具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA‑A蛋白模拟表位肽、模拟表位肽组合物及其应用
技术领域
本发明涉及抗原表位肽，尤其涉及具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模拟表位肽、模拟表位肽组合物及其在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种重要的人兽共患病原菌，不仅可引起人类多种疾病，而且常引起临床型和隐性奶牛乳腺炎。长期以来，由于兽医临床上不合理使用抗生素，诱导动物源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株不断出现，不仅导致药物防治奶牛乳腺炎十分困难，给奶牛业带来严重危害，而且影响乳及乳制品的品质与安全以及人类健康。因此，选择合适的靶抗原研制新型金黄色葡萄球菌疫苗是免疫预防奶牛乳腺炎的研究重点。
然而，如何获得合适的疫苗靶抗原及其表位研制新型金黄色葡萄球菌多表位疫苗则一直是本领域技术人员所努力解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模拟表位肽。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案之一如下：
一种具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽，所述模拟表位肽是由12个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:1：His-Thr-Glu-Gln-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Lys-Met-Pro；
SEQ ID NO:2：Ser-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Glu-Arg-Met-Lys-Pro-Gly。
进一步的，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的所述模拟表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:3所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2的所述模拟表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:4所示：
SEQ ID NO:3：cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg；
SEQ ID NO:4：agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。
需要说明的是，所述的模拟表位肽可采用常规方法人工合成，也可以利用基因工程技术构建重组表达质粒，诱导表达获得。因此，含有所述的核苷酸序列的重组表达质粒以及含有所述重组表达质粒的宿主细胞也属于本发明的创新部分。
本发明的目的之二是提供一种含有前述具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的组合物，该组合物由SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽按2:1的质量比组合获得。
与本发明的目的之二相对应的，本发明还提供了一种含有前述具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的模拟表位串联肽，该模拟表位串联肽为采用基因工程技术将SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽进行串联表达获得，串联方式为：SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接头-SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接头-SEQ ID NO:2所示多肽。
进一步的，编码前述免疫保护性模拟表位串联肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
SEQ ID NO:5：cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。
本发明的目的之三是提供一种前述具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。
同样的，本发明还提供了一种前述具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽组合物在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。
