MELK活性的生物标记物及使用其的方法
本申请要求2014年3月17日提交的美国临时申请61/954,046以及2013年11月12提交的美国临时申请61/902,877的优先权。其全部内容在此通过引用并入。
背景技术
蛋白激酶——母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)，已知其参与调节细胞周期进展、细胞增殖、细胞凋亡和mRNA剪接(Badouel et al.(2006)Cell Cycle 5:883-889andBadouel et al.(2010)Exp.Cell Res.316:2166-2173)。通过基因表达谱分析，MELK也被确认与多种癌症相关，包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、淋巴瘤和宫颈癌细胞以及动物模型中乳腺肿瘤的形成(Komatsu et al.(2013)Int.J.Oncol.42:478-506；Pickard et al.(2009)Breast Cancer Res.11:R60；Hebbard et al.(2010)Cancer Res.70:8863-8873；Lin etal.(2007)Breast Cancer Res.9:R17；WO 2004/031413；WO 2007/7013665；and WO 2006/085684)。尽管有这种关联，迄今并未进行MELK介导的肿瘤发生的功能分析，MELK介导的肿瘤发生的机制和(经延伸)用于确定调节这些肿瘤发生有用的试剂测定法也是未知的。这种理解的缺乏阻止了对可靠地报告MELK酶和/或致癌活性的生物标记物的鉴定。虽然已知某些靶向MELK的激酶活性的抑制剂(参见，例如，Chung et al.(2012)Oncotarget 3:1629-1640)，但是在领域中仍有对确认MELK介导的肿瘤发生的生物标记物有明确需求，以提供快速有效的手段来评估靶向MELK的抗癌疗法。
发明概述
本申请基于，至少部分基于发现人真核起始因子4B(eIF4B)的第406位(例如，丝氨酸残基)的磷酸化水平是母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)活性的可靠生物标记物，适合在临床前和临床上测量MELK酶活性。类似地，本申请基于，至少部分基于发现人组蛋白H3的第3位(例如，苏氨酸残基)和/或第10位(例如，丝氨酸残基)和/或第11位(例如，苏氨酸残基)的磷酸化水平是母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)活性的可靠生物标记物，适合在临床前和临床上测量MELK酶活性。
一方面，提供了一种用于识别抑制人母系胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)或其直系同源物的激酶或致癌活性的试剂的方法，包括：a)用所述试剂接触包含i)人MELK或其直系 同源物和ii)人真核起始因子4B(eIF4B)或其直系同源物的样本，并且b)确定所述试剂抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中磷酸化减少识别出该试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶或致癌活性。在一个实施方式中，通过将样品中人eIF4B中第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的氨基酸磷酸化的量与对照进行比较，来确定对人eIF4B中所述第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。在另一个实施方式中，对照是指，相比于不存在试剂或样本接触试剂的较早时间点的量，样本中人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量。在另一个实施方式中，通过将样本中人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量与人eIF4B 406或其直系同源物总量的比率与对照进行比较，来确定对人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制。在另一个实施方式中，对照是指，相比于不存在试剂或在样本接触试剂的较早时间点的该比率，样本中406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B比率或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的比率。在另一个实施方式中，所述方法还包括确定从具有高度结构化的5'UTR的RNA翻译的蛋白质的量，任选地，其中所述蛋白质选自由骨髓细胞瘤癌基因(c-Myc)、凋亡蛋白X-连锁抑制剂(XIAP)和鸟氨酸脱羧酶(ODC1)的组成的组。在另一个实施方式中，所述方法还包括确定试剂是否直接结合到所述人eIF4B或其所述直系同源物，或所述人MELK或其所述直系同源物的步骤。在另一个实施方式中，样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，样本包含细胞(例如，癌细胞，例如癌症选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或eIF4B活化突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组)。在另一个实施方式中，细胞是从受试者获取。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量是通过使用特异性结合到406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化人eIF4B直系同源物的试剂进行免疫测定来确定的(例如，放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法)。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中， 所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，试剂将406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
另一方面，提供了一种用于评估试剂在受试者体内抑制人MELK或其直系同源物激酶活性的疗效的方法，包括：a)第一个时间点检测在受试者样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的直系同源物的量；b)在施用试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；然后c)比较步骤a)和所述b)中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或其直系同源物的量，其中与后续至少一个时间点相比，在第一时间点的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的直系同源物的量较高，表明试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性。在某些实施方式中，第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用的试剂能特异性地结合到第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物(例如，放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法)。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中，样本选自由离体和体内样本组成的组中。在另一个实施方式中，样本包含癌细胞(例如，癌细胞选自由含有MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或eIF4B活化突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组)。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的样本是取自受试者的单个样本的一部分。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的样本是取自受试者的合并样本的一部分。在另一个实施方式中，在第一时间点和后续时间点期间，受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于从癌症中缓解。在另一个实施方式中，所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述试剂将第 406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
在另一方面，提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，包括向受试者施用抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或在其直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的磷酸化的试剂，从而治疗患有癌症的患者。在一个实施方式中，试剂是以药学上可接受的剂型施用的。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，试剂直接结合到所述人eIF4B或其直系同源物，或所述人MELK或其直系同源物。在另一个实施方式中，癌症选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或eIF4B活化突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组。在另一个实施方式中，所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。在另一个实施方式中，这种方法还包括施用一种或多种另外的抗癌剂。
在另一方面，提供了一种用于确定人MELK或其直系同源物的功能或活性的方法，包括：a)检测样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的人eIF4B直系同源的量；b)在操作样本后和/或在操作相同样本或测试样本后，在相同样本或测试样本中一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和所述b)中检测的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的人eIF4B直系同源的量，其中与至少一个后续时间点和/或对相同样本或测试样本至少一次的后续操作相比，在第一时间点改变的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的人eIF4B直系同源的量，表明了对人MEL或其直系同源物的功能或活性进行了改变。在某些实施方式中，第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在对应于人eIF4B氨基酸位点磷酸化的人eIF4B直系同源的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用的试剂能特异性地结合到第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物(例如，放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法)。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的 人eIF4B直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中，样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，所述样本包括细胞或方法使用基于细胞的测定法。在另一个实施方式中，所述细胞是选自由MELK或eIF4B扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或eIF4B活化突变的任意癌症和MELK或eIF4B被其他激酶活化的任意癌症组成的组中的癌细胞。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的相同样本或测试样本是取自受试者的单个样本的一部分。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的相同样本或测试样本是取自受试者的合并样本的一部分。在另一个实施方式中，在第一时间点和后续时间点期间，受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于从癌症中缓解。在另一个实施方式中，所述人eIF4B或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，样本操作选自由将所述样本与测试剂接触，将样本与MELK信号通路的上游信号接触，以及将样本与MELK抑制剂接触组成的组。在另一个实施方式中，测试试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，测试试剂将第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或在人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
