用于检测感染性疾病的试剂和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月19日提交的美国临时申请62/118,453、2015年12月7日提交的美国临时申请62/263,995以及2015年12月7日提交的美国临时申请62/264,088的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
背景技术
本发明涉及使用表面增强拉曼散射(SERS)检测与官能化的适体结合的分析物的产品和方法。该系统由三个基本部分组成：SERS活性表面、适体和附接至适体的拉曼活性标记物。官能化的适体共价或非共价地附接至SERS活性表面。当该复合物与含有适体结合靶标(即，分析物)的样品接触时，适体上的拉曼活性标记物与SERS活性衬底靠近并产生具有拉曼活性标记物特有的特征性光谱的强拉曼信号。对于每个适体(或针对特定靶标的适体集合)使用不同的拉曼活性标记物，则该测定能够容易地适用于多重检测。
发明内容
本发明的一个实施方式涉及一种检测样品中的靶分子的方法，所述方法包括将所述样品与共价或非共价地附接至SERS活性表面的一种或多种靶标特异性适体接触，所述一种或多种适体(各)具有共价附接于其上的拉曼活性标记物，以使得所述靶标与所述一种或多种适体结合后，所述拉曼活性标记物能够与拉曼活性表面充分靠近以产生可检测的拉曼信号。因此，由于拉曼活性标记物与SERS活性衬底靠近，因而在形成复合物后检测到靶标特异性信号。这种检测方案与本领域公知的方案相比具有很多优点。例如，其避免了夹心法(如，用于ELISA形式的)的复杂性，并且其追踪的是信号增加而非在其他类型的测定中经常使用的信号降低。
本发明还提供了与拉曼活性标记物共价结合的靶标特异性适体，结合处为所述适体的5’或3’末端，或者所述适体末端的1-10个碱基内，或者沿着所述适体骨架的任何地方，只要与分析物的结合诱导所述适体经历构象改变从而使拉曼活性标记物与SERS活性表面紧密靠近即可。所述适体可以通过巯基连接或通过其他适宜的部分附接，标记物可以通过经修饰的寡核苷酸或其他共价或非共价连接引入。在其他实施方式中，可以将能够与所述适体杂交的一种或多种寡核苷酸附接至SERS活性表面。在一些实施方式中，本发明的适体是具有末端巯基修饰的靶标特异性适体。在一些实施方式中，所述拉曼活性标记物在沿着所述适体骨架的预设位置与适体共价缀合。在一些实施方式中，所述标记物是FAM、TAMRA、Cy3、德克萨斯红(TR)、Cy3.5、罗丹明6G、Cy5等等或其组合。
本发明的另一个方面提供了一种物质的组合物，所述物质的组合物包含与靶标特异性DNA适体共价或配位共价结合的SERS活性表面，所述靶标特异性DNA适体具有在沿着其长度的预设位置整合至DNA骨架的拉曼活性标记物，并且在所述适体与其靶标结合后，所述标记物与所述SERS活性表面足够靠近，以便在激发后产生所述标记物的特征性拉曼光谱。
本发明的另一个方面涉及一种用于检测分析物的表面增强拉曼光谱(SERS)活性试剂，所述试剂包括：(a)一种或多种SERS活性表面；(b)未经修饰或经修饰的一种或多种适体；以及(c)一种或多种拉曼活性标记物。在一些实施方式中，所述试剂在(c)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
在某些实施方式中，所述SERS活性表面选自下组：金属(包括但不限于银、金、Cu、某些其他过渡金属和氮化钛)、半导体衬底(包括但不限于氧化钛、氧化锌、硒化锌)或半金属(包括但不限于石墨烯和二硫化钼)。在某些实施方式中，所述SERS活性表面可以是引入生物样品中的纳米颗粒(NP)，或者SERS活性材料可以是NP(SERS活性的或惰性的)嵌入或未嵌入其中的固体支持物。支持材料可以由下述材料组成，包括但不限于：纸、纤维素、塑料，包括聚苯乙烯、聚乙烯和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方式中，这些支持材料上涂覆了一种或几种SERS活性材料。另一个实施方式是由涂覆了一种或几种SERS活性材料的支持材料中的一种或几种组成的图案化表面。在某些实施方式中，所述适体是官能化的。
在某些实施方式中，1)用巯基将所述适体官能化以便与所述SERS活性表面结合，并且2)用拉曼活性标记物将所述适体官能化以增强检测。
在某些实施方式中，所述适体共价或非共价附接至所述SERS活性表面。
在某些实施方式中，所述SERS活性表面未被一种或多种适体修饰。
在某些实施方式中，所述适体包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65和66。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物包含染料或荧光标记物。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物是荧光标记物，所述荧光标记物选自下组：荧光素(FAM)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、Cy3、德克萨斯红(TR)、Cy3.5、罗丹明6G、Cy5、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑)、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛，5-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′,4′,5′,7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管和富勒烯。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物在与所述分析物结合后经历构象改变。
在某些实施方式中，所述适体在与所述分析物结合后经历构象改变。
在某些实施方式中，所述适体在与所述分析物结合后的构象改变使得所述拉曼活性标记物与所述SERS活性表面的表面紧密靠近并导致拉曼信号增强。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物共价附接至所述适体。
在某些实施方式中，所述分析物选自下组：氨基酸、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药品、药物、营养物质、朊病毒、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战剂、生物危害剂、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物、诱变剂、麻醉剂、苯丙胺、巴比妥酸盐、致幻剂、废物、滥用的药物、污染物和枪击残留物。
本发明的又一个方面涉及一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含：a)至少一个SERS活性试剂，所述试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)未经修饰或经修饰的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；b)拉曼活性标记物对照，以显示基于拉曼的检测系统正在工作；c)至少一种血液、血清、其他流体或组织样品，或实验室制备的阳性对照；以及c)至少一种血液、血清、其他流体或组织对照，或者实验室制备的阴性对照。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
在某些实施方式中，所述试剂盒还可以包含取样筒。
本发明的另一个方面涉及一种检测系统，所述检测系统包括：a)未经修饰或经修饰的一个或多个SERS活性试剂；所述试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；以及b)拉曼检测器或拉曼仪器。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
在某些实施方式中，所述拉曼检测器是便携式的。
在某些实施方式中，所述系统还包括样品收集装置。
