially Inactivated States,」Nature 486:135-139)的I-Tasser生物信息软件(Roy等人,2010,「I-TASSER:a unified platform for automated protein structure and function prediction,」Nat.Protoc.5:725-738)分别产生各子域的完整模型作为跨膜结构域的主要模板。NavAB晶体结构表示信道(PDB代码：3RVY、3RVZ、3RW0及4EKW)的关闭未活化状态(Payandeh等人,2011,「The Crystal Structure of a Voltage-Gated Sodium Channel,」Nature 475:353-359)。用于模型Cav1.2的模板NavAB晶体结构的坐标提供于表C中。

　　7.21实例21：分子动力学模拟

　　如本文所述例如根据以上实例3及实例17的方法论执行MD模拟。

　　接着根据以上实例5的方法论执行MD轨迹的反复丛集以提取hCav1.2的优势构形。使用此方法论识别细胞内hCav1.2通道的相异构形。

　　7.22实例22：对接、结合自由能计算及最高命中的重新计分

　　针对所选择的优势构形对接根据以上实例2的方法论制备的化合物。使用Schrodinger套件的滑移对接模块(滑移SP)的标准精度模式进行对接。通过AMBER-MMGBSA重新计分名列第一的姿态。

　　7.23实例23：通道阻断的分类及将化合物重新设计为非阻断剂

　　对于hERG离子信道，如以上实例9中所述执行将化合物分类为「阻断剂」，例如阻断hCav1.2离子通道的化合物；或分类为「非阻断剂」，例如不阻断hCav1.2离子通道的化合物。

　　对于hERG离子信道，如以上实例10中所述执行将hCav1.2离子通道阻断剂重新设计为非阻断剂。

　　7.24实例24：对化合物选择的计算

　　图38描绘用于选择具有降低心脏毒性风险的化合物的网格计算环境。如图38中所示，用户计算机1302可经由多个方式、诸如经由一或多个网络1304与网格计算环境1306交互。网格计算环境1306可辅助使用者选择具有降低心脏毒性风险的化合物。

　　一或多个数据储存1308可储存待由网格计算环境1306分析的数据以及由网格计算环境产生的任何中间或最终数据。然而在某些实施例中，网格计算环境1306的结构设计允许执行其操作以使得中间及最终数据结果可仅储存于挥发性内存(例如RAM)中，而不要求中间或最终数据结果储存至非挥发性类型的内存(例如磁盘)。

　　此可适用于某些情况，诸如在网格计算环境1306自使用者接收特别查询时及在需要在传输过程中产生由处理大量数据产生的响应时。在此非限制性情况下，网格计算环境1306经结构设计以将经处理的信息保留在网格内存内以使得可以不同细节水平为使用者产生响应以及允许用户针对此信息进行交互式查询。

　　举例而言，网格计算环境1306接收描述离子信道蛋白的结构的结构信息且执行蛋白结构的分子动力学模拟。接着，网格计算环境1306使用丛集算法以自分子动力学模拟识别蛋白结构的优势构形且选择由该丛集算法识别的蛋白结构的优势构形。另外，网格计算环境1306接收描述一或多种化合物的构形异构体的结构信息且使用对接算法来对接一或多种化合物的构形异构体与优势构形。网格计算环境1306进一步识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形，且使用分子动力学模拟优化较佳结合构形以便判定该化合物在较佳结合构形中是否阻断蛋白的离子通道。

　　具体言的，响应于使用者关于化合物心脏毒性的查询，网格计算环境1306在不需要OLAP或关系数据库环境的情况下自数据储存1308聚集蛋白结构信息及化合物结构信息。接着网格计算环境1306使用所接收的蛋白结构信息来执行分子动力学模拟以确定靶蛋白可挠性的构形(例如历经大于50ns的模拟时长)。分子动力学模拟涉及基于近似分子内力的经验力场确定作用于原子上的力的网格计算环境1306，其中执行数值积分以更新原子的位置及速度。网格计算环境1306将基于原子的更新位置及速度形成的分子动态轨迹丛集成蛋白的优势构形，且执行对接算法，其使用化合物的结构信息以便对接化合物的构形异构体与蛋白的优势构形。基于与对接化合物的构形异构体相关的信息，网格计算环境1306识别蛋白与化合物的各组合的多个较佳结合构形。若化合物在较佳结合构形中不阻断蛋白的离子通道，则网格计算环境1306预测该化合物具有降低的心脏毒性风险。否则，网格计算环境1306预测化合物为心脏毒性且重新设计该化合物以便降低心脏毒性风险。

