一种高密度、高稳定性的核酸芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因芯片技术领域，特别涉及一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法。
背景技术
基因芯片又称DNA芯片，广泛应用于DNA测序，基因表达和表达差异，基因突变和基因组多态性检测，病原分析，基因诊断和疾病预后分析，病理学、毒理学、药理学、疫苗研究和肿瘤研究等多个方面。
基因芯片的制备方法主要有物理吸附、共价键连接、链亲和霉素-生物素三种方法。第一，物理吸附主要是利用DNA探针带负电荷与固相支持表面的正电荷之间的吸引力的作用。物理吸附的优点是不需要对核酸进行修饰，简单、直接、快速等；缺点是连接DNA探针杂乱无章拥挤没有方向性，比较容易解析，不能够重复利用等。第二，共价键连接是利用固相支持物表面进行化学修饰活化，对核酸末端进行化学官能团修饰，通过化学共价键将DNA探针连接到固相基底。共价键连接的优点是连接稳定好，键合力强，可以重复利用等；缺点是需要利用各种化学分子进行键合作用，键合时间长，不可逆转性，局部拥挤效应等。第三，链亲和霉素-生物素是利用链亲和霉素修饰在固相支持物上，将生物素修饰在DNA末端，通过利用链亲和霉素与生物素之间的相互作用使得DNA固定化。链亲和霉素-生物素的优点是有比较好的方向性、特异性和功能性，比较容易控制，可逆转性等；缺点是价格昂贵，芯片生产缓慢，拥挤效应，特定的生物适合的条件要求，不能重复利用等。图1是DNA芯片的制备方法的示意图。
目前，商业化基因芯片主要为氨基芯片和醛基芯片，二者都属于共价键连接的芯片。其中醛基芯片适用于DNA富集，但醛基芯片上的化学官能团修饰为可逆反应，DNA探针容易脱落，连接不稳定。图2是商业化DNA芯片醛基芯片的制备示意图。
因此，本领域需要改进核酸与固相支持表面的连接。
发明内容
本发明的目的在于克服目前现有技术的不足，提供了一种新型的、简单的化学修饰方法，高密度、高稳定地连接目标核酸探针。本发明通过对固相基底材料表面进行氨基衍生、活性基团氯修饰，进而连接氨基核酸探针,制备出高密度，高稳定性的核酸芯片。
因此，本发明提供了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；
(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；
(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；
(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；
(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应；
(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；
(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在60℃至70℃，优选65℃下进行反应获得基因芯片。
在一个实施方案中，所述第一和第二氨基衍生试剂选自：多聚赖氨酸、不同类型的氨基硅烷偶联剂、不同分子量的聚乙烯亚胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等带有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一种。
在一个实施方案中，所述第一氨基衍生试剂为氨基硅烷偶联剂。
在一个实施方案中，所述第二氨基衍生试剂为聚乙烯亚胺。
在一个实施方案中，所述氯修饰试剂为三聚氰氯。
在一个实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)1-5次。
在一个实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)直至所述固相基底上达到最大活性基团氯数量。
在另一方面，本发明还涵盖利用本发明的方法制备的核酸芯片以及用于核酸芯片的片基。
因此，本发明还提供了一种核酸芯片，所述核酸芯片包括：表面上连接有活性基团氯的片基和氨基修饰的探针，所述氨基修饰的探针的氨基通过与所述片基表面上的活性基团氯的SN2亲核取代反应固定于所述片基表面。
在一个实施方案中，本发明还提供了一种用于核酸芯片的片基，所述用于核酸芯片的片基包括：
硅基固相基底、第一氨基衍生试剂、第二氨基衍生试剂和氯修饰试剂；
所述第一氨基衍生试剂通过-O-与所述硅基固相基底偶联；
所述氯修饰试剂通过两种方式连接在所述硅基固相基底表面上：
(1)所述氯修饰试剂的第一活性基团氯与连接在固相基底上的第一氨基衍生试剂的氨基发生SN2亲核取代反应；或