本发明的另一个方面涉及一种用于确定一种或多种分析物在生物样品中的存在情况的方法，所述方法包括：a)接收生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)未经修饰或经修饰的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述分析物与所述适体接触；d)所述分析物与所述适体结合，其中所述结合导致所述适体经历构象改变；e)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；f)检测拉曼信号以产生拉曼光谱；以及g)将在(f)中检测到的所述拉曼信号与对照的参照拉曼信号进行比较，其中当在(f)中检测到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号不同时，确定在所述生物样品中存在一种或多种分析物。在步骤(e)的某些实施方式中，所述SERS活性表面与识别所述分析物的所述适体结合。在步骤(g)的某些实施方式中，当在(f)中检测到的所述拉曼信号与不存在靶分析物时的拉曼信号不同时，确定在所述生物样品中存在一种或多种分析物。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
类似地，本发明涉及一种用于确定一种或多种分析物在生物样品中的存在情况的方法，所述方法包括：a)获得生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)未经修饰或经修饰的一种或多种SERS活性表面；(ii)一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述分析物与所述适体接触；d)所述分析物与所述适体结合，其中所述结合导致所述适体经历构象改变；e)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；f)检测拉曼信号以产生拉曼光谱；以及g)将在(f)中检测到的所述拉曼信号与对照的参照拉曼信号进行比较，其中当在(f)中检测到的所述拉曼信号与于所述参照拉曼信号不同时，确定在所述生物样品中存在一种或多种分析物。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
在某些实施方式中，在(f)中所述拉曼光谱的所述拉曼信号与对照相比的增加与一种或多种分析物的量相关。
在某些实施方式中，所述适体在与所述分析物结合后的所述构象改变使得所述拉曼活性标记物与所述SERS活性材料的表面紧密靠近。
在某些实施方式中，所述方法可以用于检测生物样品中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种分析物。
本发明的另一个方面涉及一种用于诊断对象中疾病或病症的方法，所述方法包括下述步骤：a)接收来自对象的生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)未经修饰或经修饰的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述至少一个SERS试剂与所述生物样品中的一种或多种分析物结合，其中所述结合导致所述SERS试剂的一种或多种适体构象改变；d)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；e)检测所述至少一个SERS活性试剂的拉曼信号；以及f)将在(e)中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的拉曼信号与在接收自对照对象(健康对象)的生物样品中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的参照拉曼信号进行比较，其中当在(e)中检测到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号在拉曼敏感性标记物峰的位置和/或强度上不同时，诊断所述疾病。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
类似地，本发明涉及一种用于诊断对象中疾病或病症的方法，所述方法包括下述步骤：a)从对象中获得生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)未经修饰或经修饰的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述至少一个SERS试剂与所述生物样品中的一种或多种分析物结合，其中所述结合导致所述SERS试剂的所述一种或多种适体构象改变；d)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；e)检测至少一个SERS活性试剂的拉曼信号；以及f)将在(e)中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的拉曼信号与在接收自对照对象(健康对象)的生物样品中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的参照拉曼信号进行比较，其中当在(e)中检测到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号在拉曼敏感性标记物峰的位置和/或强度上不同时，诊断所述疾病。在一些实施方式中，所述试剂在(iii)中包含未经修饰或经修饰的一种或多种拉曼活性标记物。
或者，本发明涉及一种用于诊断对象中疾病或病症的方法，所述方法包括：a)接收在对象的生物样品中测得的所述拉曼信号；b)接收在对照对象的生物样品中测得的所述参照拉曼信号；以及c)将(a)的所述拉曼信号与(b)的所述参照拉曼信号进行比较，其中当在(a)中的所述拉曼信号在位置和/或强度上与(b)中的所述参照拉曼信号不同时，诊断所述疾病。
在某些实施方式中，所述疾病或病症选自下组：感染性疾病、增殖性疾病，神经退行性疾病、癌症、心理疾病、代谢疾病、自身免疫性疾病、性传播疾病、胃肠疾病、肺病、心血管疾病、压力和疲劳相关的病症、真菌病，病原性疾病和肥胖相关的病症。
本发明涉及使用表面增强拉曼散射(SERS)检测与官能化的适体结合的分析物的试剂和方法。该系统由三个部分组成：SERS活性表面或纳米颗粒(下文中称为SERS活性表面)、适体和附接至所述适体的拉曼活性标记物。官能化的适体共价或非共价地附接至SERS活性表面。当该复合物与含有适体结合靶标的样品(即，分析物)接触时，适体上的拉曼活性标记物与SERS活性衬底靠近，并产生具有拉曼活性标记物特有的特征的强拉曼信号。对于每个适体(或针对特定靶标的适体集合)使用不同的拉曼活性标记物，该测定能够容易地适用于多重检测。
本发明的另一个方面涉及表面增强的拉曼光谱(SERS)活性试剂，所述SERS活性试剂用于检测包柔螺旋体(Borrelia)物种中的一种或多种分析物，所述活性试剂包含：(a)一种或多种SERS活性表面；(b)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(c)一种或多种拉曼活性标记物。
在某些实施方式中，所述SERS活性表面选自下组：金属(包括但不限于银、金、Cu、某些其他过渡金属和氮化钛)、半导体衬底(包括但不限于氧化钛、氧化锌、硒化锌)或半金属(包括但不限于石墨烯和二硫化钼)。
在某些实施方式中，所述适体是官能化的。
在某些实施方式中，1)将所述适体官能化以便所述适体与所述SERS活性表面结合，并且2)用拉曼活性标记物将所述适体官能化以增强检测。
在某些实施方式中，所述适体共价或非共价地附接至所述SERS活性表面。
