用于原位合成探针阵列的探针倒转方法
交叉引用
本申请要求2015年8月18日提交的美国临时申请第62/206,741号和2016年2月9日提交的美国临时申请第62/293,203号的优先权，这些申请以引用的方式整体并入本文。
背景
诸如通过光刻法来合成原位合成阵列上的寡核苷酸探针可产生伴随在完全所需或预定长度下合成的探针序列(“全长”探针)的不完全或截短探针序列的群体。这类截短探针序列的存在可对于阵列性能具有不利影响，尤其在需要对于自由探针末端进行酶寻址的阵列中，诸如聚合酶延伸反应或连接反应。
相比之下，固定于珠粒阵列(例如，Illumina)和其他成点阵列上的寡核苷酸探针通常经由胺或合成连接至探针的5’末端的其他官能团来连接至其底物。以这种方式，仅全长序列得以固定，并且截短或与暴露自由3’末端相关联的其他缺陷得以减少或实际上消除。
发明内容
可能需要在合成后从原位合成阵列，诸如通过光刻法来制造的阵列上的探针之中选择性地移除截短探针序列。本公开提供完成截短序列的这种选择性去除的方法，同时使探针序列的定向倒转以使得从3’-末端合成的探针序列转化成经由其5’-末端来连接至底物的探针序列。
具体地说，本公开包括原位合成阵列的探针倒转方法，其可使用通用接头和可购得结构单元和试剂。这些方法可包括并入用于释放自由3’-OH末端的通用可裂解接头亚磷酰胺，并入具有用于寡核苷酸合成和合成后环化的正交保护、可寻址官能团的支链接头，使用可购得试剂的用于环化步骤的更有效交联化学，和其他改良。尝试对于原位合成阵列进行探针倒转的以前方法涉及大量特殊接头、结构单元和试剂，从而可能使得它用于原位合成阵列的大规模制造是不可行的。
本公开的方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多个分支接头的底物，其中所述底物包含多个羟烷基，其中每个分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的第一可裂解接头，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一叠氮化物基团；并且通过使所述第一叠氮化物基团与第二炔反应来环化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或邻接炔；其中当所述第二分支还包含加帽部分时，所述环化的效率增加。
在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由所述多个羟烷基来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由选自由图2A、图2B和图2C所示结构组成的组的第一中间物来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第二炔是所述第一炔。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头经由选自由图3A、图3B和图3C所示结构组成的组的第二中间物而变成所述分支接头的一部分。在本文提供方面的一些实施方案中，所述可裂解接头与所述第一炔之间的比率是约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.33、约0.25、约0.2或约0.1。如权利要求1所述的方法，所述方法还包含(c)裂解所述第一可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端与所述第二分支分离。在本文提供方面的一些实施方案中，所述裂解包含使用碱来去保护。在本文提供方面的一些实施方案中，所述所述效率是至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在本文提供方面的一些实施方案中，另一个第二分支包含偶合至第二寡核苷酸的3’末端的第二可裂解接头，其中所述第二寡核苷酸短于所述第一寡核苷酸，并且其中所述裂解将所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。在本文提供方面的一些实施方案中，所述裂解将至少90％的所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。
本公开的另一个方面提供方法，其包括：提供底物；
将多个分支接头连接至所述底物，其中所述分支接头包含(i)包含炔的第一分支和(ii)第二分支；将可裂解接头连接至所述第二分支的第一基团；将加帽部分连接至所述第二分支的第二基团；在所述可裂解接头上以3’至5’定向来合成第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括(i)经由所述可裂解接头来偶合至所述第二分支的3’末端和(ii)偶合至叠氮化物基团的5’末端；并且通过使所述叠氮化物基团与所述炔反应来环化所述第一寡核苷酸，从而将所述第一寡核苷酸的所述5’末端偶合至所述第一分支中的一个。
在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率在约5:1至约1:5之间。在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率是约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5。在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率是约1或更小。在本文提供方面的一些实施方案中，其中所述加帽部分经由加帽亚磷酰胺的中间物来连接。在本文提供方面的一些实施方案中，所述底物包含多个羟烷基。在本文提供方面的一些实施方案中，所述分支接头经由所述多个羟烷基来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述方法还包含(c)裂解所述可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端与所述第二分支的所述第一基团分离。在本文提供方面的一些实施方案中，第二寡核苷酸连接至所述第二分支的第三基团，其中所述第二寡核苷酸缺少连至所述第一分支的共价键，其中所述裂解将所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。在本文提供方面的一些实施方案中，底物包含受控微孔玻璃。在本文提供方面的一些实施方案中，所述合成包含光刻合成。
