一种蛋白质芯片的快速制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质芯片的快速制备方法，具体涉及在没有遗传材料或遗传材料高度可变的情况下，快速获取蛋白质或蛋白质共有氨基酸对应的基因、可溶性蛋白质，快速制备蛋白质芯片。
背景技术
2000年以后，新发重大传染病的频率逐步提高，带来的卫生灾难越来越大，呈愈演愈烈之势，SARS冠状病毒、埃博拉病毒、MERS冠状病毒、寨卡病毒等，给当地居民的生命健康带来巨大威胁。同时，一些常见的微生物，如流感病毒、登革病毒、艾滋病毒、结核分枝杆菌、霍乱弧菌等，通过遗传突变，使其能够逃避宿主免疫系统，产生耐药性，极大降低当前诊断、治疗措施的有效性，也给当地居民的健康产生巨大挑战。因此，快速、高效、系统、全面地了解微生物的生物学特性，尤其是病原微生物的免疫原性、致病机理、与宿主间的相互作用等，是有效诊断技术发展、新疫苗研制、治疗方案开发的关键。此外，高致病性、高传染性、高突变率等特性，进一步加大了相应微生物基础研究的难度。
作为一种高通量分析检测平台，凭借其独特的优势，如体积小、通量高、分析检测速度快、样品需求量少等，蛋白质芯片已在生命科学及医学等相关领域发挥了巨大作用。借助蛋白质芯片技术，可实现快速、高效、系统地了解病毒及其他微生物的生物学特性。但是，蛋白质芯片的制备是其应用的前提。目前蛋白质芯片制备的缺陷，主要集中于以下几个方面：制备周期长；过程极其繁琐；严重依赖原始遗传材料或基于原始遗传材料而构建的cDNA文库；忠实反应原始核酸序列，增加异源表达获得足够、相应可溶性蛋白质的难度；无法应对核酸序列高度可变的状况等。这些缺点限制了蛋白质芯片的制备效率及应用前景。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的就是建立一种蛋白质芯片的快速制备方法，以弥补已有方法的不足，为微生物，尤其是具有高致病性、高传染性、高突变率等特性的病原微生物的基础研究，提供快速、高效、全局性的研究手段和技术平台，从而为其诊断、防控、疫苗研制、新药研发等奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种蛋白质芯片的快速制备方法，所述构建方法是基于重组蛋白质构建的。其中，所述重组蛋白质是不同微生物之间存在的高度可变氨基酸序列的共有序列，或者是不同微生物之间存在的某一个或者几个自然存在的既定氨基酸序列。
优选地，所述重组蛋白质是通过转化子构建，蛋白质异源表达，高通量获得亲和纯化用标签融合的重组蛋白质。
优选地，所述转化子构建中采用的遗传材料是通过全基因合成的；其中，所述遗传材料的序列信息是通过如下方法获取的：
通过分析不同微生物的现有蛋白质氨基酸序列，获得高度可变氨基酸序列的共有氨基酸序列，或者某一个或者几个自然存在的既定氨基酸序列；并按照标准密码子表将所述氨基酸序列转化成对应的核苷酸序列，进一步优化，即得相应遗传材料的序列信息。
进一步地，所述优化的因素包括：蛋白质异源表达宿主(如E.coli菌株BL21、Pichia pastoris、CHO细胞等)使用密码子的偏好性、限制性酶切位点、GC含量、CpG含量、对应mRNA的二级结构、潜在剪接位点、mRNA的多聚腺苷酸位点、内部χ位点、内部核糖体结合位点、负调控的CpG岛、RNA不稳定基序、重复序列、干扰克隆操作的限制酶切位点等。
优选地，所述分析具体是采用聚类分析。
优选地，所述聚类分析具体是在超级计算机上使用软件muscle3.8.31进行的。
优选地，所述聚类分析后还需进一步使用软件Matlab R2014b中seqconsensus函数。
优选地，所述微生物包括登革病毒的不同毒株。
优选地，所述毒株包括I型、II型、III型和IV型。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明借助全基因合成的方式，极大提高了遗传材料获取的效率，进而将显著缩短蛋白质芯片的制备流程。此外，该策略还具有无需接触原始遗传材料、可以应对氨基酸序列高度可变的状况、提高蛋白质异源可溶性表达的成功率及蛋白质的表达量等优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为登革病毒蛋白质芯片制备流程图；
图2为所纯化登革病毒蛋白质的Western Blot结果，其中☆表示目标蛋白质所在的位置；
图3为所制备登革病毒蛋白质芯片的质检结果：其中，A是登革病毒蛋白质芯片的点制模式图；B是芯片扫描结果图；C是登革病毒蛋白质芯片的信号强度统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本实施例提供一种登革病毒蛋白质芯片的快速制备方法，登革病毒蛋白质芯片的构建流程见图1，整个流程可以在1个月时间内完成。以下为整个流程的详细流程及参数：
1、获得登革病毒的共有序列信息
从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnologyinformation)网站上查找，登革病毒相关的多蛋白氨基酸序列。
使用软件muscle3.8.31在超级计算机上进行聚类分析，而后将所有I型登革病毒、II型登革病毒、III型登革病毒和IV型登革病毒的多蛋白氨基酸序列，重新使用软件muscle3.8.31在超级计算机上进行聚类分析后，输出比对文件，进一步使用软件MatlabR2014b中seqconsensus函数，分别返回I型、II型、III型和IV型登革病毒的共有序列。
最后，获得每一血清型登革病毒三个结构蛋白质(C、prM、E)和八个非结构蛋白质(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2k、NS4B、NS5)所对应的氨基酸共有序列。