在某些实施方式中，所述适体包含与选自由SEQ ID NO：67-84组成的组的核苷酸序列至少80％相同的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物包含染料、叠氮化物、炔烃、量子点、碳纳米管或荧光标记物。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物是荧光标记物，并且所述荧光标记物选自下组：叠氮化物、炔烃、荧光素(FAM)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、Cy3、德克萨斯红(TR)、Cy3.5、罗丹明6G、Cy5、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑)、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛，5-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′,4′,5′,7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管和富勒烯。
在某些实施方式中，与所述拉曼活性标记物缀合的适体在与所述分析物结合后经历重组(reorganization)。
在某些实施方式中，与所述拉曼活性标记物缀合的适体在与所述分析物结合后经历构象改变。
在某些实施方式中，所述适体在与分析物结合后的构象改变使得所述拉曼活性标记物与所述SERS活性表面的表面紧密靠近，并导致所述拉曼信号增强。
在某些实施方式中，所述拉曼活性标记物共价附接至所述适体。
在某些实施方式中，所述分析物选自下组：表面蛋白、氨基酸、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药品、药物、营养物质、朊病毒、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战剂、生物危害剂、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物、诱变剂、麻醉剂、苯丙胺、巴比妥酸盐、致幻剂、废物、滥用的药物、污染物和枪击残留物。
在某些实施方式中，包柔螺旋体的物种选自Borrelia afzelii、Borrelia americana、Borrelia andersonii、Borrelia anserina、Borrelia baltazardii、Borrelia bavariensis、Borrelia bissettii、Borrelia brasiliensis、Borrelia burgdorferi、Borrelia californiensis、Borrelia carolinensis、Borrelia caucasica、Borrelia coriaceae、Borrelia crocidurae、Borrelia dugesii、Borrelia duttonii、Borrelia garinii、Borrelia graingeri、Borrelia harveyi、Borrelia hermsii、Borrelia hispanica、Borrelia japonica、Borrelia kurtenbachii、Borrelia latyschewii、Borrelia lonestari、Borrelia lusitaniae、Borrelia mazzottii、Borrelia merionesi、Borrelia microti、Borrelia miyamotoi、Borrelia parkeri、Borrelia persica、Borrelia recurrentis、Borrelia sinica、Borrelia spielmanii、Borrelia tanukii、Borrelia texasensis、Borrelia theileri、Borrelia tillae、Borrelia turcica、Borrelia turdi、Borrelia turicatae、Borrelia valaisiana、Borrelia venezuelensis、Borrelia vincentii、Borrelia burgdorferi B31、Borrelia burgdorferi N40、Borrelia burgdorferi JD1或Borrelia burgdorferi 297。
本发明的另一个方面涉及一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含：a)至少一个SERS活性试剂，所述试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；(b)至少一个阳性对照；以及c)至少一个阴性对照。
本发明的另一个方面涉及一种检测系统，所述检测系统包括：a)一个或多个SERS活性试剂；所述试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；以及b)拉曼检测器。
在某些实施方式中，所述拉曼检测器是便携式的或非便携式的。
在某些实施方式中，所述系统还包括样品收集装置。
本发明的另一个方面涉及一种用于确定一种或多种分析物在生物样品中的存在情况的方法，所述方法包括：a)接收生物样品；b)将生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述分析物与所述适体接触；d)所述分析物与所述适体结合，其中所述结合导致所述一种或多种适体经历构象改变；e)照射与所述一种或多种适体结合的所述至少一个SERS活性试剂；f)检测拉曼信号以产生拉曼光谱；以及g)将在(f)中检测到的所述拉曼信号与对照的参照拉曼信号进行比较，其中当在(f)中检测到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号在与拉曼敏感性标记物相关的峰的位置和/或强度上不同时，确定在所述生物样品中存在一种或多种分析物。本发明的方法能够直接检测包柔螺旋体和/或检测抗包柔螺旋体抗体。
类似地，本发明涉及一种用于确定一种或多种分析物在生物样品中的存在情况的方法，所述方法包括：a)获得生物样品；b)将生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包括：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述分析物与所述适体接触；d)所述分析物与所述适体结合，其中所述结合导致所述一种或多种适体经历构象改变；e)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；f)检测拉曼信号以产生拉曼光谱；以及g)将在(f)中检测得到的所述拉曼信号与对照的参照拉曼信号进行比较，其中当在(f)中检测到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号不同时，确定在所述生物样品中存在一种或多种分析物。相对于检测抗包柔螺旋体抗体，本发明的方法能够直接检测包柔螺旋体。
在某些实施方式中，在(f)中所述拉曼光谱的所述拉曼信号与对照相比的增加与所述一种或多种分析物的量相关。
在某些实施方式中，所述适体在与所述分析物结合后的所述构象改变使得所述拉曼活性标记物与所述SERS活性纳米颗粒的表面紧密靠近。
在某些实施方式中，所述方法可以用于检测生物样品中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种分析物。
本发明的另一个方面涉及一种用于诊断对象中莱姆病的方法，所述方法包括下述步骤：a)接收来自对象的生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述至少一个SERS试剂与所述生物样品中的所述一种或多种分析物结合，其中所述结合导致所述SERS试剂的所述一种或多种适体构象改变；d)照射与所述一种或多种分析物结合的所述至少一个SERS活性试剂；e)检测所述至少一个SERS活性试剂的拉曼信号；以及f)将在(e)中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的所述拉曼信号与在来自对照对象(健康对象)的生物样品中检测到的至少一个SERS活性试剂的参照拉曼信号进行比较，其中当在(e)中检测得到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号不同时，诊断所述莱姆病。在步骤(d)的某些实施方式中，所述SERS活性试剂与识别所述分析物的所述适体结合。在步骤(f)的某些实施方式中，在(e)中检测得到的所述拉曼信号与不存在靶分析物时的拉曼信号不同。
