一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法。
背景技术
任何细胞组织的生长都得益于复杂的细胞组装，进而获得功能性。细胞粘附和组装是最根本、最关键的对细胞外基质(包括组成、形貌、弹性以及生物化学信号等)的响应行为，其中，细胞组装要先于移动、补充或分化等其他细胞行为。特别指出的是，腱细胞、骨细胞、心肌细胞等细胞的排列能够使这些生命系统对特殊细胞功能、组织修复或再生完成有效的表达。基于此原因，细胞组装的有效调控已经成为生物医学研究的中心主题。
为了充分理解并控制细胞组装，研究者在设计具有可控表面形貌和化学组成的生物界面上做了很多努力。最常用方法是制备具有方向性形貌的表面，比如排列的纤维、褶皱或凹槽，进而细胞在表面能够沿着轴向排列。另一种方法是在表面对细胞粘附材料进行图案化，细胞优先在细胞粘附材料上粘着排列，随后扩展到细胞排斥区域。但是，这些材料的大部分性质都是被单独研究；实际上，没有细胞调控信号能够独自地引导细胞组装。目前，缺少一个通用简单的操作平台制备精确可控的纳米图案化表面来研究细胞行为。为了解决这一挑战，纳米线引导细胞排列，一种仿生纳米拓扑方法有效地引导细胞组装。
发展一种稳定的、通用的方法，能够实现对纳米结构简单地转移和精确地控制，成为发展纳米技术和满足实际应用的迫切需求。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明解决的问题为：提供一种简单、稳定地引导细胞粘附、取向以及扩展等行为的方法。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，包括步骤如下：
a、基底的制备：取一块一侧面制作有多个条带的聚二甲基硅氧烷模具板，多个条带平行设置且相邻条带之间设有模具凹槽；取树脂预聚体覆盖在聚二甲基硅氧烷模具板带有条带的一侧面上，固化得到带有条带的基底；
b、金膜沉积：在基底一侧面的条带上沉积金属金，得到沉积金膜的基底；
c、样品模块的制备：将沉积金膜的基底切割成矩形块，置于聚乙烯模具的矩形凹槽当中，添加树脂预聚体，固化后形成长方体样品模块；
d、二维金纳米线阵列结构制备：将上述样品模块的金膜一侧修整成适合金刚石刀宽度的尺寸，并将修整后的样品模块固定于超薄纳米切片机中，利用金刚石刀沿平行于基底条带一侧的方向切割样品模块得到切割薄片，然后将切割薄片收集到载体上，得到二维金纳米线阵列结构；
e、三维金纳米线阵列结构制备：利用聚苯乙烯膜作为载体，金属铝层作为牺牲层的纳米转移技术，将一包含二维金纳米线阵列结构的切割薄片转移到另一位于载体上的二维金纳米线阵列结构的切割薄片，并控制纳米线取向；将载有样品的载体置于反应性离子刻蚀机中，氧反应性离子刻蚀除去环氧树脂基体以及聚苯乙烯膜，得到交叉角度从0～90°变化的三维金纳米线阵列结构；
f、人骨髓间充质干细胞的培养：人骨髓间充质干细胞置于包含胎牛血清和抗坏血酸的培养基中生长；人骨髓间充质干细胞生长到80～90％时收集于T75培养瓶中，再用胰蛋白酶进一步培养；
g、金纳米线阵列对细胞行为引导：利用乙醇对步骤e中制备的包含不同交叉角的三维金纳米线阵列结构进行杀菌处理，并置于24孔细胞培养板中静置整夜，将人骨髓间充质干细胞加到载体上的三维金纳米线阵列结构进行细胞粘附，然后放置于培养箱中培养，然后除去没有粘连的细胞，再向培养板中加入新鲜培养基继续培养，将人骨髓间充质干细胞于PBS中利用多聚甲醛固定，再用PBS冲洗，然后利用TritonX-100溶液通透细胞膜，再通过含有BSA的PBS溶液处理细胞以阻止非特异性结合；除去BSA溶液，利用异硫氰酸荧光素、DAPI和罗丹明标记鬼笔环肽对黏着斑蛋白、细胞核和纤维状肌动蛋白着色。
进一步，所述的树脂预聚体为环氧树脂或硫醇烯类光固化树脂；所述的树脂预聚体中包含固化剂；所述的树脂预聚体和固化剂的比例为15：2。