本公开的另一个方面提供系统，其包含：包含多个羟烷基的底物；和偶合至所述多个羟烷基的多个分支接头，其中每个所述分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含第一可裂解接头和加帽部分，其中所述第一可裂解接头偶合至第一寡核苷酸的3’末端，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一叠氮化物基团。
在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一叠氮化物基团与第二炔反应以环化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或邻接炔。在本文提供方面的一些实施方案中，所述可裂解接头与所述加帽部分之间的比率是约10、约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.33、约0.25、约0.2或约0.1。在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由选自由图2A、图2B和图2C所示结构组成的组的第一中间物来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头经由选自由图3A、图3B和图3C所示结构组成的组的第二中间物而变成所述分支接头的一部分。在本文提供方面的一些实施方案中，所述加帽部分是酰基、二烷氧基磷酰基、烷基、烷氧基羰基或二烷基氨基羰基。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头可使用碱，例如，氨、甲基胺、1,2-二氨基乙烷和碳酸钾来裂解。
本公开的另一个方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多个分支接头的底物，其中每个分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的可裂解接头，和其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至叠氮化物基团；使所述叠氮化物基团与第二炔反应以环化所述第一寡核苷酸，所述反应在室温下通过缓冲液中的Cu(I)催化剂来催化，所述第二炔是所述第一炔或邻接炔；并且(c)裂解所述可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸倒转。
在本文提供方面的一些实施方案中，所述第二炔是所述第一炔。在本文提供方面的一些实施方案中，方法还包含：(d)提供与在(c)中获得的倒转第一寡核苷酸的至少一部分互补的第二寡核苷酸，其中在与所述倒转第一寡核苷酸杂交之后，所述第二寡核苷酸留下3’突出端；并且(e)用聚合酶和荧光标记dNTP来延伸所述第二寡核苷酸，从而证实所述第一寡核苷酸的所述倒转。
本公开的额外方面和优势从以下详细说明变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的例示性实施方案。应当认识到的是，本公开能够具有其他以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种不同方面做出修改，所有均不脱离公开内容。因此，附图和详述应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图简述
本发明的新型特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述利用了本发明的原理的说明性实施方案的详细描述及其附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解：
图1A示出使探针倒转的示例性方法。
图1B示出用于分支接头(左侧)和可裂解接头(中心)，和溴己基亚磷酰胺(右侧)的示例性中间物。
图1C示出用于并入图1B的中间物的探针倒转的示例性寡核苷酸(SEQ ID NO:1)。
图2A示出产生分支接头的示例性中间物。
图2B示出产生分支接头的示例性中间物。
图2C示出产生分支接头的示例性中间物。
图3A示出产生可裂解接头(CL)的示例性中间物。
图3B示出产生可裂解接头(CL)的示例性中间物。
图3C示出产生可裂解接头(CL)的示例性中间物。
图4A示出未倒转寡核苷酸的示例性HPLC轮廓。
图4B示出没有加帽亚磷酰胺的倒转寡核苷酸的示例性HPLC轮廓。
图4C示出具有1:1比率的可裂解接头与加帽亚磷酰胺的倒转寡核苷酸的示例性HPLC轮廓。
图4D示出具有1:2比率的可裂解接头与加帽亚磷酰胺的倒转寡核苷酸的示例性HPLC轮廓。
图5A示出未倒转寡核苷酸的示例性质谱。
图5B示出倒转寡核苷酸的示例性质谱。
图6A示出没有寡核苷酸的对照芯片的示例性荧光图像。
图6B示出具有未倒转寡核苷酸的对照芯片的示例性荧光图像。
图6C示出具有倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图7A示出具有延伸反应之前的倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图7B示出具有倒转延伸寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图7C示出具有延伸反应之前的未倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图7D示出具有延伸反应之后的未倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图8A示出具有–NNT-3’的不同序列变换的寡核苷酸阵列(按呈现的顺序分别为SEQ ID NO 4和5)的示意图。