类似地，本发明涉及一种用于在对象中诊断莱姆病的方法，所述方法包括下述步骤：a)获得来自对象的生物样品；b)将所述生物样品与至少一个SERS活性试剂接触，所述SERS活性试剂包含：(i)一种或多种SERS活性表面；(ii)针对包柔螺旋体物种中的一种或多种分析物的一种或多种适体；以及(iii)一种或多种拉曼活性标记物；c)使所述至少一个SERS试剂与所述生物样品中的所述一种或多种分析物结合，其中所述结合导致所述SERS试剂的所述一种或多种适体构象改变；d)照射与所述一种或多种适体结合的所述至少一个SERS活性试剂；e)检测所述至少一个SERS活性试剂的拉曼信号；以及f)将在(e)中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的所述拉曼信号与在来自阴性对照对象(健康对象)的生物样品、来自多个阴性对照对象的混合样品或实验室制备的阴性对照样品中检测到的所述至少一个SERS活性试剂的参照拉曼信号进行比较，其中当在(e)中检测得到的所述拉曼信号与所述参照拉曼信号不同时，诊断所述莱姆病。
或者，本发明涉及一种用于在对象中诊断莱姆病的方法，所述方法包括：a)接收在对象的生物样品中测得的所述拉曼信号；b)接收在对照对象的生物样品中测得的所述参照拉曼信号；以及c)将(a)的所述拉曼信号与(b)的所述参照拉曼信号进行比较，其中当在(a)中的所述拉曼信号在位置和/或强度上与(b)中的所述参照拉曼信号不同时，诊断所述莱姆病。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特性和优点将是显而易见的。然而，应当理解的是，显示本发明优选实施方式的详细描述和特定实施例仅以说明方式给出，因为通过此详细描述，在本发明主旨和范围内的各种改变和修正对本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1显示了适体使用SELEX进行体外进化的示意图。通常通过进行8-12轮选择以产生紧密结合的高特异性适体。(图片来自：http://sitemaker.umich.edu/ntr/aptamers)。
图2中含有6个板块。板块A显示了使用基于微波的合成法产生的银NP的吸收光谱的比较。等离子体吸收在401nm处达到最大值，在三周的时间段内Ag NP维持60nm的FWHM。显示了在合成当天的NP(蓝色)，合成3周后相同的NP(红色)，以及储存于在合成3周后离心的反应混合物中的NP(绿色)的吸收光谱，表明NP保持所观察到的光谱特征的能力不依赖于纯化方法。板块B显示了存在(蓝色)和不存在(红色)Ag NP的200μM巯基苯酚(MCP)溶液的拉曼光谱的比较。星号表示在其上对样品进行干燥的硅衬底的光谱贡献。板块C显示了加入NaCl后的经二巯基封端DNA修饰的Ag NP的吸收光谱。加入25mM NaCl后使得吸收强度降低，在15min后达到稳定的吸收。将NaCl的浓度增至50mM使得等离子体吸收的强度进一步降低。加入第三份试样使得加入试样后等离子体吸收立即几乎完全丧失。板块D和板块E显示了用经二巯基修饰的DNA对Ag NP进行的表面修饰的光谱解调。板块D显示了在不存在还原剂的条件下，DNA修饰的NP的经DNA修饰的Ag NP的等离子体吸收的典型光谱分析。记录光谱以跟踪以25mM的增量加入0至100mM氯化钠对等离子体吸收的影响。板块E显示了将氯化钠加入到经二巯基封端DNA修饰的Ag NP后等离子体吸收强度降低的比较。以等离子体吸收在403nm处的变化作为初始等离子体吸收强度的片段。采集光谱直至等离子体吸收强度降至初始强度的50％以下。板块F显示了经DTT处理后，5’-FAM、3’-二巯基修饰的DNA的发射光谱。对在TCEP还原条件下用DNA处理的Ag NP(红色，下部)，和在不存在还原剂的条件下使用二硫化物DNA处理的Ag NP(蓝色，上部)进行DTT处理，产生的FAM发射光谱。
图3中含有6个板块。板块A显示了在存在100μM硝酸钾(红色，上部)或氯化钠(绿色)溶液的条件下，以及在不存在盐(蓝色，下部)的条件下，200μM巯基苯酚(MCP)水溶液的拉曼光谱的比较。板块B显示了加入盐对增加拉曼信号强度的效果的比较。经5’-FAM二巯基化DNA修饰的AgNP表面的拉曼光谱显示，与存在NaCl(红色)的条件相比，加入KNO3(绿色)产生更强的光谱特征峰，或者在没有加入盐(蓝色)的情况下产生最强的光谱特征峰。在存在50mM NaCl的情况下进行DNA修饰。板块C显示了用由巯基苯酚和FAM封端DNA组成的混合单层修饰的Ag NP的拉曼光谱的比较。由下至上分别是具有4μM巯基苯酚单层的Ag NP的光谱图，以及具有MCP(浓度范围以每个光谱相差一个数量级从4mM降至4μM)的FAM修饰的DNA的混合单层的Ag NP的光谱图。板块D显示了用巯基苯酚(MCP，下部)、FAM封端DNA(中部)和FAM封端DNA与4mM MCP混合单层(上部)修饰的Ag NP的拉曼光谱的比较。为清晰起见，各光谱相互移开；用632.8nm入射光采集数据。箭头颜色与光谱特征峰的来源匹配；红色箭头表示MCP的贡献，黑色箭头表示FAM封端DNA的贡献。板块E显示了在785nm入射光下采集的经巯基苯酚(MCP；下部)、FAM封端DNA(中部)和FAM封端DNA与4mM MCP的混合单层(上部)修饰Ag NP的拉曼光谱的比较。箭头表示来自混合单层的组分的光谱特征峰。在305cm-1、714cm-1和1050cm-1处的特征峰来自见于二巯基修饰的DNA的5’末端的FAM染料，而在393cm-1、636cm-1、1010cm-1、1080cm-1和1175cm-1的特征峰是MCP单层的贡献。板块F显示了MCP和MCH的浓度对混合单层Ag NP上的MCP和FAM的光谱强度影响的比较。显示了在两个MCP浓度下观察到的FAM来源的特征峰(1050cm-1；蓝色和绿色)和MCP来源的特征峰(1076cm-1；红色和紫色)的光谱强度。用40μM MCP(蓝色和红色)和4μM MCP(绿色和紫色)采集的混合单层两个组分的光谱强度。
图4中含有2个板块。版块A显示了经含TAMRA的靶向加压素的适体修饰的Ag NP表现出结构相关蛋白催产素和物质P对加压素的选择性。使用加压素观察到线性相关(R2：0.99)，而物质P(R2：0.63)与催产素(R2：0.19)之间的相互作用没有导致浓度与光谱强度之间的线性相关。版块B显示了经含TAMRA的靶向加压素的适体修饰的Ag NP的单层组成的比较。仅用靶向加压素的适体或连同40μM MCP一起对Ag NP表面进行修饰(R2分别为0.99和0.96)使得加压素的浓度与光谱特征峰强度之间呈线性相关。相反，用靶向加压素的适体和4M MCH修饰的NP未产生线性相关(R2：0.03)。
图5中含有2个版块。版块A显示了使用基于微波的合成法生产的银NP的吸收光谱，在该方法中将溶液在30秒内加热至120℃，并在该温度下保持30、60和90秒。产生的NP显示出能够与文献中的光谱媲美的光谱特征(401nm；FWHM＝60nm)。版块B显示了微波合成Ag NP的示例性吸收光谱，来自Leona,M.Proc.Natl.Acad.Sci.2009,106,14757。
图6中含有2个版块。版块A显示了对来自人血的包柔螺旋体(Borrelia burgdorferi)进行基于SERS的检测的示意图。直接使用血液、血清或血浆液滴检测包柔螺旋体特异性蛋白。将血液、血清或血浆暴露于涂覆了适体的SERS活性表面，过滤并经拉曼光谱解调。在小型仪器上对光谱进行分析并且可以在<30min内获得结果。版块B显示了拟对肩突硬蜱(Ixodes scapularis)若虫中的包柔螺旋体进行基于SERS的检测的示意图。收集并裂解黑腿蜱若虫。将匀浆与涂覆了适体的纳米颗粒混合并经拉曼光谱解调。在便携式仪器上对光谱进行分析并且可以在<20min内获得结果。
图7中含有2个版块，显示了通过使用微柱进行的针对多个靶标的适体选择工作流程。版块A显示了10μL GFP固化树脂填充的微柱。版块B显示了RNA适体的多重选择。用虚线箭头表示的步骤是可选的，而且不是每轮必须进行的。(Szeto,K.等，PLoS ONE 2013,8,e82667)。
图8显示了OspA适体(SEQ ID NO:4)与包柔螺旋体OspA蛋白的高亲和性结合。通过荧光各向异性确定结合的Kd为约2.2nM。
