成人AML危险度分层和临床预后评估试剂盒及CPNE3的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及急性髓系白血病基因的检测、急性髓系白血病危险度分层或临床预后评估，特别是涉及成人急性髓系白血病基因的检测、基因芯片和试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性极强的恶性血液病，占成人急性白血病的80％左右(参见MROZEK K,HEEREMA N A,BLOOMFIELD C D.,Cytogenetics in acute leukemia[J].Blood reviews,2004,18(2):115-36)，它包括许多具有不同遗传异常状况和临床特征的实体，预后具有高度的异质性。在NCCN(NationalComprehensive Cancer Network)危险度分层指南中，约有一半以上的AML被分在中危组(包括全部的正常核型急性髓系白血病Cytogenetically Normal AML,CN-AML)，现有技术缺乏用于危险度分层和临床预后评估的有效标志物，因此，目前临床上AML的分层诊断及个体化治疗非常困难，亟待找到有效的预后标志物来确认此类患者治疗的强度，以实现精准的个体化治疗，避免一部分预后良好的患者治疗强度过大，带来众多不必要的并发症，同样也避免另一部分预后不良的患者治疗强度不足，最终导致白血病复发。
有一部分AML内部存在致病的基因突变，这些基因突变具有对AML患者进行危险度分层和临床判断预后的价值，例如携带FLT3-ITD(参见WHITMAN S P,MAHARRY K,RADMACHERM D,et al.FLT3internal tandem duplication associates with adverse outcome andgene-and microRNA-expression signatures in patients 60years of age or olderwith primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia:a Cancer andLeukemia Group B study[J].Blood,2010,116(18):3622-6)的正常核型AML患者属于高危组，而携带NPM1突变(参见DOHNER K,SCHLENK R F,HABDANK M,et al.Mutantnucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acutemyeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutation[J].Blood,2005,106(12):3740-6)、CEBPA双突变(参见PASTORE F,KLING D,HOSTER E,etal.Long-term follow-up of cytogenetically normal CEBPA-mutated AML[J].Journalof hematology&oncology,2014,7)的患者具有相对较低的危险度和较好预后。CN104508143A公开了用于诊断、预测、治疗和处理急性髓系白血病的方法，该方法涉及预测患有急性髓系白血病患者的生存率，包括：分析从所述患者分离的遗传样品是否存在细胞遗传学异常，以及在基因FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WTI、IDHI、IDH2、KIT、RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突变。
发明内容
本发明的目的是提供一种敏感性高，通用性好，特异性强的标志物，来检测成人(<60岁)急性髓系白血病细胞或组织样品，来辅助判断成人AML患者的危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估，是基于以下的考虑：(1)基因突变不能覆盖所有的AML，而基因表达可以覆盖所有的AML患者；(2)AML发生、发展的分子机理目前仍不清楚，寻求新的临床预后标志物有助于理解AML的发病机理，并且能为AML的精准靶向治疗奠定基础。
本发明人发现CPNE3(也称作Copine III,钙依赖膜结合蛋白3或钙依赖性磷脂结合蛋白)高表达可提示成人(年龄<60岁)急性髓系白血病的不良预后。因此，本发明提供CPNE3作为标志物，用来辅助进行成人急性髓系白血病危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估，其敏感性高，通用性好，特异性强，因此能用来制备成人急性髓系白血病危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的基因芯片或试剂盒，或者用来制备检测成人急性髓系白血病细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的基因芯片或试剂盒，帮助成人AML患者的危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估。在本发明中“成人”指年龄小于60岁的成人。
一方面，本发明提供一种检测钙依赖膜结合蛋白3表达高低的方法，特征在于，使用钙依赖膜结合蛋白3基因的引物对或者探针在成人急性髓系白血病细胞或组织样品中检测钙依赖膜结合蛋白3表达高低。。所述检测包括体外检测，包括非诊断目的检测。通过检测CPNE3的表达高低来对成人AML患者进行危险度分层，来进行异基因造血干细胞移植前评估，并分析临床预后。CPNE3高表达的成人AML具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有进行异基因造血干细胞移植的预期。CPNE3低表达的成人AML具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要行异基因造血干细胞移植治疗。
第二方面，本发明提供一种用于检测成人急性髓系白血病细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的的试剂盒，特征在于，其中包含钙依赖膜结合蛋白3基因的引物对或者探针。所述试剂盒用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估。
