免疫球蛋白结构域的工程改造

免疫球蛋白结构域的工程改造

　　本申请为分案申请，其原申请的申请日为2012年1月27日，申请号为201280016587.4，名称为“免疫球蛋白结构域的工程改造”。

　　相关专利申请的交叉引用

　　本申请要求享有2011年1月28日提交的美国临时专利申请USSN 61/437174的优选权，其全部内容以引用的方式纳入本文。

　　技术领域

　　本发明涉及免疫球蛋白结构域的工程改造。更具体地，本发明涉及对免疫球蛋白结构域进行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。

　　背景技术

　　蛋白质稳定性在蛋白质治疗中起很重要的作用，因为不稳定的蛋白质在体内会导致可变的治疗有效性以及无法预测的生理作用(Horwich,2002；Wetzel,1988；Mitraki和King,1992；Worn和Pluckthun,2001；Hurle et al.,1994)。在抗体治疗领域中，人常规抗体和抗体片段太大和/或具有较差生物物理特性，例如稳定性低、不可逆的去折叠以及表达低；因此，它们的临床应用受限。“天然存在的”单域抗体(sdAb)(例如，骆驼科(camelid)VHH、鲨鱼VNAR)不存在上述问题，但是它们因其非人的性质而是免疫原性的。

　　全人sdAb(例如，VH或VL)由于它们具有预期的低(或缺乏)免疫原性，将会是用于人疗法的理想分子；但是，由于它们的低稳定性和溶解度，它们易于聚集(Ward et al.,1989；Davies and Reichmann,1994；Davies and Riechmann,1995；Tanha et al.,2001；Kazlauskas and Bornscheuer,2009；Holliger and Hudson,2005；Hoogenboom,2005)。这限制了它们在人疗法中的应用。考虑到稳定抗体作为治疗分子的重要性，已经做出了很多努力以选出更稳定/可溶的单域抗体这一事实并不令人惊讶(Davies and Riechmann,1996a；Jespers et al.,2004；To et al.,2005；Tanha et al.,2006；Arbabi-Ghahroudi et al.,2009a；Arbabi-Ghahroudi et al.,2009b；Arbabi-Ghahroudi et al.,2010)。

　　一种提高sdAb稳定性的典型方法是使用一种sdAb作为骨架(scaffold)来产生展示文库，所述文库包含上亿种sdAb，每种均具有独特的特异性；然后通过淘选技术选出针对靶抗原的结合物(sdAb)。在实现该方法的一种途径中，首先对亲本骨架进行工程改造以使其是非聚集性的，然后基于所述非聚集性的骨架来构建所述文库；因为假定说是文库中的子代sdAb大体上“遗传”了所述亲本骨架的非聚集特性，所以进行仅基于亲和性标准的常规淘选以选出非聚集性的sdAb。在另一种途径中，所述亲本骨架可以是非聚集性的，也可以不是非聚集性的，因此基于亲和性和非聚集标准来对其文库进行淘选。不管是哪种途径，聚集性的和非聚集性的sdAb经常被一起选出来(co-selected)；在很多情况下，聚集性的sdAb在筛选过程中占主导，或者所选的结合物具有低溶解性、稳定性和表达水平。此外，在亲和筛选的过程中，很多VH抗体丢失，其中出现大范围的氨基酸取代使VH去稳定化，导致了聚集(Kazlauskas and Bornscheuer,2009；Bloom et al.，2006)。这些因素使得非聚集性的sdAb的筛选是令人厌倦且劳动密集型的，并且有时是令人气馁的。

　　因此，本领域仍然需要非聚集性的、可溶且稳定的抗体。

　　发明内容

　　本发明涉及免疫球蛋白结构域的工程改造。更具体地，本发明涉及对免疫球蛋白结构域进行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。

　　本发明提供了一种含免疫球蛋白骨架的组合物以及制备和使用所述组合物的方法，所述免疫球蛋白骨架在框架区(FR)内包含一个或多个非常规二硫键。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是单域抗体(sdAb)。所述免疫球蛋白骨架可以是VH；所述VH可以属于VH3家族。或者，所述免疫球蛋白骨架可以是VL；所述VL可以属于κ或λ家族。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人工程化(humaneered)的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是骆驼科的。在一个实施方案中，所述骆驼科物种选自美洲鸵、羊驼和骆驼。

　　在如上所述的免疫球蛋白骨架中，所述一个或多个非常规二硫键可以是在FR2和FR3中在通过突变引入的半胱氨酸之间形成。在所述免疫球蛋白骨架是VH的情况下，本发明提供了一种制备所述骨架的方法，其中所述Cys可以在基于Kabat编号的位置47-49中的任一位置处以及位置67-71中的任一位置处引入。在一个实施方案中，Cys可在基于Kabat编号的位置49和69处引入。在所述免疫球蛋白骨架是VL的情况下，本发明提供了制备所述骨架的方法，其中所述Cys残基可以在基于Kabat编号的位置46-49中的任一位置处和位置62-66中的任一位置处引入。在一个实施方案中，Cys残基可以在基于Kabat编号的位置48和64处引入。

　　本文描述的免疫球蛋白骨架可以包含多肽序列，所述多肽序列包含引入至抗体可变区的框架区FR2和FR3中的至少2个非常规Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含在选自VH sdAb结构域的VH FR2区域的残基47-49的位置上的Cys残基，以及在选自VH sdAb结构域的VH FR3区域的残基69-71的位置上的Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含在选自VL sdAb结构域的VL FR2区域的残基46-49的位置上的Cys残基，以及在选自VL sdAb结构域的VL FR3区域的残基62-66的位置上的Cys残基。

　　在一个实施方案中，所述多肽包含至少在VH结构域位置49上的Cys残基以及至少在VH结构域位置69上的Cys残基。在一个实施方案中，本发明的VH结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明VH sdAb片段的表达文库，其中本发明的sdAb片段包含多种CDR序列。在一个实施方案中，选自SEQ ID NO:2、4、6和8的本发明VH sdAb片段的CDR区域的位置是PCT公开文本WO2006/099747图1A中提供的位置，选自SEQ ID NO:70至83的那些是PCT公开文本WO2006/099747图2中为相应的野生型序列所提供的位置。

　　在一个实施方案中，所述多肽至少包含VL结构域位置48上的Cys残基和至少VL结构域位置64上的Cys残基。在一个实施方案中，本发明VL结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明VL sdAb片段的表达文库，其中本发明的sdAb片段包含多个CDR序列。在一个实施方案中，选自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22和24的本发明VLsdAb片段的CDR区域的位置是FIG.1B中提供的位置。

　　在一个实施方案中，本发明多肽的CDR残基可以是任意合适的序列，并且可以具有非图1A和1B提供的数量的可变数量的残基。

　　在一个实施方案中，本发明的免疫球蛋白多肽包含选自以下的一个或多个序列的骨架区域

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：2)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：4)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWVAISSSSGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：6)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVISESMTWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAAKKIDGARYDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：8)；

　　DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLFAASTLQSGVPSRFSSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGHGTKVTVL(SEQ ID NO：10)；

　　EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGRYLAWYQQRPGQAPRLLFDTSNRAPGVPARFSRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQRSSGLrFGGGTKVTVL(SEQ ID NO：12)；

　　EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLYGTSNRATGIPDRFSSGSGTHFTLTINRLEPGDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：14)；

　　DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRTDLDWFQQRPGRAPHRLYGASSLQGGVPSRFSSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCLQHHTYPRTFGLGTKVTVL(SEQ ID NO：16)；

　　EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLYDASNRATGISARFSSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPRTFGGGTKVTVL(SEQ ID NO：18)；

　　ETTLTQSPATLSVSPGERATFSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLYGASSRTTGIPDRFSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDTSPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)；

　　QSVVTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSSYNIGENSVSWYQQLPGTAPKLLYGNDKRPSGIPDRFSSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSNLRASVFGGGTKVTVL(SEQ ID NO：22)；

　　ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRNNLAWYQQRPGQAPRLLYGASTRATGIPARFSSGSGTDFTLTISSLQVEDVAVYYCQQYYTTPKTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：24)，

　　EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEPRSVSGLRGVVDSWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：70)

　　QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGTDMEVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：71)

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　　QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNSLYLQMNSLGAEDTAVYYCARSWSGSSYGGDLDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：73)

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：74)

　　EVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFINYAMSWVRQAPDKGLDWVTISNNGGATYYADSVKGRFTSRDNSNNTLYLQMNSLRPDDTAVYYCAKGPINTGRYGDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：75)

　　QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGGGDHTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGMVRGVSSAPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：76)

　　EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVGISGSGASTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTALYYCARQSITGPTGAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：77)

　　QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWFRQAPGKGLEWVFIRSKAYGGTTEYAASVKGRFTSRDDSKSIAYLQMNSLRAEDTAMYYCARRAKDGYNSPEDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：78)

　　QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMTWVRQAPGKGLEWVRIKTKTDGGTTDYAAPVKGRFTSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRDHSSGSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：79)

　　DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCTASGFPFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVRITSKTDGGTTDYVAPVKGRFTSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDQANAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：80)

　　QMQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSRMSWFRQAPGMGLEWVVIYSGGSTYYADSVRGRFSSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAREREGAVTREDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：81)

　　QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVFIYSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVGGGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：82)

　　QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVVTNNGGSTSYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：83)

　　或者与其基本相同的序列，或其片段，条件是所述基本相同的序列或其片段保留了所述常规和非常规二硫键，并且其中CDR的区域中的序列可以是任意合适的序列并且在每个CDR1、CDR2和CDR3中有合适但可变数量的残基。在SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的情况下，构成所述CDR的残基在图1A和1B中提供。在SEQ ID No：70至83的情况下，构成所述CDR的残基是由在PCT公开文本WO2006/099747图2中提供的对应野生型克隆中提供。

　　本发明还包括编码多种可变结构域的重组文库，所述可变结构域包含多种CDR，所述CDR包含多种合适的序列和长度(length)，其间散布着包含本文描述的非常规Cys-Cys残基的骨架的框架区。在一个实施方案中，所述重组文库包含哺乳动物序列。在一个实施方案中，所述重组文库包含人序列。在一个实施方案中，所述重组文库包含骆驼科序列。在一个实施方案中，所述重组文库包含多种序列，所述序列一旦被选择，其任选地为成熟的和/或人工程化的。

　　本发明还提供了提高单域抗体的稳定性的方法，其包括在框架区引入一个或多个非常规二硫键。

　　本发明提供了工程改造具有增强稳定性的VH和VL结构域的方法。本文示出了通过在特定位置处引入Cys对而在VH和VL结构域中形成额外的二硫键以将VH和VL转变为高度非聚集性的、可溶的、稳定且可表达的结构域。具体地，当取代FR2和FR3区域中的残基以便引入VH氨基酸位置49和69上的Cys对以及VL氨基酸位置48和64上(Kabat编号)的Cys对时，可获得这些有利的特性。在Cys突变体中所引入的非常规残基之间二硫键的形成是通过质谱确认。以该方式修饰的所有Cys突变体，即含有所列出的非常规二硫键的Cys突变体，在大肠杆菌中没有显示出不利的表达，通过表面等离子共振(“过表面等)结合测量没有显示出不利的构象变化，并且显示出聚集减少或消失。此外，与所有突变体均具有显著高于其野生型对应物的稳定性，具有高至少11℃的解链温度。本发明的数据证明，通过向VH和/或VL骨架引入这样的二硫键来稳定VH和VL结构域框架，可以提高它们的蛋白酶抗性。可以制备基于本发明经工程改造的骨架的VH和/或VL文库来鉴别结合特定靶分子的稳定且非聚集性的VH和VL。可以使用本领域已知的多种展示文库来表达本发明的VH和/或VL构建体。在一个实施方案中，所述文库是单域抗体(“sdAb”)文库。

　　本发明提供了新方法，所述方法可以(i)将聚集性的sdAb转变为非聚集性的sdAb；(ii)提高从sdAb文库获得非聚集性sdAb的效率；(iii)额外地提高稳定性，例如，sdAb的解链温度、重折叠效率、蛋白酶抗性和表达水平。提供具有这些特性的VH和VL骨架可以允许从抗体文库中回收更广范围的抗体；保留高度的非聚集性和稳定性可以使得分离原本在抗体选择过程中会丢失的新抗体。此外，改善的生物物理特性可允许VH和VL在治疗和工业领域中更广泛地被应用。

　　附图说明

　　将参考附图以举例的方式描述本发明的这些以及其他特征，其中：

　　图1示出VH、VL和对应Cys突变体的一级结构。图1A示出VH(SEQ ID NO:1-38)的编号和CDR名称，使用Kabat(Kabat et al.,1991)编号系统。当前被半胱氨酸替换的残基(Ser 49和Ile 69)用灰色阴影标示。图1B示出VL的编号和CDR名称，使用Kabat(Kabat et al.,1991)编号系统。当前被半胱氨酸替换的残基(Ile/Val 48和Gly/Ala 64)用灰色阴影标示。“FR”表示VH和VL的框架区，CDR是VH和VL的互补决定区。

　　图2A示出IMAC(固定化金属亲和色谱法)纯化中的VH洗脱图谱。野生型和突变体VH分别用虚线和实线表示。在20ml处或之后洗脱的峰含有纯化的VH。图2B示出通过IMAC纯化的野生型和突变体VH的非还原性SDS-PAGE(HVHAm302/HVHAm302S和HVHPC235/HVHPC235S对作为举例示出)。箭头标示HVHAm302的二聚体。SDS-PAGE凝胶上的“M”表示用蛋白质标准品上样的通道。

　　图3A是用于质谱分析的VH的胰蛋白酶酶解肽(tryptic peptide)(SEQ ID NO:25-36，也参见表2)的示意图。连接一对Cys的二硫键用线表示。实心点标示位置49和69处引入的半胱氨酸(C)。仅示出携带常规天然的(存在于野生型和突变体中)或非常规工程改造的(仅存在于突变体中)的二硫键的主要肽。胰蛋白酶消化位点(Lys和Arg的C-末端)用粗体显示。还原性SDS-PAGE图谱示出VH已被胰蛋白酶成功消化为小肽(比较“+胰蛋白酶”和“–胰蛋白酶”)。SDS-PAGE凝胶上的“M”表示用蛋白质标准品上样的通道。图3B为工程改造的二硫键连接的肽(GLEWVCAISSSGGSTYYADSVK(P1)(T44-T64)-FTCSR(P2)(T67-T71)(Cys49-Cys69)(SEQ ID NO:29和30))的m/z 964.04(3+)离子的碰撞诱导解离(CID)-MS2图谱，所述肽来自HVHAm302S的胰蛋白酶消化物。携带二硫键的两个肽(b16+P2和y117+P2)在MS(质谱)峰上有注释并用星号标示。相关数据示于表2中。图3C是HVLP324S胰蛋白酶酶解肽在m/z 1042.66(6+)处的二硫键连接肽离子的CID-MS2图谱，所述胰蛋白酶酶解肽对应于从LC-MS色谱图测量观察到的二硫键连接肽LLCFAASTLQSGVPSR(P1)(SEQ ID NO:43)、FSCSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPR(P2)(SEQ ID NO:44)和VTITCR(P3)(SEQ ID NO:42)。从P2中观察到包含很多信息的y片段离子，P3作为经由二硫键的修饰。还观察到几乎完整的P1的y离子系列。通过HVLP324S相同的二硫键连接肽在m/z 1250.99(5+)处的肽离子[M+5H]5+的ETD-MS2谱进一步确认了所述二硫键，在所述ETD-MS2谱中，当通过ETD解离所述3个肽的二硫键时，以相对高的丰度观察到了分别在m/z 691.47(1+)、1648.86(1+)和1956.85(2+)处的完整的P1、P2和P3离子(数据未示出)。