　　图39说明网格计算环境1306的硬件及软件组件。如图39中所示，网格计算环境1306包括中央协调器软件组件1406，其在根数据处理器1404上操作。网格计算环境1306的中央协调器1406与用户计算机1402及节点协调器软件组件(1412、1414)连通，节点协调器软件组件在网格计算环境1306内含有的其自身独立数据处理器(1408、1410)上执行。

　　作为实施环境的一实例，网格计算环境1306可包含多个刀锋服务器，且中央协调器1406及节点协调器(1412、1414)与其自身刀锋服务器相关。换言的，中央协调器1406及节点协调器(1412、1414)在其自身各别刀锋服务器上执行。在一些实施例中，各刀锋服务器含有多个核心且线程与属于节点处理器(例如节点处理器1408)的核心相关且在其上执行。网络将各刀锋服务器连接在一起。

　　中央协调器1406包含网格上的节点。举例而言，可能存在100个节点，其中仅指定50个节点作为节点协调器来运行。网格计算环境1306将运行中央协调器1406作为第51个节点，且自网格内随机选择中央协调器节点。因此，中央协调器1406具有与节点协调器相同的硬件结构设计。

　　中央协调器1406可接收信息且为用户提供关于使用者已提交至网格的查询的信息。中央协调器1406亦负责与50个节点协调器节点连通，诸如通过发送关于做什么的彼等指令以及接收及处理来自节点协调器的信息。在一个实施中，中央协调器1406为客户端的相对于网格的中央接触点，且使用者从未与节点协调器中的任一个直接连通。

　　相对于涉及中央协调器1406的数据传送，中央协调器1406与客户端(或另一来源)连通以获得待处理的输入数据。中央协调器1406划分输入数据且传送输入数据的校正部分以选路至节点协调器。中央协调器1406亦可产生随机数目由节点协调器用于模拟操作以及自该节点协调器聚集任何处理结果。中央协调器1406管理节点协调器，且各节点协调器管理在其各别机器上执行的线程。

　　节点协调器为线程分配与线程相关的内存。相关线程为与节点协调器处于相同物理刀锋服务器中的彼等线程。然而，应理解，可使用其他结构设计，诸如多个节点协调器处于相同刀锋服务器中以管理在服务器上操作的不同线程。类似于刀锋服务器内的节点协调器管理及控制操作，中央协调器1406在底盘内管理及控制操作。

　　在某些实施例中，节点处理器包括供节点协调器及其线程使用的共享内存。结构化网格计算环境1306来进行其操作(例如矩阵操作等)，以使得与在不同刀锋上运行的线程的间执行数据传送对比，在一个刀锋服务器内发生尽可能多的数据传送(亦即经由其节点上的共享内存在线程的间)。经由共享内存的该数据传送比涉及与另一刀锋服务器连接的数据传送更有效。

　　图40描绘由化合物选择系统使用的数据结构的实例示意图。多个数据结构储存于数据储存1500中，包括蛋白结构信息数据结构1502、候选化合物结构信息数据结构1504、结合构形数据结构1506、分子动力学模拟数据结构1508、优势构形数据结构1510、丛集数据结构1512及心脏毒性分析数据结构1514。此等相关数据结构可通过自个别节点聚集资料成为中央协调器1406的一部分。然而，可按需要分布此等数据结构的部分，以使得个别节点可储存过程数据。数据储存1500可为不同类型的储存装置及程序构造(例如RAM、ROM、闪存、平面文件、数据库、程序数据结构、程序变量、IF-THEN(或相似类型)表述构造等)。举例而言，数据储存1500可为单个关系数据库或可为分布式网络中驻留在服务器上的数据库。