第三方面，本发明提供一种用于检测成人急性髓系白血病细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的的基因芯片，特征在于，其中包括固相载体和CPNE3基因的引物对或者探针。所述基因芯片用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估。
进一步地，本发明提供了CPNE3基因的引物对或者探针在制备通过检测CPNE3的表达高低而对成人急性髓系白血病进行危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。
本发明还提供了CPNE3基因在设计或制备用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估的试剂、试剂盒或基因芯片中的用途。
本发明还提供了CPNE3在筛选或制备用于治疗成人急性髓系白血病的药物中的用途。
在很多方面能利用成人AML细胞或组织中CPNE3表达高低的检测和鉴定信息。例如，可辅助评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后，是否进行异基因造血干细胞移植等)。此外，CPNE3基因表达谱(或个体基因)允许筛选抑制成人AML表达谱或将不良预后谱转变成更好的预后谱的药物候选物。
本发明也提供了测定成人AML受试者的预后的方法，其包括，测量来自受试者的受试样品中CPNE3基因产物的表达水平(其与成人AML的特定预后例如好的或积极的预后、差的或不利的预后相关)。根据这些方法，与对照样品中相应的CPNE3基因产物的表达水平相比，受试样品中与特定预后相关的CPNE3基因产物水平的改变，指示受试者患有具有特定预后的成人AML。CPNE3基因产物表达高与不利(即，差)预后相关。不利预后的实例包括、但不限于，低存活率和疾病快速进展。通过检测CPNE3的表达高低来对成人AML患者进行危险度分层，来进行异基因造血干细胞移植前评估，并分析临床预后。CPNE3高表达的成人AML具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有进行异基因造血干细胞移植的预期。CPNE3低表达的成人AML具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要行异基因造血干细胞移植治疗。在本发明的一个具体实施方案中，提供一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，特征在于，使用CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3。
在本发明的另一个具体实施方案中，提供一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，特征在于，使用CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER cgccatggagtttctggatg SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ttctgttgtttcgtggctgg SEQ ID NO：6。
在本发明的又一个具体实施方案中，提供一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，特征在于，使用CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER tgccatctctcaccccaaat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER tgactgggcaaagatggact SEQ ID NO：9。
在本发明的再一个具体实施方案中，提供一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，特征在于，使用CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER tatatcggagtgacggtgcc SEQ ID NO：11
RIGHT PRIMER gcataagtagcaatggggcc SEQ ID NO：12
在本发明提供的一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的试剂盒的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cgccatggagtttctggatg SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ttctgttgtttcgtggctgg SEQ ID NO：6
第三组引物对：
LEFT PRIMER tgccatctctcaccccaaat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER tgactgggcaaagatggact SEQ ID NO：9
或者
第四组引物对：
LEFT PRIMER tatatcggagtgacggtgcc SEQ ID NO：11
RIGHT PRIMER gcataagtagcaatggggcc SEQ ID NO：12。
所述试剂盒用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人
AML预后评估。
在本发明提供的一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的基因芯片的一个具体实施方案中，所述基因芯片包括固相载体和CPNE3基因的引物对，所述引物对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cgccatggagtttctggatg SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ttctgttgtttcgtggctgg SEQ ID NO：6
第三组引物对：
LEFT PRIMER tgccatctctcaccccaaat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER tgactgggcaaagatggact SEQ ID NO：9
或者
第四组引物对：
LEFT PRIMER tatatcggagtgacggtgcc SEQ ID NO：11