图9中含有2个版块，显示了使用经拉曼活性标记物修饰的适体对生物靶标进行检测的示意图(版块A)和对其原理的说明(版块B)。版块A显示了在暴露于靶分析物(以红色圆圈表示)后拉曼活性染料(以蓝色圆圈表示)与拉曼衬底表面(以黄色方块表示)紧密靠近。染料与SERS衬底的紧密靠近产生了高强度的SERS信号，这有利于对四个靶分析物的检测(图片来自：Baker,B.R.等，J.Am.Chem.Soc.2006,128,3138)。版块B显示了对原理进行说明的光谱——本发明人用TAMRA(一种拉曼活性染料)对靶向加压素的适体进行修饰。观察到TAMRA拉曼信号的强度随着靶分子加压素浓度的增加而增强，这表明经拉曼活性染料修饰的适体在生物靶标检测中起到作用。
图10显示了将在多重检测中使用的拉曼活性染料的拉曼光谱。每种染料作为四个靶分析物各自的替代物，具有使其能够在含有其他染料的样品的光谱中被识别出的光谱特征，并且便于在唾液或其他生物基质中对分析物进行检测。(Cao,Y.C.等，Science 2002,297,1536)。
具体实施方式
A.定义
为了方便起见，将在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语汇集在这里。除非另有定义，在本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
在本申请中使用的冠词“一个(“a”)”和“一个(“an”)”指该冠词的一个或一个以上(即至少一个)的语法对象。举例来说，“元件”指一个元件或一个以上元件。
B.纳米颗粒和其他SERS活性衬底材料
SERS活性纳米颗粒是本领域公知的，并且用于提供本发明的拉曼活性表面。其他SERS活性材料涂覆的表面、金属涂覆的表面或嵌入SERS活性纳米颗粒的表面均在本发明的考虑范围内。SERS活性纳米颗粒包括但不限于美国专利申请公布号2004/0134997中所描述的那些。例如，可以使用基于微波的AgNO3还原或通过本领域技术人员公知的任意数量的其他方法制备银(Ag)纳米颗粒。银和金纳米颗粒也是被公知和使用的，其可以在市面上购得或合成获得并且适用于本方法。除了纳米颗粒以外，可以使用的其他SERS活性衬底，包括但不限于：涂覆了用于拉曼活性的金属的核壳、中空或Si小珠，或者在适宜支持物上的由金属、半导体或半金属组成的其他SERS活性衬底或者涂覆了SERS活性材料的聚合物表面；这些材料可以具有或不具有嵌入的NP。Wang,W.等，Appl.Phys.Lett.106,2015,211604。
在某些实施方式中，SERS活性NP可以是游离的并引入生物样品中的，或者SERS活性材料可以是其中已嵌入NP(SERS活性或惰性)的固体支持物。支持材料可以由下述材料组成，包括但不限于：纸、纤维素、塑料(包括聚苯乙烯、聚乙烯和聚二甲基硅氧烷(PDMS))或其他聚合物材料。在一些实施方式中，这些支持材料上涂覆了一种或几种SERS活性材料。另一个实施方式是由涂覆了一种或几种SERS活性材料的支持材料中的一种或几种组成的图案化表面(Wang,W.等，Appl.Phys.Lett.106,2015,211604)。
如果适体附接至SERS活性衬底，则适体可以共价或非共价地与SERS活性表面结合。可以使用巯基对DNA适体进行修饰。对于共价、配位(dative)或配位(coordinate)共价附接而言，可以对表面或SERS活性衬底进行修饰以含有适于附接DNA或RNA适体或寡核苷酸的各种反应性基团，可以使用本领域公知的任何基团修饰，通常使用巯基。例如，可以将封端试剂(如，二氢硫辛酸)共价附接至拉曼活性表面，以及可以使用标准的用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)进行的胺与羧酸的缀合，将胺封端的DNA适体与纳米颗粒共价连接。对于非共价适体附接而言，可以将条码DNA、通用引物或者DNA(或RNA)的其他结合特异性序列(即，捕获寡核苷酸)附接至纳米颗粒或SERS活性表面。将此类捕获寡核苷酸与具有捕获寡核苷酸的互补序列的靶标特异性适体(通常与拉曼活性标记物距离较远或者接近其相对端)杂交。
C.适体
适体是单链核酸(DNA或RNA)分子，其长度通常但不总是在100个碱基以下，其具有以高度的亲和性和特异性与其他分子结合的能力。例如，可以使用通过称为指数富集的配基系统进化(SELEX；图1)的过程，利用随机寡核苷酸库的体外进化过程产生适体。SELEX过程由这些小的寡核苷酸折叠成独特的三维结构的能力控制，该独特的三维结构能够以高度的特异性和亲和性与特定靶标相互作用。能够针对各种各样的靶标产生适体，包括：金属离子1、小分子(如，有机染料2和氨基酸3)、医学相关的分子(如，抗生素4和肽5)以及生物学相关的分子(如，蛋白6,7)、全细胞、病毒和病毒感染的细胞8，以及细菌9,10。一旦知晓特定适体或适体组的序列，则可以容易地使用针对寡核苷酸的本领域公知的标准技术，或者通过合成或重组DNA的技术合成适体。与催产素、加压素、其他激素、感染性疾病药剂和疾病标志物蛋白结合的适体值得特别关注。
此外，适体可以结合非法药物，例如但不限于大麻素/大麻(Cannabis)/大麻(Marijuana)(Δ9-四氢大麻酚，THC)、合成大麻素、卡利普多(和甲丙氨酯)、可卡因(苯甲酰甲基芽子碱)、右美沙芬、苯海拉明、γ-羟基丁酸(GHB、GBL和1,4-BD)、氯胺酮、麦角酸二乙基酰胺(LSD)、丁丙诺啡(subutex)、美沙酮、甲基苯丙胺、安非他明、亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA，摇头丸)、巴比妥类、苯二氮卓类、阿片类(羟考酮、丙氧芬、吗啡和海洛因)或苯环己哌啶(PCP)。
本发明的适体可应用于诊断和预测，如检测持续性的感染性疾病、增殖性疾病、神经退行性疾病、癌症、心理疾病、代谢疾病、自身免疫性疾病、性传播疾病、胃肠疾病、肺病、心血管疾病、压力和疲劳相关的病症、真菌病，病原性疾病、肥胖相关病症或相关的生物标记物。病毒感染性疾病包括人乳头瘤病毒(HPV)、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、逆转录病毒(如，人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2))、疱疹病毒(如，爱泼斯坦巴尔病毒(EBV))、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2、流感病毒、甲型和乙型肝炎病毒、FIV、慢病毒、瘟病毒、西尼罗河病毒、麻疹、天花、牛痘、埃博拉病毒、冠状病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、马铃薯S病毒、猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、莫洛尼病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)或者劳斯肉瘤病毒(RSV)。本发明的适体可以检测与诸如各种寄生虫的病原体(如，疟疾)相关的抗原、抗体或其他分析物。此外，还包括细菌、真菌和其他病原性疾病，如曲霉、布鲁格丝虫、念珠菌、基孔肯亚热、衣原体、球虫、隐球菌、登革热、恶丝虫、淋球菌、组织浆菌、利什曼原虫、分枝杆菌、支原体、草履虫、百日咳、疟原虫、肺炎球菌、肺囊虫、以按蚊为媒介的间日疟原虫(P.vivax)、立克次体、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌，弓形虫和霍乱弧菌。示例性的物种包括奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhea)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、B型链球菌(Group B Streptococcus sp.)