进一步，所述的步骤a中的聚二甲基硅氧烷模具板一侧的条带通过刻蚀或者纳米压印技术在平整硅表面制得；所述步骤a中树脂预聚体覆盖在聚二甲基硅氧烷模具板上的固化时间为2至10h，固化温度为50～80度；所述步骤a中基底一侧条带的间距为5～200μm、宽度为5～200μm、高度为1～20μm。
进一步，所述的步骤b中将基底至于真空条件下，以
进一步，所述的步骤c中固化温度为50～80℃、固化时间为2～10小时。
进一步，所述的步骤d中利用2～4mm宽的金刚石刀，以0.6～1.2mm/s的速度沿平行于基底条带的方向切割样品模块得到厚度50～300nm的切割薄片；所述的载体为玻璃、硅片、金片中的一种。
进一步，所述的步骤e中刻蚀时间5～20min，刻蚀气压为5～10mTorr，刻蚀温度10～20℃，氧气流速10～50sccm，刻蚀功率为100～200W。
进一步，所述的步骤f的培养基中胎牛血清浓度为5～15％胎牛血清，抗坏血酸浓度为0.05～0.2％，培养温度为36～38℃，CO2浓度为3～7％；采用胰蛋白酶于36～38℃温度下进一步培养3～5分钟。
进一步，所述的步骤g中，用于杀菌的乙醇浓度为60～80％；以每孔1×104～3×104个细胞密度将人骨髓间充质细胞加到载体上进行细胞粘附；控制培养箱中的温度为36～38℃，CO2浓度为3～7％，培养时间为1～2小时；每孔中加入1～3mL新鲜培养基继续培养1～3天；在室温条件下细胞在PBS中利用3～4％的多聚甲醛固定10～30分钟，再用PBS冲洗2～5次，然后利用0.1～1％的TritonX-100溶液通透细胞膜3～5分钟，通过含有3～10％BSA的PBS溶液处理细胞20～40分钟以阻止非特异性结合。
本发明的有益效果
本发明所制备金纳米线拓扑表面操作简便，可控性强，能够精确控制纳米线阵列的交叉角，从而提供一种通用而且稳定的方法实现对细胞粘附、取向、扩展等行为的有效引导。本方法涉及纳米线引导细胞排列的仿生纳米拓扑技术，以纳米切割技术为基础实现纳米结构的图案化以及对其精确控制，这些纳米结构影响细胞的取向、生长，提供一种简单且廉价的方法研究体外细胞行为。通过表面拓扑结构和化学性质的相互协同作用，仿生纳米线结构提供一种交互式的、有效的方法调节细胞组装，不仅控制细胞的粘附以及取向，还可以控制细胞的矢量响应。纳米线引导细胞排列表面的接触导向和延展性，以及容易制备的特点促进有序细胞阵列的探索和应用。
附图说明
图1为制备金纳米线阵列结构制备的流程示意图。其中，聚二甲基硅氧烷模具板-1、基底-2、金膜-3、包含金纳米线阵列的切割薄片-4、金刚石刀-5、载体-6。
图2为经过转移和控制之后形成的三维金纳米线阵列结构的扫描电子显微镜照片。其中A代表纳米线交叉角为60°，B代表纳米线交叉角为90°。
图3为控制不同的金纳米线阵列结构的交叉角时，细胞对金纳米线仿生图案矢量响应的荧光照片。其中，(A)代表纳米线交叉角为0°；(B)代表纳米线交叉角为60°；(C)代表纳米线交叉角为70°；(D)代表纳米线交叉角为90°时。
具体实施方式
下面结合附图对本发明内容作进一步详细说明。
如图1所示，一种基于金纳米线阵列引导细胞行为的方法，包括步骤如下：
a、基底的制备：
取8mL环氧树脂预聚体(预聚体与固化剂的体积比为15：2)搅拌均匀，置于60℃烘箱中加热2分钟以增加预聚体的流动性并排净气泡，将预聚体倒入经软刻蚀技术制备的条带型聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中(条带间距为10μm，条带宽度为10μm，条带高度为5μm)，静置5分钟，然后置于60℃烘箱固化3小时，脱模后得到具有条带结构的环氧树脂基底。
b、金膜沉积：
将环氧树脂基底置于真空条件下，在5×10-6Pa的真空度下进行电子束沉积金属金，先以
c、样品模块的制备：
将沉积金膜的环氧树脂基底切割成小的矩形块，然后置于聚乙烯模具的矩形凹槽当中，添加适量环氧树脂预聚体之后，在60℃烘箱中固化3小时，形成环氧树脂包覆金膜的1.5×0.8×0.5cm长方体样品模块。