图8B示出具有延伸反应之后的倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图9A示出具有–NN-3’的不同序列变换的寡核苷酸阵列(按呈现的顺序分别为SEQ ID NO 6和5)的示意图。
图9B示出具有延伸反应之后的倒转寡核苷酸的芯片的示例性荧光图像。
图10示出具有与Cy3-标记互补DNA杂交的倒转核苷酸的晶片上的对准标志的图像。
图11A示出在单一碱基延伸中并入dGTP核苷酸的图像。
图11B示出在单一碱基延伸中并入dTTP核苷酸的图像。
图11C示出在单一碱基延伸中并入dATP核苷酸的图像。
图11D示出在单一碱基延伸中并入dCTP核苷酸的图像。
图12A示出在单一碱基延伸中将dGTP核苷酸并入倒转晶片芯片的3’位置的图像。
图12B示出在单一碱基延伸中将dTTP核苷酸并入倒转晶片芯片的3’位置的图像(插图：展示阵列特征的实际图像的放大部分)。
图12C示出在单一碱基延伸中将dATP核苷酸并入倒转晶片芯片的3’位置的图像。
图12D示出在单一碱基延伸中将dCTP核苷酸并入倒转晶片芯片的3’位置的图像。
详述
本公开提供环化并倒转原位合成寡核苷酸探针的方法。描述特定环化化学，包括使用溴基或碘化物基团的点击化学反应(click chemistry reaction)。这类反应可用于使寡核苷酸的5’末端结合至表面结合接头分子；然后，环化寡核苷酸可使其3’末端释放，从而将寡核苷酸倒转。本文公开的方法也可减少或消除不含有完全合成寡核苷酸序列的截短寡核苷酸探针，同时保存含有完全合成寡核苷酸序列的全长寡核苷酸探针。举例来说，全长寡核苷酸可在释放3’末端之前环化，而非全长寡核苷酸保持非环化并且因此在释放3’末端时从表面移除。
术语“寡核苷酸”可意指核苷酸链。在一些情况下，寡核苷酸小于200个残基长度，例如，15与100个之间的核苷酸长度。寡核苷酸可包含至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个碱基。寡核苷酸可为约3至约5个碱基，约1至约50个碱基，约8至约12个碱基，约15至约25个碱基，约25至约35个碱基，约35至约45个碱基，或约45至约55个碱基。寡核苷酸(也被称为“寡核苷酸”)可为任何类型寡核苷酸(例如，引物)。寡核苷酸可包含天然核苷酸、非天然核苷酸或其组合。
术语“点击化学”可意指模块化、宽范围、给出高产量、只产生无害副产物的反应，诸如可通过非色谱方法来移除，并且立体定向(但是不一定对映选择性)的副产物。示例性点击化学反应是叠氮化物和炔的胡伊斯根1,3-偶极环加成，即，叠氮化物与炔的铜催化反应以形成5员杂原子环，被称为Cu(I)催化叠氮化物-炔环加成(CuAAC)。
术语“点击化学部分”可为末端炔。
如本文使用的术语“约”是指指定量的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文使用的术语“环化(circularize)”或“环化(circularization)”是指使其两个末端经由共价键来连接至底物或支撑物的寡核苷酸结构。
随着快速基因组测序和大基因组数据库的出现，遗传信息可以无数方式来利用。这类应用中的一个是寡核苷酸阵列。寡核苷酸阵列，或普遍地被称为DNA微阵列或DNA阵列或DNA芯片的一般结构是表面上的点或可寻址位置的明确界定的阵列。每个点可含有相对短DNA链的层，被称为“探针”或“捕获探针”(例如，Schena编,“DNA Microarrays A Practical Approach”,Oxford University Press；Marshall等人(1998)Nat.Biotechnol.16:27-31；各自以引用方式并入本文)。至少存在用于产生阵列的两种技术。一种技术基于光刻(例如Affymetrix)，而另一种技术基于机器人控制喷墨(spotbot)技术(例如，Arrayit.com)。产生微阵列的其他方法是已知的并且可在本文中使用任何这类已知方法。
总体上，安置于阵列中的给定点的寡核苷酸(探针或捕获探针)被选择来结合核酸或目标核酸的互补核酸的至少一部分。在适当杂交条件下，将含水样品与阵列接触来安置。然后将阵列充分地洗涤以移除所有非特异性吸附物质。为了确定是否捕获目标序列，阵列可通过添加例如与目标序列的未占据部分互补的荧光标记寡核苷酸序列来“显影”。然后，微阵列使用输出阵列图像的微阵列读取器或扫描器来“读取”。展现强荧光的点对于此特定目标序列来说是阳性的。
探针可包含沉积以便产生成点阵列的生物材料。探针可包含根据其他技术来合成、沉积或定位以形成阵列的材料。因此，在下文出于便利，根据任何这些技术来形成的微阵列可总体上并且共同地被称为“探针阵列”。术语“探针”不限于以阵列格式来固定的探针。实际上，本文描述的功能和方法也可相对于其他并行测定装置来使用。举例来说，当探针固定于珠粒、光纤或其他底物或介质上或中时，可采用这些功能和方法。
在本公开的方法和系统中，探针可连接至固体底物。探针可直接或经由接头来结合至底物。接头可包含例如氨基酸、多肽、核苷酸、寡核苷酸或不干扰探针功能的其他有机分子。
固体底物可为生物、非生物、有机、无机底物或任何这些底物的组合。底物可以例如一个或多个颗粒、链、沉淀物、凝胶、薄片、管材、球、容器、毛细管、衬垫、切片、薄膜、板、载玻片或半导体集成芯片形式存在。固体底物可为扁平的或可采用替代表面配置。举例来说，固体底物可含有发生合成或沉积的凸起或凹陷区域。在一些实例中，可选择固体底物来提供适当光吸收特性。举例来说，底物可为聚合Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃(例如受控微孔玻璃)、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、铟锡氧化物(ITO)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅、半导体集成电路(IC)芯片的顶部介电层，或各种凝胶或聚合物诸如(聚)四氟乙烯、(聚)偏氟二乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、多环烯烃中的任何一个或其组合。