RIGHT PRIMER gcataagtagcaatggggcc SEQ ID NO：12。
所述基因芯片用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估。
因此，优选地，本发明也提供了一组引物对，特征在于，其序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cgccatggagtttctggatg SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ttctgttgtttcgtggctgg SEQ ID NO：6
第三组引物对：
LEFT PRIMER tgccatctctcaccccaaat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER tgactgggcaaagatggact SEQ ID NO：9
或者
第四组引物对：
LEFT PRIMER tatatcggagtgacggtgcc SEQ ID NO：11
RIGHT PRIMER gcataagtagcaatggggcc SEQ ID NO：12。
在本发明优选的技术方案中提供了一组引物对，所述引物是SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3。
本发明还提供了一种基因芯片，特征在于，其包括固相载体和上述引物对SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列。本发明也提供了一种试剂盒，其包含上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列。本发明上述引物对SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒用于检测细胞或组织中钙依赖膜结合蛋白3的表达高低。在本发明的一个更优选具体实施方案中，上述引物对、基因芯片、试剂盒用于诊断或非诊断目的检测成人急性髓系白血病细胞或组织中钙依赖膜结合蛋白3的表达高低，用于辅助进行成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估。
本发明还提供了一种检测细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。在本发明的一个优选具体实施方案中，提供了一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。在本发明的一个更优选具体实施方案中，提供了一种非诊断目的的检测成人急性髓系白血病细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。所述检测钙依赖膜结合蛋白3表达高低是对离体细胞或组织样品的检测，包括非诊断目的的检测。
本发明提供了引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列在制备通过检测钙依赖膜结合蛋白3的表达高低而对成人急性髓系白血病患者进行危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。
更优选地，本发明提供了用于检测成人AML细胞或组织样品中CPNE3的表达高低的一组引物对，其序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3。
在一个具体实施方案中，所述CPNE3的序列是SEQ ID NO：1,4884bp。PCR扩增产物大小是203，产物序列是SEQ ID NO：4。
优选地，本发明提供了上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列在制备用于检测成人急性髓系白血病细胞或组织中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的基因芯片或试剂盒中的用途。
优选地，本发明提供了一种非诊断目的的检测成人AML细胞或组织样品中钙依赖膜结合蛋白3表达高低的方法，特征在于，使用本发明的CPNE3引物对，基因芯片或试剂盒；更优选地，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。更优选地，所述检测钙依赖膜结合蛋白3表达高低是非诊断目的的，是对离体细胞或组织样品的检测。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于通过检测CPNE3的表达高低而对成人急性髓系白血病患者进行危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的一组引物对，其序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER agactcccacgaaactcagg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER ctgtgcgctcaacctcatac SEQ ID NO：3。
所述CPNE3的序列是SEQ ID NO：1。PCR扩增产物大小是203，产物序列是SEQ IDNO：4。
在本发明一个具体实施方案中，提供了包含上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3或者它们的互补序列的用于通过检测成人AML细胞或组织样品中CPNE3的表达高低而对成人急性髓系白血病患者进行危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的基因芯片或试剂盒。本发明还提供了序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列的引物在制备通过检测成人AML细胞或组织样品中CPNE3的表达高低而对成人急性髓系白血病患者进行危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。