另一方面，提供了一种用于识别抑制人MELK或其直系同源物激酶或致癌活性的试剂的方法，包括：a)用试剂接触包含i)人MELK或其直系同源物和ii)人组蛋白H3或其直系同源物；和b)确定试剂抑制人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化或在人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸；和/或在人组蛋白H3的第10位丝氨酸磷酸化或人组蛋白H3的直系同源物中相应的磷酸化氨基酸；和/或人组蛋白H3的第11位苏氨酸磷酸化或人组蛋白H3的直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的能力，其中减少的磷酸化识别出抑制人MELK或其直系同源物激酶或致癌活性的试剂。在一个实施方式中，对人组蛋白H3所述第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化，或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制是通过与对照组样本中第3位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3和/或第10位丝氨酸磷酸化的人组蛋白H3和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量，或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量相比较来确定的。在另一个实施方式中，对照是指，相对于未用试剂或样本接触试剂后较早时间点，样本中第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的 量。在另一个实施方式中，对人组蛋白H3所述第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制，是通过将第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量与样本中组蛋白H3或其直系同源物总量的比率与对照相比较来确定的。在另一个实施方式中，对照是指，相比于未用试剂或将样本与试剂的较早时间点，样本中第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3比率或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸比率。在另一个实施方式中，方法还包括确定有丝分裂的特异性蛋白的量。在另一个实施方式中，所述方法还包括确定试剂是否直接结合到所述人组蛋白H3或其所述直系同源物，或所述人MELK或其所述直系同源物的步骤。另一个实施方式中，样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，样本包含细胞，例如癌细胞(例如，癌细胞选自由MELK或组蛋白H3扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或组蛋白H3活化突变的任意癌症和MELK或组蛋白H3被其他激酶活化的任意癌症组成的组)。在另一个实施方式中，细胞是从受试者获取。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量是通过使用特异性结合到第3位苏氨酸磷酸化或第10位丝氨酸磷酸化或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3或相应的磷酸化人组蛋白H3直系同源物的试剂进行免疫测定来确定的。在另一个实施方式中，免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。在另一个实施方式中，所述酶免疫测定法是夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人组蛋白H3或相应的人组蛋白H3直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第3位苏氨酸磷酸化或第10位丝氨酸磷酸化或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3或相应的磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中，所述人组蛋白H3或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述试剂将第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量和/或人组蛋白 H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
另一方面，提供了一种用于评估试剂在受试者体内抑制人MELK或其直系同源物激酶活性的疗效的方法，包括：a)在第一个时间点检测受试者样本中第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的量；b)在施用试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和所述步骤b)中磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白直系同源物的量，其中第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的量在第一时间点高于至少一个后续时间点，表明试剂抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性。在某些实施方式中，第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用特异性地结合到第3位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3或第10位丝氨酸磷酸化的人组蛋白H3或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3，或相应的磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的试剂。在另一个实施方式中，免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人组蛋白H3或相应的人组蛋白H3直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第3位苏氨酸磷酸化或第10位丝氨酸磷酸化或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3或相应的磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中，样本选自由离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，样本包含癌细胞(癌细胞选自由MELK或组蛋白H3扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或组蛋白H3活化突变的任意癌症和MELK或组蛋白H3被其他激酶激活的任意癌症组成的组)。在另一个实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的样本是取自受试者的单个样本的一部分。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的样本是取自受试者的合并样本的一部分。在另一个实施方式中，在第一时间点和后续时间点期间，受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于从癌症缓解中。在另一个实施方式中，所述人组蛋白H3或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小 分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述试剂将第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
另一方面，提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，包括向受试者施用抑制人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化或其直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的试剂，从而治疗患有癌症的患者。在某些实施方式中，试剂是以药学上可接受的剂型施用的。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，试剂直接结合到所述人组蛋白H3或其直系同源物，或所述人MELK或其直系同源物。在另一个实施方式中，癌症选自由MELK或组蛋白H3扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或组蛋白H3活化突变的任意癌症和MELK或组蛋白H3被其他激酶激活的任意癌症组成的组。在另一个实施方式中，所述人组蛋白H3或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述试剂将第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。在另一个实施方式中，所述方法还包括施用一种或多种另外的抗癌剂。
另一方面，提供了一种用于确定人MELK或其直系同源物功能或活性的方法，包括：a)检测样本中第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的量；b)在操作所述样本和/或操作相同样本或测试样本后，在所述相同样本或测试样本中的一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和所述步骤b)中磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的量，其中与至少一个后续时间点和/或对相同样本或测试样本至少一次后续操作相比，在第一时间点第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的的量改变，表明对人MELK或其直系同源物功能或活性进行了调节。在某些实施方式中，第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量通过免疫测定来确定，这种免疫测定使用特异性地结合到第3位苏氨酸磷酸化或第10位丝氨酸磷酸化或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白 H3或相应的磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的试剂。在另一个实施方式中，免疫测定是放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。在另一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人组蛋白H3或相应的人组蛋白H3直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第3位苏氨酸磷酸化或第10位丝氨酸磷酸化或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3或相应的磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的检测抗体或片段。在另一个实施方式中，样本选自由体外、离体和体内样本组成的组。在另一个实施方式中，所述样本包括细胞或所述方法使用基于细胞的测定法。在另一个实施方式中，细胞是选自由MELK或组蛋白H3扩增或过度表达的任意癌症、有MELK或组蛋白H3活化突变的任意癌症和MELK或组蛋白H3被其他激酶激活的任意癌症组成的组中的癌细胞。在另一个实施方式中，所述样本选自由组织、全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的相同样本或测试样本是取自受试者的单个样本的一部分。在另一个实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中的相同样本或测验样本是取自受试者的合并样本的一部分。在另一个实施方式中，在第一时间点和后续时间点期间，受试者已经接受癌症治疗、已完成癌症治疗和/或处于从癌症中缓解。在另一个实施方式中，所述人组蛋白H3或其直系同源物，和/或所述人MELK或其直系同源物，包括表1所列的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方式中，样本的操作选自由将所述样本与测试剂接触，将样本与MELK信号通路的上游信号接触，以及将样本与MELK抑制剂接触组成的组。在另一个实施方式中，测试剂为小分子，或抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，测试剂将第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或人组蛋白H3直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量降低至少50％。
还应当理解，根据本领域技术人员可获取的知识，本申请的特定实施方式可与本文所述的一个以上方法一同使用。
附图简述