本发明还提供了一种前述具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的模拟表位串联肽，在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。
本发明的目的之四是提供一种金黄色葡萄球菌多表位疫苗，该多表位疫苗中含有具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽，从而该多表位疫苗能够有效预防金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎。
最后，本发明还提供了一种具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的筛选方法，包括以下步骤：
S1、以rFnBPA-A纯化蛋白为免疫原，制备兔抗FnBPA-A抗体；所述兔抗FnBPA-A抗体的制备过程为：将浓度为1mg/mL的rFnBPA-A纯化蛋白和Tween-80混匀作为水相，再加入司本白油并在漩涡振荡器上反复震荡乳化，所述rFnBPA-A纯化蛋白、Tween-80、司本白油的体积比为1:0.042:3.126；接着于实验兔的颈部、背部皮下多点注射乳化好的免疫原，免疫剂量为1mg/只，一免后第14天进行二免，二免剂量和免疫途径同一免，二免后第10天进行三免，三免无免疫佐剂，三免剂量和免疫途径与一免相同；于三免后32天采集兔血并分离得到兔血清以获得所述兔抗FnBPA-A抗体；
S2、所述兔抗FnBPA-A抗体的纯化：采用硫酸铵分级沉淀法粗提取所述兔血清中的IgG，经透析除盐后使用Protein G亲和层析柱纯化IgG以获得纯化的兔抗FnBPA-A抗体；
S3、利用所述纯化的兔抗FnBPA-A抗体对噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选，淘选使用的所述噬菌体随机十二肽库试剂盒的库容量为2.7×109、滴度为1.5×1013/μL、Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌；所述淘选过程为：用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO3溶液将纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释至100μg/mL，包被酶标孔，4℃过夜；次日，用TBST洗涤液洗涤6次，再加入5％BSA封闭液，37℃封闭1h，所述TBST洗涤液中含0.5％Tween-20；之后弃封闭液，将原始肽库、TBST洗涤液、纯化后的阴性血清以10:195:195体积比混匀后按照100μL/孔加入酶标孔，温和震荡1h；再弃酶标孔内液体，使用TBST洗涤液洗涤6次后用0.2mol/L、pH2.2的甘氨酸-HCl洗脱缓冲液洗脱与兔抗FnBPA-A抗体特异性结合的噬菌体，并加入1mol/L、pH9.1的Tris-HCl缓冲液中和；取5μL所述洗脱缓冲液进行噬菌体滴度测定，其余噬菌体侵染宿主菌E.coli ER2738进行扩增，用于下一轮淘选，共进行四轮淘选以获得亲和力更高的特异性噬菌体阳性克隆；四轮淘选过程中逐轮降低纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释浓度、逐轮增加所述TBST洗涤液中Tween-20的浓度，其中第四轮淘选中所述纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释浓度为50μg/mL，第四轮淘选中所述TBST洗涤液中Tween-20的浓度增加到0.5％；
S4、所述特异性噬菌体阳性克隆DNA测序以及表位肽分析：使用噬菌体DNA单链提取试剂盒提取所述特异性噬菌体阳性克隆的单链DNA，并对所述单链DNA样品进行DNA测序，根据所述单链DNA样品中携带的外源基因序列，推导出展示于噬菌体表面的FnBPA-A蛋白模拟表位肽序列。
本发明的有益效果如下：
1)纤连蛋白结合蛋白A(Fibronectin-binding proteins A，FnBPA)是几乎所有金黄色葡萄球菌临床分离株产生的高度保守的黏附素蛋白，该蛋白能与存在于血浆、体液和胞外基质中的纤维蛋白特异性结合，从而使细菌有效地黏附于宿主组织中，引起感染发生。研究表明FnBPA蛋白结构中包括A、B、C、D四个功能区，其中A区不仅是该蛋白的主要黏附功能域，可与纤维蛋白发生特异性结合，在感染建立的初始阶段发挥重要作用，而且FnBPA-A蛋白诱导机体产生的抗体可抵抗金黄色葡萄球菌感染。因此，FnBPA-A是研制金黄色葡萄球菌疫苗的理想靶抗原之一。
本发明创造性的选择了金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽作为解决前述技术问题的切入点，为最终解决技术问题提供了良好的基础。