　　图4A示出VH结构域及其对应Cys突变体形式(HVHAm302/HVHAm302S、HVHAm427/HVHAm427S、HVHAm431/HVHAm431S和HVHPC235/HVHPC235S)的分子筛色谱图。图4B示出4个额外的Cys突变体VH结构域(HVHP414S、HVHP420S、HVHP426S和HVHP429S)的分子筛色谱图。对应的野生型形式之前被表明是非聚集性的单体(To et al 2005)。图4C示出人VL结构域及其Cys突变体形式的分子筛色谱图。对于图4A、B和C中的每个色谱图，背景吸收已被减去，相对于设置为100％的单体峰(用箭头示出)归一化了所有的峰。单体峰左边的峰被认为是聚集物的峰。

　　图5示出了VH的热诱导去折叠。野生型和Cys突变体VH分别由实心和空心符号标示(HVHAm302和HVHAm302S(方块)；HVHAm431和HVHAm431S(圆圈)；HVHPC235和HVHPC235S(三角))。VH的计算的中点去折叠温度Tm记录在表4中。

　　图6示出野生型(图6A)或Cys突变体(图6B)VL的热诱导去折叠。计算的Tm记录在表4中。在图6C中，并列比较了HVLP389和HVLP325(分别具有最低和最高Tm)与它们的Cys突变体形式HVLP389S和HVLP325S的热诱导去折叠曲线。

　　图7示出VH针对固定化蛋白A的SPR结合分析。在图7A中，以μM计的每个VH的浓度如下：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.35(HVHAm302)；0.2、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和3.88(HVHAm427)；0.5、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.81(HVHAm431)；0.01、0.01、0.02、0.05、0.25、0.25、0.5、1.0和2.5(HVHAmC235)；0.4、0.8、1.6、3.2、5.4和8.22(HVHAm302S)；0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.0和3.08(HVHAm427S)；0.5、1.0、1.0、2.0、4.0、6.5、10.0和13.3(HVHAm431S)；0.025、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.4、0.8、0.8、0.8、1.5、1.5、3.0、6.0和9.9(HVHAmC235S)。计算的KD记录在表4中。RU，响应单位。图7B是野生型和突变体VH的动力学速度图，带有等亲和性斜线图(isoaffinity diagonals plot)。将由SPR分析确定的动力学速度(kon和koff)以对数刻度标绘在二维平面上以使得在相同斜线上的VH具有相同的KD值。

　　图8示出VL对固定化蛋白L的Biacore传感图。在图8A中，每个VL的浓度如下：0.2、0.5、0.75、1、2、3、5和10μM(HVLP389、HVLP351和HVLP364)；1、2、3、5、7.5和10nM(HVLP342)；0.2、0.5、1、2、3、5和10μM(HVLP335)；0.2、0.5、1、1.5、2和5μM(HVLP325)；0.2、0.5、0.75、1、1.5、2、3和5μM(HVLP3103)以及1、2、4、6、8和10nM(HVLP324)。HVLP324和HVLP342结合至蛋白质L的低亲和性位置的传感图没有包括在内，但是计算的KD记录在表4中。在图8B中，Cys突变体VL的浓度为：0.05、0.1、0.2、0.2、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4和7μM(HVLP389S)；0.1、0.2、0.2、0.4、0.6、1、2、4、6和8μM(HVLP335S)；0.05、0.1、0.2、0.2、0.4、0.6、1、2、4和6μM(HVLP351S)；0.1、0.2、0.2、0.5、0.75、1、2、4、7和10μM(HVLP3103S)；4、8、8、16、32、64、120、240nM(HVLP324S)；0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、3、6、12μM(HVLP325S)；2、4、8、16、16、32、64、120、240nM(HVLP342S)。计算的KD记录在表4中。

　　图9示出VL的GI蛋白酶(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)抗性。图9A比较了以不同的蛋白酶与蛋白质比例计的野生型VL(空心圆圈)与Cys突变体VL(实心圆圈)的蛋白酶抗性谱。在图9B中，示出野生型VL(空心圆圈)与Cys突变体VL(实心圆圈)的％蛋白酶抗性相对于Tm的图。

　　图10示出fd-tetVL24S载体的示意图。在其3’端携带接头序列HVLP324S基因是用PCR制备，用ApaLI和NotI限制性内切酶消化，之后克隆至用ApaLI和NotI限制性内切酶线性化的fd-tetGIIID(Tanha et al.，2001)噬菌体DNA中。这将带有接头序列的HVLP324S置于噬菌体基因III前导序列和基因III开放阅读框之间。所述DNA接头序列编码GSGSKAAA(SEQ ID NO:86)多肽，其中赖氨酸残基提供胰蛋白酶切割位点(由箭头标示)。这允许在淘选抗体噬菌体展示文库的结合步骤之后通过加入胰蛋白酶而将结合噬菌体从靶抗原上洗脱。

　　图11示出合成HVLP324S文库的构建。将用于文库构建的人VL骨架，HVLP324S的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)按照Kabat系统(Kabat el at.，1991)编号。要随机化的CDR(1、2和3)中的氨基酸位置用下划线表示。非常规Cys残基用点来标示。所选择的用于体外基因突变的CDR中的HVLP324S密码子与它们对应的随机密码子一起示出。氨基酸位置28(在CDR1上)被限制为Ser或Gly密码子(显示为RGC)，位置54(在CDR2上)被限制为Arg或Leu密码子(显示为CKN)。对于CDR3突变，使用了不同长度的3个寡核苷酸(VL24-CDR3/3a/3b；参见实施例8，表6)，产生长度为9、10或11个氨基酸的CDR3。按照IUPAC命名法，使用以下字母标明所述寡核苷酸不同位置上的简并核酸，其中N：A、T、G或C核苷酸；R：A或G核苷酸；K：T或G核苷酸。

　　图12示出结合至人溶菌酶的VL的噬菌体筛选。从两种不同筛选条件下(室温和65℃-2小时)的噬菌体淘选(3轮和4轮)中选出的抗人溶菌酶VL的频率(％)分别用灰色和黑色矩形柱表示。

　　图13示出抗人溶菌酶和抗人血清白蛋白VL的氨基酸序列。对HVLP324S的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)与被选择用于详细生物物理分析的8个抗人溶菌酶VL和1个抗人血清白蛋白VL的氨基酸序列进行了对比。通过Kabat编号(Kabat el at.，1991)对CDR和FR进行编号。

　　图14示出抗人溶菌酶VL的非聚集状态和热稳定性。(A)抗人溶菌酶和抗人血清白蛋白VL的SuperdexTM 75分子筛色谱法(SEC)。对于每个色谱图，背景吸收已被减去，相对于设置为100％的单体峰(箭头)归一化了所有的峰。单体峰左侧的峰被视为聚集体峰。通过对所述色谱图的面积积分来计算％聚集体和％单体值。(B)抗人溶菌酶和抗人血清白蛋白VL的热诱导去折叠转变曲线。如之前所述获得折叠分数(fraction folded)对温度的图。将对应于去折叠转变曲线的中点(F0.5)的温度作为解链温度(Tm)。Tm范围用双箭头表示。(C)Tm对％单体的相关曲线。用Graphpad Prizm(版本4.02)来绘图分析数据。

　　图15示出抗人溶菌酶VL的SPR分析。Biacore传感图示出在每张传感图上标出的不同浓度范围下人溶菌酶至固定化抗人溶菌酶VL的结合，所述不同浓度范围如下：对于HVLHLAQ，为10、25、25、100、200、200、500、750和2000nM；对于HVLHLDS为100、250、500、1000、1000、2500、5000、7500、10000和10000nM；对于HVLHLEM为750、1000、2500、5000、7500、10000、15000和20000nM；对于HVLHLNE为10、25、50、100、250、250、500、750和1000nM；对于HVLHLNN为50、50、100、250、500、750、1000和1000nM；对于HVLHLQI为100、250、500、750、1000、1000和2500nM；对于HVLHLRN为10、25、50、100、200、200、500、750和1000nM；对于HVLHLYS为50、100、250、500、1000、1000、2500、5000、7500、10000、10000、15000和20000nM。

　　图16示出抗人溶菌酶VL的IMAC纯化和SDS-PAGE分析(A)纯化之后抗人溶菌酶VL的固定化金属亲和色谱法(IMAC)的洗脱谱。对应于纯化的VL的洗脱峰用矩形框来标示。mAU，毫吸光度单位。(B)在还原(+DTT)条件下IMAC纯化的VL的SDS-PAGE图。在进行SDS-PAGE分析之前，将纯化的VL在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析。星号表示失去His标签的VL。蛋白质标准品(泳道M)标记有它们各自的分子量(以kDa计)。

　　图17示出抗人血清白蛋白VL的SPR分析。Biacore传感图示出在传感图上标出的不同浓度范围下抗人血清白蛋白VL至固定化人血清白蛋白的结合，所述不同的浓度范围为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.75、1、1、2和4μM。

　　具体实施方式

　　本发明涉及对免疫球蛋白结构域的工程改造。更具体地，本发明涉及对免疫球蛋白结构域进行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。提供了物质组合物以及制备和使用这样的组合物的方法。

　　本发明提供了包含多肽的组合物，所述多肽包含在框架区(FR)包含一个或多个非常规二硫键的VH或VL骨架，其中所述非常规二硫键为所述多肽提供改善的稳定性和非聚集性。在一个实施方案中，所述多肽是VH或VL骨架。在一个实施方案中，所述多肽包含VH或VL结构域的sdAb片段。所述sdAb可源自于本文所述的VH区域、VHH区域或VL区域。

　　所述免疫球蛋白骨架可以包含重链的可变区(“VH”)。在一个实施方案中，所述VH源自于VH1、VH2或VH3家族。在一个实施方案中，所述VH可以属于VH3家族。或者，所述免疫球蛋白骨架可以是轻链的可变区(“VL”)。在一个实施方案中，所述VL可以属于κ或λ家族。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是非人的动物的。在一个实施方案中，所述非人的动物包括所有的脊椎动物，特别是选自以下的脊椎动物：鸟类、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、骆驼科、鸡、大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、牛、猫、狗、马或非人灵长类。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是骆驼科的。在一个实施方案中，所述骆驼科物种选自美洲鸵、羊驼和骆驼。在一个实施方案中，所述骆驼科骨架源自于VH区域、VL或VHH区域中的任意一种或多种。

　　在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是“人工程化”的(或者被称为人源化的)，即源自于非人物种的sdAb，在给予人受试者的sdAb的情形中其免疫原性或潜在免疫原性氨基酸残基已经被免疫原性较低或没有免疫原性的氨基酸取代。在本发明中已考虑到本领域中已知的制备人工程化抗体的任何方法，包括但不限于Kalobios的人工程化技术。应注意到，当骨架被人工程化时，免疫原性氨基酸可被任意其他免疫原性较低的氨基酸残基取代，不管这种取代是否构成保守性氨基酸改变。应理解本发明的人工程化的骨架保留本文所述的非常规Cys残基以及任意的天然(常规)二硫键。

　　本文使用的术语“VH”或“VL”，在本文也被称为“VH或VL结构域”，分别是指抗体重链或抗体轻链的可变区。在一个实施方案中，所述VH或VL结构域是“单域抗体”(sdAb)的形式。本文使用的“sdAb”是指保留了免疫球蛋白折叠的单个免疫球蛋白结构域；即，它是其中最多至3个互补决定区(CDR)连同最多至4个框架区(FR)形成抗原结合位点的可变区。本文中VH或VL可变结构域的CDR被称为CDR1、CDR2和CDR3。VH或VL可变结构域的FR被称为FR1、FR2、FR3和FR4。鉴定互补决定区域有多种方法，最常见的两种是Kabat的方法以及Chothia和Lesk的方法。Kabat等(1991)基于VH和/或VL结构域的抗原结合区的序列可变性定义了“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987)基于VH和VL结构域中的结构环区域的位置定义了“超变环”(H或L)。由于这些单独的方法定义了邻接或重叠的CDR和超变环，抗体领域的技术人员经常将术语“CDR”和“超变环”互换使用，本文中也可以这样使用它们。可变结构域(VH或VL)中大部分序列可变性出现在CDR/环中；CDR/环之外的区域被称为框架区域(FR)。FR为可变结构域提供结构完整性，并且确保保持免疫球蛋白折叠。本文的FR和CDR/环是根据Kabat编号系统(Kabat et al.，1991)定义。在一个实施方案中，本文描述的多肽的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区域的位置编号在图1A(对于VH结构域)以及在图1B中(对于VL结构域)提供。

　　人VH或VL结构域可从人Ig重链或轻链序列获得(Holliger and Hudson,2005；Holt et al.，2003；Jespers et al.，2004；To et al.，2005)。本领域中已知用于获得非人物种的VH或VL结构域的类似方法。此外，本发明的VH和VL结构域包括重组产生的VH或VL，以及通过亲和成熟、稳定化、溶解化(solubilization)(例如，骆驼源化(camelization))或其他抗体工程改造方法对这样的VH或VL进行进一步修饰所产生的那些VH或VL。本发明还包括保留或提高了所述VH或VL的稳定性和非聚集特性的同系物、衍生物或变体。

　　本发明提供包含骨架的新VH或VL结构域，所述骨架包含非常规Cys残基。本文使用的“骨架”或者“免疫球蛋白骨架”包含所述VH或VL的框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中所述框架为多种CDR(CDR1、CDR2、CDR3)提供多肽主链。本文使用的术语“骨架”忽略CDR区域，是为了描述本发明组合物的框架部分。

　　本文描述的免疫球蛋白骨架可以包含多肽序列，所述多肽序列包含至少两个被引入至抗体可变区的框架区FR2和FR3中的非常规Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含在选自VH sdAb结构域VH FR2区域的残基47-49位置上的Cys残基和在选自VH sdAb结构域VHFR3区域的残基69-71位置上的Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含选自VL sdAb结构域VL FR2区域的残基46-49位置上的Cys残基和选自VL sdAb结构域VL FR3区域的残基62-66位置上Cys残基。本文使用的“引入的”或“引入”意指使用本领域技术人员已知的任何合适的方法，尤其包括重组技术，将变化纳入多肽组合物或编码所述多肽组合物的核苷酸序列。在一个实施方案中，通过用对半胱氨酸残基特异性的密码子替换基因、编码序列和/或mRNA中已经存在的密码子而将Cys残基引入至VH和/或VL构建体中。

　　在一个实施方案中，本发明的组合物包含选自VH或VL骨架的免疫球蛋白骨架，其中所述VH骨架在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键是在引入基于Kabat编号的位置49和69处的Cys残基之间形成；VL骨架在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键是在引入基于Kabat编号的位置48和64处的Cys残基之间形成。

　　本文使用的“本发明的”VH构建体或sdAb片段包含至少一个非常规二硫键，其包含至少一个位置49处的Cys残基和至少一个位置69处的Cys残基。

　　本文使用的“本发明的”VL构建体或sdAb片段包含至少一个非常规二硫键，其包含至少一个位置48处的Cys残基和至少一个位置64处的Cys残基。

　　在一个实施方案中，所述多肽包含至少一个VH结构域的位置49处的Cys残基和至少一个VH结构域的位置69处的Cys残基。在一个实施方案中，本发明的VH结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明VH免疫球蛋白骨架的表达文库，其中所述免疫球蛋白骨架还包含多个CDR序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明VH免疫球蛋白骨架和多个合适的CDR序列的重组文库以便为文库提供至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或超过109个克隆/文库的多样性(diversity)。在一个实施方案中，选自SEQ ID NO:2、4、6和8的本发明VH sdAb片段的CDR区域的位置为图1A中提供的位置，SEQ ID NO:70至83的VH sdAb片段的CDR区域的位置为PCT公开文本WO2006/099747的图2中为相应野生型序列提供的位置。