在上面的具体实施方案中，使用的引物对可以用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6代替，PCR扩增产物大小是222，扩增产物序列是SEQ ID NO：7。使用的引物对还可以是SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9，PCR扩增产物大小是158，扩增产物序列是SEQ ID NO：10。使用的引物对还可以是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，PCR扩增产物大小是223，扩增产物序列是SEQID NO：13。SEQ ID NO：1是CPNE3的序列，4884bp。
进一步地，本发明还提供了CPNE3基因在设计或制备用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
进一步地，本发明还提供了CPNE3基因的引物对或探针在设计或制备用于成人AML危险度分层或成人AML异基因造血干细胞移植前评估或成人AML预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
进一步地，本发明提供了CPNE3在筛选或制备用于治疗成人急性髓系白血病的药物中的用途。
本发明钙依赖膜结合蛋白3基因的引物对序列或者它们的互补序列、包含载体和CPNE3引物对或探针的基因芯片、包含CPNE3引物对或探针的试剂盒、检测成人急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，可以用于临床或非临床检测CPNE3表达水平，可以用于诊断或非诊断目的。可以利用本发明提供的CPNE3基因引物对、基因芯片、试剂盒，检测急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法，通过对成人AML患者的细胞或组织样品检测CPNE3的表达高低来对成人AML患者进行危险度分层，进行异基因造血干细胞移植前评估，对成人AML患者分析临床预后。CPNE3高表达的成人AML患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有进行异基因造血干细胞移植的预期。CPNE3低表达的成人AML患者具有较低的危险度分层和较好的临床预后，只需化疗就可以，不需要行异基因造血干细胞移植治疗。本发明提供的CPNE3基因引物、基因芯片、试剂盒以及检测急性髓系白血病细胞或组织中CPNE3表达高低的方法还可以用于非临床或非诊断目的，包括但不限于实验室研究，细胞培养或组织培养中CPNE3的检测，血液制品检测、标准控制等等。
本发明CPNE3基因的引物对或探针可以通过本领域技术人员公知的方法进行设计，可以通过本领域公知的生物或化学合成技术制备本发明的引物或探针。基因芯片所用固相载体、基因芯片的制备方法和试剂盒的制备是本领域公知技术。可使用多种本领域技术人员熟知的技术测量基因产物的表达水平。例如使用RNA印迹分析，Northern Blot，Southern Blot，WesternBlot，或者荧光定量PCR检测，检测受试样品中基因产物的水平低于对照样品中相应的基因产物的水平，或者受试样品中基因产物的水平高于对照样品中相应的基因产物的水平。
附图简要描述
图1所示是CPNE3在成人AML和CN-AML患者组织样品中的预后分析。
图1A所示是在成人AML和NCCN中危组患者组织样品中对CPNE3表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率；横坐标是生存时间(月)。
图1B所示是在成人AML和NCCN中危组患者组织样品中对CPNE3表达水平进行无事件生存率分析。纵坐标是无事件生存率；横坐标是生存时间(月)。
图1C所示是在成人CN-AML和欧洲白血病协作组危险度分层(ELN)中危-I组患者组织样品中分别对CPNE3表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率；横坐标是生存时间(月)。
图1D所示是在成人CN-AML和ELN中危-I组患者组织样品中分别对CPNE3表达水平进行无事件生存率分析。纵坐标是无事件生存率；横坐标是生存时间(月)。
图2所示是在成人AML患者组织样品中化疗、移植两种治疗策略及CPNE3表达高低组的预后分析。
图2A所示是在成人AML患者组织样品中分别对CPNE3表达水平高低组、移植和化疗组进行总生存率分析。纵坐标是总生存率；横坐标是生存时间(月)。
图2B所示是在成人AML患者组织样品中分别对CPNE3表达水平高低组、移植和化疗组进行无事件生存率分析。纵坐标是无事件生存率；横坐标是生存时间(月)。
具体实施方式
CPNE3引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以实时荧光定量PCR检测CPNE3表达高低。实时荧光定量PCR常用的荧光染料有Taqman探针、SYBR Green I等。SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。本发明主要采用SYBR Green I进行实时荧光定量PCR检测。
实施例1总RNA的提取
实验操作中，与RNA提取及检测有关的微量移液器、Tip枪尖、EP管等均需经过无RNase处理。
1、裂解细胞：向收集的细胞沉淀中加入1ml的QIAZOL试剂，振荡器震荡混匀，室温作用15分钟以上使其充分裂解。若加入QIAZOL试剂后不能立刻提取RNA，可将其放入-20℃保存，短期内可用。
2、按照氯仿：QIAZOL体积比为1:4的比例，加入约300μl氯仿，上下颠倒混匀1分钟，室温静置5-10分钟，低温离心：4℃，12600rpm离心10分钟。
3、离心完毕后，EP管内液体分三层，上层为含有RNA的上清液，中下层为DNA和蛋白质。然后，将上清液转移至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，低温静置10分钟，离心：4℃，12600rpm离心15分钟。
4、弃上清，白色沉淀即为RNA，加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻颠倒混匀，常温离心：8000rpm离心5分钟。
5、溶解RNA：去上清，并将EP管倒扣于吸水纸上，吸干管口。再于离心机上空甩几秒，用加样枪将剩余的酒精全部吸出，风干3-5分钟。加入一定体积的无核酸酶的水溶解RNA。
6、紫外分光光度计检测RNA浓度。提取得到的RNA放-20℃保存，一个月内可用；置于-80℃则可保存相对较长时间。
实施例2RNA反转录
1、按照表1配制反转录体系，总反应体积为25μl(总RNA量为1μg)。以下操作均在冰上进行：
表1反转录体系的配制
2、将以上各反应组分配制到0.2ml的PCR反应管中后，放入PCR仪中进行逆转录反应，程序为37℃，2h；4℃，forever。反应结束后得到的产物即为cDNA，将反应产物取出后放于-20℃保存待用。