(2)所述第二氨基衍生试剂的第一氨基与连接在所述硅基固相基底表面上的氯修饰试剂的第二活性基团氯发生SN2亲核取代反应，连接在所述硅基固相基底表面上；所述氯修饰试剂的第一活性基团氯与连接在所述硅基固相基底表面上的第二氨基衍生试剂的第二氨基发生SN2亲核取代反应。
在一个实施方案中，所述氯修饰试剂为三聚氰氯。
在一个实施方案中，在所述硅基固相基底表面有最大活性基团氯数量。
利用本发明的方法制备的核酸芯片密度高，稳定性高。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明
图1是DNA芯片的制备方法的示意图，从A-C分别示例性给出了物理吸附、共价键连接、链亲和霉素-生物素结合。
图2是商业化DNA芯片醛基芯片的制备示意图。
图3示出了本发明的DNA芯片的制备方法一个示例。A示出玻片上的硅被浓硫酸双氧水羟基化，得到羟基化玻片；B示出将所述羟基化玻片与氨基硅烷偶联剂进行偶联；C示出将所述氨基化玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯通过与聚乙烯亚胺发生SN2亲核取代反应连接至所述氨基化玻片上；D示出将C中得到的玻片与聚乙烯亚胺反应；E示出将D中得到的玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯通过氨基连接至所述氨基化玻片上；F示出将氨基修饰的探针与连接三聚氰氯的玻片进行反应获得核酸芯片。图C-E中，(a)和(b)为同一结构的不同表示。
图4示出了利用x射线光电子能谱仪(xps)获得芯片表面活性基团的图谱，通过所述图谱可以确定每步反应的分子结构：A为羟基片表征图谱；B为氨基片表征图谱；C为聚合物玻片表征图谱；D为DNA芯片表征图谱。
图5示出了通过qPCR检测目标DNA浓度。
具体实施方式
本发明通过利用化学方法将目标核酸探针固定于固相基底材料上的核酸芯片技术，尤其是利用特定的固相基底材料及特殊的化学修饰把大量目标核酸探针高密度、高稳定地固定于基底材料上
本发明提供了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；
(2)将所述羟基化的固相基底与氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；
(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；
(4)将步骤(3)得到的固相基底与氨基衍生试剂反应；
(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂反应；
(6)重复步骤(4)、(5)直至所述固相基底上达到最大活性基团氯数量；
(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底进行反应获得核酸芯片。
优选地，在步骤(3)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(4)中，在室温下进行反应；在步骤(5)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(7)中，在60℃至70℃，优选65℃下进行反应。
在本发明中，步骤(4)中，固相支持物表面的三聚氰氯与氨基衍生试剂发生SN2亲核取代反应，使得氨基衍生试剂能够共价连接于固相支持物表面；在步骤(5)中氯修饰试剂上的氯与连接在固相基底上的氨基发生SN2亲核取代反应，从而使得氯基团固定于固相支持物表面。通过如此循环(步骤6)，放大活性基团氯的数量。也就是说，每次亲核取代反应引入更多的氨基和/或活性基团氯，直至固相支持物表面达到饱和。
在本发明中，氨基修饰的核酸探针可以是DNA探针、RNA探针或其他核酸类似物探针。DNA氨基修饰探针的制备方法是，首先通过数据库筛选目标序列，设计探针；通过高通量基因合成平台合成探针；通过基因克隆技术制备探针模板；最终利用氨基修饰的引物，通过PCR技术生产出氨基修饰的DNA探针。RNA氨基修饰探针的方法：首先通过数据库筛选目标序列，设计探针；通过高通量基因合成平台合成探针；通过基因克隆技术制备探针模板；最终通过逆转录生产出氨基修饰的RNA探针。
在本发明中，所述硅基固相基底可以为玻璃、陶瓷、硅、石英等材质。这些材质表面都可以提供用于羟化的硅。
本发明中，所使用的氨基衍生试剂指的是分子中含有伯氨基和仲氨基的有机试剂，可以为多聚赖氨酸、不同类型的氨基硅烷偶联剂、不同分子量的聚乙烯亚胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等带有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一种。
本发明中所使用氯修饰试剂优选是有机试剂三聚氰氯。
本发明中所使用的溶剂为一般的有机溶剂，例如为正己烷、异辛烷、丙酮、四氢呋喃中的任意一种。