2)金黄色葡萄球菌致病因子众多且致病机制复杂，以单一保护性抗原制备疫苗，其所诱导的免疫保护作用有限，这就需要将多个保护性抗原嵌合表达制备亚单位嵌合疫苗。然而，由于表达载体容量有限，使得构建亚单位嵌合疫苗的抗原数量受到限制、甚至出现嵌合蛋白表达量低或不表达等问题。然而，表位(epitope)是抗原发挥作用的关键片段，将多种抗原的保护性表位串联构建而成的多表位疫苗既能够排除整个蛋白分子中免疫无关成分或免疫耐受成分，诱导出较完整蛋白更有效的免疫保护性应答，又能克服表达载体对多种抗原嵌合表达的容量限制。
因此，本发明提供了含有具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的模拟表位串联肽，从而更进一步的提高了疫苗的免疫保护作用
3)制备多表位疫苗的首要环节是鉴定出具有免疫保护性的表位或模拟表位，而噬菌体展示技术为研究表位提供了的有效手段。噬菌体展示技术筛选鉴定表位的原理是以纯化的单克隆或多克隆抗体为靶分子，生物淘选噬菌体随机肽库，即可筛选出特异性抗体的结合肽，将该结合肽与天然抗原序列进行比较，发现其中有的是与天然抗原序列完全相同的线性表位；另一些则是与天然抗原序列不相同或不完全相同但功能相似的模拟表位肽。因此，本发明利用噬菌体展示技术结合动物免疫保护性试验开展了金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的免疫保护性模拟表位肽的筛选与鉴定工作，为进一步开发预防奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌多表位疫苗奠定基础。
4)为进一步说明本发明的优点，现对本发明的技术途径和技术效果描述如下：
首先，本发明用纯化的rFnBPA-A蛋白(本实验室制备)为免疫原，制备兔抗rFnBPA-A蛋白抗体。通过饱和硫酸铵分级沉淀结合Protein G亲和层析柱对抗体进行纯化。经核酸蛋白测定仪测得纯化抗体的浓度约为2.5mg/mL，SDS-PAGE分析其纯度约为95％，间接ELISA方法检测其效价大于1:838860800。该纯化抗体满足作为靶分子淘选噬菌体随机十二肽库的条件。
然后，本发明以纯化的抗rFnBPA-A抗体为靶分子对噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选。在亲和淘选过程中逐轮降低抗体包被浓度(从100μg/mL降至50μg/mL)和逐渐加大洗脱液中Tween-20浓度(从0.1％增加到0.5％),经过4轮淘选和ELISA鉴定获得8个噬菌体阳性克隆。测序与序列分析显示，8个噬菌体阳性克隆共展示6种不同的12肽序列(分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6)，由于这6个展示表位肽序列与FnBPA-A蛋白序列均无一级结构同源性(Score<50)，确定它们为金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模拟表位，并通过肽ELISA进一步验证了这6个模拟表位肽的确能够模拟FnBPA-A蛋白与抗rFnBPA-A抗体发生特异性结合反应。
本发明进一步通过间接ELISA方法和免疫保护性试验检测小鼠免疫6个模拟表位肽后血清抗体产生水平和攻毒后免疫保护率，结果发现6个模拟表位肽均能刺激机体产生不同水平的特异性抗体，但只有模拟表位肽P1和P2具有一定程度的免疫保护性，它们对免疫小鼠的免疫保护率分别为25％和50％，并且P1与P2按2:1质量比混合的多肽组合物对黄色葡萄球菌感染小鼠的免疫保护效果高于FnBPA-A全蛋白，免疫保护率高达75％。因此，本发明中的免疫保护性模拟表位肽P1和P2及其组合物可作为有效成分，进一步用于多表位疫苗的开发，具有良好的应用前景。
附图说明
图1肽ELISA对模拟表位肽的验证。
图1显示6个模拟表位肽与抗rFnBPA-A抗体反应的平均OD492nm值均大于其与阴性血清反应的平均OD492nm值的2.1倍，而与His标签抗体反应孔的平均OD492nm值均小于其与兔阴性血清反应孔平均OD492nm值的2.1倍。说明这些模拟表位肽均能模拟FnBPA-A蛋白，与抗FnBPA-A抗体发生特异性结合反应。
具体实施方式
为了便于理解,以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
下述说明中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验方法中的所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述说明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述说明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。
实施例1：兔抗FnBPA-A蛋白抗体的制备与纯化
1.1抗体制备