　　具体言的，蛋白结构信息数据结构1502经结构设计以储存与钾离子信道蛋白的结构相关的数据，例如不同原子的间的特殊关系数据。与钾离子信道蛋白的结构相关的数据可自同源模型、NMR溶液结构、X射线晶体结构、分子模型等获得。可对储存于蛋白结构信息数据结构1502中的数据执行分子动力学模拟。举例而言，分子动力学模拟涉及根据物理学法则来求解运动方程式，例如允许蛋白内的化学键挠曲、旋转、弯曲或振动。自分子动力学模拟获得关于给定分子/原子的位置及速度方面的时间依赖性及波动量值的信息。举例而言，与分子/原子的坐标及速度相关的数据在相等时间间隔或采样间隔下自分子动力学模拟获得。基于由分子动力学模拟所得的分子/原子的位置及速度形成原子级轨迹数据(例如在不同时间片下)且将其储存于分子动力学模拟数据结构1508中。分子动力学模拟可具有任何持续时间。在某些实施例中，分子动力学模拟的持续时间大于50ns，例如较佳大于200ns。

　　使用丛集算法处理储存于分子动力学模拟数据结构1508中的数据，且将相关丛集群数据储存于丛集数据结构1512中。至少部分基于储存于分子动力学模拟数据结构1508中的数据及储存于丛集数据结构1512中的相关丛集群资料来识别钾离子通道蛋白的优势构形。将与所识别的优势构形相关的原子级轨迹数据(例如在不同时间片下)储存于优势构形数据结构1510中。

　　处理储存于候选化合物结构信息数据结构1504中的数据以及与储存于优势构形数据结构1510中的钾离子通道蛋白的优势构形相关的资料。使用对接算法(例如DOCK、AutoDock等)将一种或多种化合物的构形异构体对接至钾离子信道蛋白的结构的优势构形，以测定与钾离子通道蛋白与化合物的各种组合相关的数据且将其储存于结合构形数据结构1506中。举例而言，该化合物为抗病毒剂(例如C型肝炎抑制剂)。作为一实例，结合构形数据结构包括与结合能相关的数据。可将化合物的2D信息翻译成待储存于候选化合物结构信息数据结构1504中的3D代表性结构以用于对接。使用丛集算法处理储存于结合构形数据结构1506中的数据，且将相关丛集群数据储存于丛集数据结构1512中。至少部分基于储存于结合构形数据结构1506中的数据及储存于丛集数据结构1512中的相关丛集群数据来识别一或多个较佳结合构形。举例而言，较佳结合构形包括具有最大丛集群及最低结合能的彼等结合构形。

　　使用可扩充的分子动力学模拟(例如经由NAMD软件等)优化所识别的较佳结合构形。在某些实施例中，计算(例如使用挽救模型等)相应优化较佳结合构形中的蛋白与化合物(受体与配位体)的各组合的结合能。输出所计算的结合能作为蛋白与化合物的各组合的预测的结合能。

　　心脏毒性分析数据结构1514包括与例如较佳结合构形中的一或多种化合物的阻断程度相关的资料。举例而言，储存于心脏毒性分析数据结构1514中的数据报括阻断位点及非阻断位点的识别。储存于心脏毒性分析数据结构1514中的数据在(i)hERG通道内的口袋分类为阻断部位且(ii)配位体在口袋内适合且处于预定结合亲和力水平内时指示潜在的心脏危险。储存于心脏毒性分析数据结构1514中的数据在配位体结合至hERG通道内分类为非阻断部位的口袋时不指示潜在的心脏危险。在一些实施例中，若化合物在较佳结合构形中不阻断离子通道(例如阻断程度低于临限值)，则预测该化合物具有降低的心脏毒性风险且可选择该化合物。在其他实施例中，若化合物在较佳结合构形中阻断离子通道(例如阻断程度高于临限值)，则预测该化合物为心脏毒性。分子模拟算法可用于化学修改或重新设计化合物以便降低心脏毒性风险(例如用以降低阻断程度)。