、人型支原体(Microplasma hominis)、杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)、腹股沟肉芽肿(Granuloma inguinale)、淋巴肉芽肿(Lymphopathia venereum)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、胎儿弯曲菌肠亚种(Campylobacter fetus intestinalis)、波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绵羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、牛毛滴虫(Trichomonas foetus)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、马驹放线杆菌(Actinobacillus equuli)、绵羊流产沙门氏菌(Salmonella abortusovis)、马流产沙门氏菌(Salmonella abortusequi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、马棒状杆菌(Corynebacterium equi)、化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)、羊放线杆菌(Actinobacilus seminis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、分枝犁头霉(Absidia ramose)、马媾疫锥虫(Trypanosoma equiperdum)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)；或真菌，例如巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；或其他病原体，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。还包括美国国立过敏和传染病研究所(NIAID)的优先病原体。这些包括A类物质，如重型天花(天花)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(瘟疫)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)毒素(肉毒中毒)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(土拉菌病)、丝状病毒(埃博拉出血热、马尔堡出血热)、沙粒病毒(拉沙(拉沙热))、胡宁(阿根廷出血热)以及相关病毒；B类物质，如立克次体(Coxiella burnetti)(Q热)、布鲁氏菌(Brucella)种(布鲁氏菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽病)、甲病毒(委内瑞拉脑脊髓炎、东部&西部马脑脊髓炎)、来自蓖麻(蓖麻子)的蓖麻毒素、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的ε毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B、沙门氏菌(Salmonella)种、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株O157:H7、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)；C类物质，如尼帕病毒、汉坦病毒、伊蚊传播的黄热病和多药耐药性结核菌；蠕虫，如血吸虫(Schistosoma)和绦虫(Taenia)；以及原生动物，如沙蝇传播的利士曼原虫(Leishmania)(例如墨西哥利士曼原虫(L.mexicana))、疟原虫(Plasmodium)、猎蝽传播的疟原虫(Plasmodium)(恰加斯病)。
细菌病原体包括但不限于，如细菌致病性革兰氏阳性球菌，其包括但不限于：肺炎球菌；葡萄球菌和链球菌。致病性革兰氏阴性球菌包括：脑膜炎球菌和淋球菌。致病性肠革兰氏阴性杆菌包括：肠杆菌科；假单胞菌、不动杆菌和艾肯菌属；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌；嗜血杆菌；软下疳；布鲁氏菌；土拉菌；鼠疫菌(巴氏杆菌)；念珠状链杆菌和螺杆菌；单核细胞增多性李斯特菌；猪丹毒菌；白喉；霍乱；炭疽；和杜诺凡病(腹股沟肉芽肿)。致病性厌氧菌包括：破伤风；肉毒中毒；其他梭状芽孢杆菌；结核；麻风；和其他分枝杆菌。致病性螺旋体疾病包括：梅毒；密螺旋体病；雅司病、品他病和地方性梅毒；和钩端螺旋体病。由致病性更高的细菌和致病性真菌导致的其他感染包括：放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、波氏霉菌病、球拟酵母病、足分枝菌病和着色性真菌病；以及皮肤癣菌病。立克次体感染包括立克次体和立克次体病。支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎；性病淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。致病性原生动物、蠕虫和感染性真核生物因此包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺孢子虫；贾第虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫(trematodes)或吸虫(flukes)；以及绦虫(带虫)感染。
本发明的适体可应用于诊断和预测，如检测持续性的感染性疾病。在某些实施方式中，所述适体可以使用手指针刺或标准抽血法采集的人血液、血清或血浆，检测人体内包柔螺旋体科的物种引起的感染(如，包柔螺旋体感染)。此外，所述适体可以检测莱姆病和其他由蜱传播的病原体，如：巴倍虫(Babesia)、埃利希氏体(Ehrlichia)、无浆体(Anaplasma)、巴尔通氏体(Bartonella)以及其他新出现的由蜱传播的病原体如Borrelia miyamotoi、斑疹热和玻瓦桑病毒。适体可以用于检测Borrelia afzelii、Borrelia americana、Borrelia andersonii、Borrelia anserina、Borrelia baltazardii、Borrelia bavariensis、Borrelia bissettii、Borrelia brasiliensis、Borrelia burgdorferi、Borrelia californiensis、Borrelia carolinensis、Borrelia caucasica、Borrelia coriaceae、Borrelia crocidurae、Borrelia dugesii、Borrelia duttonii、Borrelia garinii、Borrelia graingeri、Borrelia harveyi、Borrelia hermsii、Borrelia hispanica、Borrelia japonica、Borrelia kurtenbachii、Borrelia latyschewii、Borrelia lonestari、Borrelia lusitaniae、Borrelia mazzottii、Borrelia merionesi、Borrelia microti、Borrelia miyamotoi、Borrelia parkeri、Borrelia persica、Borrelia recurrentis、Borrelia sinica、Borrelia spielmanii、Borrelia tanukii、Borrelia texasensis、Borrelia theileri、Borrelia tillae、Borrelia turcica、Borrelia turdi、Borrelia turicatae、Borrelia valaisiana、Borrelia venezuelensis、Borrelia vincentii、Borrelia burgdorferi B31、Borrelia burgdorferi N40、Borrelia burgdorferi JD1或Borrelia burgdorferi 297。包柔螺旋体的物种可以存在于肩突硬蜱(Ixodes scapularis)中。