将1mL浓度为1mg/mL的rFnBPA-A纯化蛋白(本实验室制备)和42μL Tween-80混匀作为水相，再加入3126μL司本白油并在漩涡振荡器上反复震荡乳化。于实验兔的颈、背部皮下多点注射乳化好的免疫原，免疫剂量为1mg/只。一免后第14天进行二免，免疫剂量和免疫途径同一免。二免后第10天进行三免，三免时不加免疫佐剂，免疫剂量和免疫途径与一免相同。分别于免疫前和免疫后第32天采集兔血、分离血清，以20μg/mL rFnBP-A蛋白液为包被抗原，1:5000羊抗兔HRP-IgG为二抗，采用间接ELISA方法检测免疫血清中抗FnBPA-A抗体的效价为1:209715200。
1.2抗体纯化
采用饱和硫酸铵分级沉淀法粗提免疫兔血清中IgG，经透析除盐后，再使用Protein G亲和层析柱纯化IgG。经核酸蛋白测定仪测得纯化抗体的浓度约为2.5mg/mL，SDS-PAGE分析其纯度约为95％，间接ELISA方法检测其效价大于1:838860800。
结论：制备与纯化的兔抗FnBPA-A抗体可作为靶分子淘选噬菌体十二肽库。
实例2：FnBPA-A蛋白的抗原表位筛选与鉴定
2.1用兔抗FnBPA-A纯化抗体对噬菌体随机十二肽库进行淘选
噬菌体随机十二肽库试剂盒购自NEB公司，其中库容量为2.7×109个转化子，滴度为1.5×1013pfu/μL,Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。按试剂盒说明书进行淘选，简要过程如下:用0.1mol/L pH8.6 NaHCO3溶液将纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释至100μg/mL，包被96孔板，4℃过夜。次日，用TBST溶液(TBS+0.5％Tween-20)洗涤6次，加入5％BSA，37℃封闭1h。弃封闭液，将10μL原始肽库(1.0×1011PFU)、195μL TBST及195μL纯化后的阴性血清混匀后加入酶标孔，100μL/孔，温和震荡1h。弃孔内液体，TBST洗涤6次，用pH2.2，0.2mol/L甘氨酸-HCl洗脱缓冲液洗脱与抗FnBPA-A抗体特异性结合的噬菌体，并加入1mol/L pH9.1Tris-HCl缓冲液中和。取5μL洗脱液进行噬菌体滴度测定，其余噬菌体侵染E.coli ER2738进行扩增，用于下一轮淘选，共进行四轮淘选。为了获得高亲和力的特异性噬菌体，在四轮淘选过程中逐轮降低抗体浓度(从100μg/mL降至50μg/mL)，增加洗涤液中Tween-20的浓度(从0.1％增加到0.5％)，结果发现，噬菌体的投入与产出比逐轮升高，依次为1.8×10-5、1.9×10-4、6.5×10-4和8.9×10-3，特异性噬菌体克隆得到富集，第2、3和4轮淘选的富集倍数分别达到11、36和494倍。
2.2与抗FnBPA-A抗体特异性结合的噬菌体阳性克隆鉴定
随机挑选第四轮淘选后的25个噬菌体克隆进行夹心ELISA初步鉴定。即用浓度为100μg/mL的兔抗FnBPA-A抗体包被酶标板，4℃过夜。次日弃包被液，加入5％BSA，37℃封闭1h；倒掉封闭液，用TBST溶液洗涤6次。加入待检噬菌体克隆，108PFU/孔，每个克隆做3个重复，37℃作用2h，实验中设置空白对照(用PBS代替待检噬菌体克隆)和阴性对照(加原肽库中的M13噬菌体)。TBST洗涤6次，加入1:5000HRP标记鼠抗-M13抗体，37℃作用1h。此后，按洗涤、显色、终止、测定OD492nm的常规方法操作。结果有18个待检克隆的平均OD492nm值大于原始肽库噬菌体阴性对照平均OD492nm值的2.1倍，初步认为它们为噬菌体阳性克隆。
采用竞争抑制ELISA法对18个初筛噬菌体阳性克隆进一步鉴定。即用浓度为100μg/mL的兔抗FnBPA-A抗体包被酶标板，每个待鉴定克隆包被一排酶标孔，4℃过夜。次日弃包被液，封闭、洗涤同上。分别将不同浓度(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)的竞争物(包括rFnBPA-A蛋白及His标签蛋白)分别与初筛阳性噬菌体克隆(5.0×109PFU)等体积混合，取混合液分别加到抗体包被孔中，100μL/孔，37℃作用1h，TBST洗涤6次，余下步骤同上。试验中同时做未加竞争物的初筛阳性噬菌体克隆对照(即用PBS代替竞争物与噬菌体克隆等体积混合)。根据公式计算抑制率，抑制率(％)＝(未抑制OD492nm值－抑制后OD492nm值)/未抑制OD492nm值×100％。结果如表1所示，随着rFnBPA-A蛋白浓度的增加，其对C2、C8、C10、C11、C15、C19、C21和C23 8个初筛噬菌体克隆的竞争抑制率逐渐增加。当rFnBPA-A蛋白的浓度为200μg/mL时，对8个噬菌体克隆的竞争抑制率均大于50％，而相同浓度的游离His标签蛋白竞争物对上述8个噬菌体克隆的抑制率均低于20％，说明这8个噬菌体克隆为与rFnBPA-A抗体特异性结合的噬菌体阳性克隆。
表1不同浓度的竞争蛋白对噬菌体克隆的抑制率
2.3噬菌体阳性克隆DNA测序及其表面展示的表位肽分析