　　在一个实施方案中，所述多肽包含至少一个VL结构域位置48处的Cys残基和至少一个VL结构域位置64处的Cys残基。在一个实施方案中，本发明的VL结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的VL sdAb片段的表达文库，其中所述本发明的sdAb片段包含多个CDR序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的VL免疫球蛋白骨架和多个合适CDR序列的重组文库以便为文库提供至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或超过109个克隆/文库的多样性。在一个实施方案中，选自SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22和24的本发明VL sdAb片段的CDR区域的位置在图1B中提供的位置。

　　在一个实施方案中，本发明多肽的CDR残基可以是任意合适的序列，并且可以有非图1A和1B提供的数量的可变数量的残基。根据抗体领域技术人员已知的指导，每个CDR1、CDR2和CDR3的序列和长度可以不同。不意欲受限于任何具体的参考，示例性指导在本文引用的Kabat以及Chothia和Lesk的出版物中提供。在一个非限制性实例中，基于HVLP324S骨架的噬菌体文库的设计和构建在图11和实施例8中提供，所述文库在实施例9中进行表征。

　　本发明VH或VL组合物在额外文库和抗体的构建中提供骨架。在一个实施方案中，VH或VL的框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)可用于携带各种CDR，即，其中FR如所提供的并且其中CDR区域的序列和残基数量如所提供的，或者在一个或多个或者全部CDR-特异性残基处有变化。以这种方式，合成VH或VL文库是通过以下方式在单个骨架上构建的：插入合适的包含随机序列的寡核苷酸以提供随机化的CDR/环。这样的文库可以是展示文库，例如噬菌体展示文库、核糖体展示文库或酵母展示文库。这种方法在本领域中是常规的，并且已被记载于很多出版物中(例如，但不限于Arbabi-Ghahroudi et al.，2009a，以及其中的参考文献)。所述文库可任选地用于进一步的抗体工程改造或者用于体外亲和成熟(Davies and Riechmann,1996b；Yau et al.，2005)。或者，可以使用基于天然sdAb的已有文库通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应(SOE-PCR)(Arbabi-Ghahroudi et al.，2010和其中的参考文献；Ho et al.，1989)或其他方法(Kunkel et al.，1987；Sidhu et al.，2000)来将二硫键工程改造至所述文库的每个成员中。

　　另一种选择是，VH或VL可被用作骨架来纳入具体的CDR序列；例如但不以任何方式进行限制，通过使用重组技术可从任意非人抗体构建人源化抗体以根据本文提供的方法进一步包含非常规二硫键。然后可通过将合适的CDR编码片段(负责所需的结合特性，并且根据本文引用的和抗体领域技术人员已知的指导，其序列和长度可变)插入至本发明的人源化抗体骨架中而将此构建体进一步修饰以结合特定靶。如本领域技术人员所知，这些技术是通过标准的克隆和重组DNA方法，使用合适的载体并且在细胞(哺乳动物或其他)中表达来实现。这样的方法和技术是本领域技术人员熟知的，本文不做描述。

　　本发明的VH或VL骨架在框架区内包含一个或多个非常规二硫键。二硫键是通过将半胱氨酸残基之间两个巯基偶联而稳定蛋白质的共价力(Betz,1993)。“非常规”的意思是所述二硫键不存在于天然存在的人VH和VL中，而是使用分子基因工程技术引入的。连接可变区内两个β-折叠之间的天然存在的(或“常规的”)二硫键在VH和VL超家族中是高度保守的(Amzel and Poljak,1979；Williams and Barclay,1988)。在VH的Cys22和Cys92之间以及VL的Cys23和Cys88之间形成所述保守的二硫键，其中残基是根据Kabat进行编号(参见图1)。在本发明中，一个或多个额外的非常规二硫键被工程改造至VH或VL结构域中。优选地，所述经工程改造的二硫键在所述免疫球蛋白折叠中的第一β-折叠的Cys和邻近的第二β-折叠的Cys之间形成。例如，这可以通过以下方式来实现：在所述框架区内的位置处引入将在所表达的且完全折叠的蛋白质中形成二硫键的合适数量的Cys对。所述Cys残基可被引入可变结构域三维结构中相邻的框架区中。例如，但不以任何方式进行限制，Cys残基可被引入至FR2β-折叠区域和FR3β-折叠区域中。可在用于偶联巯基基团的区域内的位置上将Cys残基引入相邻的框架区。例如但不以任何方式进行限制，对于VH，Cys残基可在位置47-49(3个位置)之一和位置67-71(5个位置)之一处引入；对于VL，Cys残基在位置46-49(4个位置)之一和位置62-66(5个位置)之一处引入(基于Kabat编号)，条件是各个Cys对离得足够近以形成二硫键。在另一个非限制性实例中，对于VH，Cys残基可在位置49和69处引入，并且/或者，对于VL，Cys残基可在位置48和64处引入(基于Kabat编号)。

　　可使用本领域中已知的任意合适方法将Cys引入至VH或VL结构域的框架区中。不欲进行限制，可通过重组DNA方法进行点突变或插入来引入Cys；例如但不以任何方式进行限制，可利用剪接重叠延伸(SOE)-PCR(Arbabi-Ghahroudi et al.，2010和其中的引用内容；Ho et al.，1989)来引入Cys。

　　VH和/或VL骨架中的一个或多个非常规二硫键可提供所述抗体的改善的稳定性和非聚集性。非聚集性的是指以单体状态存在的分子；例如但不意欲以任何方式进行限制，单体在分子筛色谱(SEC)中基本上给出一个峰。聚集的分子形成二聚体、三聚体以及更高阶的聚集体。抗体的稳定性包括生物物理特性，例如热稳定性、热和化学诱导重折叠效率以及蛋白酶抗性。评估本发明的VH或VL骨架时要考虑的其他因素包括表达水平和溶解度。如本领域所知，溶解度是指在沉淀之前可溶于液体中的分子数/体积(例如，以摩尔浓度或mg/mL为单位)；在sdAb的情况下，以及在本发明的情形中，单体分子的数量尤其重要。

　　非常规二硫键的加入可以改善一种或多种前述生物物理特性。例如但意欲不囿于理论，将非常规二硫键引入至VH或VL结构域中可以提高稳定性(例如，更高的解链温度和蛋白酶抗性。通过稳定所述框架)；和/或改善非聚集性(通过减少分子内相互作用和聚集体的形成)。

　　引入非常规二硫键的VH或VL骨架可以是任意合适的种系起源的。例如，但不意欲以任何方式进行限制，VL可以属于κ或λ家族，例如κ1或κ3，或者其组成可以是源自于V和J片段种系序列的多种组合。在另一实例中，但不意欲以任何方式进行限制，VH可以属于VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6或VH7家族，或者其组成可以是源自V、D和J片段种系序列的多种组合(To et al.，2005；V BASE database of the MRC Centre for Protein Engineering,http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。在一个实施方案中，VH可以属于VH3家族。

　　在一个实施方案中，本发明的VH或VL骨架可以包括但不限于包含框架区的骨架，所述框架区的序列选自以下序列或者与其基本相同的序列或其片段：

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS(HVHAm302S；SEQ ID NO：2)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTVSS(HVHAm427S；SEQ ID NO：4)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWVAISSSSGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS(HVHAm431S；SEQ ID NO：6)；

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVISESMTWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAAKKIDGARYDYWGQGTMVTVSS(HVHPC235S；SEQ ID NO：8)

　　DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLFAASTLQSGVPSRFSSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGHGTKVTVL(HVLP324S；SEQ ID NO：10)；

　　EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGRYLAWYQQRPGQAPRLLFDTSNRAPGVPARFSRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQRSSGLTFGGGTKVTVL(HVLP325S；SEQ ID NO：12)；

　　EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLYGTSNRATGIPDRFSSGSGTHFTLTINRLEPGDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK(HVLP335S；SEQ ID NO：14)；

　　DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRTDLDWFQQRPGRAPHRLYGASSLQGGVPSRFSSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCLQHHTYPRTFGLGTKVTVL(HVLP342S；SEQ ID NO；16)；

　　EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLYDASNRATGISARFSSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPRTFGGGTKVTVL(HVLP351S；SEQ ID NO：18)；

　　ETTLTQSPATLSVSPGERATFSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLYGASSRTTGIPDRFSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDTSPRTFGQGTKVEIK(HVLP364S；SEQ ID NO：20)；

　　QSVVTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSSYNIGENSVSWYQQLPGTAPKLLYGNDKRPSGIPDRFSSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSNLRASVFGGGTKVTVL(HVLP389S；SEQ ID NO：22)；

　　ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRNNLAWYQQRPGQAPRLLYGASTRATGIPARFSSGSGTDFTLTISSLQVEDVAVYYCQQYYTTPKTFGQGTKVEIK(HVLP3103S；SEQ ID NO：24)，

　　EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEPRSVSGLRGVVDSWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：70

　　QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGTDMEVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：71)

　　QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGKGGSSGYDHPDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：72)

　　QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAISGSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNSLYLQMNSLGAEDTAVYYCARSWSGSSYGGDLDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：73)

　　QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVAISSSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：74)

　　EVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFINYAMSWVRQAPDKGLDWVTISNNGGATYYADSVKGRFTSRDNSNNTLYLQMNSLRPDDTAVYYCAKGPINTGRYGDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：75)

　　QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAIRGGGDHTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGMVRGVSSAPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：76)

　　EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVGISGSGASTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTALYYCARQSITGPTGAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：77)

　　QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWFRQAPGKGLEWVFIRSKAYGGTTEYAASVKGRFTSRDDSKSIAYLQMNSLRAEDTAMYYCARRAKDGYNSPEDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：78)

　　QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMTWVRQAPGKGLEWVRIKTKTDGGTTDYAAPVKGRFTSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRDHSSGSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：79)

　　DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCTASGFPFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVRITSKTDGGTTDYVAPVKGRFTSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDQANAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：80)

　　QMQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSRMSWFRQAPGMGLEWVVIYSGGSTYYADSVRGRFSSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAREREGAVTREDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：81)

　　QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVFIYSGGSTYYADSVKGRFTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVGGGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：82)and

　　QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVVTNNGGSTSYADSVKGRFTSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：83)

　　条件是所述基本相同的序列或其片段保留了常规和非常规二硫键，并且其中CDR区域中的序列可以是任意合适的序列，并在每个CDR1、CDR2和CDR3中可以具有合适但可变数量的残基。在SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的情况下，构成CDR的残基如图1A和1B中所提供的。在SEQ ID No：70至83的情况下，构成CDR的残基如由PCT公开文本WO2006/099747图2中提供的对应野生型克隆所提供的，其中所述图2以引用方式纳入本文。所述基本相同的序列还应该保留或改善VH或VL的稳定性和非聚集特性。如本文通篇所述，本发明的骨架不限于CDR区域中列出的残基，其如图1A和1B中对本文列出的克隆所进行划界的那样。

　　基本相同序列可以包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域中已知对参考序列进行一个或多个保守性氨基酸突变可产生在生理学、化学或功能特性上与所述参考序列相比没有实质变化的突变肽；在这样的情况下，所述参考序列和突变序列可被认为是“基本相同”的多肽。保守性氨基酸突变可以包括氨基酸的添加、缺失或取代；本文将保守性氨基酸取代定义为将一个氨基酸残基用具有类似化学特性(例如，大小、电荷或极性)的另一个氨基酸残基取代。

　　在一个非限制性实例中，保守性突变可以是氨基酸取代。这样的保守氨基酸取代可以用碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸来取代相同类型的另一个氨基酸。术语“碱性氨基酸”意指具有pK值大于7的侧链的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带正电。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指具有在生理pH下不带电的侧链的亲水性氨基酸，但是其具有至少一个其中由两个原子共用的成对电子更靠近其中一个原子的化学键。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水氨基酸”(也被称为“非极性氨基酸”)包括表现出高于0的疏水性的氨基酸，疏水性测量是依据Eisenberg的标准化通用疏水性标度(1984)。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。“酸性氨基酸”是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带负电。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。

　　序列同一性被用于评估两个序列的相似性；它是通过计算当比对两个序列残基位置之间最大一致性时相同的残基的百分比来确定。任何已知的方法都可用于计算序列同一性；例如，可用计算机软件来计算序列同一性。不意欲进行限制，序列同一性可由例如由瑞士生物信息研究所维护的NCBI BLAST2服务(可见于http://ca.expasy.org/tools/blast/)、BLAST-P、Blast-N或FASTA-N的软件，或者本领域中已知的任意其他合适软件来计算。在一个实施方案中，百分比同一性的计算限于框架区的比较，不考虑CDR中的残基。在一个实施方案中，百分比同一性的计算比较了多肽中的所有残基，包括框架区和CDR中的残基。

　　如本文通篇所述，本发明的骨架不限于CDR区域列出的残基，对于本文列出的克隆如SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24，其如图1A和1B中所划界的那样；对于对应本文列出的克隆的野生型序列如SEQ ID No:70至83，其如PCT公开文本WO2006/099747图2中所进行的划界那样。

　　本发明的基本相同的序列可以至少90％相同；在另一个实例中，所述基本相同的序列可以在氨基酸水平上与本文描述的序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其间的任意百分比)相同。在另一个实施方案中，当与本文提供的本发明组合物进行比对时，基本相同的序列可在框架区含有1个、2个、3个或4个氨基酸差异。重要的是，所述基本相同的序列保留参考序列的稳定性和生物物理特性。在一个非限制性实施方案中，序列同一性的差异可归结于保守性氨基酸突变。在一个实施方案中，所述基本相同的序列由构成FR1、FR2、FR3和FR4的残基组成，不考虑构成CDR1、CDR2和CDR3中任意一个或多个的残基。

　　为了增加它们的生物物理特性，例如非聚集性、稳定性、表达水平和溶解度，所述VH或VL骨架可作为更大抗体蛋白质或片段(例如，一个或多个sdAb、scFv、Fab、F(ab)2和/或成熟免疫球蛋白(包括但不限于IgG、IgE和/或IgM))的一部分而被包括在内。本文使用的“成熟免疫球蛋白”包含轻链，所述轻链包含可变区和恒定区，以及重链，所述重链包含可变区和恒定区。在一个实施方案中，所述成熟免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和/或IgM。在一个实施方案中，该更大抗体构建体的引入序列是人的或人工程化的。上述方法还可应用于VH和VL衍生物，例如通过将VH和VL融合至其他多肽(例如毒素、具有相同或不同特异性的VH和/或VL、Fc结构域等)制备的融合构建体，目的是增加它们的生物物理特性，例如溶解度、非聚集性、表达水平和稳定性。

　　本发明的VH或VL骨架还可被融合至另外的序列以帮助表达、检测或纯化重组抗体或其片段。可以使用本领域技术人员已知的任意这样的序列或标签。例如，但不意欲进行限制，所述抗体或其片段可以包含靶向序列或信号序列(例如，但不限于ompA)、检测标签(例如但不限于c-Myc)、纯化标签(例如但不限于His5或His6)、Fc片段，或它们的组合。在另一个实例中，所述另外的序列可以是生物素识别位置，例如由Cronan等在WO 95/04069中所描述的或Voges等在WO/2004/076670中所描述的生物素识别位点。同样，如同本领域技术人员所知的，接头序列也可以与所述额外的序列或标签联合使用。