在本发明中，发明人不希望拘囿于任何理论，因为单个的固相支持物表面积是一定的，重复到一定次数芯片表面活性基团数量就会达到相对饱和，达到所述固相基底上达到最大活性基团氯数量。在本发明中，所述固相基底上达到最大活性基团氯数量是指继续重复的情况下活性基团氯基本不增加，或者仅稍微增加，例如再增加重复每次仅增加小于5％，优选小于2％，更优选小于1％。
在本发明中，室温是指15℃-40℃，优选20℃-30℃，最优选25℃。
氨基修饰的核酸或氨基修饰的探针，氨基修饰可以是内部氨基修饰、5'氨基修饰和3'氨基修饰：
(1)内部氨基修饰，主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接，目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin修饰。
(2)5'氨基修饰，可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片(DNAMicroarray)和多重标记诊断系统。目前提供5'C6氨基修饰和5'C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
(3)3'氨基修饰，目前提供3'C6氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
对于本发明使用的氨基修饰的探针，可以通过探针提供商商业化获得。
在本发明中，只要能够提供活性氨基与活性基团氯发生SN2亲核取代反应，用于与反应即可，并不局限于任何氨基修饰方式。虽然内部氨基修饰、5'氨基修饰和3'氨基修饰都可以用于实现本发明，但优选使用5'氨基修饰的探针。5'氨基修饰的探针在探针扩增时，可以通过5'氨基修饰的引物扩增获得，5'氨基修饰的引物通常可以通过引物提供商商业化获得。
在本发明中，优选所使用的DNA探针为氨基修饰DNA探针。
在一个实施方案中，本发明的高密度、高稳定性的DNA芯片的制备方法包括步骤：
(1)将玻片上的硅羟基化，得到羟基化玻片；
(2)将所述羟基化玻片与氨基硅烷偶联剂进行偶联，得到氨基化玻片；
(3)将所述氨基化玻片与三聚氰氯(例如三聚氰氯的四氢呋喃溶液)反应；
(4)将步骤(3)得到的玻片与聚乙烯亚胺反应；
(5)将步骤(4)得到的玻片与三聚氰氯(例如三聚氰氯的四氢呋喃)反应，
(6)重复步骤(4)、(5)直至芯片表面达到最大活性基团氯数量；
(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的玻片进行反应获得核酸芯片。
优选地，在步骤(3)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(4)中，在室温下进行反应；在步骤(5)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(7)中，在60℃至70℃，优选65℃下进行反应。
实施例
制备实施例
本发明的核酸芯片的制备的具体操作工艺如下：
(1)将玻片用蒸馏水、铬酸洗液清洗过后，浸没于浓硫酸：双氧水(30％)＝1：1混合溶液中，70℃条件下反应2h，得到羟基化玻片，见图3A；图3A示出玻片上的硅被浓硫酸双氧水羟基化，得到羟基化玻片。
(2)将上述羟基化玻片浸没于15％氨基硅烷偶联剂(本实施例中使用的是γ-氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液中，50℃反应24h，得到氨基化玻片，见图3B；图3B示出将所述羟基化玻片与氨基硅烷偶联剂进行偶联。
(3)称取三聚氰氯5mmol，将其溶于300ml四氢呋喃(THF)溶剂中，将氨基化处理的玻片置于该反应体系，冰浴超声4℃条件下反应1h，四氢呋喃超声清洗，空气中干燥，该过程如图3C所示；图3C示出将氨基化玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯上的氯与连接在固相基底上的氨基衍生试剂的氨基发生SN2亲核取代反应，连接至所述氨基化玻片上，(a)和(b)为同一结构的不同表示。
(4)将步骤(3)得到的玻片置于0.1％聚乙烯亚胺水溶液中，室温超声反应1h，去离子水超声清洗，氮气吹干，该过程如图3D所示；图3D示出将步骤(3)中得到的玻片与聚乙烯亚胺反应，(a)和(b)为同一结构的不同表示。
(5)称取三聚氰氯5mmol，将其溶于300ml四氢呋喃(THF)溶剂中，将步骤(4)得到的玻片置于该反应体系中，冰浴超声4℃条件下反应1h，四氢呋喃超声清洗，空气中干燥，该过程如图3E所示；图3E示出将步骤(4)中得到的玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯上的氯与连接在固相基底上的氨基衍生试剂的氨基发生SN2亲核取代反应，连接至所述氨基化玻片上，(a)和(b)为同一结构的不同表示。