固体底物可包含聚合物涂层或凝胶，诸如聚丙烯酰胺凝胶或PDMS凝胶。凝胶和涂层可另外包含改变其物理化学性质例如疏水性的组分。举例来说，聚丙烯酰胺凝胶或涂层可在其聚合物结构中包含改性丙烯酰胺单体诸如乙氧基化丙烯酰胺单体、磷酸胆碱丙烯酰胺单体、甜菜碱丙烯酰胺单体及其组合。
DNA微阵列可使用预先合成寡核苷酸的空间引导原位合成或固定来制造。在两种情况下，合成寡核苷酸通常在添加单体的情况下在3’至5’方向上，使用标准3’-亚磷酰胺试剂和固相合成方案(例如，M.Egli等人编,“Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry”,John Wiley&Sons)来进行。主要杂质是由于不完全单体偶合以及在较小程度上脱嘌呤反应所产生的截短、部分长度序列。
在一方面，制造预先合成寡核苷酸探针的阵列通常涉及经由5’-末端将寡核苷酸共价连接至底物，当寡核苷酸在高通量合成器中合成时经由添加至末端的反应性改性剂(参见S.J.Beaucage等人Curr.Med.Chem.2001,8,1213-44)。这确保连接至支撑物的探针主要是全长序列，因为截短序列在合成期间被加帽并且变得无反应性(Brown T and Brown T,Jr.(2005-2015)Solid-phase oligonucleotide synthesis.[Online]Southampton,UK,ATDBio.<http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis>[2016年8月9日访问])。
本公开的显著优势是寡核苷酸探针的3’-羟基在底物的“远端”，并且自由地可用于酶反应，诸如模板引导的聚合酶催化链延伸和连接；并且可利用此特性来执行用于检测并定量遗传多态性的非常敏感和特异性测定(K.Lindroos等人Nucleic Acids Res.2001,29,e69；Gunderson KL等人Nature Genetics 2005,37,549-54)。
另一方面，DNA微阵列也可使用序列的原位合成直接在支撑物上制造。在此情况下，序列以高度并行方式通过使用喷墨的空间引导合成(T.R.Hughes等人Nature Biotechnol 2001,19,342-7；C.Lausted等人Genome Biol 2004,5,R58)、光刻技术(A.C.Pease等人Proc Natl Acad Sci USA 1994,91,5022-6；G.McGall等人Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:13555-60；S.Singh-Gasson等人Nature Biotechnol 1999,17,974-8；)或电化学技术(PLoS ONE 2006,1,e34；B.Y.Chow等人Proc Natl Acad Sci USA 2009,106,15219-24)来“印刷”。在此处，合成也在3’至5’方向上进行(虽然在5’至3’方向上的固相寡核苷酸合成是可行的，但是不太有效和经济，提供较低产率和产品纯度)。然而，所得探针在3’-末端处连接至底物，并且在合成期间出现的任何截短序列杂质保留于支撑物上，其在光刻合成的情况下可尤其造成问题(J.Forman等人Molecular Modeling of Nucleic Acids,第13章，第221页,American Chemical Society(1998)和G.McGall等人J.Am.Chem.Soc.119:5081-5090(1997))。因此，使用以这种方式制成的阵列，基于聚合酶的延伸测定通常是不可行的。
尽管上述限制，光刻合成仍然是制造极高密度DNA阵列的非常有吸引力的方法，因为它能够制造超过1千万个排列序列/cm2(A.R.Pawloski等人J Vac Sci Technol B 2007,25,2537-46)，并且在制造环境中是高度可扩展的。
因此，开发使这类探针阵列上的序列倒转的有效方法是非常合乎需要的。
多个探针可位于固体底物上的一或多个可寻址区域(点、位置等)，在本文中被称为“像素”。在一些情况下，固体底物包含至少约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000个具有探针的像素。在一些情况下，固体底物包含至多约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000个具有探针的像素。在一些情况下，固体底物包含约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超过1,000,000个具有探针的像素。
在一些情况下，具有不含有探针的像素是有用的。这类像素可充当对照点以便增加测量的质量，例如，通过使用结合至所述点来估计并校正非特异性结合。在一些情况下，可控制探针的密度以促进探针的连接或增强探针的随后检测。
在一些实例中，具有冗余像素是有用的，所述冗余像素具有与另一个像素相同的探针序列但是在实体上可能与其他像素不相邻或接近。通过这类探针阵列所获得的数据可能不太易发生制造非理想性和测量误差。
在一些情况下，除了并入目标中的标记以外，将标记连接至像素内的探针。在这类系统中，所捕获的目标可导致两个标记在像素中彼此紧密接近。如以前论述，特异性标记之间的相互作用可产生独特可检测信号。举例来说，在目标和探针上的标记分别是可参与荧光共振能量转移(FRET)现象的荧光供体和受体部分时，可检测到FRET信号强化或信号淬灭。
合成倒转寡核苷酸
图1A示出将原位合成探针阵列中的探针倒转并且移除截短探针序列的示例性方法。首先，制备合成底物，其包含可用表面基团诸如羟基，如图1A中示出。这些羟基是合成底物或支撑物上的羟烷基的一部分。举例来说，表面可用试剂例如羟烷基三烷氧基硅烷来改性以提供可用于分支接头连接的羟烷基。或者，聚合物薄膜可施加至合成底物或支撑物的表面，其中聚合物含有用于连接的自由羟基。此外，与DNA合成试剂和处理条件相容并且含有羟烷基的支撑物可用于连接分支接头。