“巴倍虫”指巴倍虫科的感染性原生动物物种，包括但不限于Babesia bigemina、Babesia bovis、Babesia canis、Babesia cati、Babesia divergens、Babesia duncani、Babesia felis、Babesia gibsoni、Babesia herpailuri、Babesia jakimovi、Babesia major、Babesia microti、Babesia ovate或Babesia pantherae。“埃利希氏体”指埃利希氏体科的感染性病原体物种，包括但不限于Ehrlichia chaffeensis、Ehrlichia muris、Ehrlichia ewingii、Ehrlichia ruminantium或Ehrlichia canis。“无浆体”指无浆体科的感染性病原体物种，包括但不限于Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale、Anaplasma centrale、Anaplasma mesaeterum、Anaplasma ovis或Anaplasma platys。“巴尔通氏体”指巴尔通氏体科的感染性病原体物种，包括但不限于Bartonella henselae、Bartonella quintana、Bartonella bacilliformis、Bartonella elizabethae或Bartonella clarridgeiae。
基于其靶标识别能力、选择性和高亲和性结合，可以将适体类比成抗体。然而，由于其独特的性质，适体在开发和应用范围上具有更大的灵活性。特别地，通过SELEX过程产生适体所需的时间相对较短。此外，适体可以化学合成，可以对其进行引入各种官能团和特定部分(如，生物素、羧基、氨基和巯基基团)所需要的生化操作，其大部分不会影响适体对靶标的识别。适体适于体外进化，选择的过程中可以增加压力，以潜在地增加适体对其靶标的亲和性或选择性。
例如，适体选自1014至1015个随机DNA或RNA序列的适体库(自商业来源购得，作为产生合成寡核苷酸的库)，并使用SELEX过程富集序列特异性适体。SELEX包括将DNA或RNA适体库与靶标(通常在固体支持物上)以及“阴性”靶标(即，该过程的其他部分，如在该过程中使用的塑料或不存在靶标的固体支持物)接触，以确保适体库不是针对“阴性”靶标富集的。适体与靶标相互作用并与靶标结合，并将未结合的适体洗去。将结合的适体洗脱并通过PCR进行复制，使用翼侧恒定区作为扩增引物位点。用富集的适体库重复进行该过程，直至少量的适体在库中占据多数。可以使用凝胶位移测定、荧光各向异性实验或其他结合实验以确定适体针对给定靶标的亲和性。
本申请中的术语“％同源性”可以与本申请中的术语“％同一性”互换使用，并且通常指使用序列比对程序比对时，本发明的DNA或RNA适体的核酸序列之间的核酸同一性水平。
例如，本申请中所用的通过已定义算法确定的80％同源性以及80％序列同一性含义相同，相应地，给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同一性。示例性的序列同一性水平包括但不限于如本申请所述的、与给定序列具有80、85、90、95、98％或更高的序列同一性。
可以用于确定两条序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST公开访问的BLAST程序套件，例如BLASTN、BLASTX和BLASTX，BLASTP和TBLASTN，以及其他下一代DNA测序分析程序。其他程序包括Galaxy、Lasergene Genomics Suite、CLC Genomics Workbench、DNANexus、GenomeQuest、Softgene NextGENe。
在某个实施方式中，本发明包括包含与选自下组的核苷酸序列至少50％相同的核苷酸序列或其任意组合的适体：SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65和66。在某些实施方式中，适体包含与选自下组的核苷酸序列至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列或其任意组合：SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65和66。
在表1中提供了用于莱姆病检测的示例性适体序列。
表1：针对OspA、OspC和BmpA的适体
在某个实施方式中，本发明包括包含与选自下组的核苷酸序列至少50％相同的核苷酸序列或其任意组合的适体：SEQ ID No.67-84或其任意同源物。在某些实施方式中，适体包含与选自下组的核苷酸序列至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列或其任意组合：SEQ ID No.67-84或其任意同源物。
参考文献
(1)Hofmann,H.P.等，RNA 1997,3,1289.
(2)Ellington,A.D.等，Nature 1990,346,818.
(3)Geiger,A.等，Nucleic Acids Res.1996,24,1029.
(4)Strehlitz,B.等，Bioanal.Rev.2012,4,1.
(5)Williams,K.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.1997,94,11285.
(6)Purschke,W.G.等，Nucleic Acids Res.2003,31,3027.
(7)Mie,M.等，Appl.Biochem.Biotechnol.2013,169,250.
(8)Ohuchi,S.Biores Open Access 2012,1,265.
(9)Ikanovic,M.等，J.Fluoresc.2007,17,193.
(10)Kim,Y.S.等，Anal.Biochem.2013,436,22.
D.拉曼活性标记物分子
拉曼活性标记物是共价附接至一种或多种适体的化学部分。标记物通常是已与亚磷酰胺(用于在固体支持物上构建DNA序列的单体)合并的荧光标记物，亚磷酰胺设计为用于与合成的寡核苷酸合并。还有另一类小一些的拉曼活性标记物(并且因此不太可能影响适体与靶标的相互作用)，如也可以像亚磷酰胺一样与合成的寡核苷酸分子合并的炔、叠氮化物等(Yamakoshi(2012)J Am Chem Soc 134:20681-9)。有用的拉曼活性标记物包括但不限于Cy3、TAMRA、德克萨斯红(TR)、Cy3.5、罗丹明6G、Cy5。由于对拉曼标记物分子微小的化学修饰就能够产生拉曼光谱不同的新分子，即使两个分子表现出的荧光光谱几乎无法区分，因此可用的拉曼活性标记物比荧光染料多得多。Kneipp等，Chem.Rev.99,2957(1999)；Graham等，Angew.Chem.Int.Ed.39,1061(2000)。这使得可以通过使用针对各适体或适体的集合具有独特光谱特征的拉曼活性标记物对给定靶标进行多重检测。
可以用于拉曼光谱的拉曼活性标记物的非限制性实例包括炔烃、叠氮化物、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑)、德克萨斯红(TR)、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛，5-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′,4′,5′,7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管和富勒烯。这些和其他拉曼标记可以从商业来源获得(例如，Molecular Probes,Eugene,OR；Sigma Aldrich Chemical Co.,St.Louis,MO；Glen Research,Sterling,VA)和/或通过本领域公知的方法合成。
如本领域所公知的，多环芳香族化合物可以作为拉曼活性标记物发挥作用。本领域技术人员将意识到所使用的拉曼标记应当产生不同的拉曼光谱并且可以与不同类型的适体特异性结合或关联。