d、二维金纳米线阵列结构制备：
利用刀片将长方体样品模块围绕着金膜图案部分修整成方便切割的梯形体结构模块，梯形体的下底宽度小于金刚石刀的宽度。将修整后的梯形体结构模块固定于切片机的样品卡盘中，先利用玻璃刀进行预切割，使得模块梯形结构端形成光滑的表面，再替换成3mm宽的金刚石刀，刀槽内注满水后，以1mm/s的速度以及平行基底的方向切割模块成下底2.5mm、上底1.5mm、高1mm、厚100nm的梯形切割薄片。制得的梯形切割薄片漂浮在刀槽内的水面上，将它们一次一片地收集在玻璃载体上。
e、三维金纳米线阵列结构制备：
将200μL、浓度为100mg/mL的聚苯乙烯的甲苯溶液滴加到覆有切割薄片的铝膜基底表面，旋涂得到约1μm厚的膜层。再利用盐酸溶液逐渐地刻蚀掉金属铝膜，聚苯乙烯膜包覆着切割薄片从载体脱离开来，转移到步骤d中得到的覆有二维金纳米线阵列结构的玻璃载体上，并调整纳米线位置以及取向。最后，氧反应性离子刻蚀10分钟除去环氧树脂基体和聚苯乙烯膜，刻蚀气压为5mTorr，刻蚀温度20℃，氧气流速20sccm，刻蚀功率为30W，得到三维金纳米线网格结构，金纳米线的尺寸为1.5mm长、100nm宽以及100nm高。
f、人骨髓间充质干细胞的培养：
人骨髓间充质干细胞置于包含浓度为10％胎牛血清和0.1％抗坏血酸的培养基中生长，培养温度为37℃，CO2浓度为5％。细胞生长到80～90％，收集于T75培养瓶中，再用胰蛋白酶于相同温度下进一步培养3～5分钟。
如图2所示，通过如上的方法可以制备得出交叉角角度在0至90度范围内的多种金纳米线，同时培养出人骨髓间充质干细胞，下面通过多个交叉角度不同的三维金纳米线阵列对人骨髓间充质干细胞矢量响应行为影响具体实施如下：
实施例1 0°交叉角的三维金纳米线阵列对细胞行为的引导
利用70％的乙醇对实施例5中制备的包含交叉角为0°金纳米线结构的基底进行杀菌处理，并置于24孔细胞培养板中静置整夜。然后，以每孔2×104个细胞的密度将人骨髓间充质细胞加到基底上进行细胞粘附。样品放置于温度为37℃，CO2浓度为5％的培养箱中1.5小时后，除去没有粘连的细胞，再于每个孔中加入1mL新鲜培养基继续培养2天。在室温条件下细胞于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中利用3.7％多聚甲醛固定20分钟，再用PBS冲洗3次，然后利用0.5％的TritonX-100溶液通透细胞膜3分钟，含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液处理细胞30分钟以阻止非特异性结合。除去BSA溶液，利用异硫氰酸荧光素、DAPI和罗丹明标记鬼笔环肽对黏着斑蛋白、细胞核和纤维状肌动蛋白着色，然后利用装配水浸物镜的LEICATCS SP2CLSM显微镜观测细胞矢量响应行为。
实施例2 60°交叉角的三维金纳米线阵列对细胞行为的引导
利用与实施例1相同的方法，以60°交叉角的金纳米线阵列对细胞的行为进行引导，并观测细胞矢量响应行为。
实施例3 70°交叉角的三维金纳米线阵列对细胞行为的引导
利用与实施例1同的方法，以70°交叉角的金纳米线阵列对细胞的行为进行引导，并观测细胞矢量响应行为。
实施例4 90°交叉角的三维金纳米线阵列对细胞行为的引导
利用与实施例1相同的方法，以90°交叉角的金纳米线阵列对细胞的行为进行引导，并观测细胞矢量响应行为。
如图3所示，细胞粘附、排列等响应行为严格遵循金纳米线结构，细胞在0°交叉角的金纳米线阵列结构表面展现完全的矢量响应行为；大部分细胞在60°和70°交叉角的金纳米线阵列结构表面展现矢量行为；细胞在90°交叉角的金纳米线阵列结构表面沿着正交方向排列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