然后，分支接头(例如，ALK，在图1B中)可经由各种中间物来添加至合成底物或支撑物的表面以便在一个位置/分支上引入炔并且在另一个位置/分支上引入DMT保护羟基(以便稍后连接寡核苷酸)。用于引入分支接头的上述中间物包括但不限于分支接头亚酰胺中间物(例如，图1B(左图)和图2C中的炔改性剂丝氨醇亚磷酰胺)，或如图2A和图2B中示出的中间物。
现在转向图2A和2B，乙酰丙基(LEV)是用于羟基的保护基并且可使用含有水合肼、醋酸和吡啶的试剂(例如，使用1:1吡啶/醋酸中的0.5M水合肼)来特异性地移除。4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)是可在酸性条件下移除的另一种羟基保护基。2-氰乙基(CE)是亚磷酸盐/磷酸盐保护基并且可在碱性条件下移除。图2A、2B和2C示出的分子可从Glen Research(Sterling,VA 20164)购得。
用于引入分支接头的中间体，例如，在图2A和图2B中示出的中间体，不但可与表面羟烷基反应以便连接至支撑物，而且具有两个正交保护羟基以允许引入叠氮化物连接寡核苷酸、炔或加帽部分。举例来说，需要少许额外步骤来将炔基团连接至分支接头的第一分支。首先，图2A和图2B中的亚磷酰胺中间物偶合至支撑物上的表面羟烷基，随后将所得亚磷酸盐氧化至磷酸盐。然后将LEV保护基团选择性移除而不影响DMT保护基团以致于揭露羟基。含有炔的亚磷酰胺，例如，化合物A，然后偶合至显露羟基以完成具有炔的第一分支的合成。将亚磷酸盐氧化至磷酸盐可在化合物A与表面羟烷基的反应之后执行。
或者，图2C中的炔改性剂丝氨醇亚磷酰胺可直接偶合至支撑物。因为炔基团预先安装于此中间物中，所以不需要额外步骤来将炔基团引入第一分支。
在安装含有炔基团的第一分支之后，可移除DMT保护基团以提供另一个羟基作为用于连接可裂解接头，随后连接寡核苷酸的处置柄。寡核苷酸可通过任何寡核苷酸合成法以逐步方式来引入。用于每一轮寡核苷酸合成，执行加帽步骤以便在延伸(在此自由羟基上没有寡核苷酸链的延伸)之后使用乙酰基或在磷酸化之后使用其他合适加帽分子将自由羟基加帽。以这种方式，防止加帽失败序列参与目标寡核苷酸的链延长的其余部分。因此，这些加帽失败序列是截短寡核苷酸，如图1A中示出。在寡核苷酸链延伸的最终步骤处，最后一个核酸的显露5’羟基可用含有叠氮化物的尾部来加帽。此步骤可通过首先引入在末端处具有离去基团的接头来实现。离去基团可为Cl、Br、I、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐或三氟甲磺酸盐。然后将离去基团用叠氮化物取代。溴化物至叠氮化物转化的实例在图1A的第二行中示出。
如上所述，接头可包含合成后反应性基团，诸如用于点击化学。举例来说，可使用炔基团，其在寡核苷酸的DNA合成期间可为稳定的，并且因此将不需要使用保护/去保护策略。具有亚磷酰胺部分的分支接头和可裂解接头可添加至合成底物或支撑物以提供稍后使用标准DNA合成方案来引入寡核苷酸的接近点。在一些情况下，接头可使用具有延长偶合时间(例如，3分钟)的标准DNA合成方案来添加至合成底物。
具体来说，在形成自由羟基之后，可裂解接头亚酰胺中间物(CL)可并入分支接头中，诸如图1B(中间图)、图3A、图3B和图3C示出的可裂解接头。可裂解接头可使用标准DNA合成方案来添加至合成底物。在一些情况下，可裂解接头可使用具有延长偶合时间(例如，3分钟)的标准DNA合成方案来添加至合成底物。
然后，标准寡核苷酸探针合成可在可裂解接头上经由其自由羟基来进行以便合成探针序列。合成探针序列可包含全长探针序列和截短探针序列。全长探针序列可在5’末端上包含具有溴基(例如，溴)基团的接头基团(参见，例如，图1A)或碘化物基团或在一个末端处包含其他离去基团。举例来说，DNA合成方案的最后偶合可使用5’-溴己基亚磷酰胺来执行以在合成寡核苷酸的5’末端处提供溴基团。在一些情况下，全长探针序列可包含5’末端上的–OH基团，并且–OH基团可与试剂反应以添加在其末端上具有所需离去基团(诸如Br、I、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐和三氟甲磺酸盐)的接头。然后，全长探针序列的5’末端上的这些离去基团可转化成其他基团，诸如叠氮化物基团。举例来说，叠氮化钠和碘化钠于DMF中的溶液可用于使合成寡核苷酸与离去基团在其5’末端上反应以提供叠氮化物基团。在一些情况下，合成底物可在与叠氮化物基团反应之前和/或之后加以洗涤(例如，使用乙腈)。
在一个实例中，受控微孔玻璃(CPG)珠粒用作合成底物，并且寡核苷酸探针在连接至底物的可裂解接头上得以合成。珠粒在管柱中使用乙腈来洗涤并且在氮气下干燥。然后，将洗涤珠粒添加至13毫克(mg)叠氮化钠和30mg碘化钠于2毫升(mL)于干燥DMF中的溶液并且在65℃下允许反应1小时。然后将反应混合物冷却并且用吸移管将溶剂移除，并且珠粒用2mL DMF和2mL乙腈洗涤两次。然后，将珠粒转移至管柱并且在氮气下干燥。寡核苷酸的5’末端羟基也可遵循由Eric T Kool(J Org Chem.2004,69,2404-2410)公布的报告方案来转化成含有叠氮化物的接头基团。
全长探针序列的末端上的叠氮化物基团可环化至相同或不同分支接头的另一个分支，例如，如图1A的第三行中示出。环化可经由点击化学(例如，Cu(I)点击化学或Cu+点击化学)来完成。用于点击化学的催化剂可为Cu(I)盐，或通过使用还原剂将Cu(II)试剂还原成Cu(I)试剂来原位制成的Cu(I)盐(Pharm Res.2008Oct；25(10):2216–2230)。用于点击化学的已知Cu(II)试剂可购得，包括但不限于Cu(II)-(TBTA)复合物和Cu(II)(THPTA)复合物。作为三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺的TBTA，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，是Cu(I)盐的稳定配位体。作为三-(羟丙基三唑基甲基)胺的THPTA是Cu(I)的另一个稳定剂。环化也可使用无铜点击DNA连接来完成，诸如通过环应变促进炔-叠氮化物环加成反应(参见，例如，Chem.Commun.,2011,47:6257-6259或Nature,2015,519(7544):486-90)。