图1显示了MELK与eIF4B的相互作用。在MDA-MB-468细胞中条件表达Flag-MELK。将有丝分裂裂解液进行抗Flag免疫共沉淀，随后进行串联质谱分析。左图显示了从免疫沉淀中回收的肽的的量。右图显示了有丝分裂期间MELK和eIF4B之 间相互作用的验证。需要注意的是Flag-MELK是可进行多西环素诱导的。
图2显示了用于确定MELK的最佳底物基序的肽库筛选的结果。上图显示了使用重组全长MELK进行体外磷酸化在空间排列的肽库的结果。每种肽包含一个固定在相对于所述中央固定的磷酸受体(例如，丝氨酸或苏氨酸)的9个位置之一的残基。将反应物点样到膜上，并将所述点暴露于荧光体存储屏幕。下图显示了使用量化和标准化的屏幕数据生成的序列标识。需要注意的是MELK对在相对于磷酸受体位点-3位的精氨酸有强选择性。
图3显示了MELK在体外将eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化。用免疫沉淀的Flag-eIF4B(野生型)或Flag-eIF4B(S406A)对重组全长MELK或MELK的激酶结构域进行体外激酶测定。MELK存在时可以观测到eIF4B的第406位丝氨酸的强烈磷酸化。当用突变eIF4B(S406A)取代野生型(wt)eIF4B时这种磷酸化消失。
图4显示了在体外MELK不能将eIF4B的第422位磷酸化。用免疫沉淀的Flag-eIF4B(野生型)或Flag-eIF4B(S422A)对重组全长MELK或MELK的激酶结构域进行体外激酶测定。通过免疫印迹对反应进行分析。
图5显示了MELK在体内调节eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化。左图显示了敲除MELK损害了eIF4B第406位丝氨酸的磷酸化。在多西环素存在或不存在时，通过使用诺考达唑处理收集MDA-MB-468细胞稳定表达的可四环素诱导(tet-on)的小发夹MELK(shMELK)，并进行免疫印迹。右图显示了MELK抑制剂损害eIF4B的第406位丝氨酸的磷酸化。使用溶媒或200nM的OTSSP167(一种MELK抑制剂)(Chung et al.(2012)Oncotarget 3:1629-1640)处理有丝分裂的MDA-MB-468细胞30分钟。裂解液用于免疫印迹。
图6显示了使用mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素和Torin 1)处理有丝分裂细胞30分钟与使用MELK抑制剂(例如，OTSSP67)处理这些细胞的比较结果。结果表明MELK抑制而不是mTOR抑制，抑制eIF4B的第406位丝氨酸的磷酸化。
图7显示了在有丝分裂时敲除MELK或eIF4B降低XIAP、c-Myc和ODC1的蛋白丰度。用多西环素或溶媒对照处理稳定表达tet-on shMELK或sh-eIF4B的MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞。通过诺考达唑诱导的阻滞获得了在前中期的有丝分裂细胞。需要注意的是XIAP、c-Myc和ODC1的mRNA已被证明含有结构性5'UTR，并且它们的总水平保持不变。
图8显示了MELK敲除降低了有丝分裂期间由c-Myc或ODC1的5’UTR驱动的荧光 素酶的翻译。将被指示的双顺反子载体在多西环素存在或不存在时转染稳定表达tet-onshMELK的MDA-MB-231细胞。在转染两天后，收获诺考达唑阻滞的有丝分裂细胞并进行荧光素酶测定。用对照载体的值标准化海肾萤光素酶与萤火虫萤光素酶的比率(RL/FL)。需要注意的是，在表现相对的RL/FL比率的图中所显示的每一对柱状体中，左侧柱状体对应于Dox(-)，右侧柱状体对应于Dox(+)。
图9显示了MELK在体外将人组蛋白H3的第3位苏氨酸、第10位丝氨酸和第11位苏氨酸磷酸化。重组人组蛋白H3在重组MELK(激酶结构域)存在或不存在的情况下在ATP存在的情况下30℃孵育30分钟。通过加入SDS样品缓冲液终止反应。然后使用指示抗体对样品进行免疫印迹。
图10显示了MELK敲除降低了组蛋白H3的第3位苏氨酸、第10位丝氨酸和第11位苏氨酸而不是第28位丝氨酸的有丝分裂的磷酸化。稳定转导tet-on shMELK的MDA-MB-468细胞，使用或不使用多西环素(200ng/ml)处理来诱导基因沉默。然后将细胞用诺考达唑(200ng/ml)处理20小时。有丝分裂细胞通过摇落法(shake-off)获得，细胞裂解物通过使用指示抗体进行免疫印迹。
图11显示了MELK敲除不影响极光激酶的磷酸化，已知极光激酶是人组蛋白H3的第10位丝氨酸的激酶。稳定转导tet-on shMELK的MDA-MB-468细胞使用或不使用多西环素(200ng/ml)处理来诱导基因沉默。细胞用诺考达唑(200ng/ml)处理20小时。有丝分裂细胞通过摇落法(shake-off)获得，细胞裂解物通过使用指示抗体进行免疫印迹。
图12显示了MELK抑制剂在体外抑制MELK诱导的组蛋白H3的第10位丝氨酸的磷酸化。重组的组蛋白H3在重组MELK(激酶结构域)不存在或存在的情况下、在OTSSP167(200ng/ml终浓度)存在或不存在情况下30℃培养30分钟。通过加入SDS样品缓冲液终止反应。然后样品使用指示抗体进行免疫印迹。
图13显示了对MELK的抑制作用抑制了组蛋白H3的第3位苏氨酸、第10位丝氨酸和第11位苏氨酸而不是第28位丝氨酸的有丝分裂的磷酸化。通过诺考达唑(200ng/ml，20小时)诱导的细胞周期阻滞获得在前中期的有丝分裂细胞。通过MELK的化学小分子抑制剂OTSSP167以指示的浓度处理细胞30分钟。然后制备细胞裂解物用于免疫印迹。
发明详述
本申请的方法涉及以下意想不到的发现，人真核起始因子4B(eIF4B)的第406位(如，丝氨酸残基)的磷酸化水平，或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸，可以用作MELK酶(例如激酶)活性和/或致癌活性的生物标记物。具体而言，例如eIF4B的第406位丝氨酸的磷酸化降低(例如，通过直接或间接地抑制MELK介导的第406位丝氨酸磷酸化)，与降低MELK酶活性(例如，激酶活性)和MELK介导的致癌效应相对应。这样的生物标记物对于临床前和临床应用是特别有利的，因为eIF4B的磷酸化状态与MELK原癌基因本身是直接相关的。类似地，本申请的方法也涉及以下意想不到的发现，人组蛋白H3的第10位(如，丝氨酸残基)或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸的磷酸化水平，和/或人组蛋白H3的第11位(如，苏氨酸残基)或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸的磷酸化水平，可以用作MELK酶(例如激酶)活性和/或致癌活性的生物标记物。具体地，例如人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化降低(例如，通过直接或间接地抑制MELK介导的第3位苏氨酸磷酸化)和/或人组蛋白H3的第10位丝氨酸磷酸化降低(例如，通过直接或间接地抑制MELK介导的第10位丝氨酸磷酸化)和/或人组蛋白H3的第11位苏氨酸磷酸化降低(例如，通过直接或间接地抑制MELK介导的11位苏氨酸磷酸化)，与降低的MELK酶活性(例如，激酶活性)和MELK介导的致癌效应相对应。这样的生物标记物对于临床前和临床应用是特别有利的，因为组蛋白H3的磷酸化状态与MELK原癌基因本身是直接相关的。在某些实施方式中，根据本申请可以考虑使用人eIF4B的第406位丝氨酸、人组蛋白H3的第3位苏氨酸、人组蛋白H3的第10位丝氨酸和/或人组蛋白H3的第11位苏氨酸，以及任何其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸，包括其任意组合。在其他的实施方式中，根据本申请，人eIF4B的第28位丝氨酸或其直系同源物的相应的磷酸化氨基酸不受MELK调节，因此不使用它。
A.MELK、eIF4B和组蛋白H3分子
本文所使用的“MELK”指蛋白激酶超家族中MELK成员，也被称为“PEG3激酶”、“蛋白激酶Eg3”、“蛋白激酶”和“丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MELK”。至少存在九种剪接变异体编码九种不同的人MELK亚型。人MELK转录变异体1(NM_014791.3)编码长的人MELK亚型1(NP_55606.1)。人MELK转录变异体2(NM_001256685.1)与转录变异体1相比在3’编码区缺少一个外显子，但是保留了阅读框并导致产生了比亚型1短的亚型(NP_001243614.1)。人MELK转录变异体3(NM_001256687.1)与转录变异体1相比在5’编码区缺少一个外显子，但是保留了阅读框并导致产生了比亚型1短的亚型(NP_001243616.1)。人MELK转录变异体4(NM_001256688.1)与转录变异体1相比在5’编码区缺少两个连续的外显子，但是保留了阅读框并导致产生了比亚型1短的亚型(NP_001243617.1)。人MELK转录变异体5(NM_001256689.1)从另一个起始密码子开始翻译，与转录变异体1相比在5’编码区缺少一个外显子，从而导致产生了比亚型1短且有不同的N-端的亚型(NP_001243618.1)。人MELK转录变异体6(NM_001256690.1)从另一个起始密码子开始翻译，与转录变异体1相比在5’编码区缺少两个连续的外显子，但是保留了阅读框从而导致产生了比亚型1短且有不同的N-端的亚型(NP_001243619.1)。人MELK转录变异体7(NM_001256691.1)从另一个起始密码子开始翻译，与转录变异体1相比在5’编码区缺少两个外显子，但是保留了阅读框从而导致产生了比亚型1短且有不同的N-端亚型(NP_001243620.1)。人MELK转录变异体8(NM_001256692.1)与转录变异体1相比在5’编码区缺少三个外显子并从下游框内的起始密码子开始翻译，导致产生了比亚型1的N-端短的亚型(NP_001243621.1)。最后，人MELK转录变异体9(NM_001256693.1)与转录变异体1相比在5’编码区缺少两个连续的外显子并从下游框内的起始密码子开始翻译，导致产生了比亚型1的N-端短的亚型(NP_001243622.1)。调节MELK自磷酸化和在目标蛋白上激酶活性的活化的蛋白结构域和结构基础是已知的(详见至少Cao et al.(2013)PLoSOne 8:e70031和Canevariet al.(2013)Biochemistry 52:6380-6387)。
小鼠MELK核酸(NM_010790.2)和氨基酸(NP_034920.2)序列可从美国国家生物技术信息中心维护的GenBank数据库通过公开渠道获得。在除小鼠和人外的其他物种MELK直系同源物的核酸和多肽序列也是已知的，包括，例如黑猩猩MELK(XM_001169038.3,XP_001169038.1,XM_001168991.3,XP_001168991.1,XM_001168745.3,XP_001168745.1,XM_001168775.3,XP_001168775.1,XM_003951427.1,XP_003951476.1,XM_520578.4,XP_520578.3,XM_001168822.3,XP_001168822.2,XM_003312085.2,XP_003312133.1,XM_003951428.1,XP_003951477.1,XM_003312086.2,and XP_003312134.1)、猴MELK(XM_001115076.2和XP_001115076.2)、狗MELK(XM_003431578.1,XP_003431626.1,XM_538730.3,XP_538730.2,XM_003431579.1,和XP_003431627.1)，牛MELK(NM_001111260.1和NP_001104730.1)、大鼠MELK(NM_001108662.1和NP_001102132.1)、鸡MELK(NM_001031509.1和NP_001026680.1)和斑马鱼MELK(NM_206888.2和 NP_996771.2)。
本文所使用的“eIF4B”指真核翻译起始因子家族中真核翻译起始因子4B成员，也被称为“EIF-4B”和“PRO1843”。人eIF4B核酸(NM_001417.4)和氨基酸(NP_001408.2)序列可从美国国家生物技术信息中心维护的GenBank数据库通过公开渠道获得。在除人外的其他物种eIF4B直系同源物的核酸和多肽序列也是已知的，例如小鼠eIF4B(NM_145625.3和NP_663600.2)、黑猩猩eIF4B(XM_003313676.1,XP_003313724.1,XM_001142097.3,和XP_001142097.3)、猴eIF4B(NM_001195808.1和NP_001182737.1)、狗eIF4B(XM_853888.2,XP_858981.2,XM_853812.2和XP_858905.2)、牛eIF4B(NM_001035028.2和NP_001030200.1)、大鼠eIF4B(NM_001008324.1和NP_001008325.1)和鸡eIF4B(XM_003643408.2和XP_003643456.2)。另外，eIF4B的“第406位丝氨酸”指人eIF4B的氨基酸编号。因此，本领域技术人员将容易理解人eIF4B多肽的第406位丝氨酸在众多物种中是保守的，尽管这些特定的残基在本文中可能被引用，但本申请的方法同样适用于与所述人eIF4B的第406位丝氨酸对应的其他物种的亚型、同源物和直系同源物中相应的残基(例如，磷酸化的氨基酸)。