　　本发明的VH或VL骨架还可以是在多价展示中。可以通过本领域中已知的任意合适方法进行多聚化。例如，但不意欲以任何方式进行限制，可使用如Zhang et al(2004a；2004b)和WO2003/046560中所描述的自组装分子来进行多聚化。所描述的方法通过表达包含本发明的VH或VL骨架和AB5毒素家族B-亚基的五聚化结构域(Merritt and Hol，1995)的融合蛋白产生五聚体；所述五聚化结构域组装成五聚体，通过所述五聚体形成所述抗体或其片段的多价展示。此外，所述五聚化结构域可使用接头连接至VH或VL骨架；这样的接头应具有足够的长度和合适的组成以提供两个分子的柔性连接，但是不应该妨碍VH或VL骨架的生物物理特性。

　　本发明还包括其他形式的多价展示。例如，但不意欲于进行限制，VH或VL骨架可以以至少二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或任意其他合适的低聚体存在。这可以通过本领域中已知的方法实现，例如直连连接(direct linking connection，Nielson et al，2000)、c-jun/Fos相互作用(de Kruif and Logtenberg、1996)、“Knob into holes”相互作用(Ridgway et al.，1996)或对本发明克隆的编码区的重复单位的顺序克隆以及本领域中已知的合适的短多肽接头。

　　本领域中已知的另一种多聚化的方法是使用Fc结构域将VH或VL组合物二聚化。当在体内应用时，单体sdAb被迅速地从循环中清除(Bell et al.，2010)。为了解决这个问题并且赋予VH或VL在抗原结合后诱导免疫应答的能力，可将VH或VL骨架融合至抗体恒定区片段(“体恒定)中以产生嵌合重链抗体(Bell et al.，2010)。在该方法中，将Fc基因与所述VH或VL基因一起插入至载体中以产生sdAb-Fc融合蛋白(Bell et al.，2010；Iqbal et al.，2010)；将融合蛋白重组表达，然后纯化。这样的抗体易于进行工程改造并且易于生产(Zhang et al.，2009)，可以极大地延长VH或VL的血清半衰期，并且可以是极佳的肿瘤成像试剂(Bell et al.，2010)。在一个实施方案中，Fc部分是人的。

　　本发明还包括编码本文所述分子的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含编码选自VH或VL骨架的免疫球蛋白骨架的序列，其中所述VH骨架包含至少一个在FR中的非常规二硫键，其是在基于Kabat编号的位置49和69上引入的Cys残基之间形成的；所述VL骨架包含至少一个在FR中的非常规二硫键，其是在基于Kabat编号的位置48和64上引入的Cys残基之间形成的。在一个实施方案中，所述核酸编码任意一个或多个选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和70-83的序列。在一个实施方案中，所述核酸序列包含编码合适氨基酸残基的简并密码子中的任意密码子。在一个实施方案中，所述核酸序列的编码区是密码子优化的。在一个实施方案中，所述核酸在表达载体中。在一个实施方案中，所述表达载体在能够表达所述核酸的宿主细胞或生物体中。

　　如本领域技术人员所熟知的，可以通过将编码特定氨基酸的核苷酸(即，密码子)用另一个可在宿主生物体中更好地表达的密码子替换来提高核酸序列在所述宿主细胞或生物体中的表达。引起这种作用的一个原因是由于这样的事实，即，不同的生物体表现出对不同的密码子的偏好。具体地，与植物和动物相比，细菌生物体和酵母生物体偏好不同的密码子。基于密码子偏好来改变核酸序列以实现更好的表达的过程被称作密码子优化。已有统计学方法来分析各种生物中的密码子使用偏好，已经开发了很多计算机算法以在密码子优化的基因序列的设计中执行这样的统计学分析(Lithwick and Margalit，2003)。在一个实施方案中，可对所述核酸序列进行密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。在一个实施方案中，可对所述核酸序列进行密码子优化用于在各种微生物中表达。在一个实施方案中，可对所述核酸序列进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达。在一个实施方案中，可对所述核酸序列进行密码子优化用于在酵母中表达。在一个实施方案中，对所述核酸序列进行密码子优化用于在酵母中表达以及用于抗体表面展示，即，在抗体噬菌体展示和抗体酵母展示之间穿梭。本发明还包括含如上所述核酸的载体。此外，本发明包括含有所述核酸和/或载体的细胞。

　　本发明还包含使用各种方法固定化至表面上的VH或VL骨架；例如，但不意欲进行限制，所述VH或VL骨架可通过His-标签偶联、生物素结合、共价结合、吸附等连接或偶联至所述表面。所述固体表面可以是任意合适的表面，例如，但不限于微量滴定板的孔表面、表面等离子体共振(SPR)传感芯片的通道、膜、小珠(例如磁性小珠或琼脂糖小珠或其他色谱树脂)、玻璃、薄膜或任意其他可用表面。

　　本发明还提供连接至货物分子的本发明的VH或VL；所述抗体或其片段可将所述货物分子递送至需要的位点。所述货物分子可以是可用于诊断、治疗或检测生物标志物的任何类型的分子。在一个实施方案中，所述货物标志物是可以减少和/或抑制靶细胞生长的分子。在一个实施方案中，所述靶细胞是与增殖性疾病相关的细胞。在一个实施方案中，所述增殖性疾病是癌症，包括各种类型的肿瘤，其中所述靶细胞表达被本发明的VH或VL结构域部分识别的标志物。因此，在一个实施方案中，所述货物分子是治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，所述货物分子被连接至治疗剂或诊断剂。

　　例如，但不意欲以任何方式进行限制，所述治疗剂可以是可用于放射免疫治疗的放射性同位素；毒素，例如免疫毒素；细胞因子，例如免疫细胞因子；细胞毒素；凋亡诱导物；酶；或本领域中已知的任意其他合适的治疗性分子。或者，诊断剂可以包括，但不以任何方式受限于放射性同位素、顺磁性标签、荧光团、亲和标签(例如生物素、亲和素等)、基于融合至可检测的蛋白质的分子，或任意其他可通过成像方法检测的合适试剂。在一个具体的非限制性实例中，所述抗体或其片段可被连接至荧光试剂，例如FITC，或者可以基因方法融合至增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。

　　可使用本领域中已知的任意方法(重组技术、化学缀合等)将所述抗体或其片段连接至所述货物分子。

　　本发明还提供了提高单域抗体的稳定性的方法，其包括在框架区中引入一个或多个非常规二硫键。在一个实施方案中，所述方法包括将至少两个非常规Cys残基引入至目的免疫球蛋白的框架区中。在一个实施方案中，所述两个Cys残基替换抗体可变区的FR2和FR3中的残基。在一个实施方案中，所述方法包括将Cys残基引入至选自VH sdAb结构域的VH FR2区域的残基47-49位置处，以及将Cys残基引入至选自VH sdAb结构域的VH FR3区域的残基69-71位置处。在一个实施方案中，所述方法包括将Cys残基引入至选自VL sdAb结构域的VLFR2区域的残基46-49位置处，以及将Cys残基引入至选自VL sdAb结构域的VL FR3区域的残基62-66位置处

　　在一个实施方案中，所述方法包括将至少1个非常规Cys残基引入VH结构域的位置49处和至少1个非常规Cys残基引入VH结构域的位置69处。在一个实施方案中，所述方法包括将至少1个非常规Cys引入VL结构域的位置48处和至少1个非常规Cys残基引入VL结构域的位置64处。

　　在一个实施方案中，所述方法包括制备包含本发明VH sdAb片段的表达文库，所述本发明的VH sdAb片段包含位置49和69处的非常规Cys残基之间的二硫键，其中所述本发明的VH sdAb片段包含多个CDR序列。在一个实施方案中，所述方法包含制备包含本发明的VLsdAb片段的表达文库，所述本发明的VL sdAb片段包含位置48和64处的非常规Cys残基之间的二硫键，其中所述本发明的VL sdAb片段包含多个CDR序列。可以使用本领域已知的用于CDR序列的抗体文库制备替换的任意合适方法。在一个实施方案中，所述CDR区域的位置如Kabat所定义。在一个实施方案中，所述CDR区域的位置如Chothia and Lesk所定义。在一个实施方案中，对所述表达文库进行密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。在一个实施方案中，对所述表达文库进行密码子优化用于在酵母中表达。在一个实施方案中，对所述表达文库进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达。

　　在一个实施方案中，所述突变可通过SOE-PCR方法(Arbabi-Ghahroudi et al.，2010以及其中的参考文献；Ho et al.，1989)或其他方法(Kunkel et al.，1987；Sidhu et al.，2000、Hussack et al.，In press(c))引入。或者，所述突变体的基因(无论是基因本身还是存在于靶克隆和表达载体内的基因)都可商购，(Kim et al.，In press)。

　　将会在以下实施例中进一步说明本发明。但是，应理解这些实施例是用于示例性目的，不应被用于以任何方式进行限制本发明的范围。

　　实施例1：突变体VH和VL的克隆、表达和纯化

　　将聚集性和非聚集性VH和VL结构域以及它们的对应物双半胱氨酸突变体克隆、表达并纯化。所使用的VH和VL，以及它们对应的Cys突变体，在表1中列出并在图1中示出。

　　表1.VH和VL以及构建的突变体

　　

　　＊在本文中称为“野生型”。如果没有提供序列编号(SEQ ID NO)，那么野生型序列是在PCT公开文本WO2006/099747中提供，尤其如所述公开文本的图2所示。

　　如Arbabi-Ghahroudi et al.(2009b)中所述制备野生型VH、HVHAm302、HVHAm427、HVHAm431和HVHPC235。如Tanha的WO 2006/099747中所述制备14个另外的野生型VH、HVHP44、HVHB82、HVHP421、HVHP419、HVHP430、HVHP429、HVHM41、HVHM81、HVHP428、HVHP420、HVHP414、HVHP423、HVHP413和HVHP426和野生型VL。含有这些野生型结构域(14个上述的VH除外；参见下文)的基因的质粒被用作模板来通过SOR_PCR构建相应的突变体。

　　本发明的VH和VL的构建体，在本文中也被称作“Cys突变体”(HVHAm302、HVHAm427、HVHAm431和HVHPC235)是使用剪接重叠延伸(SOE)-PCR(Ho et al.，1989；Kim et al.，提交的Arbabi-Ghahroudi et al.，2010)制备以在位置49和69处(VH)或位置48和64处(VL)引入一对Cys，所述VH和VL的位置如Kabat编号(Kabat et al.，1991)所定义的，并且VH结构域如图1A所提供的，VL结构域如图1B所提供的。简言之，为了产生VH突变体。制备了所述克隆的Cys-突变的亚片段，然后将其通过SOR_PCR组装成全长Cys突变体。例如，在HVHAm302S的情况下，通过标准PCR分别产生亚片段302S-1和302S-2，所述PCR使用包含野生型HVHAm302基因的质粒作为DNA模板和以下引物对：

　　M13RPa(5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’)(SEQ ID NO：37)

　　KT131(5’-ACCACTACTACTAATAG CGCAGACCCACTCCAGCCCCTTC-3’)(SEQ ID NO：38)(用于302S-1亚片段)和

　　M13FP(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)(SEQ ID NO：39)

　　KT129(5’-GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCTGCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC-3’)(SEQ ID NO：40)(用于302S-2亚片段)，

　　其次，使用302S-2作为模板，通过PCR制备片段302S-2-2，所述PCR使用以下PCR引物对：M13FP和

　　KT130(5’-TGCGCTATTAGTAGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG-3’)(SEQ ID NO：41)

　　该步骤将重叠区加至302S-2。之后，通过SOE-PCR使用引物对M13RP a或b/M13FP将亚片段302S-1和302S-2-2组装以产生具有Cys突变的全长VH片段。其他VH突变体使用相同的步骤和引物从其对应的野生型VH质粒制备；使用与用于VH突变体相同的SOE-PCR步骤制备VL突变体，除了使用不同的VL基因特异性的PCR引物和对应的野生型VL质粒模板。通过DNA2.0(Menlo Park，CA，USA)合成所述14个非聚集性VH，HVHP44、HVHB82、HVHP421、HVHP419、HVHP430、HVHP429、HVHM41、HVHM81、HVHP428、HVHP420、HVHP414、HVHP423、HVHP413和HVHP426的Cys突变体形式。它们分别被称作HVHP44S、HVHB82S、HVHP421S、HVHP419S、HVHP430S、HVHP429S、HVHM41S、HVHM81S、HVHP428S、HVHP420S、HVHP414S、HVHP423S、HVHP413S和HVHP426S。对于这14个构建体，所述框架和CDR区与对应的野生型序列相同，所述野生型序列如PCT公开文本WO2006/099747所提供的，尤其如所述公开文本的图2所示。

　　然后将全长Cys突变体克隆至表达载体中，表达，纯化，并且如他处(Sambrook et al.,1989；To et al.,2005；Arbabi-Ghahroudi et al.2009a；2009b；2010)所述确定它们的浓度。

　　额外的二硫键对Cys突变体VH和VL的表达量没有不利影响；野生型和突变体sdAb具有在毫克量上相当的产量。事实上，在一些表达试验中，HVHAm302S和HVHAm431S比它们的野生型对应物具有显著更高的表达量(参见图2A中的IMAC洗脱谱)。

　　在非还原性SDS-PAGE凝胶上，突变体VH和VL的迁移比它们的野生型对应物慢很多(图2B，示出HVHAm302/HVHAm302S和HVHPC235/HVHPC235S VH对的实例)。在还原条件下迁移差异消失。这样的SDS-PAGE迁移模式也见于VHH的情况下，并且被建议作为Cys突变体中已形成的Cys49/Cys69二硫键的标志(Hussack et al.,2011)。由于所述野生型/突变体对具有基本相同的分子量，野生型和突变体VH之间的凝胶迁移差异归因于由突变体中额外的、工程改造的二硫键造成的构象差异(Kim and Tanha，2010)。此外，野生型VH HVHAm302形成聚集体(参见图2B中的二聚体的条带)，这通过使用抗-His的抗体的蛋白质印迹进一步确认(图2B，数据未示出)。对于对应的突变体VH，HVHAm302S，所述二聚体条带消失(图2B)。这表明工程改造的二硫键改善了VH非聚集性，并且与分子筛色谱法的发现一致(参见下文和图4A)。

　　实施例2：Cys突变体的二硫键作图

　　由于引入所述VH和VL Cys突变体的二硫键对于所述抗体来说不是天然的，在进一步表征所述VH和VL突变体之前证实了所述突变位置上的二硫键的存在。

　　基于关于野生型VH中形成天然二硫键的两个Cys残基(Cys22和Cys92)(Amzel and Poljak，1979；Williams&Barclay，1988)和所述突变体的经突变的残基的知识，可以预测二硫键的位置。由于VH中的所预测的二硫键之间有一些胰蛋白酶切割位点存在，能够用胰蛋白酶消化所述Cys突变体，并利用质谱来证实所述工程改造的二硫键的存在。

　　如他处所述(Hussack et al.,In press(b)；Kim and Tanha，In press；Wu et al.,2009)进行VH和VL的二硫键测定。完全地如Kim and Tanha(In press)中所述进行HVHAm302和HVHAm302S的二硫键测定。简言之，将VH Cys突变体使用带有biomax-5膜的Ultrafree-0.5离心过滤装置(MWCO 5000；Millipore，Nepean，ON，Canada)浓缩于0.1M Tris-HCl(pH 8.5)中，以在0.1M Tris-HCl(pH 8.5)中0.5mg/mL的浓度进行胰蛋白酶消化(Roche Diagnostics Canada，Laval，QC，Canada)，通过SDS-PAGE分析胰蛋白酶消化的成功与否，之后进行肽质谱分析(图3和表2)。

　　结果显示通过VH的胰蛋白酶消化产生的二硫键连接肽可以通过所使用的质谱法来鉴定(图3B和表2)。使用输注ESI_MS测定重组蛋白质的所有分子量至40ppm的质量准确度之内。从使用具有DDA的nanoRPLC-MS2进行的对胰蛋白酶消化物的分析(依赖于数据的分析)得到的每种蛋白质的鉴定覆盖超过30％。二硫键连接肽离子在DDA实验的全元素扫描(survey sacn)中看起来是突出的。来自VH的所预测的二硫键连接肽序列全部都通过人工从头测序确认了。