可进行环化以使得仅全长探针序列得以环化。然后，可裂解接头可例如通过使用碱包括但不限于氨、甲基胺、1,2-二氨基乙烷和碳酸钾的标准去保护来裂解。可裂解接头的裂解可释放探针序列的3’-OH末端，从而释放截短探针序列并且使环化全长探针序列倒转，如图1A的第三行示出。
由于全长探针序列的大小和空间限制，炔与叠氮化物之间的点击化学反应的效率和位置可变化。在一个实施方案中，环化形成均连接至同一分支接头的炔基团与叠氮化物基团之间的共价键。在另一个实施方案中，环化形成各自连接至不同分支接头的炔基团与叠氮化物基团之间的共价键。虽然分子内反应(相对于同一分支接头)总体上优于分子间反应(在两个不同分支接头之间)，但是前体的反应性以及空间位阻可使得分子间反应更有利，尤其在与用于分子内反应的候选物相比，存在用于分子间反应的更多候选物时或在归因于空间位阻，与用于分子内反应的候选物相比，用于分子间反应的候选物更可接近时。如本文使用的环化效率是指在底物上的叠氮化物至1,2,3-三唑的转化率。
影响点击化学反应的效率的一个方法是改变底物上的炔与叠氮化物基团之间的比率。这可通过使第二接头上的可利用羟基与用于引入可裂解接头中间物和加帽部分的中间物混合物反应来实现。这类加帽部分可为酰基、二烷氧基磷酰基、烷基、烷氧基羰基或二烷基氨基羰基基团，其可与自由羟基反应并且使得羟基不可用于连接可裂解接头和随后带有叠氮化物的寡核苷酸。分支接头上的加帽部分的存在不仅减少与寡核苷酸相关联的空间位阻，而且它还提供较高炔与叠氮化物的比率以基于叠氮化物基团的消耗来改进环化效率。当加帽部分与用于引入可裂解接头的中间物一起添加时，叠氮化物基团可具有与其反应的多个邻接炔基团。
最后，本公开允许经由与表面上的羟基反应的个别亚磷酰胺单体来将带有叠氮化物的寡核苷酸和炔引入支撑物，而不是引入在分支接头上的寡核苷酸和炔。
所使用的接头，包括分支接头和可裂解接头，在诸如本文论述的寡核苷酸探针合成方法期间可为稳定的。接头的稳定性可允许寡核苷酸探针合成到无需使用保护-去保护步骤来保持接头。接头可缺少反应性物质。在接头中不存在反应性物质可导致接头在DNA合成方法期间呈惰性，从而可消除保护-去保护步骤的需要。在一些情况下，在DNA合成之前存在的接头的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％在DNA合成之后保持完整。
本文论述的探针倒转技术可在水性介质中进行。避免使用有机溶剂可使得这类技术更环保并且增加化学操作和废物处置的简易性。
本文论述的探针倒转技术可在至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0或13.5的pH下进行。本文论述的探针倒转技术可在至多约14.0、13.5、13.0、12.5、12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0或0.5的pH下进行。本文论述的探针倒转技术可在约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0或13.5的pH下进行。在一些情况下，本文论述的探针倒转技术可在生理pH或大约生理pH下，诸如在约7.365或约7.5下进行。在生理pH下进行反应可减少或消除操作苛刻物质或反应条件的需要，并且可使用水性介质。
本文论述的探针倒转技术可在约15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的温度下进行。本文论述的探针倒转技术可在至多约15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的温度下进行。本文论述的探针倒转技术可在至少约15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的温度下进行。在一些情况下，本文论述的探针倒转技术可在室温或大约室温下，诸如在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约20℃至约26℃，或约20℃至约22℃下进行。在室温下进行反应可减少或消除操作苛刻物质或反应条件的需要。
释放截短探针序列可增加存在于阵列中的全长序列的百分比。在一些情况下，在探针倒转方法之后保持结合至阵列底物的探针的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％是全长序列。在一些情况下，探针倒转方法可释放在探针倒转方法之前结合至阵列底物的截短探针的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％。
合成底物可包含不同形式或形状，诸如珠粒或扁平阵列。合成底物可包含任何合适材料，包括但不限于玻璃(例如，受控微孔玻璃)、硅或塑料。底物可包含聚合物涂层或凝胶，诸如聚丙烯酰胺凝胶或PDMS凝胶。凝胶和涂层可另外包含改变其物理化学性质例如疏水性的组分。举例来说，聚丙烯酰胺凝胶或涂层可在其聚合物结构中包含改性丙烯酰胺单体诸如乙氧基化丙烯酰胺单体、磷酸胆碱丙烯酰胺单体、甜菜碱丙烯酰胺单体及其组合。
对于各种应用，倒转探针可提供优于标准未倒转探针的许多优势。举例来说，如以上论述，探针倒转可移除大多数或全部不需要的截短序列，从而提供含有多达100％全长序列的倒转探针群体。另外，倒转探针可具有自由3’OH基团，其可有利于进行酶反应(例如，单一或多个碱基延伸、连接酶反应)。倒转探针也可用于通过合成来测序(SBS)。
实施例
实施例1–受控微孔玻璃上的探针倒转