本文所使用的“Histone H3”指组蛋白家族的H3成员，其包括用于形成真核细胞核小体结构的蛋白。真核细胞存在以核小体的形式围绕在蛋白质周围的染色质，这是染色质的最小亚基并且包括缠绕在核心组蛋白的八聚体周围约146-147个DNA碱基对(两个H2A、H2B、H3和H4)。哺乳动物细胞具有3个已知的组蛋白H3序列变异体，表示为H3.1、H3.2和H3.3，这三个序列变异体高度保守，区别仅在几个氨基酸序列。在许多细胞过程中组蛋白H3的残基的翻译后修饰很重要，第10位丝氨酸和/或第28位丝氨酸磷酸化对细胞分裂和增殖调控很重要。第10位丝氨酸磷酸化的组蛋白H3对于有丝分裂的细胞是特定生物标记物，与其他已知的有丝分裂特异型生物标记物类似，例如磷酸化的MPM-2、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白1(Rb)、磷酸化cdc2、BubR1、细胞周期蛋白B1、cdc25c、cdk1、cdc27和类似物等。任何丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸残基都可以被磷酸化。在某些实施方式中，其他可能被磷酸化的位点包括第3位苏氨酸、第6位苏氨酸，第11位苏氨酸、第31位丝氨酸、第41位酪氨酸、第57位丝氨酸、第80位苏氨酸和第107位苏氨酸。
本文所使用的“Histone H3”既可以指单独的H3.1、H3.2或H3，也可以指它们全部。这些氨基酸序列包括一个甲硫氨酸作为第1号残基，当蛋白质被加工时它将被切除。因此，例如，以下表1中组蛋白氨基酸序列中第11位丝氨酸对应本申请中的第10位丝氨酸(Ser)。这三种蛋白变异体是通过至少15种不同的基因/转录子编码。编码组蛋白H3.1变异体的序列可以通过公开途径获得，HIST1H3A(NM_003529.2；NP_003520.1)、HIST1H3B(NM_003537.3；NP_003528.1)、HIST1H3C(NM_003531.2；NP_003522.1)、HIST1H3D(NM_003530.3；NP_003521.2)、HIST1H3E(NM_003532.2；NP_003523.1)、HIST1H3F(NM_021018.2；NP_066298.1)、HIST1H3G(NM_003534.2；NP_003525.1),HIST1H3H(NM_003536.2；NP_003527.1)、HIST1H3I(NM_003533.2；NP_003524.1)和HIST1H3J(NM_003535.2；NP_003526.1)。编码组蛋白H3.2变异体的序列可以通过公开途径获得，HIST2H3A(NM_001005464.2；NP_001005464.1)、HIST2H3C(NM_021059.2；NP_066403.2)和HIST2H3D(NM_001123375.1；NP_001116847.1)。编码组蛋白H3.3变异体的序列可以通过公开途径获得，H3F3A(NM_002107.3；NP_002098.1)和H3F3B(NM_005324.3；NP_005315.1)。具体信息详见U.S.专利公开号2012/0202843。此外，组蛋白H3直系同源物的多肽序列，以及编码这些多肽的核酸序列，在许多物种中是已知的，包括，例如，小鼠中组蛋白H3.1直系同源物(NM_013550.4；NP_038578.2)、黑猩猩(XM_527253.4；XP_527253.2)、猴(XM_001088298.2；XP_001088298.1)、狗(XM_003434195.1；XP_003434243.1)、牛(XM_002697460.1；XP_002697506.1)、大鼠(XM_001055231.2；XP_001055231.1)和斑马鱼(NM_001100173.1；NP_001093643.1)。小鼠中组蛋白H3.2直系同源物(NM_178215.1；NP_835587.1)、黑猩猩(XM_524859.4；XP_524859.2)、猴(XM_001084245.2；XP_001084245.1)、狗(XM_003640147.1；XP_003640195.1)、牛(XM_002685500.1；XP_002685546.1)、大鼠(NM_001107698.1；NP_001101168.1)、鸡(XM_001233027.2；XP_001233028.1)和斑马鱼(XM_002662732.1；XP_002662778.1)。类似地，小鼠中组蛋白H3.3直系同源物 (XM_892026.4；XP_897119.3)、猴(XM_001085836.2；XP_001085836.1)、牛(NM_001099370.1；NP_001092840.1)、大鼠(NM_053985.2；NP_446437.1)、鸡(NM_205296.1；NP_990627.1)和斑马鱼(NM_200003.1；NP_956297.1)是已知的。检测磷酸化的组蛋白H3(例如，第3位苏氨酸、第10位丝氨酸、第11位苏氨酸和组蛋白H3的其他残基)磷酸化的抗体以及制备这些抗体的方法在本领域内是已知的。另外，例如，组蛋白H3“Ser-10”指人组蛋白H3的氨基酸编号。因此，本领域技术人员将容易理解人组蛋白H3多肽的第10位丝氨酸在众多物种中是保守的，尽管这些特定的残基在本文中可能被引用，但本申请的方法同样适用于对应于所述人组蛋白H3的第10位丝氨酸的亚型、同源物和其他物种的直系同源物的相应的残基(例如，磷酸化的氨基酸)。第3位苏氨酸和第11位苏氨酸同样适用。
本发明提供了有代表性的MELK、eIF4B和Histone H3直系同源物(例如，至少在表1和实施例中)如下：
表1
人MELK(亚型1)cDNA序列(NM_014791.3)
人MELK(亚型1)氨基酸序列(NP_55606.1)
人MELK(亚型2)cDNA序列(NM_001256685.1)
人MELK(亚型2)氨基酸序列(NP_001243614.1)
人MELK(亚型3)cDNA序列(NM_001256687.1)
人MELK(亚型3)氨基酸序列(NP_001243616.1)
人MELK(亚型4)cDNA序列(NM_001256688.1)
人MELK(亚型4)氨基酸序列(NP_001243617.1)
人MELK(亚型5)cDNA序列(NM_001256689.1)
人MELK(亚型5)氨基酸序列(NP_001243618.1)
人MELK(亚型6)cDNA序列(NM_001256690.1)
人MELK(亚型6)氨基酸序列(NP_001243619.1)
人MELK(亚型7)cDNA序列(NM_001256691.1)
人MELK(亚型7)氨基酸序列(NP_001243620.1)
人MELK(亚型8)cDNA序列(NM_001256692.1)
人MELK(亚型8)氨基酸序列(NP_001243621.1)
人MELK(亚型9)cDNA序列(NM_001256693.1)
人MELK(亚型9)氨基酸序列(NP_001243622.1)
小鼠MELK cDNA序列(NM_010790.2)
小鼠MELK氨基酸序列(NP_034920.2)
人eIF4B cDNA序列(NM_001417.4)
人eIF4B氨基酸序列(NP_001408.2)
小鼠eIF4B cDNA序列(NM_145625.3)
小鼠eIF4B氨基酸序列(NP_663600.2)
猴eIF4B cDNA序列(NM_001195808.1)
猴eIF4B氨基酸序列(NP_001182737.1)
牛eIF4B cDNA序列(NM_001035028.2)
牛eIF4B氨基酸序列(NP_001030200.1)
大鼠eIF4B cDNA序列(NM_001008324.1)
大鼠eIF4B氨基酸序列(NP_001008325.1)
人组蛋白H3.1氨基酸序列(NP_003520.1)
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小鼠组蛋白H3.1氨基酸序列(NP_038578.2):
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人组蛋白H3.2氨基酸序列(NP_001005464.1):
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小鼠组蛋白H3.2氨基酸序列(NP_835587.1):
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人组蛋白H3.3氨基酸序列(NP_002098.1):
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小鼠组蛋白H3.3氨基酸序列(NP_032237.1):
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由于遗传密码的简并性或由于编码或具有“非必要”、“保守”、“立体异构体”或“非常规”的氨基酸而不同的核酸和蛋白质分子(例如，不同物种的MELK、eIF4B以及它们的直系同源物)不会明显改变MELK的酶(例如激酶)调节能力和/或对eIF4B 的第406位丝氨酸的调节能力，因此这些也包括在本申请的范围之内。“保守氨基酸取代”指氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本文中所述多肽的合适组分。特定蛋白的氨基酸序列和编码蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系，这种对应由遗传密码所定义(如下所示)。同样地，特定核酸的核苷酸序列和由该核酸编码的氨基酸序列存在已知且明确的对应关系，这种对应由遗传密码所定义。
遗传密码重要的和众所周知的特征是它的简并性，由此，对于大多数用于制造蛋白质的氨基酸，可以采用多于一个三联体编码核苷酸(例如，如上图所示)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。这些核苷酸序列因为在所有生物体中产生相同的氨基酸序列而被认为是功能等价的(尽管某些生物体相对于翻译其他核苷酸序列可以更有效地翻译一部分核苷酸序列)。此外，偶尔，在给定的核苷酸序列中可以发现嘌呤或嘧啶的甲基化变异体。这种甲基化不影响三联体核苷酸密码子和相应的氨基酸之间的编码关系。此外，熟练技术人员将理解如何突变特定密码子的核苷酸以便特异性地改变基于相关密码子表编码的氨基酸。其他所需的核酸和/或氨基酸修饰可以使用位点定向诱变和PCR介导的诱变技术进行工程化。
“核酸”可以采取多种编码本文所描述的生物标记物形式(例如，DNA、mRNA和cDNA)的任一种。例如，这些生物标记物核酸包括DNA(例如，基因组DNA和cDNA)，其包含所需基因的整个或部分序列，或这些序列的互补序列或杂交片段。生物标记物核酸分子也包括RNA，其包含所需基因的整个或部分序列，或所述序列的互补序列，其中所有的胸腺嘧啶残基被尿嘧啶残基取代。“转录的多核苷酸”是一种多核苷酸(例如，RNA、cDNA，或RNA或cDNA的类似物)，其至少一部分与本申请中的生物标记物转录生成的成熟RNA的全部或部分互补或同源，和正常的转录后加工(例如，剪接，如果有的话)以及转录子的逆转录。
如本文中互换使用的术语“同源性”或“相同性”，是指两个多核苷酸序列或两个多肽序列之间的序列相似性，而相同性是更严格的比较。短语“相同性或同源性百分比”和“相同性或同源性％”指在两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列进行比较时，序列相似性所占百分比。两个或多个序列相似值在0-100％区间的任意位置，或0-100％区间的任意整数值。相同性或相似性可以通过比较用于比较目的而排列的每个序列的位置来确定。当被比较序列中的位置由相同核苷酸碱基或氨基酸占据时，那么所述分子在该位置是相同的。多核苷酸序列之间的相似性或相同性的程度是多核苷酸序列共有的位置上相同或匹配的核苷酸的量的函数。多肽序列的相同性程度是由多肽序列共有的位置的相同氨基酸的的量的函数。多肽序列之间的同源性或相似性的程度是多肽序列共有的位置的氨基酸的的量的函数。术语“基本同源”指至少50％同源、至少60％同源、至少65％同源、至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、至少95％同源或更多(例如，约96％同源、96.5％ 同源、97％同源、97.5％同源、98％同源、98.5％同源、99％同源、99.5％同源、99.6％同源、99.7％同源、99.8％同源、99.9％同源或更多)。在某一个实施方式中，生物标记物核酸分子编码包含氨基酸序列的蛋白质或其部分，这种氨基酸序列与维持例如，磷酸化eIF4B的能力、磷酸化组蛋白H3和/或被MELK磷酸化的能力的蛋白质或其部分的氨基酸序列足够同源。
可以使用数学算法来比较序列和测定两个序列的同源性百分比。可以使用Clustal法进行比对。多重比对参数包括GAP罚分＝10、Gap长度罚分＝10。对于DNA对比，配对比对参数可以是Htuple＝2，Gap罚分＝5，Window＝4和Diagonal saved＝4。对于蛋白质对比，配对比对参数可以是Ktuple＝1，Gap罚分＝3，Window＝5和Diagonals Saved＝5。相似地，两个氨基酸序列之间的相同性百分比是用Needleman和Wunsch算法确定的(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))，其已被纳入GCG软件包的GAP程序(在线提供)中，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重1、2、3、4、5或6。在另一个实施方式中，两个核苷酸序列之间的相同性百分比是用GCG软件包的GAP程序(在线提供)确定的，使用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重为40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6。在另一个实施方式中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的相同性百分比是用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))算法确定的，其已被并入ALIGN程序(2.0版)(在线提供)，使用PAM120权重残基表，gap长度罚分为12，gap罚分为4。