　　表2通过质谱进行的VH的二硫键确定。示出了含有二硫键的主要胰蛋白酶酶解肽，所连接的半胱氨酸以粗体和下划线显示；VH中其余的序列因胰蛋白酶消化而丢失。肽双联体之间的距离表示序列不连续性。

　　a MWfor和MWexp之间的非常接近的匹配表明了Cys49-Cys69二硫键的存在。MWfor：化学式(预测的)分子量；MWexp：通过MS实验确定的分子量；ΔMW是计算出来的：(MWfor-MWexp)。给出了以道尔顿(Da)计的MWfor、MWexp和ΔMW。

　　在HVHAm302S的情况下，在m/z 964.04(3+)处的突出离子被测序为二硫键连接肽GLEWVAISSSGGSTYYADSVK(P1)(SEQ ID NO:29)和FTSR(P2)(SEQ ID NO:30)(图3B和表2)，其中分别在m/z 1153.85(2+)和m/z 649.78(2+)处清楚地观察到含有二硫键的肽片段离子，y117+P2和b16+P2(图3B和表2)。这确认了HVHAm302S中Cys49和Cys69之间工程改造的二硫键的存在。还确定了HVHPC235S中Cys49和Cys69之间工程改造的二硫键的存在(表2)。然而，通过质谱没能确认HVHAm427S和HVHAm431S的二硫键，因为它们高度抗蛋白酶(胰蛋白酶或胃蛋白酶)消化。但是，与它们各自的野生型形式相比，HVHAm427S和HVHAm431S的显著升高的Tm(表4)以及SDS-PAGE迁移变化(图2B)，表明在HVHAm427S和HVHAm431S中均存在工程改造的二硫键。

　　作为另一个代表性实例，所述14个突变体VH之一(HVHP426S)被选取用于确定Cys 49/Cys 69二硫键的形成。同其他VH的情况一样，MS结果表明HVHP426S在Cys 49和Cys 69之间形成了二硫键(表2)。

　　在突变体VL上进行的类似质谱分析确认了所有VL中位置Cys48和Cys64之间工程改造的二硫键的存在(表3)。

　　表3.通过质谱(MS)进行的VL的二硫键确定。示出了含二硫键的主要胰蛋白酶酶解肽，所连接的半胱氨酸以下划线(和斜体)和粗体显示；在HVLP324S、HVLP342S、HVLP351S和HVLP3103S的情况下，另一对连接的半胱氨酸为斜体；VL中的其余序列因胰蛋白酶消化而丢失。肽片段之间的距离表示序列不连续性。

　　a MWfor和MWexp之间非常紧密的匹配表明Cys48-Cys64二硫键的存在。MWfor：化学式(预测的)分子量；MWexp：通过MS实验确定的分子量；ΔMW是计算出来的：(MWfor-MWexp)。给出了以道尔顿(Da)计的MWfor、MWexp和ΔMW。

　　晶体结构分析确认了在所测试的所有本发明VH和VL构建体中，除了常规Cys-Cys残基之间的二硫键之外，存在非常规Cys-Cys残基之间二硫键。

　　实施例3：分析性分子筛色谱法

　　分子筛色谱法(或凝胶过滤色谱法)通过分子大小和流体力学体积分离蛋白质(Porath and Flodin，1959)。因此，这种方法可用于评估溶液中的蛋白质聚集状态。将使用SuperdexTM 75的分子筛色谱法用于评估VH(或VL)结构域的聚集状态。非聚集性的VH(或VL)应该产生具有单对称峰的色谱图，且具有单体VH(或VL)的期望洗脱体积。相反，聚集性VH的色谱图，除了单体峰之外，还包括另外的峰例如大聚集体、二聚聚集体，其较早洗脱。单体百分比可通过对所述峰进行面积积分计算，并且可用作VH(或VL)聚集倾向的定量性量度(VH(或VL)的单体％越高，它的聚集倾向越低，反之亦然，VH(或VL)的聚集体％越高，聚集倾向越高)。

　　如前所述(Sambrook et al.,1989；To et al.,2005；Arbabi-Ghahroudi et al.,2009a；Arbabi-Ghahroudi et al.,2009b；Arbabi-Ghahroudi et al.,2010；Kim and Tanha、In press)对VH和VL以及它们的对应Cys突变体进行分子筛色谱。简言之，将SuperdexTM 75分子筛柱用50mL过滤并脱气的ddH2O洗涤，然后以0.5mL/分钟的泵速用50mL过滤并脱气的PBS平衡。将样本通过0.22μm一次性过滤装置过滤，然后按照制造商的说明在使用Superdex柱和流速0.5mL/分钟的PBS缓冲液的AKTA FPLC上进行分子筛色谱。使用AKTA级分收集器以每管0.5mL级分体积收集对应于峰的洗出液。分子筛色谱之后，使用绘图软件GraphPad Prism(对于Windows为版本4.02；GraphPad Software，San Diego，CA)将A280对洗脱体积作图(图4)。对单体峰和聚集体峰进行积分以获得％单体或％聚集体。

　　将分子筛色谱(SEC)的吸光度值(A280)归一化，并相对于洗脱体积作图。根据下式进行吸光度归一化：

　　％A280＝(A280N–A280B)/(A280M–A280B)×100

　　其中％A280是归一化的吸光度，A280N是在任意洗脱体积下的吸光度，A280M是最大吸光度，A280B是基线吸光度。

　　结果(图4A)表明全部三种聚集性的VH(HVHAm302、HVHAm427和HVHAm431)中，突变极大地改善了蛋白质非聚集性。除了单体峰之外，野生型VH显示出聚集性VH的典型的早期洗脱峰(对于HVHAm302和HVHAm427为约22％，对于HVHAm431为25％)，这些早期洗脱峰在对应突变体中消失，其基本由单体峰构成；这表明二硫键工程改造将聚集性VH转变为非聚集性VH。非聚集性VH，HVHPC235，当被Cys突变为HVHPC235S时，保留了其非聚集特性，如它们的分子筛色谱所示(图4A)。图4B示出所述VH的14个VH突变体，HVHP44S、HVHB82S、HVHP421S、HVHP419S、HVHP430S、HVHP429S、HVHM41S、HVHM81S、HVHP428S、HVHP420S、HVHP414S、HVHP423S、HVHP413S和HVHP426S各自的SEC图谱。如在所检查的所有4个实例(HVHP414S、HVHP420S、HVHP426S和HVHP429S)中可看到的，所述突变体保留了与它们的亲本野生型VH相似的非聚集性。这再次表明在非聚集性VH的情况下，二硫键工程改造没有损害VH的非聚集特性，其极大地提高了它们的稳定性，如下文所示。

　　野生型VL基本上没有聚集体，并且给出对称单峰。VL Cys突变体也是单体的，HVLP364S除外，其显示出轻微的聚集(11％的二聚聚集体)。因此，总的来说，工程改造的二硫键并没有损害VL的非聚集特性(图4C)。

　　实施例4：通过圆二色性(CD)色谱进行的热稳定性测量

　　为了评估突变体VH和VL中额外的工程改造的二硫键是否会提高蛋白质稳定性，评估了通过用CD色谱测量的解链温度(Tm)得到的热稳定性。

　　对于所有的VH和突变体VL，使用装备有Peltier热电型温度控制系统的Jasco J-815分光偏振计(Jasco、Easton、MD、USA)来进行实验。使用径长为1mm的CD比色皿。在180-260nm的波长范围记录光谱，扫描速度为50nm/分钟，数字积分时间(DIT)为4s，带宽1nm，数据间距(data pitch)1nm，积分时间为1秒。为了测量解链温度或Tm(Greenfield、2006a；2006b)，在30℃至96℃的温度范围内记录CD光谱。所有的CD光谱都减去对应于缓冲液光谱的空白值。用溶于100mM(pH 7.4)磷酸钠缓冲液中浓度为50μg/mL的VH进行测量。通过椭圆率变化监测热诱导的蛋白质变性，对所有Cys突变体VL以及对HVHAm431、HVHAm431S和HVHP419S在210nm下监测；对HVHAm427、HVHAm427S、HVHAm302、HVHAm302S、HVHB82、HVHP421、HVHP426、HVHP428、HVHP429、HVHP420S、HVHP429S、HVHM81S、HVHP430S、HVHP421S、HVHP426S、HVHP428S、HVHM41和HVHP414S在205nm下监测；对HVHPC235在220nm下监测；对HVHPC235S、HVHP430、HVHP413、HVHP423、HVHM81、HVHP419、HVHP420和HVHP82S在200nm下监测；对HVHP44、HVHP414和HVHP423S在202nm下监测；对HVHP44S在208nm下监测；对HVHM41S在209nm下监测。通过如(Greenfield、2006a；2006b)描述的公式获得折叠分数(ff)：

　　ff＝([θ]T–[θ]U)/([θ]F–[θ]U) 公式I

　　其中[θ]T是任意温度下的摩尔椭圆率，[θ]F是30摄氏度下完折叠蛋白的摩尔椭圆率，[θ]U是90℃下解折叠蛋白的摩尔椭圆率。使用作图软件GraphPad Prism(对Windows为4.02版本)通过非线性回归曲线拟合(Boltzman S形方程式)得到作为解折叠曲线(折叠分数(ff)相对于温度)中点的解链温度(Tm)，并记录在表4中。

　　对于野生型VL，使用了具有NESLAB RTE-111水浴配件(bath accessory)的Jasco J-810分光偏振计。使用径长为0.02cm的圆形皿(cell)。以100nm/分钟的扫描速度、1nm的带宽和1秒的积分时间记录光谱。对于HVLP342、HVLP351和HVLP3103，在25℃至85℃的温度范围内记录CD光谱；对于HVLP324、HVLP325、HVLP364和HVLP389在25℃至80℃的温度范围内记录CD光谱；对于HVLP335在25℃至90℃的温度范围内记录CD光谱。热诱导的摩尔椭圆率改变，对于HVLP325和HVLP389是在203nm下监测，对于HVLP324、HVLP335、HVLP342、HVLP351、HVLP364和HVLP3103是在218nm下监测。在浓度范围为4.1×10-5M至5.7×10-5M的磷酸钠缓冲液中进行测量。所有CD光谱都减去对应缓冲液光谱的空白值，并且如之前对VH和突变体VL的描述获得解链温度(Tm)。

　　表4.VH、VL和对应Cys突变体的亲和常数KD和解链温度Tm。对于VL，KD是针对蛋白L的；对于VH，KD是针对蛋白A的。

　　a对应于HVLP324、HVLP324S、HVLP342和HVLP342S与蛋白L上高亲和位点的结合的较小KD值。

　　b参见Arbabi-Ghahroudi et al.(2009b)中的表1。

　　c获得两个非常接近的KD。

　　d括弧中的值是使用较高浓度的单体获得的。

　　e表示因尚未限定的较低平衡得到的最小估算Tm(参见图5A中解链曲线图)。

　　f以两个重复进行。

　　g取自To et al.,2005的KD。

　　假定二态系统(其与所观察到的对应于急剧转变至变性的变性曲线一致)，基于椭圆率数据确定VH(HVHAm302和HVHAm302S、HVHAm427和HVHAm427S、HVHAm431和HVHAm431S、HVHPC235和HVHPC235S、HVHP44和HVHP44S、HVHB82和HVHB82S、HVHP421和HVHP421S、HVHP419和HVHP419S、HVHP430和HVHP430S、HVHP429和HVHP429S、HVHM41和HVHM41S、HVHM81和HVHM81S、HVHP428和HVHP428S、HVHP420和HVHP420S、HVHP414和HVHP414S、HVHP423和HVHP423S、HVHP413和HVHP413S、和HVHP426和HVHP426S)和VL的解链温度(Tm)，(图5和6以及表4)。Tm值是在折叠分数(ff)与温度的S形变性曲线的中点取值。与HVHAm302和HVHC235不同，HVHAm427和HVHAm431都有相当高的Tm，可能是由于存在可能的CDR1-CDR3内二硫键(图1A和表4)。在HVHAm302和HVHAm302S、HVHAm427和HVHAm427S、HVHAm431和HVHAm431S、HVHPC235和HVHPC235S VH的情况下，本发明人发现与它们对应的野生型对应物相比，突变体VH具有显著较高的Tm(表4)(配对t-检验，双尾，p＝0.0008)，表明了工程改造的二硫键的稳定作用。野生型VH的Tm为52.8℃-70.9℃，而突变体VH的Tm提高至65.4℃-84.6℃。这对应12.6℃-16.5℃的Tm增加(ΔTm)。在HVHP44和HVHP44S、HVHB82和HVHB82S、HVHP421和HVHP421S、HVHP419和HVHP419S、HVHP430和HVHP430S、HVHP429和HVHP429S、HVHM41和HVHM41S、HVHM81和HVHM81S、HVHP428和HVHP428S、HVHP420和HVHP420S、HVHP414和HVHP414S、HVHP423和HVHP423S、HVHP413和HVHP413S以及HVHP426和HVHP426S VH的情形中观察到类似的模式，其中野生型VH的Tm为54.2℃-72.5℃，而突变体对应物的Tm为64.7℃-82.7℃。对于突变体VH，这对应为8.9℃-16.8℃的Tm增加(ΔTm)。(表4)。通过比较突变体VH和野生型VH的二硫键模式(表2)，很明显Tm提高确实是因为存在额外的Cys49/Cys69二硫键。不意欲囿于理论，HVHAm427S中的二硫键可引起构象改变以使得构象模块(例如β折叠)接近(通过短或长范围的接触起作用)，从而诱导额外的化学力，例如疏水相互作用或盐桥，以进一步稳定该水平上的结构。

　　VL的Tm的范围为49.3℃-64.6℃，其他sdAb中也观察到了这样的范围(Jespers et al.,2004；Tanha et al.,2006)(图6和表4)。如同在突变体VH的情况下，与野生型VL的Tm相比，所有突变体VL的Tm平均显著增加17℃(范围：11.2℃-21.1℃)。与野生型VL为49.3℃-64.6℃的Tm范围相比，突变体VL的Tm范围为63.8℃-82.5℃。因此，热稳定性最低的突变体(HVLP342S)的Tm，与热稳定性最高的野生型(HVLP325)的Tm相当(图6C)；HVLP325S具有最高的Tm(82.5℃)，而HVLP342S具有最低的Tm(63.8℃)。二硫键工程改造对VL稳定性的作用看来是普遍的，因为它既稳定λ也稳定κ型VL，并且不考虑它们的种系序列起源。

　　实施例5：表面等离子体共振(SPR)

　　VH和VL的蛋白A和蛋白L结合特性被分别用于SPR结合分析以探测由VH和VL突变体中工程改造的二硫键引起的任意细微的可能结构变化。蛋白A经常被用于监测VH的构象完整性(Starovasnik et al.,1999)。执行了标准步骤用于VH和VL的SPR分析。

　　将VH和VL在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％P20表面活性剂)中以流速0.5mL/分钟进行SuperdexTM 75 10/300(GL)分子筛色谱(GE Healthcare)，然后进行BIACORE分析，甚至在没有聚集的物质的任何迹象的情况下收集纯化的单体峰。VH与蛋白A(Pierce、Nepean、ON、加拿大)以及VL与蛋白L(Pierce)的相互作用的结合动力学是使用BIACORE 3000生物传感器系统(GE Healthcare)通过SPR确定。