具有炔部分的分支接头亚磷酰胺在DNA合成器上使用标准DNA合成方案来偶合至dT-衍生受控微孔玻璃(CPG)固体支撑物(参见，例如，图1A)。然后，可裂解接头(CL，参见图1B)使用标准程序来连接至分支接头(Alk，参见图1B)，随后合成19-基体DNA序列(5’-GGCTGAGTATGTGGTCTAT-3’(SEQ ID NO:1))。在最后寡核苷酸偶合步骤中，并入5’-溴己基亚磷酰胺(Br-Hex，参见图1B)(参见图1C)。DNA合成使用ABI 394 DNA合成器使用标准DNA合成方案来进行。延长偶合时间(3分钟)用于所有接头亚磷酰胺(Alk、CL和Br-Hex)。
一旦DNA合成完成，通过在65℃下在CPG固体支撑物上用DMF中的NaN3/NaI处理寡核苷酸1小时来将5’-溴基转化至叠氮化物基团。13mg叠氮化钠(NaN3)和30mg碘化钠(NaI)溶解于2mL干燥DMF中；然后将此溶液添加至2mL微量离心管中的负载于CPG珠粒上的寡核苷酸。在65℃下加热反应混合物1小时。在冷却之后，将反应混合物和CPG珠粒转移回到管柱。珠粒用水(4mL)和乙腈(6mL)洗涤，然后在氮气下干燥。
然后，点击环化使用铜催化叠氮化物-炔环加成(CuAAC)化学来执行。新鲜制备5mM浓度的抗坏血酸储备溶液(例如，2.0mL水中的1.8mg抗坏血酸)。铜(II)-TBTA储备溶液以55％DMSO中的10mM铜(II)-TBTA的浓度来制备(例如，将5mg CuSO4于1mL水中的溶液与11.6mg TBTA于1.1mL DMSO中的溶液混合)。具有炔-叠氮化物修饰寡核苷酸的CPG珠粒在耐压密闭的小瓶中与55μL水混合。将20μL的2M三乙基铵乙酸酯(TEAA)缓冲液(pH 7.0)添加至小瓶，随后添加95μL的DMSO。将小瓶涡动。然后，将20μL的5mM抗坏血酸储备溶液添加至小瓶，并且短暂涡动。溶液通过将氮气鼓泡通入其中1分钟来脱气。将10μL的10mM铜(II)-TBTA储备溶液添加至小瓶。然后将小瓶用氮气冲洗、密封、充分地涡动，并且在室温下过夜培育。小瓶中的最终浓度为约0.5μmol CPG珠粒、约50vol％DMSO、约50vol％水、0.5mM抗坏血酸、0.2M TEAA缓冲液，和0.5mM Cu-TBTA复合物。
仅具有叠氮化物官能度的全长寡核苷酸得以环化(参见，例如，图1A)。一旦点击环化完成，使用标准去保护条件(例如，在55℃下用NH4OH处理15小时)将寡核苷酸去保护并且从可裂解接头(CL)位点中裂解。
点击环化和探针倒转效率通过将标准未倒转寡核苷酸的HPLC轮廓(参见图4A)与倒转寡核苷酸的HPLC轮廓(图4B)比较来测试。标记为“1”的峰对应于未倒转寡核苷酸，而标记为“2”的峰对应于倒转寡核苷酸。HPLC分析展示约70％的寡核苷酸在测试反应条件下倒转。将点击环化反应时间从过夜增加至3天未增加倒转寡核苷酸的百分比。
点击环化的效率降低可归诸于致密CPG固体支撑物上的DNA分子的空间位阻。为了减少固体支撑物上的DNA探针密度，在第一亚磷酰胺(分支接头，Alk)偶合之后立即使用不同比率(例如，1:0、1:1、1:2)的可裂解接头(CL)与加帽亚磷酰胺(CAP，参见图4A中的插图)的混合物。直接在分支接头(Alk)偶合步骤之后使用加帽亚磷酰胺(CAP)可减少固体支撑物上的寡核苷酸密度，并且可增加可最后有助于点击环化的炔的百分比(参见图4A-4D，右图)。DNA密度减少50％(CL:CAP 1:1；叠氮化物:炔比率1:2，图4C)导致大约90％的寡核苷酸倒转。DNA密度减少66％(CL:CAP 1:2；叠氮化物:炔比率1:3，图4D)提供寡核苷酸的约100％倒转。倒转寡核苷酸的存在通过将点击环化之前的未倒转(参见图5A)的质谱点击环化之后的倒转寡核苷酸(参见图5B)的质谱比较来再确认。
实施例2–芯片上的探针倒转
芯片(例如，硅烷化玻璃表面)上的DNA合成以与在G.H.McGall,F.A.Fidanza,Photolithographic synthesis of arrays.In Methods in Molecular Biology:DNA Arrays,methods and Protocols；J.B.Rampal编；Humana Press:Torowa,NJ,2001；第170卷,71-101中所描述的方案类似的方式来进行。DNA密度减少不被视为对于芯片上寡核苷酸倒转是必不可少的，因为在具有和没有密度减少的情况下，倒转效率是相似的。为了在芯片上产生特定DNA特征，使用光可裂解亚磷酰胺代替标准DMT-亚磷酰胺。
在DNA合成之后，通过在65℃下用NaN3和NaI于DMF中的混合物处理2小时将5’-溴基转化成叠氮化物。13mg叠氮化钠(NaN3)和30mg碘化钠(NaI)溶解于2mL干燥DMF中；然后将溶液经由注射器添加至含有芯片的流槽，并且反应混合物在65℃下加热2小时，并且在1小时之后将新鲜反应混合物推至流槽中。在冷却至室温之后，将反应混合物移除并且寡核苷酸用DMF、水和乙腈洗涤，并且在氮气下干燥。
然后，全长寡核苷酸使用CuAAC点击化学来环化(参见，例如，图1A)。含有芯片的流槽用氮气冲洗约5-10分钟。反应混合物制备如下：将275μL水添加至2mL微量离心管，随后添加pH 7.0下的100μL的0.2M三乙基铵乙酸酯(TEAA缓冲液)和475μL的DMSO。将混合物涡动，添加100μL的5mM抗坏血酸储备溶液(如实施例1所描述)，并且将混合物短暂涡动。然后溶液通过将氮气鼓泡2分钟来脱气。将50μL的10mM铜(II)-TBTA储备溶液(如实施例1所描述)添加至混合物。反应混合物用氮气冲洗1分钟，然后在氮气氛下经由注射器添加至芯片。点击环化反应在室温下执行24小时。
点击环化之后，寡核苷酸用50％EDA/H2O混合物来去保护。EDA处理用于将DNA碱基去保护并且将寡核苷酸的3’末端从可裂解接头(CL)位点处裂解。在室温下将芯片在乙二胺(EDA)与水的1:1混合物培育7小时，并且每2小时将EDA:H2O去保护混合物用新鲜制备EDA:H2O混合物交换。其后芯片用水充分地洗涤，然后在4℃下存储。此步骤移除截短以及未环化寡核苷酸，只允许全长倒转寡核苷酸序列保持连接至固体表面。EDA处理还使得3'-OH基团可用于进一步酶干预(参见，例如，图1A)。