制备核酸的方法(例如，在本领域已知翻译自具有结构性5’区的核酸的MELK、eIF4B和/或mRNA，包括标准杂交、PCR和/或合成核酸技术。扩增的核酸可以被克隆到合适的载体，并通过基因序列分析表征。
“生物标记物蛋白”是由本申请的生物标记物编码或与其对应的蛋白质。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在一个实施方式中，所述蛋白质与本文所述MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质的整个氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、90％和95％或更多(例如，95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多)同源。此外，本文所述MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质的生物活性部分均包含在其中，与本文所述的MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质片段(例如结构域或基序，此片段能磷酸化eIF4B、磷酸化组蛋白H3和/或被MELK磷酸化)具有至少50％、60％、70％、80％、90％和95％或更多(例如，95.5％、96％、96.5％、97％、 97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上)的同源性。典型地，生物活性部分(肽，例如，有5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或更多氨基酸长度的肽)包含一个结构域或基序，例如MELK激酶结构域、包含由MELK磷酸化的氨基酸残基的eIF4B结构域，例如MELK介导的磷酸化底物基序，其相对于丝氨酸/苏氨酸(人eIF4B的第406位丝氨酸或第422位丝氨酸)在-3位有一个精氨酸、或包含由MELK磷酸化的氨基酸残基的组蛋白H3结构域，例如包含第10位丝氨酸的人组蛋白H3区。另外，其他生物活性部分，其中所述蛋白质的其他区域缺失，可以通过重组技术制备并通过本文中所述的一种或多种活性来评估。
制备蛋白质(例如MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3)的方法在本领域已知，包括例如，在合适的细胞中从cDNA从头表达蛋白质或通过在起始氨基酸中随后加入氨基酸制备(详见Current Protocols,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。此外，制备蛋白质片段的方法在本领域是已知的，包括用适当的蛋白酶裂解蛋白质或产生编码蛋白质片段的核酸片段并在适当的细胞中后续表达该核酸片段。制备突变蛋白质的方法，例如，通过交换或/和删除一个或多个氨基酸，在本领域是已知的。
B.诊断方法
提供了鉴别试剂(如小分子和抗体)的方法，所述试剂抑制人MELK或其直系同源物的致癌活性和/或激酶活性，包括：a)用试剂接触含i)人MELK或其直系同源物和ii)人真核起始因子4B(eIF4B)或其直系同源物的样品；然后b)测定所述试剂抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或其直系同源物中相应氨基酸磷酸化的能力，其中，磷酸化降低识别了抑制人MELK或其直系同源物的激酶或致癌活性的试剂。类似地，提供了鉴别试剂(如小分子和抗体)的方法，所述试剂抑制人MELK或其直系同源物的致癌活性和/或激酶活性，包括：a)用试剂接触含有i)人MELK或其直系同源物和ii)人组蛋白H3或其直系同源物的样品；然后b)测定试剂抑制人组蛋白H3的第3位苏氨酸和/或第10丝氨酸和/或第11位苏氨酸磷酸化或其直系同源物中相应氨基酸磷酸化的能力，其中，磷酸化水平降低识别了抑制人MELK或其直系同源物的激酶活性或致癌活性的试剂。这些方法在本文中也被称为药物筛选测定法，通常包括筛选候选/测试化合物或试剂与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质相互作用(例如，结合)的能力，该相互作用通过MELK调节eIF4B磷酸化，调节eIF4B的磷酸化残基与MELK介导的细胞内信号转导的目标的相互作用，通过MELK调节组蛋白H3磷酸化，和/或调节组蛋白H3的磷酸化残基与MELK介导的细胞内信号转导目标的相互作用。具有一种或多种这些能力的测试化合物或试剂可以用作药物，来治疗以畸变的、异常、和/或不需要的MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3核酸表达和/或蛋白质的活性为特征的疾病，例如癌症。候选/测试化合物包括，例如，小的有机和无机分子(例如，组合和天然产物库中获取的分子)。类似地，抗体试剂，例如以MELK调节残基磷酸化的方式结合到MELK、以通常的MELK介导的磷酸化驱动的调节eIF4B活性的方式结合到MELK、和/或以通常的MELK介导的磷酸化的驱动调节组蛋白H3活性的方式结合到MELK，这些试剂均是有用的。本领域技术人员也可容易地制备其他调节试剂，例如适配体、反义RNA、siRNA，这些试剂能与MELK核酸和/或蛋白质相互作用以影响MELK介导的eIF4B或组蛋白H3磷酸化(详见，至少Chung et al.(2012)3:1629-1640；WO2013/109388；WO 2012/016082；WO 013/045539；其各自全部通过引用并入本文)。
术语“样本”、“组织样本”、“受试者样本”、“受试者细胞或组织样本”或“标本”，每个均指从受试者组织或受试者的体外(例如，培养的)、离体或体内(例如，分离的原代细胞)样本获取的相似细胞的集合。组织样本的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样本、活组织检查或吸出物的实体组织；血液或血液成分；体液，如全血、血清、血浆、颊刮、唾液、脑脊液、尿、粪便和骨髓、羊水、腹膜液或间质液；或受试者妊娠或发育过程中任何时间的细胞。组织样本可能包含与自然组织非天然地混合在一起的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。样本还可能包括癌细胞，例如卵巢癌、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤细胞或任意癌症，其中MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3扩增或过度表达、有一个活化的突变或被其他激酶活化。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。在本文中，术语“受试者”和“受试者们”指动物，例如，哺乳动物包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、驴、山羊、骆驼、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、羊)和灵长类动物(例如，猴，如食蟹猕猴，大猩猩、黑猩猩和人)。
术语“抑制”指目标度量的统计学显著降低，例如第3位苏氨酸磷酸化和/或第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的组蛋白H3、第406位丝氨酸磷酸化的eIF4B、MELK酶活性(例如，激酶活性)、肿瘤进展等的降低。这种统计学显著减少与对照组相比可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％ 或更多，例如，根据本文描述的方法施用并分析的待测化合物可以包含MELK酶活性的真正抑制剂(例如，激酶活性)，这种抑制通过与未施用MELK配体或超出给定时间后相比，第406位丝氨酸磷酸化的eIF4B的量、第3位苏氨酸磷酸化的组蛋白H3的量、第10位丝氨酸磷酸化的组蛋白H3的量，和/或第11位苏氨酸磷酸化的组蛋白H3的量降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一个实施方式中，术语“MELK抑制剂”是一种物质，例如小分子、抗体、反义核酸、小干扰核酸，其干扰人eIF4B的第406位丝氨酸的磷酸化或eIF4B406直系同源物相应磷酸化位点，人组蛋白H3的第3位苏氨酸的磷酸化或人组蛋白H3直系同源物相应磷酸化位点，人组蛋白H3的第10位丝氨酸的磷酸化或人组蛋白H3直系同源物相应磷酸化位点，和/或人组蛋白H3的第11位苏氨酸的磷酸化或人组蛋白H3直系同源物相应磷酸化位点。示例性的MELK抑制剂在本领域是已知的，如OTSSP167、盐屋霉素A、硫链丝霉素和抗MELK抗体已被公开，例如在Chung et al.(2012)Oncotarget3:1629-1640；WO 2013/045539；WO 2013/109388；和WO2012/016082中；其各自全部通过引用并入本文。
术语生物标记物的“改变量”或生物标记物的“改变水平”指与对照样本相比，本申请的至少一部分的样本中的生物标记物的表达、修饰和/或活性的增加或减少。
如果生物标记物的的量分别比正常水平多于或少于用于评估的量所用方法的标准误差，或至少是正常值的两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍，那么受试者体内的生物标记物的量与正常量相比是“显著”的高或低。或者，如果的量分别比生物标记物正常量(例如，在对照样本或本申请中数个对照样本生物标记物的平均表达水平)高或低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍，那么受试者体内的生物标记物的的量与正常量相比可被认为是“显著”的高或低。
本文所述“可能”指增加的可能性，即有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更高(包含在内的任何范围)的可能一个项目、对象、事件或人会发生。因此，在一个实施方式中，可能抑制MELK介导的eIF4B磷酸化的试剂有增加的抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B的直系同源物相应磷酸化氨基酸的可能性。在另一个实施方式中，可能抑制MELK介导的组蛋白H3磷酸化的试剂有增加的抑制人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化、第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化，或人 组蛋白H3直系同源物相应磷酸化氨基酸的可能性。
本申请的待测化合物(至少部分)可以通过本领域已知的组合库法中的多种途径中的任一种获得，包括：生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法；需要解卷积的合成文库法；“一珠一化合物”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库法限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽低聚物或化合物小分子文库(Lam,K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
用于分子库合成的方法的实例可以在本领域中找到，例如在：DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erbet al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37:2678；Choet al.(1993)Science261:1303；Carrellet al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carellet al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和在Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233中。
化合物文库可呈现在溶液(e.g.,Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421)，或在磁珠(Lam(1991)Nature 354:82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、细菌(Ladner USP 5,223,409)、孢子(Ladner USP'409)、质粒(Cull et al.(1992)ProcNatlAcadSci USA 89:1865-1869)或在噬菌体(Scott and Smith(1990)Science249:386-390)上；(Devlin(1990)Science 249:404-406)；(Cwirlaet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)；(Ladner在前)。
在某些实施方式中，其中对人eIF4B第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的抑制是通过与对照组样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量的比较来确定的。对照可以是指，相比于未用试剂或与将所述试剂与所述样本接触的较早时间点的所述的量，样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的的量。eIF4B的磷酸化水平通常是通过测定磷酸化的eIF4B蛋白质的的量和任选地未磷酸化的eIF4B的的量以及将待分析样本中磷酸化蛋白质的量用总蛋白质的量标准化来确定的。在待测化合物存在下计算的响应磷酸化水平和基底或背景磷酸化水平(例如，未使用待测化合物或在施用待测化合物后的较早时间点)因而在给定时间点不受指示剂蛋白的绝对的量差异的影响。