　　系统可经结构设计以使得可在独立计算机上提供化合物选择系统2102以供用户2104撷取，诸如图41中的2100处所展示。

　　另外，可通过包含可由装置处理子系统执行的程序指令的程序代码在许多不同类型的处理装置上实施本文所述的方法及系统。软件程序指令可包括源代码、目标程序代码、机器程序代码或任何其他储存的数据，其可操作以使处理系统执行本文所述的方法及操作。然而，亦可使用其他实施，诸如经结构设计以进行本文所述的方法及系统的韧体或甚至适当设计的硬件。

　　系统及方法的数据(例如关联、映像、数据输入、数据输出、中间数据结果、最终数据结果等)可在一或多个不同类型的计算机实施的数据储存中储存及实施，诸如不同类型的储存装置及程序构造(例如RAM、ROM、闪存、平面文件、数据库、程序数据结构、程序变量、IF-THEN(或相似类型)表述构造等)。应注意，数据结构描述用于在数据库、程序、内存或由计算机程序使用的其他计算机可读媒体中组织及储存数据的格式。

　　可在许多不同类型的计算机可读媒体上提供系统及方法，该计算机可读媒体包括含有用于由处理器执行已执行方法操作及实施本文所述的系统的指令(例如软件)的计算机储存机构(例如CD-ROM、磁盘、RAM、闪存、计算机的硬盘机等)。

　　本文所述的计算机组件、软件模块、函数、数据储存及数据结构可彼此直接或间接连接以便允许其操作所需的数据流动。亦应注意，模块或处理器包括(但不限于)执行软件操作的代码单元，且可例如作为代码的次例程单元、或作为代码的软件功能单元、或作为目标(如在目标定向的范式)、或作为小应用程序、或在计算机脚本语言中、或作为另一类型的计算机代码来实施。软件组件及/或功能件可视迫切情况而定位于单个计算机上或跨越多个计算机分布。

　　计算系统可包括客户端及服务器。客户端与服务器一般远离彼此且通常经由通信网路交互。客户端与服务器的关系藉助于在各别计算机上运行且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序产生。

　　虽然本说明书含有许多特性，此等特性不应理解为限制范畴或可能主张的内容，而是应理解为对特异于特定实施例的特征的描述。本说明书的上下文或独立实施例中所述的某些特征亦可在单个实施例中以组合形式实施。相反地，在单个实施例的上下文中所述的各种特征亦可在多个实施例中独立或以任何适合子组合形式来实施。此外，尽管上文可能将特征描述为以某些组合起作用且甚至最初主张如此，但来自所主张的组合的一或多个特征在某些状况下可自该组合删除，且所主张的组合可针对子组合或子组合的变化。

　　类似地，虽然以特定次序在图式中描绘操作，但不应将此理解为要求以所展示的特定次序或以连续次序执行该操作或执行所有说明的操作来实现合乎需要的结果。在某些情况下，多任务处理及并行处理可为有利的。此外，上述实施例中的各种系统组件的分离不应理解为在所有实施例中要求该分离，且应理解，所述程序组件及系统一般可一起整合于单个软件产品中或封装至多个软件产品中。

　　因此，已描述特定实施例。其他实施例在以下申请专利范围的范畴内。举例而言，可以不同次序执行申请专利范围中所述的动作且仍实现合乎需要的结果。

　　本说明书中所引用的所有公开案及专利申请案以引用的方式并入本文中，就如同各个别公开案或专利申请案特定地且个别地指示以引用的方式并入一般。尽管已出于清楚理解的目的借助于说明及实例相当详细地描述前文，但根据本说明书的教示，对于一般技术者将易于显而易见的是，可在不脱离所附申请专利范围的精神或范畴的情况下对其作出某些改变及修改。

　　表A

　　表B

　　表C