2、优化基因序列
根据E.coli BL21菌株使用密码子的偏好性，将获得的共有氨基酸序列，分别转换成对应的核苷酸序列后，经过OptimumGeneTM优化，最终获得44种蛋白质对应的核苷酸序列信息。
3、全基因合成
根据上述获得的核苷酸序列信息，通过全基因合成，快速获得所有蛋白质对应的遗传材料。
4、高通量纯化蛋白质
a.构建转化子
将上述获得的遗传材料，通过标准的分子遗传操作，通过限制酶BamH I、EcoR I，连接至表达载体pGEX-4T-1，经电泳、测序验证正确后，转化E.coli BL21，构建能够表达目标蛋白的转化子。添加等体积的50％浓度甘油，保存于-80℃冰箱，待用。
b.活化转化子
使用96孔深孔板，每孔添加800μL的LB培养基(含有100μg/mL的氨苄青霉素)，分别培养转化子，37℃，200rpm，培养过夜。
c.诱导转化子
使用12通道板，每一通道添加6mL的LB培养基(含有100μg/mL的氨苄青霉素)。按照1％的接种量，使用排枪，将上述活化的转化子，接种至12通道板中。37℃，90rpm，培养2.5h。每一转化子培养12mL。
添加诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM。16℃，90rpm，诱导过夜。
3900rpm，离心10min，弃上清。使用预冷的PBS缓冲液(配方见表1)，洗涤菌体后，转移至96孔深孔板中。3900rpm，离心10min，收集菌体。
d.重组蛋白质的高通量纯化
在常温与-80℃，冻融三次。每孔添加500μL的裂解液(配方见表2)，200μL的锆珠，使用方形硅胶盖封口。在冷库中，使用高通量细胞破碎仪，震荡6次，每次1min。震荡间隔1min，置于冰上。3900rpm，4℃，离心10min，取上清。
使用100mL的1％琼脂，将NUNC 96孔过滤板封底。使用裂解液洗涤谷胱甘肽层析介质3次，添加至NUNC 96孔过滤板中，每孔50μL。最后将96孔深孔板中的上清液，转移至NUNC96孔过滤板中。使用锡箔纸，封口。置于4℃，50rpm，孵育2h。
去掉NUNC 96孔过滤板琼脂封底，置于96孔深孔板中，4℃，3900rpm，离心10min。NUNC 96孔过滤板中，每孔添加250μL PBS(含0.1％吐温20)。4℃，3900rpm，离心10min。重复3次。
NUNC 96孔过滤板中，每孔添加50μL洗脱缓冲液(配方见表3)。4℃，静置15min。将NUNC 96孔过滤板，置于96孔PCR板中。4℃，3900rpm，离心10min。96孔板中收集的蛋白质，即为纯化的目的蛋白质。保存于-80℃，待用。
e.Western Blot检测
SDS-PAGE：将每一纯化的蛋白质，吸取8μL，与2μL SDS-PAGE上样缓冲液。混匀后，95℃变性10min。使用浓度为10％的分离胶，每一样品的上样量为10μL，同时添加5μL的分子量标准，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为80V，30min；120V，90min。
转膜：使用醋酸纤维素膜。转膜条件为160mA，78min。(转膜缓冲液的配方见表4)
封闭：用5％脱脂奶粉的PBS(含0.1％吐温20)，室温封闭1h，50rpm。
孵育一抗：按照1:5000，使用PBS(含0.1％吐温20)稀释兔抗GST抗体。室温孵育1h，50rpm。使用PBS(含0.1％吐温20)洗涤3次，每次5min。
孵育二抗：按照1:5000，使用PBS(含0.1％吐温20)稀释荧光800羊抗兔抗体。室温孵育1h，50rpm。使用PBS(含0.1％吐温20)洗涤3次，每次5min。
Odyssey扫描仪扫描，保存图片。结果见图2。
5、制备蛋白质芯片
a.将每一蛋白质取出10μL，转移至384孔板中。同时，添加阳性对照(人Ig G、人IgM)、空白对照(点样液)、用于质检的GST蛋白、用于样品点定位的蛋白(LightTM549偶联的鼠抗人Ig G、LightTM649偶联的驴抗人Ig M)等。在冷库中，使用晶芯
b.质检
封闭：用5％脱脂奶粉的PBS(含0.1％吐温20)，室温封闭1h，50rpm。
孵育一抗：按照1:1000，使用PBS(含0.1％吐温20)稀释兔抗GST抗体。室温孵育1h，50rpm。使用PBS(含0.1％吐温20)洗涤3次，每次5min。
孵育二抗：按照1:1000，使用PBS(含0.1％吐温20)稀释LightTM549偶联的鼠抗人IgG、LightTM649偶联的驴抗人Ig M、Cy5偶联的羊抗兔抗体。室温孵育1h，50rpm。使用PBS(含0.1％吐温20)洗涤3次，每次5min。使用超纯水清洗1min后，在SliderWasherTM8上甩干后，使用GenePixTM4200A扫描仪，扫描并记录结果。结果如图3B所示，其中登革病毒蛋白质信号强度的统计结果见图3C。
上述实施例中，所有溶液的配方：以下溶液的容积均为去离子水；
(1)LB培养基
25g LB培养基粉末溶于1L水中。121℃，20min，灭菌。
(2)PBS缓冲液(见表1)
表1
(3)细菌裂解液(见表2)
表2
(4)洗脱缓冲液(见表3)
表3
(5)转膜缓冲液
1L容液的组份如下(见表4)：
表4
综上所述，本发明借助全基因合成的方式，极大提高了遗传材料获取的效率，进而将显著缩短蛋白质芯片的制备流程。此外，该策略还具有无需接触原始遗传材料、可以应对氨基酸序列高度可变的状况、提高蛋白质异源可溶性表达的成功率及蛋白质的表达量等优点。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