在向细胞施用待测化合物后可以选择差别时间点或预定的时间以达到样本中的第406位丝氨酸磷酸化水平相较于对照组有校正后的具有统计学意义的显著差异。在预定的时间，这种差异可能是最大的，但是这不是必需的，取决于测试的其他参数。此 外，虽然本文中所述的比率计算有利于提供有用的比较数字，但是计算施用待测化合物的磷酸化的eIF4B水平与对照组之间的绝对差异，和待测受试者与对照受试者之间绝对差异，也是能够使用的并且是有效的。
在某些实施方式中，上面描述的方法可以进一步包括确定从具有高度结构化的5’非翻译区(5’UTR)的mRNA翻译的蛋白质的量，任选地其中所述蛋白质选自由细胞骨髓样细胞瘤基因(c-Myc)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和鸟氨酸脱羧酶(ODC1)组成的组中。已知eIF4B刺激eIF4A的解旋酶活性以解开mRNA的5’UTR的二级结构，且eIF4B对具5’UTR结构的mRNA的翻译很重要(Dmitrievet al.(2003)Mol.Cell Biol.23:8925-8933和Shahbazianetal.(2010)Mol.Cell Biol.30 1478-1485)。熟练的技术人员容易发现编码致癌蛋白的具5’UTR结构的mRNA，如c-Myc、XIAP(X连锁凋亡抑制蛋白)、ODC(鸟氨酸脱羧酶)、VEGF、HIF-1alpha等(详见，至少Bert et al.(2006)RNA 12:1074-1083)。
磷酸化是一种生化反应，其中将一个磷酸基团添加到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，并通过蛋白激酶催化。磷酸化通常修饰靶蛋白的功能，通常是导致活化。作为细胞稳态机制的一部分，磷酸化仅仅是可被其他称作磷酸酶逆转的暂时过程。因此，蛋白质磷酸化水平随时间而改变，并且可通过许多已知的方法进行评估，包括，例如，通过免疫学方法。例如，第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或人eIF4B直系同源物中相应的磷酸化氨基酸的量是通过使用特异性结合到第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化人eIF4B直系同源物的试剂进行免疫测定来确定的。这些免疫测定包含许多已知的方式，包括但不局限于放射免疫测定、Western印迹分析、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。本领域的一般技术人员已知在进行上述各种免疫测定法中使用的一般技术和技术的其他变型，例如原位邻位连接分析(PLA)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、抑制免疫散射浊度分析法(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)、ELISA等，其单独或同NMR、MALDI-TOF、LC-MS/MS等组合或替换地使用。
在一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合人eIF4B或相应的人eIF4B直系同源物的捕获抗体或片段和特异性地结合第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B或相应的磷酸化的人eIF4B直系同源物的检测抗体或片段。这种酶免疫测定特别有利，因为其可以鉴别相关激酶家族成员和亚型之间在蛋白质水 平的差异，即使在这些激酶本身之间和其磷酸化形式之间具有相对较高的同源性。
用于识别eIF4B磷酸化和非磷酸化形式以及检测MELK的免疫试剂，在本领域是已知的，并且可以使用标准技术(例如通过用适当的eIF4B荧光体肽接种宿主细胞)来生产。这种抗MELK，抗eIF4B，和/或抗磷酸化eIF4B抗体试剂(例如，单克隆抗体)可用于分离和/或确定(例如在细胞裂解物中)相应蛋白质的量。这种试剂也可用于监测细胞或组织(例如，白细胞或淋巴细胞)中蛋白质水平，作为临床检测程序的一部分，例如，用以监测抑制剂的最佳剂量。监测可以通过将抗体与检测物质耦合(例如，物理连接)来促进。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白，合适的放射性材料的实例包括125I,131I,35S or 3H。
上述筛选方法还可适于识别候选/测试化合物，这些化合物调节(例如，刺激或抑制)eIF4B蛋白质与靶eIF4B蛋白质之间的相互作用(最可能也是MELK和eIF4B的致癌活性)，其中eIF4B蛋白质与靶eIF4B蛋白质正常相互作用或调节其以验证MELK介导的酶促活性随着磷酸化eIF4B水平的降低而降低。这些靶分子或物质的实例包括如本文进一步所述的某些由具结构化5’UTR的mRNA编码的蛋白质。
如上所述，可以类似地确定对eIF4B磷酸化、人组蛋白H3的第3位苏氨酸磷酸化、第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化，或人组蛋白H3直系同源物相应磷酸化氨基酸的识别和其调节(例如，抑制)。
在另一个实施方式中，本申请提供与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质相互作用(例如，结合到)的候选/测试化合物的筛选方法。“结合化合物”应指结合组合物，例如小分子、抗体、肽、肽类配体或非肽类配体、蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸类似物，例如肽核酸、外源凝集素或其他任何能特异地结合到靶蛋白质或分子或具有目的分析物的稳定化合物形成的分子实体，如蛋白质复合物。“结合部分”是指任何分子标记可以直接或间接结合上去的分子，其能特异地结合到分析物。结合部分包括但不局限于，抗体、抗体结合组合物、肽、蛋白质、核酸和具有高达约1000 道尔顿分子量并包含选自由氢、氟、碳、氧、氮、硫和磷组成的组的原子的有机分子。通常，所述测定是基于细胞的测定。所述细胞，例如，可以是哺乳动物来源的表达MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3的，例如癌细胞。
在其他实施方式中，测定是无细胞的测定，其包括将MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质或其生物活性部分和候选/测试化合物结合的步骤，例如，在允许候选/测试化合物与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质或其生物活性部分相互作用(例如，结合)形成复合物的条件下，以及检测复合物的形成，其中候选化合物与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3多肽或其生物活性片段相互作用的能力是通过候选化合物存在于复合物中来表明的。可以对MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3蛋白质与候选化合物形成的复合物进行定量，例如，使用标准的免疫测定。这些分析会识别作为MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3配体的测试化合物。
为了进行上述药物筛选方法，固定MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3或其靶分子，以便于从一种或两种蛋白质的非复合物形式中分离复合物，以及调试测定的自动化会比较可取。在候选化合物存在或不存在的情况下，MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3与靶分子的相互作用(例如，结合)能在适于容纳反应物的任何容器内实现。这些容器的实例包括酶标板、试管和微量离心管。在一个实施方式中，可以提供一种融合多肽，其添加了一个结构域使所述多肽结合到基质上。例如，谷胱甘肽-S-转移酶MELK、-组蛋白H3和/或-eIF4B融合多肽可以被吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的酶标板，然后将其与细胞裂解物(例如， 35S-labeled)和候选化合物结合，在利于复合物形成的条件下孵育该混合物(例如，在盐和pH的生理条件下)。孵育后，将珠粒清洗以除去任何未结合的标记，将所述基质固定并直接确定放射性标记，或在复合物解离后的上清液中确定。另外，复合物可以通过SDS-PAGE从基质解离，使用标准电泳技术从凝胶上定量磁珠上的MELK-、组蛋白H3-和/或eIF4B-结合多肽的水平。
将多肽固定在基质上的其他技术也可以在本申请的示例性药物筛选测定法中使用。例如，MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3或它的靶分子可以利用生物素和链霉亲和素耦联而固定。生物素化的MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3分子可以使用本领域已知的技术用生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，罗克福德，伊利诺伊州)，并固定在链霉亲和素包被的96孔板的孔中(Pierce Chemical)。此外，抗体与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3反应，但该反应不干扰多肽与其可衍生 于板孔中的靶分子结合，且MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3通过抗体耦联截留在孔中。如上所述，MELK-和/或eIF4B-结合多肽和候选化合物的制备是在MELK-和/或eIF4B-和/或组蛋白H3-存在的板孔中孵育，并且孔中截留的复合物的量是可以定量的。检测这些复合物的方法，除了上述针对GST固定化复合物的方法，还包括使用抗体与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3靶分子反应进行复合物免疫测定，或使用其他与MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3多肽反应并与靶分子竞争的物质进行免疫测定；以及依赖于检测靶分子相关的酶活性的酶联分析。
另一方面，提供一种方法用于评估试剂在受试者体内抑制人MELK或其直系同源物激酶活性的疗效，包括：a)在第一个时间点检测受试者样本中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的的量；b)在施用所述试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和步骤b)中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的量，其中第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B的量或相应的氨基酸磷酸化的人eIF4B直系同源物的的量在第一时间点高于至少一个后续时间点，表明所述试剂抑制MELK或其直系同源物的激酶活性。类似地，提供一种方法用于评估试剂在受试者体内抑制人MELK或其直系同源物激酶活性的疗效，包括：a)在第一个时间点检测受试者样本中第3位苏氨酸磷酸化、第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的的量；b)在施用试剂后的一个或多个后续时间点重复步骤a)；和c)比较步骤a)和步骤b)中磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白直系同源物的量，其中第3位苏氨酸磷酸化、第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的人组蛋白H3的量或相应的氨基酸磷酸化的人组蛋白H3直系同源物的的量在第一时间点高于至少一个后续时间点，表明所述试剂抑制MELK或其直系同源物的激酶活性。
如本文所述，“时间过程”指初始事件与随后事件之间的时间量。例如，随着受试者癌症的进展，时间过程可能与受试者疾病相关，且能通过计量疾病过程中的显著事件来测定，其中初始事件可以是诊断，随后事件可以是增殖、转移等。
一旦结合被证实，可以根据本领域已知的方法进行额外的测定法，例如用来确定磷酸化作用抑制的激酶测定法。例如，确定MELK激酶活性的测定法在本领域是已知的(详见，例如，本文所述和通过引用全部并入本文的出版物)。简言之，MELK可以在允许eIF4B或组蛋白H3磷酸化的缓冲液中使用合适的底物孵育。底物磷酸化可 通过使用标记的磷酸基团进行测定，如使用缓冲液中作为ATP来源的放射性标记32P。另外，特异性用于eIF4B催化活性的磷酸化产物的抗体可以用来检测活性。正如本领域的普通技术人员所显而易见的，测定法适于使用机器人化和自动化处理的高通量技术。另外，MELK激酶活性可以使用合成底物(例如肽库)来测定。MELK活性也可通过检测如本文中所述的激酶的下游靶标进行测定。