　　对于VH，HVHAm302、HVHAm302S、HVHAm427、HVHAm427S、HVHAm431和HVHAm431S，540RU和1350RU的蛋白A和卵清蛋白(作为参考蛋白)(Sigma、Oakville、ON、加拿大)分别被固定化在研究级CM5传感芯片上(GE Healthcare)。使用制造商(GE Healthcare)提供的胺偶联试剂盒在10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中以50μg/mL进行固定化。在25℃下，所有的测量都在HBS-EP缓冲液中以50μL/分钟的流速进行。表面是通过用电泳缓冲液洗涤来再生。

　　对于HVHPC235和HVHPC235S，分别约1,100RU和1,000RU的重组蛋白A和卵清蛋白(参考蛋白质)被固定化在研究级传感芯片CM5上。使用制造商提供的胺偶联试剂盒，在10mM乙酸盐缓冲液(对于蛋白A或卵清蛋白分别为pH 4.0或pH 4.5)中以50μg/mL进行固定化。所有的测量都在25℃下在HBS-EP缓冲液中以分别以20μL/分钟(对于HVHPC235)或40μL/分钟(对于HVHPC235S)的流速进行。

　　对于突变体VH(HVHP44S、HVHB82S、HVHP421S、HVHP419S、HVHP430S、HVHP429S、HVHM81S、HVHP428S、HVHP420S、HVHM41S、HVHP423S、HVHP413S、HVHP426S和HVHP414S)，分别约1170RU和1240RU的重组蛋白A和卵清蛋白(参考蛋白)被固定化至研究级传感芯片CM5上。使用制造商提供的胺偶联试剂盒，在10mM乙酸盐缓冲液(对于蛋白A和卵清蛋白pH均为4.5)中以50μg/mL进行固定化。所有的测量都在25℃下在HBS-EP缓冲液中进行，对于HVHB82S、HVHP421S、HVHP429S、HVHM41S、HVHM81S、HVHP423S、HVHP413S、HVHP426S,和HVHP414S或者HVHP44S、HVHP419S、HVHP430S、HVHP428和HVHP420S，流速分别为20μL/分钟或40μL/分钟。之前测定了野生型对应物的蛋白A结合特性(To et al 2005)。

　　对于野生型VL，600RU的蛋白L或800RU的Fab参考蛋白被固定化至研究级CM5传感芯片上(GE Healthcare)。对于VL突变体，约400RU的重组蛋白L或卵清蛋白(参考蛋白)被固定化。使用制造商(GE Healthcare)提供的胺偶联试剂盒，在10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中以20或50μg/mL的蛋白质浓度进行固定化。所有的测量都在25℃下在HBS-EP缓冲液中以40或50μL/分钟的流速进行。表面通过用电泳缓冲液洗涤来再生。使用BIAevaluation 4.1软件(GE Healthcare)来评估所有的数据。

　　SPR分析表明，与它们的野生型对应物相比，绝大部分突变体VH(HVHAm302S、HVHAm427S、HVHAm431S、HVHPC235S、HVHB82S、HVHP421S、HVHP419S、HVHP430S、HVHP429S、HVHM81S、HVHP420S、HVHM41S、HVHP423S、HVHP413S、HVHP426S和HVHP44S)以较低亲和性与蛋白A结合，可由较高的KD值反映(图7和表4)(仅两个突变体VH[HVHP428S和HVHP414S]显示出与它们的野生型对应物差不多相同的KD值)。蛋白质A结合的减弱(KD值的增加)范围为从1.6倍(对于HVHM81/HVHM81S对)至10倍(对于HVHPC235/HVHPC235S对)(图7A和表4)。这证明了所述工程改造的二硫键稍微改变了VH的结构构象。不意欲囿于理论，蛋白A结合位置(已知在VH的FR1和FR3内部(Starovasnik et al.,1999；Riechmann和Davies、1995))，可能被FR2和FR3的β折叠上引入的两个Cys影响了。值得注意的是，与它们的野生型对应物相比，变体VH显示出一致增大的离解速度常数(koff)，这导致平衡结合常数(KD)增大(图7B)。

　　发现VL Cys突变体以与它们的野生型对应物相似的亲和性来结合蛋白L(图8A和表4)，这表明二硫键没有影响VL的整个结构。

　　实施例6：蛋白酶稳定性

　　使用主要GI蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶就工程改造的二硫键对VL和VH的蛋白酶稳定性的作用进行评估。在用GI蛋白酶进行消化反应之后，通过SDS-PAGE和质谱检查VL和VH中酶切割的发生情况。基本如(Hussack et al.,2011)所述进行消化。

　　对于VL，消化实验按如下方式进行：总体积为30μL，含6μg VL，在37℃下进行1小时，酶与sdAb的比例为1:200、1:40、1:20和1:10(胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶)，或1:200、1:20、1:10和1:4(胃蛋白酶)。根据制造商的说明使用测序级酶(Hoffmann-La Roche Ltd.，Mississauga，ON，Canada)进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化实验。在约pH 2.0下进行胃蛋白酶(Sigma)消化反应，其中pH是通过加入合适体积的400mM HCl来调节。在对照实验中，用等体积的反应缓冲液来替代酶。通过加入等体积的SDS-PAGE样品缓冲液(含0.2M二硫苏糖醇)并在95℃下煮沸所述混合物5分钟来终止反应。之后通过SDS-PAGE对样品进行分析，蛋白酶消化之后完整的sdAb的百分比是通过如Hussack et al.,In press(a)所述的点密度分析来确定，并且将其与对照进行比较以计算蛋白酶消化之后具有完整结构的VL的百分比。

　　对于VH，使用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶/胃蛋白酶的消化实验按如下方式进行：总体积为30μL，含6μg的VH及其突变体VH对应物(平行实验)，在37℃下进行1小时，酶与sdAb的比例是1:20，在两个独立实验中以两个重复进行。如对VL所描述的进行消化和分析。

　　结果在图9A中示出。在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抗性方面，没有观察到野生型和突变体VL之间有显著差异(Wilcoxon配对t检验，双尾P值＝0.2969[胰蛋白酶]和0.0625[胰凝乳蛋白酶])，但是胃蛋白酶抗性方面的差异是显著的(Wilcoxon配对t检验，双尾P值＝0.0078)。所测试的突变体VL显示出提高的胃蛋白酶抗性，其中之一，HVLP3103S，显示从0％抗性(野生型)至几乎90％抗性(突变体)的显著提高。在胃蛋白酶与VL比例为1:20的情况下，突变体VL胃蛋白酶抗性的平均值为51％，野生型VL为11％。在相同的比例下，突变体VL的胃蛋白酶抗性中位数为54％，野生型VL为1.5％。因此，sdAb的二硫键工程改造显著提高了它们的胃蛋白酶抗性而不影响它们的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抗性。

　　通过对蛋白酶抗性(％)相对于Tm作图进一步探究了热稳定性与蛋白酶抗性之间的相关性(图9B)。通常，具有更高Tm的VL显示出较高的胃蛋白酶抗性(双尾，P值＝0.0012，R2(Spearman)＝0.7344)。这样的相关性在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的情况下没有观察到(双尾，P值＝0.5245，R2(Spearman)＝-0.1719[胰蛋白酶]；双尾，P值＝0.5407，R2(Spearman)＝-0.1653[胰凝乳蛋白酶])。

　　在表5示出的VH的情况中，突变体VH显示出对所有3种GI蛋白酶的更高抗性(％中位数)(对于野生型和突变体VH分别是，77％和82％[胰蛋白酶]，69％和75％[胰凝乳蛋白酶]，96％和98％[胃蛋白酶])，尽管所述差异不是那么显著(Wilcoxon配对t检验，双尾P值＝0.0899[胰蛋白酶]、0.7896[胰凝乳蛋白酶])、0.7832[胃蛋白酶])。虽然大部分突变体VH显示出未改变或轻微提高的胃蛋白酶抗性，但是两个突变体VH(HVHM81S和HVHP423S)显示出从100％(对于HVHM81和HVHP423)至53％(对于HVHM81S)和至68％(对于HVHP423S)的抗性降低，但是HVHM81S的胃蛋白酶抗性似乎由于点密度分析工具不能正确识别蛋白条带而被低估了。值得注意的是，两个突变体VH(HVHP44S和HVHP413S)在胰蛋白酶抗性方面显示出大幅改善，其中它们的胰蛋白酶抗性从5％和29％(分别对于HVHP44和HVHP413)提高至57％和100％(分别对于HVHP44S和HVHP413S)。总的来说，与野生型对应物一样，所述突变体具有蛋白酶抗性。

　　表5.VH的GI蛋白酶抗性

　　a胃蛋白酶抗性是低估的。

　　实施例7：VH之间和VL之间的序列同一性

　　确定了VH之间的序列同一性以及VL之间的序列同一性。仅FR序列包含在所述分析中，即，不包括CDR序列。

　　使用ClustalW(Thompson et al.,1994)对VH对或VL对的序列进行了对比，VH对或VL对之间的百分比同一性是使用BioEdit序列对比编辑软件计算。

　　VH位置49和69处以及VL位置48和64处的Cys对取代的生物物理学影响被证明是普遍的，与它们的序列、种系起源，以及CDR长度和组成都无关。VH具有多样化的种系起源以及CDR长度和氨基酸组成。具体地，CDR3长度和组成更加多样化。但是，不依赖于这些结构改变，在位置49和69上Cys对的引入导致Cys49/Cys69二硫键的形成以及VH的非聚集性、热稳定性和蛋白酶稳定性的显著提高，而不损害它们的表达量。WO 2006/099747中描述的32个VL是多样化的：它们属于κ和λ家族，并且具有不同的V片段和J片段种系起源以及CDR氨基酸组成和长度。CDR3的长度，具体地为6至11个氨基酸。从上述32个VL中选出代表不同种类的8个非聚集性VL(图1B)来评估Cys48/Cys64取代的生物物理学影响。如同在VH的情况下，对8个VL和它们的Cys突变体形式进行的并列分析显示，不依赖于结构改变，位置48和64上的Cys对引入导致Cys48/Cys64二硫键的形成以及VL的热稳定性和蛋白酶稳定性的显著提高，而不损害它们的非聚集状态或表达量。

　　实施例8：二硫键稳定的VL噬菌体展示文库的构建

　　通过Hussack et al.(In press(c))描述的方法分两步构建HVLP324S VL噬菌体展示文库。首先，基于HVLP324S VL骨架构建含有随机化的CDR3的文库(图10)。然后，将所述CDR3-随机化文库用作骨架来构建含有所有3个CDR均随机化的最终文库。

　　(i)CDR3-随机化VL噬菌体展示文库的构建

　　如(Hussack et al.,In press(c))所述制备包含尿苷而非胸苷的噬菌体ssDNA(dU-ssDNA模板)，除了用于ssDNA制备的噬菌体是fd-tetVL24S以外。fd-tetVL24S是fd-tetGIIID噬菌体(Tanha et al.,2001)，其基因组中有HVLP324S VL基因并且与噬菌体p3基因融合(图10)。如(Hussack et al.,In press(c))中所述通过将所述噬菌体针对TG1和CJ236大肠杆菌细胞进行滴定来确认尿苷被纳入到噬菌体ssDNA中。制备总共75μg的溶于ddH2O水中的fd-tetVL24S ssDNA。如(Hussack et al.,In press(c))所述，使用引物VL24-CDR3、VL24-CDR3a和VL24-CDR3b进行异源双链DNA的体外合成，同时伴有CDR3随机化。将引物磷酸化(Hussack et al.,In press(c))并用于退火反应中。进行3个单独的退火反应，分别在93℃下进行5分钟，在50℃下进行15分钟，在20℃进行20分钟，总体积为15μL，含8.2μL的121.5ng/μL fd-tetVL24S dU-ssDNA，0.33μL磷酸化引物VL24-CDR3、VL24-CDR3a或VL24-CDR3b，1μL混合物(2μL10×TM缓冲液[500mM Tris-HCl、100mM MgCI2、pH 7.5]，2μL 10mM ATP，1μL 100mM DTT，15μL ddH2O)和1.5μL 10×TM缓冲液。如下所述合成共价闭合的环状DNA(CCC-DNA)：制备总量为100μg的溶于ddH2O水中的CCC-DNA，并将其通过SpeedVacTM浓缩至溶于255μL中的82.5μg(323ng/μL)。如所述进行23次转化(11μL CCC-DNA+350μL的电感受态大肠杆菌TG1)。在SOC培养基中孵育之后，对转化材料进行滴定并将其在1L的2×YT/四环素(12.5μg/mL)中于37℃和180rpm下过夜培养。早晨收集细胞并且如所述制备冷冻文库储液。所述冷冻文库储液的细胞密度是通过A600nm测量值来估算。将扩增的文库噬菌体从所述上清液中纯化，滴定(参见Hussac et al.(c))，并用作起始材料以构建最终文库(参见(ii)部分)。根据对所述转化材料的滴定实验(参见上文)，确定所述文库的规模(转化株的数量)为2.3×108。

　　(ii)所述CDR1/CDR2/CDR3-随机化VL噬菌体展示文库的构建

　　在所述文库构建的第二步中，将CDR1和CDR2随机化。用上文得到的4×1012cfu CDR3-随机化文库噬菌体起始来制备dU-ssDNA模板(参见Hussac et al(c))。从2mL噬菌体(2x109/μL)中得到200μg的ssDNA。如上所述确认尿苷被纳入到噬菌体ssDNA中。dU-ssDNA模板被用于使用诱变寡核苷酸VL24-CDR1和VL24S-CDR2的第二轮诱变中。退火和CCC-DNA合成步骤与上文描述的那些基本相同。制备300μg溶于1mL ddH2O水中的CCC-DNA。如所述进行77次转化(13μL CCC-DNA+200μL电感受态大肠杆菌TG1)。在SOC培养基中孵育之后，对转化材料进行滴定并将其在3L的2×YT/四环素(5μg/mL)中于37℃和180rpm下过夜培养。如上所述制备冷冻文库储液并估算其细胞密度。从所述上清液中纯化所述文库噬菌体，溶于终体积20mL PBS中，针对TG1进行滴定，并以500μL的等分试样在-80℃下冷冻保存，将来作为输入噬菌体用于第一轮筛选。所确定的所述文库规模为1×108株转化株。如Hussac et al(c)所述，将来自所述文库(非扩增文库)滴定板的78个VL克隆进行测序。

　　HVLP324S VL被用作构建二硫键稳定的合成VL文库的骨架。HVLP324S是之前描述的HVLP324的突变体形式，但是其在Cys48和Cys64之间有额外的二硫键。基本上如针对之前记载的HVLP324VL噬菌体展示文库所描述的，通过在所有3个CDR的16(CDR3＝9个氨基酸)、17(CDR3＝10个氨基酸)和18(CDR3＝11个氨基酸)位置上引入多样性来构建HVLP324S VL噬菌体展示文库(图11，Hussack et al(c))。所述文库规模适中，为1×108转化株。对来自非扩增文库的78个VL克隆的序列分析显示多样性已被引入至所有的CDR位置，并且有偏好亲本VL(HVLP324S)氨基酸残基的偏好随机化。对78个克隆的测序显示2个与野生型HVLP324S相同，8个具有CDR1的野生型序列，2个具有CDR2的野生型序列，18个具有CDR3的野生型序列，9个具有CDR1和CDR2的野生型序列，1个具有CDR2和CDR3的野生型序列，2个具有CDR1和CDR3的野生型序列。所述文库中这些克隆的存在有助于之前提到的序列偏好。

　　对所述76个文库克隆的CDR3长度分布分析显示大部分(71％)所述文库克隆的CDR3长度为9个氨基酸。CDR3长度为10个和11个氨基酸的克隆分别是18％和11％。

　　所述文库设计、构建和表征的其他细节在图11的图片和图注中提供。所使用的具体寡核苷酸在表6中提供，其中使用IUPAC命名法指定各个位置上简并核苷酸残基用N、K和R表示。

　　表6.用于分子克隆的寡核苷酸列表

　　N:A、T、G、or C.