(6)重复步骤(4)、(5)步骤一次；
(7)将1012个氨基修饰的DNA探针涂布于步骤(6)得到的芯片表面，65℃条件下进行反应，制备成芯片，通过富集目标DNA并进行浓度检测得到芯片表面探针数量为109个。
在本实施例中，氨基修饰探针制备原理：首先通过数据库筛选目标序列，设计探针；通过高通量基因合成平台合成探针；通过基因克隆技术制备探针模板；最终利用氨基修饰的引物为5'C6氨基修饰(该氨基修饰的引物由苏州泓迅科技股份有限公司提供)，通过PCR技术生产出氨基修饰的探针。
方法如下：
a.Top10感受态细胞制备-CaCl2热激法；
b.将目的探针序列转化至质粒pUC57中构建重组质粒；
c.采用热激法将重组质粒转入感受态细胞Top10中；
d.采用Amp抗性平板筛选阳性克隆后用于PCR扩增模板；
e.目的片段获得：
PCR反应体系：
反应程序：95℃3min；29个循环：(95℃30s，初次66℃，每个循环-0.2℃72℃60s)；72℃5min；12℃维持。
f.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的片段采用天根凝胶回收试剂盒纯化回收。
g.Quit测定纯化产物的浓度。
在本实施例中，探针固定方法步骤如下：
将氨基DNA探针点制在芯片上后，探针上的氨基将和基片表面的氯发生置换反应而固定DNA探针，具体的化学反应过程如图3F所示，图3F示出将氨基修饰的探针与连接三聚氰氯的玻片进行反应获得核酸芯片：
a.配制点样液：将氨基修饰的dsDNA探针与20×SSC缓冲液配制点样液，探针终浓度为25mM，3×SSC；
b.准备密闭水化容器：将饱和食盐水浸湿的吸水纸置于密闭容器底部；
c.涂覆探针：用毛细管将点样液均匀涂布于P-基片上；
d.紫外处理：将芯片放入紫外交联仪，600mj处理；
e.过夜水化：将涂布好的芯片置于步骤(2)中备好的密闭玻容器中，悬浮于吸水纸上方，37℃处理过夜；
f.点样后漂洗：含有0.2％SDS的2×SSC清洗液摇床漂洗5min，1×SSC清洗液摇床漂洗5min，ddH2O摇床漂洗5min，氮气干燥；
g.封闭：Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)封闭处理5min；
h.蒸馏水漂洗三次，每次摇床处理5min；
i.氮气干燥，4℃干燥密封保存。
所述反应步骤(6)中，重复(4)、(5)步反应一次即可达到最大活性基团修饰数量。
所述反应步骤(7)中所使用的氨基探针数量可以为107-1013个。
通过x射线光电子能谱仪(xps)可以确定每步反应的分子结构，对本发明核酸芯片的制备过程进行检测的方法步骤如下：
1)通过利用x射线光电子能谱仪(xps)得到芯片表面活性基团修饰成功(见图4)。
图4示出了利用x射线光电子能谱仪(xps)获得芯片表面活性基团的图谱：A为羟基片表征图谱，证明了将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；B为氨基片表征图谱，证明了将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；C为聚合物玻片表征图谱，证明了将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在得到偶联活性基团氯的固相基底；D为DNA芯片表征图谱，证明了将氨基修饰的探针与固相基底反应获得DNA芯片。在图4B中，结合能为400eV处比图4A中多了一个N峰，表明氨基在固相支持物表面修饰成功；图4C中结合能为200eV处比图4B又多了一个Cl峰，表明活性基团Cl在固相支持物表面修饰成功，而且图4C中的N峰明显比图4B中的N峰高出很多，表明我们通过氨基衍生试剂来增加固相支持物表面活性基团数量取得了极大的成功；图4D中结合能为135eV处比图4C又多出了一个P峰，表明氨基修饰DNA成功连接于固相支持物表面。
2)利用DNA杂交技术富集目标DNA，并回收目标DNA，通过qPCR检测目标DNA浓度，得到芯片表面探针数目(见图5)。
图5示出了通过qPCR检测目标DNA浓度。从图5可以看出：本发明的方法制备的芯片(P1P2P3)通过Qpcr检测Cq值约13～15，而商业醛基片检测Cq值约为23，这代表本发明的方法制备的芯片富集产物浓度是商业醛基片(CHO)的10～100倍。
本发明有如下技术效果：
(1)本发明所使用的试剂三聚氰氯三个氯原子为可温控反应，第一个氯原子在0℃左右即可反应，第二个氯原子在室温条件下反应，第三个氯原子在65℃左右才能反应，这样就能大大提高了芯片表面活性基团的数量，而且三聚氰氯反应生成三聚氰胺在DNA杂交条件下性质稳定探针不易脱落，可重复利用多次。
(2)本发明所使用的氨基衍生试剂为各种多氨基化合物，其大大提高了芯片表面的活性位点，进一步提升了芯片表面活性基团的密度。