第406位丝氨酸磷酸化的eIF4B可根据本文所述的任意方法和使用任意样本(例如，单一的受试者样本或合并的受试者样本)进行分析。可以识别在磷酸化eIF4B依赖性响应(例如，抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或eIF4B直系同源物中相应磷酸化氨基酸残基)方面产生统计学显著变化的候选化合物。这种统计学显著变化可通过多个标准和/或相对于多个对照来测量。例如，相较于对照组，如果被分析的输出被抑制1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.1-、2.2-、2.3-、2.4-、2.5-、2.6-、2.7-、2.8-、2.9-、3.0-、3.1-、3.2-、3.3-、3.4-、3.5-、3.6-、3.7-、3.8-、3.9-、4.0-、4.1-、4.2-、4.3-、4.4-、4.5-、4.6-、4.7-、4.8-、4.9-、5.0-、5.5-、6.0、6.5-、7.0-、7.5-、8.0-、8.5-、9.0-9.5-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-、20-倍或更多的不同(包括所含的任意范围)，则可确认对第406位丝氨酸磷酸化的显著调节。在一个实施方式中，在所述第一时间点和随后的时间点之间，受试者已经经历癌症治疗，已完成癌症治疗，和/或处于癌症缓解期。
如上所述，可以类似地识别和/或分析eIF4B磷酸化，第3位苏氨酸磷酸化、第10位丝氨酸磷酸化和/或第11位苏氨酸磷酸化的组蛋白H3，或人组蛋白H3直系同源物相应的磷酸化氨基酸，和其改变(例如，抑制)。
术语“癌症”指存在具有典型致癌细胞特征的细胞，所述特征例如增殖失控、永生、转移潜能和特定的特征性形态特征。癌细胞常常以肿瘤的形式存在，但是这些细胞可以单独存在于动物体内，或可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。如本文所述，术语“癌症”包括癌前病变及恶性肿瘤。癌症包括但不局限于，B细胞肿瘤，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；重链病，如α-链病，γ-链病，和μ链病；良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性病，黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统的癌症、周围神经系统癌、食道癌、子宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或喉咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液学组织癌等。还包括有编码MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3的基因扩增或过度表达 的任意癌症，或有活化突变的癌症，或MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3被其他激酶过度活化的癌症。在某些实施方式中，可以优选是卵巢癌(包括浆液性囊腺癌)、头颈部癌症(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、鳞状细胞癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、和/或神经胶质瘤。
“处理”、“治疗”和这个词的其他形式指施用试剂，其中试剂能抑制1)MELK磷酸化eIF4B和/或组蛋白H3的能力和/或2)MELK磷酸化eIF4B或组蛋白H3的能力，以改善癌症症状、延长受试者的预期存活时间和/或延长癌症进展的时间等。
本文中所述的对治疗“响应性”到“反应”，和这个动词的其他形式是指受试者使用试剂治疗后出现的反应，其中试剂能够抑制1)MELK磷酸化eIF4B和/或组蛋白H3的能力和/或2)MELK磷酸化eIF4B或组蛋白H3的能力。例如，如果测定条件相对于未施用试剂或超出给定时间改变了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则受试者响应对受试者或其细胞用试剂进行的治疗。
C.治疗方法
本文所述MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3抑制剂可以用于治疗癌症。在一个实施方式中，治疗患有癌症的患者的方法包括施用抑制人eIF4B的第406位丝氨酸磷酸化或人eIF4B直系同源物相应磷酸化的氨基酸的试剂，例如特异性调节第406位丝氨酸磷酸化，从而治疗患有癌症的患者的试剂。在另一个实施方式中，这些MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3抑制剂也可用来确定用所述试剂进行的治疗的疗效、毒性或副作用。如下面进一步描述的，这些治疗方法通常包括向需要这种治疗的受试者(例如患有癌症或面临患癌风险的受试者)施用药物组合物中的调节剂。
术语“施用”旨在包括给药途径，其允许试剂发挥它所希望抑制MELK磷酸化eIF4B的能力、eIF4B被MELK磷酸化的能力、MELK磷酸化组蛋白H3的能力，和/或组蛋白H3被MELK磷酸化的能力的功能。可以使用的给药途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入和经皮给药。注射可以是弹丸注射也可以是连续输注。根据给药途径，所述试剂可以涂覆有或处于所选择的材料中，以保护它不受可能会对其发挥预期作用产生不利影响的自然条件影响。试剂可以单独施用，或与药学上可接受的载体结合使用。所述试剂也可作为前药施用，其在体内转化为它的活性形式。
术语抑制MELK磷酸化eIF4B的能力和/或eIF4B被MELK磷酸化的能力的试剂的“有效量”是指在受试者或测试人群内必要或足以抑制MELK磷酸化eIF4B的能力和/或eIF4B被MELK磷酸化的能力的量，例如，根据上述方法测定的第406位丝氨酸磷酸化的人eIF4B 的量或eIF4B直系同源物中相应磷酸化残基的水平。相同分析适用于抑制MELK磷酸化组蛋白H3的能力，和/或组蛋白H3被MELK磷酸化的能力。有效量会根据治疗剂使用类型、受试者体型大小或疾病严重程度等因素而变化。
应当理解的是，个人剂量可能会根据主治医师判断的受试者需求、治疗疾病的严重程度和使用的特定化合物而变化。在确定治疗有效量或剂量时，主治医生可能会考虑许多其他因素，包括但不局限于：特定药剂的药效学特征及其给药方式和途径；所需的治疗时间过程；哺乳动物的种类；它的体型大小、年龄和一般健康状况；具体涉及的疾病；疾病的程度或复杂性或严重性；个体受试者的反应；施用的特定化合物；给药形式；制剂的生物利用度特性；选择的给药方案；联合治疗的种类；和其他相关情况。
治疗可以从较小剂量开始，这个剂量比化合物的有效剂量小。此后，在一个实施方式中，所述剂量应通过较小增量增加直到达到该情况下的最佳效果。为了方便，根据需要总的每日剂量可以分开并部分给药。
任何特定试剂的治疗癌症的效果，可以通过比较从接受癌症治疗的受试者获取的两个或多个样本进行监测。通常，第一个样本在受试者接受治疗前获取，在治疗过程中获取一个或多个样本。在这种情况下，可以确定接受治疗前癌症患者的细胞表达的基线，然后可以在治疗过程中监测癌症患者细胞表达的基线的状态变化。或者，可以使用治疗过程中获取的两个或多个连续样本而不需要治疗前基线样本。在这样的情况下，从受试者获取的第一个样本作为基线来确定代谢紊乱的受试者的细胞表达是否增加或减少。
MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3抑制剂可以在药学可接受的组合物中施用，药学可接受的组合物包括与一个或多个药学可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起的治疗有效量的抑制剂。例如，配方可进行基于制药领域已知的方法调整以适用于(1)口服给药，例如，灌服剂(含水的或非水的溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠外给药，例如通过皮下、肌内或静脉注射，例如，无菌溶液或悬浮液；(3)局部给药，例如，作为适用于皮肤、口腔或舌下表面的霜剂、软膏或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；或(5)鼻腔/气溶胶，例如，作为一种含水气溶胶，脂质体制剂或含有该化合物的固体颗粒。
短语“药学可接受的”在本文中用于指这些试剂、材料、组合物，和/或剂型，它们在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物组织接触而没有过多毒性、刺激性、过敏性反应，或其他问题或并发症，并与合理的利益/风险比率相称。
短语“药学可接受的载体”在本文中指一种药学可接受的材料、组合物或溶媒，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将对象化学物从一个器官或身体的一部分携带或运输到身体的另一个器官或一部分。每个载体在与制剂的其他成分相容并且不损害受试者的意义上是“可接受”的。一些可作为药学可接受的载体的材料实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)在药物制剂中使用的其他非毒性相容物质。
术语“药学上可接受的盐”指本申请包含的能降低PKC-iota磷酸化水平和/或活性的试剂的相对无毒的无机和有机加成盐。这些盐可以在最终分离和纯化期间在原位制备，或通过纯化的试剂以其游离碱形式与适宜的有机或无机酸单独反应制备，并分离形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘磺酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、和月桂基磺酸盐等(参见，例如，Berge et al.(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。
另外，本文描述的方法还包括除施用一种或多种其他抗癌试剂和/或使受试者的样本暴露于这些抗癌试剂之外，用MELK和/或eIF4B和/或组蛋白H3抑制剂治疗受试者。本领域技术人员已知的抗癌试剂，其包括但不局限于化疗和放疗，还有免疫治疗，激素治疗和使用与肿瘤或癌症起始、进展和/或病理相关的核酸分子和/或蛋白质的基因治疗。
化疗包括施用化疗试剂。这些化疗试剂可能是但不限于从以下化合物组中选择的那些：铂类化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷化剂，砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷类、核苷类似物、植物生物碱和毒素；和其合成衍生物。典型的化合物包括但不局限于，烷化剂：顺铂、苏消安和氯乙环磷酰胺；植物生物碱：长春碱、紫杉醇、多西紫杉醇；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷、克立那托、丝裂霉素；抗叶酸：甲氨蝶呤、霉酚酸，和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷 和阿糖胞苷；嘌呤类似物：巯嘌呤和硫鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2’-脱氧-5-氟尿苷、阿非迪霉素甘氨酸酯和吡唑并咪唑；和抗有丝分裂剂：软海绵素、秋水仙素，以及根霉素。也可使用包含一种或多种化疗试剂(例如，FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包括氟达拉滨、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和强的松。在另一个实施方式中，可使用PARP的(例如，PARP-1和/或PARP-2)抑制剂，其在本领域是已知的(例如，Olaparib,ABT-888,BSI-201,BGP-15(N-Gene ResearchLaboratories,Inc.)；INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.)；PJ34(Soriano et al.,2001；Pacheret al.,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen)；4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺；(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲酰胺(U.S.Pat.Re.36,397)；和NU1025(Bowmanet al.)。在另一个实施方式中，化疗试剂是铂化合物，如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂和异丙铂。其它抗肿瘤铂配位化合物在本领域中是已知的，可以根据本领域中已知的方法进行修饰，并包括在美国专利号4,996,337、4,946,954、5,091,521、5,434,256、5,527,905和5,633,243公开的化合物，所有这些都通过引用并入本文。上述例子中的化疗试剂是示例性的，并且不旨在进行限制。
放射治疗也包含其他抗癌试剂。在放射治疗中使用的辐射可以是电离辐射。放射治疗也可以是γ射线，X射线，或质子束。放射治疗的实例包括但不局限于外部束放射疗法，放射性同位素组织间植入(碘-125，钯-103，铱-192)，静脉注射放射性同位素(如锶-89)，胸部放疗治疗，腹腔32P放射治疗，和/或全腹盆腔放射治疗。放射治疗的一般概述，参见Hellman,Chapter 16:Principles of Cancer Management:Radiation Therapy,6thedition,2001,DeVitaet al.,eds.,J.B.Lippencott Company,Philadelphia。放射疗法可作为外部束放射或远距离治疗施用，其中所述放辐射源自远程源。放射治疗还可作为内部治疗或近距离放射治疗施用，其中放射源置于体内接近癌细胞或肿瘤团块的部位。还包括含光敏剂施用的光动力疗法，如血卟啉和其衍生物、维替泊芬(BPD-MA)、酞菁、光敏剂PC4、脱甲氧基竹红菌素A；和2BA-2-DMHA。