　　K:T或G.

　　R:A或G.

　　实施例9：二硫键稳定的VL噬菌体展示文库的确认

　　为确认HVLP324S VL噬菌体展示文库，对所述文库筛选针对两个不同测试抗原(即人溶菌酶和人血清白蛋白(HSA))的结合物。将通过初始结合测定(噬菌体ELISA)鉴定的阳性候选结合物(噬菌体展示的VL)亚克隆至载体中用于在大肠杆菌中表达。将VL结合物表达、纯化并对亲和性和稳定性进行分析。

　　实施例9a：淘选

　　通过标准淘选技术(参见，例如Lee et al.,2007；Arbabi-Ghahroudi et al.,2009a)来进行抗人溶菌酶的VL的筛选。简言之，将Nunc微滴定孔(VWR International,Ltd.,Mississauga，ON，Canada)在4℃下用100μL溶于无菌PBS(3.2mM Na2HPO4、0.5mM KH2PO4、1.3mM KCl、135mM NaCl、pH 7.4)中1mg/mL的人溶菌酶(Sigma-Aldrich，Mississauga，ON，Canada)包被过夜。将所述孔用无菌PBS洗涤三次，用纸巾吸干，在37℃下用150μL溶于无菌PBS(2％MPBS)中的2％(w/v)乳封闭2小时。将封闭剂从所述孔中除去，并向所述空中加入100μL文库噬菌体(在实施例8，(ii)部分中制备的溶于1％MPBS中的扩增噬菌体(5×1011cfu；在37℃下预孵育1.5h))并在37℃下孵育1.5h。用PBST(溶于无菌PBS中的0.05％(v/v)吐温-20)洗涤10次之后，通过在室温下用100μL新鲜配制的124mM三乙胺孵育所述孔10分钟，在第8分钟时用移液器吹打来洗脱噬菌体。通过在1.5mL微型管中与50μL 1M Tris-HCl(pH 7.5)混合来中和所述洗脱的噬菌体溶液，并将其放在冰上直至感染阶段。在50mL无菌Falcon管中制备2×5mL指数生长的大肠杆菌TG1细胞(OD600＝～0.5)，从其中取2mL用145μL洗脱的噬菌体(保留5μL用于如下所述测定洗脱的噬菌体的滴度)在37℃下感染30分钟。使用Sorval Legend RT转子和离心机(Thermo Fisher Scientific，Nepean，ON，加拿大)将感染的细胞在4℃下以4000rpm离心20分钟，除去上清液，将片状沉淀物重悬于1mL 2×YT中并且均匀涂布至3个含有2×YT琼脂/5μg/mL四环素(2×YT/Tet)的大培养皿上。将所述培养皿在37℃下过夜孵育。次日，从所述大培养皿上回收扩增的噬菌体。简言之，将10-15mL无菌PBS(根据菌落密度决定添加体积)加至每个培养皿，将所述细胞用玻璃涂布器刮下并收集在无菌的50ml无菌Falcon管中。如前所述再次刮下将所述细胞并与上次的细胞合并。通过使用Sorval Legend RT转子和离心机(Thermo Fisher Scientific)在4℃下以4000rpm下离心20分钟将所述悬液分级分离为细胞片状沉淀物和上清液。基本上如(Lee et al.,2007)从所述上清液纯化扩增的噬菌体。简言之，在50ml无菌Falcon管中，向用无菌0.22μm滤器预过滤的噬菌体上清液中加入1/5体积的20％PEG-8000/2.5M NaCl，将所得的混合物在冰上孵育1小时。使用Sorval Legend RT转子和离心机(Thermo Fisher Scientific)将所述溶液在4℃下以4000rmp离心20分钟。将所述噬菌体片状沉淀物重新溶解于3mL无菌PBS，转移至15mL无菌Falcon管，与1/5体积的20％PEG-8000/2.5M NaCl(0.6mL)混合，并在冰上孵育20分钟。使用Sorval Legend RT转子和离心机(Thermo Fisher Scientific)将所述噬菌体溶液在4℃下以4000rmp离心20分钟，并将噬菌体片状沉淀物溶于0.5-1mL无菌PBS中，溶解体积取决于所述片状沉淀物的体积。将所述噬菌体溶液以0.1mL体积等分至无菌的1.5mL无菌微型管中。如下所述测定所述扩增噬菌体的滴度。

　　对于第二轮淘选，用与上所述的常规淘选进行平行实验，也进行热淘选，其中将来自第一轮的溶于无菌PBS中的所述扩增噬菌体在1.5mL无菌微型管中于65℃下加热2小时，然后离心，将所述噬菌体上清液加至所述人溶菌酶包被的孔中用于结合(在第二轮淘选中)。两种淘选方法中所有其余步骤都相同。再进行另外两轮的平行淘选。对于第二、第三和第四轮淘选，洗涤分别为12x、15x和15x。

　　如针对人溶菌酶所述的，进行对人血清白蛋白的淘选(常规淘选)，除了没有进行平行热淘选以外。淘选之后，对来自滴定板的克隆(从洗脱的噬菌体中获得)进行标准噬菌体ELISA(Harrison et al.,1996；Tanha et al.,2001；Hussack et al.,In press(c))以鉴定展示对与人溶菌酶或血清白蛋白的结合阳性的VL的噬菌体。

　　实施例9b：噬菌体滴度测定

　　使用标准方法测定噬菌体滴度。为了测定所述洗脱的噬菌体的滴度，制备在PBS中以10-1-10-4稀释的所述洗脱噬菌体的稀释液(将2μL噬菌体加至18μL PBS来制备10-1稀释液，以此类推)。将10μL每种稀释液与100μL指数生长的大肠杆菌TG1细胞(OD600＝约0.5)混合，并将所述混合物在37℃下孵育30分钟以发生大肠杆菌TG1细胞的噬菌体感染。将感染的TG1细胞铺板在2×YT/Tet琼脂培养皿上并在37℃下培养过夜。将菌落数用于确定所述洗脱的噬菌体的滴度(cfu/mL)。对菌落进行菌落-PCR以确认插入序列的存在(阳性匹配(hit)的大小约500bp)并且为使用引物fdTGIII和-96GIII的DNA测序提供模板(表6)。通过DNASTAR Lasergene 8对序列进行分析和操作。

　　简言之，为测定所述扩增噬菌体(输入噬菌体)的滴度，制备10-3、10-6、10-8和10-10的噬菌体稀释液。将10μL每种稀释液与100μL指数生长的TG1细胞混合，并将所述混合物在37℃下孵育30分钟以发生细胞的噬菌体感染。然后，使用无菌一次性涂布器将所述噬菌体感染的细胞涂布在含有2×YT r/Tet琼脂培养基的培养皿上，并且留在无菌工作台上5分钟。将平板在37℃下培养过夜。早晨，将所述平板上的菌落滴度用于确定扩增所述噬菌体的滴度。

　　为了表现所述文库的效用，将所述文库针对人溶菌酶和人血清白蛋白淘选四轮。在针对人溶菌酶进行淘选的情况下，在第一轮中进行常规淘选，之后从第二轮开始平行进行常规淘选和热淘选。在热淘选方法中，将所述输入噬菌体在65℃下孵育2小时，离心以除去任何可能的聚集体，将所得上清液加至溶菌酶包被的孔中用于结合。在常规淘选方法中，将所述输入(扩增的)噬菌体直接加至溶菌酶包被的孔中，而不进行热处理。进行热淘选以观察，与被预测不能区分稳定和不稳定的VL结合物的常规淘选相比，其是否优先地富集稳定(热稳定和/或非聚集性的)VL结合物。

　　表7示出针对人溶菌酶的淘选的结果(关于所述输出噬菌体滴度或洗脱噬菌体滴度)。通常，与常规方法相比，热淘选方法的输出滴度低3-4个数量级。这可能是由于使用较低的输入噬菌体滴度以及在热处理过程中噬菌体(可能是聚集性的噬菌体-展示的VL)聚集造成的进一步损失(数据未示出)。

　　表7.在室温(常规淘选)与65℃-2h(热淘选)筛选条件下进行的淘选的噬菌体滴度。数据是针对人溶菌酶的淘选的数据。cfu:菌落形成单位。

　　第3轮和第4轮的噬菌体ELISA和序列分析鉴定了9个抗人溶菌酶的VL，它们对固定化人溶菌酶的亲和性不同(图13和表8)。在4轮淘选之后，分析了总共177个VL(第3轮和第4轮分别为101个VL和76个VL)，在第三轮中鉴定的总共9个中有5个克隆存留下来：HVLHLRN；HVLHLDS；HVLHLNE；HVLHLNN；HVLHLFL(图12)。在热淘选方法中(65℃、2h)，HVLHLRN和HVLHLDS分别占54.2％和25％，其后HVLHLNE、HVLHLNN和HVLHLFL分别占8.3％、8.3％和4.2％。相反，在常规淘选方法中(室温[RT])，HVLHLRN和HVLHLDS不存在，HVLHLNE、HVLHLNN和HVLHLFL出现的相对频率分别为28.6％、42.9％和28.6％(图12)。HVLHLRN和HVLHLDS在热淘选的第3轮中仍为占多数的克隆，而在常规淘选的第3轮中则以极低限度存在。HVLHLYS、HVLHLAQ、HVLHLQI和HVLHLEM在常规淘选和热淘选的第4轮中都没有被筛选出来。

　　表8：从第3轮和第4轮淘选分离到的抗人溶菌酶和抗人血清白蛋白的VL的特性。

　　ND，未确定；RT，室温；Agg.，聚集体。％是％聚集体。

　　在针对人血清白蛋白进行4轮淘选之后，通过噬菌体ELISA和测序对50个克隆进行的筛选得到一个主要的VL，即HVLHSA1(图13，表8)，其在噬菌体ELISA中对与人血清白蛋白的结合是阳性的。

　　随后对所有10个抗溶菌酶和抗白蛋白噬菌体-VL结合物进行处理以进行进一步表征。

　　实施例9c：抗人溶菌酶和抗人血清白蛋白的VL的生物物理表征

　　以噬菌体展示的VL克隆开始，通过如上文对其他抗体结构域所述的标准技术将VL克隆、表达并纯化。随后通过分子筛色谱分析所述VL的聚集状态，通过CD分析热稳定性，通过表面等离子体共振分析它们的结合亲和性和特异性。

　　通过如对其他结构域所述的标准技术将9个抗人溶菌酶VL和HVLHSA1VL(图13，表8)克隆，并在大肠杆菌中表达和纯化。由于VL在它们的C末端具有His6标签，它们是通过固定化金属亲和色谱法进行纯化。图16A示出纯化的VL的IMAC色谱图，其显示对于最高洗脱峰，A280范围为400mAU(HVLHLEM)至2400mAU(HVLHLRN)。VL的SDS-PAGE图显示VL是高度纯净的(图16B)。从其IMAC色谱图判断HVLHSA1的表达量也高(数据未示出)。因此VL可在大肠杆菌中以高纯度和高产量在大肠杆菌中表达。

　　之后，通过SuperdexTM 75分子筛色谱分析VL的聚集行为。如(Arbabi-Ghahroudi et al.,2010)所述测定每种VL的％聚集体(或％单体)。如图14A所示，3个抗人溶菌酶的VL(HVLHLRN、HVLHLEM和HVLHLDS)是纯单体的(非聚集性的)，而剩余的VL结合物是聚集性的，％聚集体的范围为7％至17％(表8)。还如对其他结构域所述，通过分子筛色谱分析了HVLHSA1VL。色谱图给出了对称的单体峰，这证明VL是100％非聚集性的单体(图14A；表8)。这些结果表明具有非常规Cys48/Cys64(或Cys49/Cys69)二硫键特征的VL(或VH)文库产生非聚集性的结合物。

　　为了获得对VL结合物的热稳定性的测量，如之前对其他结构域所述，通过CD测定VL的解链温度(Tm)。图14B示出抗人溶菌酶的VL的范围为62℃至74℃的解链曲线图。计算得到的Tm记录在表8中。还测定了抗白蛋白的HVLHSA1的Tm，其证明是高的：71℃(图14B；表8)。这些Tm显著高于没有非常规二硫键的VL的Tm，这证明具有非常规Cys48/Cys64(或Cys49/Cys69)二硫键特征的VL(或VH)文库产生更稳定的结合物。在人溶菌酶淘选的情况下，非聚集性(表8)且具有最高Tm的HVLHLRN和HVLHLDS也是这样的克隆，即通过热淘选而非常规淘选而与聚集性的、热稳定性较低的克隆相比显著富集的克隆。这证明尽管两种淘选方法都产生非聚集性的、热稳定的结合物，但是热淘选在富集它们方面更有效。(非聚集性的且热稳定的HVLHLEM在热淘选第4轮中仍未被筛选出来，这一事实可归因于其在所述淘选的结合阶段中非常低的亲和性[图12；表8])。图14C示出在抗溶菌酶和抗白蛋白VL的Tm和％单体之间存在强的正相关(R2＝0.8568；P值(双尾)＝0.0013、Spearman r＝0.9061)，意味着VL的Tm越高，VL越可能是非聚集性的。这还意味着由于具有非常规二硫键特征的VL/VH文库比没有此特征的文库产生热稳定性更高的VL/VH结合物，因此他们也产生非聚集性更高的VL/VH结合物。治疗性的、非聚集性的和热稳定的VL/VH结合物更有效。

　　还测定了抗人溶菌酶VL对它们的抗原(人溶菌酶)的亲和性(KD)。使用BIACORE 3000(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)测定了人溶菌酶与固定化抗人溶菌酶的VL结合物的结合。将298共振单位(RU)、312RU、295RU、339RU、315RU、412RU、370RU、345RU和349RU的每种VL结合物(分别对应HVLHLAQ、HVLHLNE、HVLHLEM、HVLHLYG、HVLHLRN、HVLHLNN、HVLHLQI、HVLHLYS和HVLHLDS)固定化至研究级CM5传感芯片上。使用制造商提供的胺偶联试剂盒在10mM乙酸中(pH 4.5)以10μg/mL的浓度下进行固定化。在Biacore分析之前，在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)，150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％P20表面活性剂)中以0.5mL/分钟的流速将人溶菌酶通过Superdex 75柱(GE Healthcare)，以除去任何可能的聚集体。对于结合研究，在25℃下在含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20的10mM HEPES(pH 7.4)中进行分析。所使用的流速为20μL/分钟。为了再生，用电泳缓冲液将所述表面洗涤15分钟。用BIAevaluation 4.1软件分析数据。结合图谱和所计算的KD在图15和表8中示出。从SPR图谱(图15)可以看出抗人溶菌酶的VL的确结合至它们的靶抗原(溶菌酶)，这确认了通过噬菌体ELISA获得的结合结果。所计算出的结合亲和性(KD)是不同的，它们中的多数具有高亲和性(KD＝0.05μM–0.2μM)。

　　如上文对其他结构域所述，通过表面等离子体共振测定VL针对人血清白蛋白的KD。简言之，使用BIACORE 3000(GE Healthcare)通过SPR测定VL至固定化人血清白蛋白的结合。将约1600RU的人血清白蛋白、1900RU的牛血清白蛋白和2200RU的卵清蛋白固定化至研究级CM5传感芯片上。以与蛋白质表面完全相同的方法制备乙醇胺封闭的表面作为参考。使用制造商提供的胺偶联试剂盒在10mM乙酸(pH 4.5)中以20μg/mL的浓度下进行固定化。在Biacore分析之前，将VL通过Superdex 75柱(GE Healthcare)以除去任何可能的聚集体。对于结合研究，在25℃下在含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20的10mM HEPES(pH 7.4)中进行分析。所使用的流速为40μL/分钟，样品体积为60μL。为了再生，将所述表面用电泳缓冲液洗涤15分钟。用BIAevaluation 4.1软件分析数据。图17清楚地显示VL结合至其靶抗原人血清白蛋白。所计算的KD确定为0.8μM(表8)。所述结合是特异性的，因为VL不结合至卵清蛋白或牛血清白蛋白。