使用噬菌体DNA单链提取试剂盒(购自美国Omega公司)提取阳性噬菌体克隆的单链DNA，并委托上海英潍捷基生物技术有限公司对单链DNA样品进行测序。根据阳性噬菌体单链DNA中携带的外源基因序列，推导出展示于噬菌体表面的表位肽序列。结果如表2所示，8个噬菌体阳性克隆共展示6种不同的12肽序列，其中克隆C8、C11和C21展示相同肽序列(命名为P3)，另外5个克隆(C19、C23、C2、C10、C15)分别展示不同的肽序列(分别命名为P1、P2、P4、P5、P6)。将6个展示表位肽序列分别与GenBank收录的FnBPA-A蛋白序列进行比对分析，由表3可见，它们与FnBPA-A蛋白均无一级结构同源性(Score<50)，表明这6个展示肽均为FnBPA-A蛋白的模拟表位。
表2噬菌体阳性克隆展示肽序列
表3展示肽序列与FnBPA-A蛋白序列的比对结果
2.4模拟表位肽的肽ELISA验证
委托上海淘普技术有限公司采用固相合成法合成上述6个FnBPA-A蛋白的模拟表位肽(要求其纯度大于98％)，采用肽ELISA对其进行验证。简要过程如下:用浓度为40μg/mL的合成模拟表位肽包被酶标孔，4℃包被过夜。弃包被液，加入5％BSA封闭液，37℃封闭2h，0.5％PBST洗涤6次。加入1:200倍稀释的兔抗FnBPA-A抗体，同时做阴性血清对照以及1:200倍稀释的兔抗His标签蛋白抗体对照，37℃反应1h，0.5％PBST洗涤6次，加入1:5000HRP-羊抗兔，37℃孵育1h，0.5％PBST洗6次。加邻苯二胺底物溶液，室温避光作用10min，加入终止液，测定OD492nm值。若抗FnBPA-A抗体反应孔的OD492nm值大于与阴性血清反应孔2.1倍，同时兔抗His标签蛋白抗体反应孔OD492nm值小于阴性血清2.1倍，则判肽ELISA反应为阳性，即FnBPA-A抗体能够识别模拟表位。结果如图1所示，6个模拟表位肽与rFnBPA-A抗体反应的平均OD492nm值均大于其与阴性血清反应的平均OD492nm值的2.1倍，而与His标签抗体反应孔的平均OD492nm值均小于其与兔阴性血清反应孔平均OD492nm值的2.1倍。说明这些模拟表位肽与rFnBPA-A抗体的结合反应是特异性的，它们模拟了金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的免疫反应性。
结论：利用噬菌体展示技术筛选和鉴定到6个FnBPA-A蛋白的模拟表位。
实例3：FnBPA-A蛋白模拟表位的免疫活性检测
3.1实验小鼠的免疫与模拟表位肽的免疫原性检测
体重为18-20g的昆明系小鼠随机分成12组，每组20只。第1组为rFnBPA-A蛋白免疫组；第2组为噬菌体M13免疫组；3-8组分别为C2、C8、C10、C15、C19和C23阳性噬菌体克隆免疫组；9-11组为模拟表位肽P1与P2不同比列混合组；第12组为生理盐水对照组。rFnBPA-A蛋白免疫组小鼠注射弗氏佐剂乳化后的rFnBPA-A蛋白，30μg/只；阳性噬菌体克隆免疫组小鼠注射噬菌体克隆，1×1012pfu/只；模拟表位肽混合组小鼠注射弗氏佐剂乳化后的混合肽(P1与P2分别按质量比1:1、1:2和2:1配比)，30μg/只；对照组小鼠则注射生理盐水，100μL/只。首免后14d和24d各加强免疫一次，免疫剂量同首免。免疫后第34d从小鼠眼球静脉丛采血，5只/组，分离血清，采用间接ELISA检测各免疫组抗体产生水平。结果如表4所示，展示的6个模拟表位肽均能刺激机体产生特异性抗体，表明它们具有免疫原性，且以P1和P2的免疫原性较好。
表4免疫后第34d各免疫组小鼠血清中的抗体效价
3.2模拟表位肽的免疫保护性检测
免疫后第35d对各实验组小鼠进行攻毒试验。即以最小致死量(6.25×106CFU/mL)的金黄色葡萄球菌WWGSP-30分离株腹腔注射免疫小鼠，15只/组，0.5mL/只，同时以未免疫小鼠腹腔感染等量菌液作为对照。注射后观察7天，记录小鼠存活情况，计算免疫保护率：[免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％]。对死亡小鼠进行剖检，观察其病理变化，并无菌采取肝脏再次分离细菌。结果如表5所示，噬菌体M13免疫组、阳性噬菌体克隆C2、C8、C10和C15免疫组的小鼠全部死亡；阳性噬菌体克隆C19(展示模拟表位肽P1)和C23(展示模拟表位肽P2)免疫组小鼠的免疫保护率分别为25％和50％；模拟表位肽P1与P2以1:1、1:2和2:1质量比混合免疫组小鼠的免疫保护率分别为31.25％、18.75％和75％。死亡小鼠眼观病变为眼部有浓汁或出血，鼻部和爪尖出血；剖检病变为肺部出血、质地变脆，脾脏坏死，腹腔积液；使用金黄色葡萄球菌Baird-Paker选择培养基从肝脏中再次分离到金黄色葡萄球菌。
表5模拟表位肽的免疫保护性
结论：通过动物免疫后的抗体检测与攻毒试验确定表2中6个FnBPA-A蛋白的模拟表位肽均具有免疫原性，但只有P1和P2为具有免疫保护性的模拟表位肽，P1和P2按质量比2:1的组合物的免疫保护效果显著的好于单一免疫保护性模拟表位肽和FnBPA-A蛋白。