其他的抗癌试剂包括免疫治疗、激素治疗和基因治疗。这些疗法包括但不局限于，使用反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋的多核苷酸等，其中这些化合物的核苷酸序列与基因的DNA和/或RNA的核苷酸序列相关，所述基因与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理相关。例如，原癌基因、生长因子基因、生长因子受体基因、细胞周期基因、DNA修复基因和其他，它们可以作为这些疗法的靶点。
免疫治疗可包括，例如，使用癌症疫苗和/或致敏抗原递呈细胞。免疫治疗还可以包括免疫抑制性通路的阻遏，如通过靶向PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4等。免疫治疗可以 涉及对宿主进行短期保护的被动免疫，其通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的抗体实现(例如，对肿瘤抗原施用单克隆抗体，其任选地与化疗试剂或毒素连接)。免疫疗法也可关注在使用识别癌细胞株表位的细胞毒性淋巴细胞。
激素治疗可以包含，例如，激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂，和类固醇(例如，地塞米松、维甲酸、三角肌、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、雄激素、孕激素)、维生素A衍生物(例如，全反式维甲酸(ATRA))；维生素D3类似物；孕酮受体拮抗剂(例如，米非司酮、奥那司酮)，或抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮)。
在一个实施方式中，用于治疗通过本申请的方法确定表型的癌症的抗癌疗法可包括本文描述的一种或多种疗法，包括但不局限于，化疗试剂、免疫治疗、抗血管生成剂、细胞因子、激素、抗体、多核苷酸、放射和光动力治疗剂。例如，组合疗法可包括一种或多种化疗试剂和放射、一种或多种化疗试剂和免疫治疗，或一种或多种化疗试剂、放射和化疗。
实施例
本申请通过以下实施例进行进一步说明，但不应将其理解成是对本申请的限制。
实施例1：实施例2-3的材料和方法
a.质粒
从人乳腺上皮细胞(HMEC)中提取总RNA，利用引物(正向：ATGGCGGCCTCAGCAAAAAAG；反向：CTATTCGGCATAATCTTCTC)从该总RNA的反转录产物中克隆人eIF4B。将PCR产物(1.8kb)作为模板扩增带有限制性位点的FLAG标记或HA标记的eIF4B。通过测序验证该构建体(pWzl-Flag-eIF4B、pTrex-eIF4B-HA)。使用QuickChange XL(Stratagene)进行eIF4B的定点突变，且通过测序确认所有突变的构建体。
为了产生靶向人eIF4B的pLKO-tet-on shRNA，将合成的寡核苷酸退火并使用消化的pLKO载体连接。随机序列、sh-eIF4B-1序列、sh-eIF4B-2序列分别是GTGGACTCTTGAAAGTACTAT、GGACCAGGAAGGAAAGATGAA和GCGGAGAAACACCTTGATCTT。
b.逆转录病毒和慢病毒基因递送
逆转录病毒通过使用逆转录病毒载体转染HEK293T细胞和包装DNA产生。一般情况下，使用1.6μg pWzl DNA、1.2μg pCG-VSVG和1.2μg pCG-gap/pol、12μl液体体积的Metafectene Pro(Biontex)。DNA和脂质在300μl的PBS中分别稀释并混合。温育15分钟(min)后，将它们添加到一天前接种300万HEK293T细胞的6厘米培养皿中。在转染48小时(h)和72小时后收集病毒上清。将上清液滤过0.45μm的薄膜，并在8μg/ml聚凝胺(Millipore)存在时将其加入到靶细胞。慢病毒通过相似途径产生，除了HEK293T细胞是使用2μg pLKODNA,1.5μg pCMV-dR8.91,and 0.5μg pMD2-VSVG转染。在初始感染72h后使用抗生素筛选细胞。嘌呤霉素和杀稻瘟菌素分别在终浓度1.5μg/ml和4μg/ml时使用。
c.免疫印迹
对于用诺考达唑处理，在含诺考达唑(200ng/ml)的培养基中恢复细胞。处理20小时后，通过轻柔的摇落法收获漂浮的有丝分裂细胞。对于药物处理，将细胞在OTSSP167(ChemExpress,HY15512；10mM的DMSO储存液)存在下接种到多孔板。
收获细胞并用添加有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)的RIPA缓冲液(25mM Tris、pH 7.4，150mM氯化钠、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠)裂解。使用BCA试剂盒(Thermo Scientific)分析澄清裂解液以获取蛋白质浓度。等量的蛋白质(10-20μg)可在SDS-PAGE上分离，随后被转移到硝酸纤维素或聚偏氟乙烯膜(Amersham)。这些膜用5％脱脂牛奶封闭，随后与一抗一起在4℃过夜孵育。清洗后，将膜用荧光标记的二抗在室温下孵育1小时。然后将膜清洗，并用
以下抗体用于免疫印迹或免疫沉淀。MELK(Epitomics,2916)、p-eIF4B(S406)(Cell Signaling,8151)、p-eIF4B(S422)(Cell Signaling,3591)、eIF4B(CellSignaling,3592)、c-Myc(Cell Signaling,5605)、XIAP(Cell Signaling,2045)、p-Akt(S473)(Cell Signaling,4060)、p-MAPK(T202/Y204)(Cell Signaling,4370)、剪切的PARP(Asp214)(Cell Signaling,9541)、极光(Aurora)A(Cell Signaling,4718)、极光(Aurora)B(Cell Signaling,3094)、p-Aurora A(T288)/Aurora B(T232)/Aurora C(T198)(CellSignaling,2914)、p-组蛋白(Histone)H3(T3)(Cell Signaling,13576)、p-组蛋白H3(S10)(Cell Signaling, 3377)、p-组蛋白H3(T11)(Cell Signaling,9767)、p-组蛋白H3(S28)(Cell Signaling,9713)、ODC(Sigma,O1136)、黏着斑蛋白(Vinculin)(Sigma,V9131,alpha-tubulin(α-微管蛋白)(Sigma,T9016)、抗-HA磁珠(Pierce,88836)、抗-Flag磁珠(Sigma,M8823)。二抗用Alexa Fluor 680山羊抗兔IgG(Invitrogen,A-21109)和IRDye800-连接的抗鼠IgG(Rockland)。
d.体外激酶测定
Flag标记的eIF4B或Flag-eIF4B(S406A)转染入HEK293T细胞(在一个60mm培养皿中向细胞加入4μg DNA)。转染后36小时，将细胞用IP缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris，pH值7.5，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物)裂解。裂解液通过抗小鼠IgG连接的磁珠孵育(4℃,30min)进行澄清，然后使用抗-Flag M2磁珠(Sigma)(4℃,120min)进行免疫沉淀。带有结合抗原的珠粒用IP缓冲液清洗5次。在最后一次清洗过程中将珠粒等分入1.5ml微量管中。去除IP缓冲液后，将珠粒用无ATP的1倍激酶缓冲液(5mMTris,pH 7.5,5mM-β-磷酸甘油,2mM二硫苏糖醇,0.1mM Na3VO4,10mM MgCl2；CellSignaling)清洗一次。清洗后，将40μl 1倍激酶缓冲液与200mM ATP加到每个试管中，然后加入5μl含或不含500ng重组MELK的缓冲液。反应在30℃下孵育30分钟，然后通过加入40μl2倍SDS样本缓冲液终止。将样本煮沸并进行免疫印迹。如上所述进行组蛋白H3的体外激酶测定法，除了使用重组的组蛋白H3.1(New England BioLabs,M2503S)(每个反应50ng)。
e.点扫描肽库筛选
从昆虫细胞中纯化活性全长人MELK。进行如Turk et al.(2006)Nat.Protocol.1:375.中描述的点位扫描肽库筛选。简而言之，使用一组具有以下序列的180(或198)个生物素-连接的肽，序列为Y-A-X-X-X-X-X-S/T-X-X-X-X-A-G-K-K-生物素。在序列中，S/T指丝氨酸和苏氨酸的等摩尔混合物。对于每个肽，9个X位置中的一个代表二十种全氨基酸之一。将肽排列在384孔板上的缓冲液中，其中缓冲液包含50mM HEPES、pH7.5、20mM MgCl2、0.02mg/ml BSA、0.01％Brij 35、5mM DTT、0.5mM EGTA和活性MELK，并且γ-[32P]-ATP加到孔中(最终[肽]＝50μM，[ATP]＝100μM，每孔0.025μCi/μl)。在30℃孵育2小时后，将反应的等分物点样在链霉亲和素膜上。将膜淬灭，完全清洗，干燥，并暴露于荧光体存储屏幕。
实施例2:eIF4B磷酸化状态是MELK酶活性和致癌活性的生物标记物
为寻找MELK对癌症(例如基底细胞样乳腺癌(BBC))重要性的潜在分子机制，研究了许多实验方法，包括免疫沉淀-串联质谱法和磷酸肽图谱分析。当Flag标记的MELK在有丝分裂的细胞裂解液进行免疫沉淀，随后进行质谱分析时，发现有丝分裂时翻译起始因子eIF4B与MELK有很强的相关性(图1)。使用点位磷酸肽图谱分析，可以识别MELK的最佳底物基序，相较于丝氨酸/苏氨酸，其对-3位的精氨酸有较强的选择性(图2)。
人eIF4B残基有两个侧翼区(例如，在Ser406和Ser422位点)，它包括MELK磷酸化基序(图3和4)。为检测MELK是否能够在这两个位点磷酸化人MELK，使用纯化的重组MELK与免疫沉淀eIF4B进行体外激酶测定。发现人eIF4B的第406位丝氨酸而不是第422位丝氨酸容易被全长MELK或MELK的激酶结构域磷酸化，并且当人IF4B的第406位的丝氨酸突变为丙氨酸或对MELK进行其它操作，观查到的磷酸化消失(图3-5)。这些结果特异性依赖于MELK，因为mTOR抑制剂(例如雷帕霉素和torins)抑制有丝分裂细胞，其不会产生相同结果(图6；vanGorpet al.(2009)Oncogene 28:95-106)。这些数据表明MELK是一种在S406磷酸化人eIF4B的激酶，因为高度保守的序列和具有所述磷酸化位点的eIF4B多肽区域的结构组成，其他物种的eIF4B直系同源物也被相似地磷酸化(表2)。
表2
已知eIF4B刺激eIF4A的解旋酶活性以解开mRNA的5’UTR的二级结构(Dmitrievetal.(2003)Mol.Cell Biol.23:8925-8933和Shahbazianet al.(2010)Mol.Cell Biol.301478-1485)。许多mRNA编码致癌蛋白，例如c-Myc、XIAP(X连锁凋亡抑制蛋白)、ODC(鸟氨酸脱羧酶)。本申请确定MELK下调减少有丝分裂过程中MDA-MB-468细胞的eIF4B(p-eIF4B)S406的磷酸化，这也导致c-Myc、XIAP和ODC1水平显著下降(图7和8)。因此，有丝分裂过程中MELK介导的eIF4B的S406的磷酸化，对具有高度结构化5’UTR的mRNA的优化翻译在功能上是重要的，其中有许多已知是致癌的，例如c-Myc、XIAP和ODC1。综上所述，这些数据表明MELK是一种在有丝分裂过程中调节eIF4B的新型激酶，因而介导含结构化5’-UTR的mRNA的翻译，其对于癌细胞的存活和增殖十分重要。因此，MELK介导的eIF4B磷酸化水平是MELK致癌活性的靶标接触生物标记物，其对临床前和临床应用有益。
实施例3:组蛋白H3磷酸化状态是MELK酶活性和致癌活性的生物标记物
由于MELK蛋白丰度在有丝分裂过程中最高，此过程也是组蛋白H3被大量磷酸化的细胞周期阶段，因而提出MELK和组蛋白H3存在联系。事实上，人组蛋白H3的第11位苏氨酸位点的残基的侧翼区包含实施例2中所述的最佳MELK磷酸化基序。
为检测MELK是否能在第3位苏氨酸(Thr3)、第10位丝氨酸(Ser10)和第11位苏氨酸(Thr11)磷酸化人组蛋白H3，使用纯化的重组人MELK激酶结构域与人组蛋白H3进行体外激酶测定。发现人组蛋白H3的Thr3、Ser10和Thr11易被MELK的激酶结构域磷酸化(图9)。
MELK下调减少有丝分裂过程中MDA-MB-468细胞中的组蛋白H3的Thr3、Ser10和Thr11位点磷酸化，但不影响极光激酶A、B或C的磷酸化，这些激酶是已知的能在Ser10位点磷酸化组蛋白H3的激酶(图10和11)。类似地，在MDA-MB-468中使用小分子化学MELK抑制剂OTSSP167来抑制MELK，减少组蛋白H3在Thr3/Ser10/Thr11位的磷酸化(图12)。可以观测到组蛋白H3的Thr3、Ser10和Thr11位点而不是Ser28位点磷酸化呈OTSSP167浓度依赖型减少(图13)。
这些数据表明MELK是一种至少在Thr3、Ser10和Thr11位点而不是Ser28位点磷酸化人组蛋白H3的激酶，因为高度保守的序列和具有磷酸化位点的组蛋白H3的多肽区域的结构组成，其他物种的组蛋白H3直系同源物也被相似地磷酸化(表3)。
表3
组蛋白H3
综上所述，这些数据表明MELK是一种在有丝分裂过程中调节组蛋白H3的新型激酶，因而对于细胞(例如，癌细胞)增殖十分重要。因此，MELK介导的组蛋白H3磷酸化水平是MELK致癌活性的靶标接触生物标记物，其对临床前和临床应用有益。
援引并入
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等效内容
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