　　因此，所述结果表明具有非常规二硫键的VH和VL结构域可以作为骨架用于构建VH/VL合成文库，所述合成文库是具有高亲和性、稳定性(非聚集性和热稳定性)和表达量的抗原结合物的来源。

　　实施例10：二硫键稳定的VH噬菌体展示文库的构建

　　设计实验以制备VH噬菌体展示文库，所述文库具有在由位置49和69上额外的二硫键稳定的VH骨架上产生的随机化CDR。为了构建所述文库，将VH噬菌体展示文库(HVHP430LGH3)用作模板以通过以下方式引入额外的二硫键：使用上文对VL文库的所描述的方法以及之前(Sidhu et al.,2000；Hussac et al(c))描述的方法用半胱氨酸替换两个所选择的氨基酸残基(49Ser和69Ile)。HVHP430LGH3噬菌体展示文库是基于噬粒载体的文库，具有克隆至噬粒pMED-1中并与蛋白质3基因融合的CDR随机化的人VH基因(“非聚集性的人VH结构域”PCT公开文本WO2009/079093)。

　　基本上如上文以及Hussac et al(c)和Sidhu et al.,2000中所述进行构建所述二硫键稳定的VH噬菌体展示文库的步骤。简言之，所述构建是通过在选择用于被半胱氨酸替换的两个氨基酸残基上进行单独的两轮定点突变来完成。首先，使用以来自HVHP430LGH3文库的噬菌体(4×1012cfu(菌落形成单位))感染的大肠杆菌CJ236制备dU-ssDNA(含尿苷的单链噬菌体DNA)。在通过如上文和Hussac et al(c)中所述测定针对大肠杆菌TG1和CJ126的滴度来确认尿苷被纳入所述dU-ssDNA之后，随后使用20μg的所述dU-ssDNA进行一系列体外DNA合成反应，其包括将引物KT124磷酸化用于退火以将49Ser突变为49Cys、连接和聚合。所述体外DNA合成反应得到总共23μg的异源双链DNA。之后进行10个独立的转化，每个转化使用50μL大肠杆菌TG1感受态细胞和564ng所述异源双链DNA，得到总共1.1×1010cfu的多样性。通过使用引物(M13RPa或b和-96GIII)的PCR进行的克隆筛选显示约50％(16个中的8个)的克隆具有49Ser至49Cys的突变。对于下一轮诱变，噬菌体是通过用M13K07辅助噬菌体对所述49Ser至49Cys突变的噬菌粒文库(HVHP430LGH3C1)进行拯救而由其制备，得到为2.1×1013cfu/mL的噬菌体滴度。之后使用所述来自(HVHP430LGH3C1)的噬菌体(4×1012cfu)从大肠杆菌CJ236中制备dU-ssDNA，然后是用8μg的所述dU-ssDNA进行的体外DNA合成和引物KT125退火，来诱变另一个氨基酸残基(69Ile至69Cys)，得到总共12μg的异源双链DNA。之后进行22个独立的转化，每个转化使用50μL大肠杆菌TG1感受态细胞和230ng所述异源双链DNA，得到总共5.3×109cfu的文库规模。为了测定携带双突变(49Ser至49Cys和69Ile至69Cys)的VH基因占所述文库的百分比，通过使用引物(M13RP a或b以及-96GIII)的PCR筛选了65个菌落，并对其测序和分析，显示出28％(65个中的18个)的克隆具有双突变(49Ser至49Cys和69Ile至69Cys)，35％(65个中的23个)具有单突变(49Ser至49Cys)，15％(65个中的10个)具有单突变69Ile至69Cys，22％(65个中的14个)没有突变。因此，根据所述克隆筛选的结果具有双Cys突变的文库(HVHP430LGH3C2)的规模被校正至1.5×109cfu(＝5.3×109×28％)。将HVHP430LGH3C2噬菌体展示文库在300mL的2×YT中扩增，将所述文库细胞重悬于15mL 10％的甘油中，之后以1mL等分试样保存在-80℃下。

　　所述文库的多样性很高(5.3×109转化株)，且在其全部VH成员中具有额外的稳定化49Ser至49Cys和69Ile至69Cys突变。使用本领域已知的标准筛选和淘选方法，所述文库应该产生对靶抗原具有高稳定性的结合物，因为在其VH成员中存在Cys49/Cys69二硫键。

　　本发明的非限制性实施方案

　　实施方案1包括含有免疫球蛋白骨架的组合物，所述免疫球蛋白骨架在框架区(FR)中包含一个或多个非常规二硫键。实施方案1还包括含有突变体免疫球蛋白骨架的组合物，所述骨架在框架区(FR)中包含一个或多个非常规二硫键，其中所述组合物具有一个或多个选自提的高稳定性、升高的解链温度、提高的溶解性和降低的聚集性的改善。实施方案1的突变体组合物的改善可选自提高的热折叠效率，增加的对蛋白酶消化的抗性，延长的在室温或室温以上、在4℃或低于0℃下的贮藏期。实施方案1的突变体组合物的改善还可以进一步表征为当给予人受试者时，与不含非常规二硫键的对应组合物相比，提高或延长的功能。

　　实施方案2包含实施方案1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白骨架选自VH或VL骨架，其中所述VH骨架在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键是在基于Kabat编号的位置49和69处引入的Cys残基之间形成；所述VL骨架是在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键是在基于Kabat编号的位置48和64处引入的Cys残基之间形成。

　　实施方案3包含实施方案1所述的组合物，其中所述骨架是选自单域抗体(sdAb)、scFv、Fab、F(ab)2或成熟免疫球蛋白的较大抗体蛋白质或片段的一部分。实施方案4包含实施方案3所述的组合物，其中所述成熟免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和/或IgM。

　　实施方案5包含实施方案1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白骨架是VH。实施方案5还包含实施方案1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白骨架选自VH1家族、VH2家族或VH3家族。实施例6包含实施例5所述的组合物，其中VH属于VH3家族。在另一个实施方案中，所述VH免疫球蛋白骨架选自以下的一个或多个序列：SEQ ID NO:2、4、6、8和70-83，或者与其基本相同的序列。在一个实施方案中，所述基本相同的序列与所公开的序列的不同之处为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个残基。

　　实施方案7包含实施方案1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白骨架是VL。实施方案8包含实施方案7所述的组合物，其中VL属于κ和λ家族。在另一个实施方案中，所述VL免疫球蛋白骨架选自以下的一个或多个序列：SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22和24，或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，所述基本相同的序列与所公开的序列的不同之处为至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个残基。

　　实施方案9包含实施方案1至8任一项所述的组合物，其中所述一个或多个非常规二硫键是在通过突变引入至FR2和FR3中的半胱氨酸之间形成。实施方案10包含实施方案5或6所述的组合物，其中所述Cys残基是在基于Kabat编号的位置49和69处引入。实施方案11包含实施方案7或8所述的组合物，其中所述Cys残基是在基于Kabat编号的位置48和64处引入。

　　实施方案12包含实施方案1至11任一项所述的组合物，其中所述骨架是多聚化的。在一个实施方案中，从实施方案12得到的多聚体至少包含二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体。

　　实施方案13包含实施方案1至12任一项所述的组合物，其中所述骨架被融合至另一个序列，其中所述另一个序列选自Fc片段、靶向序列、信号序列和纯化标签，或它们的任意组合。在一个实施方案中，所述另一个序列的至少一个单元被融合至至少一个构成本发明所述骨架的单体。在一个实施方案中，所述另一个序列的至少一个单元被融合至实施方案12的组合物。

　　实施方案14包含实施方案1至13任一项所述的组合物骨架，其中所述免疫球蛋白骨架包含序列选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和70-83，或与其基本相同的序列，或其片段的框架区，条件是所述基本相同的序列保留了所述常规和非常规二硫键，并且其中组成CDR1、CDR2和CDR3的残基可以是任意合适的序列。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:2或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:4或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:6或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:8或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:10或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:12或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:14或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:16或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:18或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:20或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:22或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:24或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:70或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:71或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:72或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:73或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:74或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:75或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:76或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:77或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:78或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:79或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:80或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:81或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:82或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:83或其功能片段。在一个具体实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO:84或其功能片段。

　　实施方案15包含编码实施方案1至14任一项所述的组合物的核酸。实施方案16包含表达载体，其包含实施方案15的核酸。实施方案17包括含有实施方案16所述的表达载体的宿主细胞或生物体。在一个实施方案中，所述编码本发明免疫球蛋白骨架的核酸序列编码与本发明公开的组合物基本相同的序列。在一个实施方案中，所述基本相同的序列与所公开的序列的不同在于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个残基。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在宿主细胞或生物体中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在细菌中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在大肠杆菌中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在酵母中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在非人的动物细胞中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在哺乳动物细胞中表达。在一个实施方案中，所述核酸是经密码子优化的，以在人细胞中表达。

　　实施方案18包括含有至少一个实施方案2的免疫球蛋白骨架的重组文库，其中所述免疫球蛋白骨架还包含多个合适的CDR序列，其中所述多个CDR序列为提供至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或超过109个克隆/文库的多样性。

　　实施方案19包括提高含免疫球白骨架的组合物的稳定性的方法，所述方法包括在框架区引入一个或多个非常规二硫键。实施方案19所述的方法还包括使用重组技术用半胱氨酸密码子分别替换免疫球蛋白序列中的第一密码子和第二密码子的方法，其中所述免疫球蛋白序列是VH骨架，其中所述第一密码子与使用Kabat编号的位置49对应，第二个密码子与使用Kabat编号的位置69对应。实施方案19所述的方法还包括使用重组技术用半胱氨酸密码子分别替换免疫球蛋白序列中的第一密码子和第二密码子的方法，其中所述免疫球蛋白序列是VL骨架，其中所述第一密码子与使用Kabat编号的位置48对应，第二密码子与使用Kabat编号的位置64对应。本发明还包括实施方案19所述的方法用于产生表达文库的用途。在一个实施方案中，所述文库是实施方案18的文库。

　　实施方案20包括制备包含免疫球蛋白骨架的突变体组合物的方法，所述骨架具有选自提高的稳定性、提高的解链温度、提高的溶解性和降低的聚集性中的一个或多个改善，其中所述方法是实施方案19所述的方法。实施方案20所述的突变体组合物的改善可以选自提高的热折叠效率，提高的对蛋白酶消化的抗性，延长的在室温或高于室温、在4℃或低于0℃下的贮藏期。实施方案20所述的突变体组合物的改善还可以进一步表征为当给予人受试者时，与不含非常规二硫键的对应组合物相比，提高或延长的功能。

　　实施方案21包括实施方案1至14中任一项或多项的一个或多个组合物，其中所述组合物是治疗剂。本发明还包括在可药用载体或赋形剂中的实施方案21所述的组合物。

　　实施方案22包括实施方案21的组合物的用途，其中向有此需要的受试者给予所述组合物。实施方案23包括实施方案22的任意一个或多个组合物在给予有此需要的受试者的药剂中的用途。

　　实施方案24包括实施方案1至14中任一项或多项的任一个或多个组合物，其中所述组合物包含源自非人的动物的所述免疫球蛋白骨架。在一个实施方案中，所述非人的动物包括所有的脊椎动物，特别是选自鸟类、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、骆驼科、鸡、大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、牛、猫、狗、马或非人灵长类的脊椎动物。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白构象是人的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是骆驼科的。在一个实施方案中，所述骆驼科物种选自美洲鸵、羊驼和骆驼。在一个实施方案中，所述骆驼科骨架为源自VH区域、VL或VHH区域中的任意一个或多个。

　　序列

　　本文描述的实施方案和实施例是示例性而不意欲限制本发明所要求保护的范围。发明人意在将对前述实施方案的改变，包括替代方案、修改和等同物都纳入权利要求的范围中。此外，对于本发明技术方案来说，所讨论的特征的组合可能不是必需的。

　　参考文献

　　本文以及整个申请中引用的所有专利、专利申请和公开文本在此以引用方式纳入。

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　　WO 95/04069

　　WO/2004/076670

　　WO2003/046560

　　WO2006/099747

　　序列表

　　<110> 加拿大国家研究委员会

　　KIM, Dae-Young

　　TANHA, Jamshid

　　<120> 免疫球蛋白结构域的工程改造

　　<130> 12181-98

　　<140> 61/437,174

　　<141> 2011-01-28

　　<160> 108

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 125

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm302

　　<400> 1

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Val Ser Asp Glu

　　202530

　　Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Thr Asp Asn Arg Ser Cys Gln Thr Ser Leu Cys Thr Ser Thr Thr

　　100 105 110

　　Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115 120 125

　　<210> 2

　　<211> 125

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm302S

　　<400> 2

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Val Ser Asp Glu

　　202530

　　Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Cys Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Thr Asp Asn Arg Ser Cys Gln Thr Ser Leu Cys Thr Ser Thr Thr

　　100 105 110

　　Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115 120 125

　　<210> 3

　　<211> 116

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm427

　　<400> 3

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Pro Glu

　　202530

　　Cys Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Ser Cys Glu Gly Glu Asn Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

　　100 105 110

　　Thr Val Ser Ser

　　115

　　<210> 4

　　<211> 116

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm427S

　　<400> 4

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Pro Glu

　　202530

　　Cys Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Cys Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Ser Cys Glu Gly Glu Asn Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

　　100 105 110

　　Thr Val Ser Ser

　　115

　　<210> 5

　　<211> 125

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm431

　　<400> 5

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Glu

　　202530

　　Cys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Arg Asp Ser Lys Asn Cys His Asp Lys Asp Cys Thr Arg Pro Tyr

　　100 105 110

　　Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115 120 125

　　<210> 6

　　<211> 125

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHAm431S

　　<400> 6

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Glu

　　202530

　　Cys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Cys Ala Ile Ser Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Val Arg Asp Ser Lys Asn Cys His Asp Lys Asp Cys Thr Arg Pro Tyr

　　100 105 110

　　Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115 120 125

　　<210> 7

　　<211> 119

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHPC235

　　<400> 7

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ile Ser Glu

　　202530

　　Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val His

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Ala Ala Lys Lys Ile Asp Gly Ala Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

　　100 105 110

　　Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115

　　<210> 8

　　<211> 119

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVHPC235S

　　<400> 8

　　Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Lys Pro Gly Gly

　　1 5 1015

　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ile Ser Glu

　　202530

　　Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

　　354045

　　Cys Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

　　505560

　　Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val His

　　65707580

　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

　　859095

　　Ala Ala Lys Lys Ile Asp Gly Ala Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

　　100 105 110

　　Thr Met Val Thr Val Ser Ser

　　115

　　<210> 9

　　<211> 107

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVLP324

　　<400> 9

　　Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

　　1 5 1015

　　Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

　　202530

　　Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

　　354045

　　Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

　　505560

　　Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

　　65707580

　　Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

　　859095

　　Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

　　100 105

　　<210> 10

　　<211> 107

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVLP324S

　　<400> 10

　　Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

　　1 5 1015

　　Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

　　202530

　　Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Cys

　　354045

　　Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cys

　　505560

　　Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

　　65707580

　　Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

　　859095

　　Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

　　100 105

　　<210> 11

　　<211> 106

　　<212> PRT

　　<213> 人 - HVLP325

　　<400> 11

　　Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

　　1 5 1015

　　Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Arg Tyr

　　202530

　　Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val

　　354045

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　　354045

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　　505560

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　　65707580

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　　100 105

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　　100 105

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　　1 5 1015

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