为了观测芯片上倒转寡核苷酸，将与倒转序列互补的Cy3-标记DNA序列用于杂交(参见，例如，图6A-6C)。通过在芯片顶部将500nM DNA溶液安置于4x盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)中，将倒转寡核苷酸与Cy3标记互补DNA序列杂交。在45℃下培育反应混合物1小时。其后芯片用4x SSC缓冲液洗涤几次。在杂交之后来自Cy3探针的荧光信号的存在证实在芯片上存在倒转寡核苷酸(参见图6C)。然而，在没有寡核苷酸的对照芯片中(图6A)或在没有点击环化的情况下将寡核苷酸去保护并裂解的芯片中(图6B)，未观察到荧光信号。这些实验证实所有芯片上寡核苷酸得以倒转。
倒转寡核苷酸上的3’-OH基团的存在通过使用荧光dNTP的引物延伸来证实并观测(参见，例如，图7)。首先通过在45℃下将芯片与4x SSC中的1μM DNA模板培育1小时来使倒转寡核苷酸与DNA模板(5’-CGAACGACGCAATAGACCACATACTCAGCC-3’(SEQ ID NO:2))杂交。其后，用水将过量DNA模板从芯片中洗掉。延伸反应混合物使用5μL的10x标准Taq缓冲液(最终量：1X)，8μL的5单位/μL TaqDNA聚合酶溶液(最终量：40单位)，包含Alexa568-dUTP、dATP、dCTP和dGTP的10μL的10μM dNTP(最终浓度2μM)和27μL水来制备。延伸反应混合物与杂交DNA模板一起安置于芯片顶部并且在50℃下在密封盒中在潮湿气氛下培育2小时。在延伸之后，芯片用水洗涤，然后成像。
荧光扫描展示来自倒转寡核苷酸的延伸部分的强烈信号(图7B)，而在不含有寡核苷酸的对照芯片中未发现荧光(图7A)。为了控制在5’OH未端处的非特异性引物延伸的可能性，对于具有自由5’OH的标准未倒转寡核苷酸执行引物延伸。在此情况下，在进行引物延伸反应之前(图7C)或之后(图7D)也未观察到荧光信号，指示在5’OH末端处缺少引物延伸。
实施例3–ABI合成寡核苷酸阵列的探针倒转
寡核苷酸阵列在ABI合成器上合成并且使用如本文论述的铜-催化叠氮化物炔环加成反应来倒转。一组阵列使用在3’末端处具有呈其不同变换形式(例如，-CCT-3’、-GCT-3’、-ACT-3’、-TCT-3’等，如图8A中示出)的序列-NNT-3’的三种核苷酸来制造。另一组阵列使用在3’末端处具有呈其不同变换形式(例如，-CT-3’、-GT-3’、-AT-3’、-TT-3’等，如图9A中示出)的序列-NN-3’的三种核苷酸来制造。
随后，倒转寡核苷酸阵列首先使用与端接–TAT-3’或–AT-3’的那些寡核苷酸互补的DNA模板来杂交。通过在45℃下将阵列与4x SSC中的1mL的1μM DNA模板培育1小时，将倒转寡核苷酸与DNA杂交。其后，首先使用4X SSC将过量DNA模板从阵列中洗掉，然后使用引物延伸缓冲液来洗涤。
然后，引物延伸以此模板使用Taq DNA聚合酶来执行。延伸反应混合物包含Taq多聚酶(8uL，40单位)和1μM的dNTP(包括Alexa568-dUTP)并且与杂交DNA模板一起安置于阵列顶部。将阵列在50℃下在密封盒中在潮湿气氛下培育1小时。一旦延伸完成，将阵列用水洗涤，然后成像。
成像实验在倒转寡核苷酸的3’末端完全匹配模板DNA的阵列区域中展示信号(参见图8B和图9B)。
实施例4–晶片上探针倒转
寡核苷酸阵列在晶片上合成并且使用如本文论述的铜催化叠氮化物炔环加成反应来倒转。
随后，倒转寡核苷酸阵列晶片通过在55℃下将对准标志与4x SSC缓冲液中的400μL的1μM Cy3-标记互补DNA序列杂交1小时来分析。其后，使用4x SSC将任何过量Cy3-标记DNA从阵列中洗掉，然后成像。图10示出具有与Cy3-标记互补DNA杂交的倒转核苷酸的晶片上的对准标志的图像。
然后通过在55℃下培育1小时将晶片芯片的顶部接头(FC2’)与FC2引物(FC2’的互补序列)杂交来执行单一碱基引物延伸(在与芯片上倒转DNA序列互补的目标序列上)。顶部接头包含倒转序列顶部的区域。过量引物使用4x SSC来洗掉，随后使用并入缓冲液来进行最终洗涤。
将含有DNA聚合酶和荧光团标记可逆终止子dNTP(所有四个核苷酸经过标记)的Illumina并入反应混合物(400μL)安置于晶片芯片顶部，所述晶片芯片已经与FC2引物杂交。将芯片在50℃下在密封盒中在潮湿气氛下培育1小时。一旦并入完成，将晶片阵列使用并入缓冲液来洗涤，然后成像(参见图11A-11D)。在通道1中发光的特征显示并入dGTP核苷酸(参见图11A)。在通道2中发光的特征显示dTTP并入(参见图11B)，并且在通道3中并入dATP(参见图11C)并且在通道4中并入dCTP(参见图11D)。晶片芯片的条形码区域(中间接头)含有具有不同碱基组合的序列阵列，并且出于任何特定原因，输入合成碱基可为四个碱基(A、T、G、C)中的任何一个。图11A-11D所示图像证明在阵列上的位置处观察发生哪一种碱基延伸的能力，从而允许通过合成来测序。
为了对于倒转晶片芯片序列进行单一碱基引物延伸，将3’阻断互补序列，即在5’位置处具有突出端(3’-ACGTTCGAACGTAGCT-5’(SEQ ID NO:3))的FC2，以与如上所述相同的方式与倒转晶片的顶部接头杂交。将含有DNA聚合酶和荧光团标记可逆终止子dNTP(所有四个核苷酸经过标记)的Illumina并入反应混合物(400mL)安置于晶片芯片顶部，所述晶片芯片已经与引物(3’ddc-FC2-突出端)杂交。然后将芯片在50℃下在密封盒中在潮湿气氛下培育1小时。一旦并入完成，晶片阵列使用并入缓冲液来洗涤，然后成像。特征只在通道2中发光，证明并入dTTP(参见图12B)。由于目标引物突出端中的第一碱基是dATP，酶只在倒转芯片的3’位置处并入dTTP。在任何其他通道中未观察到信号(参见图12A、12C-12D)。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员来说将显而易见，所述实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将会想到众多变化、改变和替代。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实行本发明。意图在于，以下权利要求书定义本发明的范围并且因此可涵盖处于这些权利要求书范围内的方法和结构以及其等效物。