实施例3实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因钙依赖膜结合蛋白3基因SEQ ID NO：1的引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3和内参GAPDH的引物(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：4,PCR扩增产物大小是203。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2 real time PCR mix的配制
实施例4实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因钙依赖膜结合蛋白3基因SEQ ID NO：1的引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6和内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：7,PCR扩增产物大小是222。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2 real time PCR mix的配制
实施例5实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因钙依赖膜结合蛋白3基因SEQ ID NO：1的引物对SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9和内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：10,PCR扩增产物大小是158。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2 real time PCR mix的配制
实施例6实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因钙依赖膜结合蛋白3基因SEQ ID NO：1的引物对SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12和内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：13,PCR扩增产物大小是223。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2 real time PCR mix的配制
实施例7CPNE3的表达水平检测及与成人AML和CN-AML其它指标的单因素分析
根据实施例1－2的试验条件，利用高通量基因芯片获取基因表达水平，基于272例成人AML患者骨髓样本、135例NCCN中危组成人AML患者骨髓样本、129例成人CN-AML患者骨髓样本，对CPNE3的表达水平进行检测并且进行单因素分析。结果见表1和图1A和1B。对99例ELN中危-I组患者骨髓样本，对CPNE3的表达水平进行检测并且进行单因素分析。结果见图1C和1D。
表1：CPNE3表达水平与AML、NCCN中危组及CN-AML相关临床及分子指标的单因素分析
FAB,French-American-British classification；ITD,internal tandemduplication；Mut:mutated；
WT:Wild type
图1所示是CPNE3在AML或CN-AML患者组织样品中的检测及预后分析显示图。图1A所示是在AML和NCCN中危组患者组织样品中对CPNE3表达水平进行总生存率分析结果。图1B所示是在AML和NCCN中危组患者组织样品中对CPNE3表达水平进行无事件生存率分析结果。图1C所示是在CN-AML和ELN中危-I组患者组织样品中分别对CPNE3表达水平进行总生存率分析结果。图1D所示是在CN-AML和ELN中危-I组患者组织样品中分别对CPNE3表达水平进行无事件生存率分析结果。CPNE3在全部AML、CN-AML、ELN中危、NCCN中危成人AML患者组织样品中都具有较短的OS和EFS。
由表1和图1可以看出，CPNE3高表达的成人(<60岁)AML患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后，CPNE3低表达的成人AML患者具有较低的危险度分层和较好的临床预后。实验结果在272例成人AML中验证；也在135例NCCN中危组成人AML患者中验证；也在129例成人CN-AML患者中得以验证。还在99例ELN中危-I组患者中得以验证。
实施例8CPNE3的表达水平检测及与成人AML和CN-AML其它指标的多因素分析
根据实施例1－2的试验条件，利用高通量基因芯片获取基因表达水平，对CPNE3的表达水平进行检测并且进行多因素分析。结果见表2。
表2：CPNE3表达水平在AML、NCCN中危组和CN-AML中预后评估的多因素分析：
针对172例患者(100例化疗患者和72例移植患者)，在基于CPNE3表达高低分组的基础上，进一步比较不同治疗方案(化疗、移植)的治疗效果，发现：CPNE3高表达患者适合于采用异基因造血干细胞移植治疗，CPNE3低表达患者只需化疗即可，不需要采用异基因造血干细胞移植治疗(附图2A和2B)，同时，在全部化疗患者中的比较也发现：高表达CPNE3患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后(附图2A和2B)。
结论：1)CPNE3高表达是成人AML患者的预后不良标志物；2)CPNE3高表达在NCCN中危组、CN-AML及ELN中危-Ⅰ组中均是预后不良标志物，因此CPNE3高表达可以作为预后标志物进一步细化这三类患者危险度分层和预后评估。CPNE3高表达的成人AML样品具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有采用异基因造血干细胞移植治疗的需要。CPNE3低表达的成人AML样品具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要采用异基因造血干细胞移植治疗，只需化疗即可。
上述实施例只是为了详细说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的保护范围。