标记或拉曼活性标记物可以在固相DNA合成过程中直接附接至适体或可以通过各种接头化合物附接。在所公开方法中使用的交联试剂和接头化合物是本领域公知的。含有设计用以与其他分子(如，适体)进行共价反应的反应性基团的拉曼标记可以在市面上购得(例如，Thermo Scientific,Eugene,OR)。用于制备标记分析物的方法是公知的(例如，美国专利号4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
E.靶标的定义
本申请中所用的术语“靶标”或“分析物”可以互换使用并且指用于检测和/或鉴定的任意目标原子、化学物质、分子、化合物、组合物或聚集物。分析物的非限制性实例包括氨基酸、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药品、药物、营养物质、朊病毒、毒素、毒物、爆炸物、杀虫剂、化学战剂、生物危害剂、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物、诱变剂、麻醉剂、苯丙胺、巴比妥酸盐、致幻剂、滥用的药物、废物、枪击残留物和/或污染物。
在某些实施方式中，分析物或靶标存在于包柔螺旋体科的物种中。在某些实施方式中，分析物是选自OspA、OspB、OspC、BmpA或其组合的包柔螺旋体表面蛋白。OspA、OspB、OspC和BmpA是存在于包柔螺旋体的外表面蛋白；并且其在人或蜱的解剖学中具有不同的表达。OspA和OspB似乎是包柔螺旋体在蜱中存活所必需的，OspC是被感染的蜱感染哺乳动物宿主所必需的。
F.生物样品
本申请中所用的术语“生物样品”可以包括但不限于血液、血液制品、血清、血浆、其他血液成分、组织、组织提取物、尿液、脑脊液、唾液、粪便、皮肤、毛发、颊组织、器官组织、呼吸、胸膜液、汗液或痰液。
本申请中所用的“样品收集装置”或“样品收集设备”可以包括但不限于棉签或其他基质(滤纸、棉花、垫或泡沫)、浸量尺、试纸条、杯、筒、毛细管或试管。可以将收集或包含在其中的生物样品复溶，例如在水或适宜的缓冲液中。在某些实施方式中，生物样品不需要复溶。样品收集设备可以用颜色编码(例如，使用染料、可检测标签或条形码)以标示该设备是阳性或阴性对照。在某些实施方式中，基质或收集设备可以由粘合聚烯烃纤维制成，如粘合聚烯烃纤维、玻璃纤维、纤维素、棉花、聚乙烯、尼龙、天然大分子、聚乙烯砜、二氧化硅、玻璃纤维、具有粘合剂的玻璃纤维、醋酸纤维素或硝化纤维素(NC)。“样品收集装置”或“样品收集设备”可以包括壳体，其中所述壳体可以包含适用于样品收集的材料，如塑料等。
样品收集设备还可以包含酶或蛋白酶、蛋白、用于处理生物样品、增加保质期的化合物或防腐剂、化学稳定剂、稀释剂、缓冲剂、添加剂、去垢剂、脂质、糖、碳水化合物或其任意组合。例如，酶或蛋白酶可以将生物样品或待测样品增溶。例如，酶可以是但不限于粘蛋白。蛋白可以是但不限于牛血清白蛋白。防腐剂可以是但不限于叠氮钠。其他添加剂和稳定剂可以包括但不限于无水正磷酸氢二钠、正磷酸二氢钾、d-甘露醇或其任意组合。
G.拉曼检测器或仪器
可以通过SERS拉曼光谱或其他适宜拉曼光谱技术的公知方法(如，尖端增强拉曼散射(TERS)和单分子拉曼散射(SMERS))检测和/或鉴定分析物。已经公开了表面增强拉曼光谱(SERS)的变体，表面增强共振拉曼光谱(SERRS)、超拉曼光谱和相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)。在SERS和SERRS中，拉曼检测对于吸附在粗糙金属表面(如，银、金、铂、铜或铝表面)的或纳米颗粒上的分子的灵敏度增加到106倍或更多。通过将拉曼活性标记物加入根据本发明的适体，产生更进一步并且更强大的信号增强；进一步地，加入标记物能够通过标记物已知、不同的光谱特征对靶标进行鉴定，当与其周围的基质或未经修饰的适体比较时，预计所述光谱特征是独特的。在美国专利公布号2013/0107254中描述了SERS检测的一种有用方法。
在美国专利号6,002,471中公开了拉曼检测单元的一个非限制性实例。由倍频Nd:YAG激光器在532nm波长处或倍频Ti:蓝宝石激光器在365nm波长处产生激发光束。可以使用脉冲激光束或连续激光束。激发光束通过共聚焦光学器件和显微镜物镜，并聚焦到含有一种或多种分析物的拉曼活性复合物上。由显微镜物镜和共聚焦光学器件收集拉曼发射信号，并将其耦合到单色仪用于光谱解离。共聚焦光学器件包括二向色滤光片、屏障滤光片、共聚焦针孔、透镜和用于减少背景信号的反射镜的组合。标准全场光学器件以及共聚焦光学器件均可使用。由拉曼检测器检测拉曼发射信号，拉曼检测器包括与用于对信号进行计数和数字化的计算机接口连接的雪崩光电二极管。
在美国专利号5,306,403中公开了拉曼检测单元的另一个实例，其包括具有在单光子计数模式下操作的砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)的Spex Model 1403双光栅分光光度计。激发源包括来自Spectra Physics,166Model的514.5nm线光源氩离子激光器和647.1nm线光源的氪离子激光器(Innova 70，Coherent)。
在某些实施方式中，典型的入射波长为约488nm、约514.5nm、约532nm、约632.8nm、约785nm和约1064nm。
替代的激发源包括在337nm处的氮激光器(Laser Science Inc.)和在325nm处的氦镉激光器(Liconox)(美国专利号6,174,677)、发光二极管、Nd:YLF激光器和/或各种离子激光器和/或染料激光器。可以使用带通滤光器(Corion)对激发光束进行光谱纯化，并且可以使用6×物镜(Newport,Model L6X)将其聚焦在拉曼活性复合物上。物镜可以通过使用全息分束器(Kaiser Optical Systems,Inc.,Model HB 647-26N18)使激发光束和发射拉曼信号呈几何直角，用于激发分析物和收集拉曼信号。可以使用全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems,Inc.)来降低瑞利散射辐射。替代的拉曼检测器包括配有红增强强化电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)的ISA HR-320光谱仪。可以使用其他类型的检测器，如傅立叶变换光谱仪(基于Michaelson干涉仪)、电荷注入器件、光电二极管阵列、InGaAs检测器、电子倍增CCD、强化CCD和/或光电晶体管阵列。
可以将本领域公知的任何适宜形式或配置的拉曼光谱或相关技术用于检测本发明的复合物，包括但不限于正常拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)、受激拉曼散射、反向拉曼光谱、受激增益拉曼光谱，超拉曼散射、分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微镜或共聚焦拉曼微光谱测定法、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱法、时间分辨共振拉曼、拉曼去耦光谱法或UV--拉曼显微法。
在某些实施方式中，本发明公开了用于测试床旁检测装置(如，便携式拉曼检测器)是否正常工作的方法。该方法包括下述步骤：(a)将样品收集设备与水、缓冲溶液或生物样品接触；(b)将样品收集设备插入床旁检测装置；以及(c)检测阳性或阴性对照的存在情况，其中存在阳性或阴性对照表明床旁检测装置正常工作。在某些实施方式中，可以使用用于校准的标准检测盒测试床旁检测装置是否正常工作。
H.其他技术
目前用于检测包柔螺旋体在蜱中存在情况的方法是使用免疫学方法来检测蜱匀浆中存在的细菌蛋白。通常，这些检测很耗时，需要大量的专业技能和培训才能进行。将蜱送入检测实验室后，检测结果通常要等上几周才能返回；许多人在收到蜱检测的结果之前，已经显示出莱姆病症状。
目前被接受的用于检测人类莱姆病的方法是基于CDC批准的双层级血清学方案，其使用全细胞匀浆作为检测人抗包柔螺旋体抗体的靶标。第一层级的检测通常使用ELISA或相关测定以检测抗-莱姆IgM或IgG抗体，而阳性或不确定的结果将启动进行第二项检测，使用包柔螺旋体提取物进行IgM或IgG免疫印迹，以检测认为是特异性于包柔螺旋体的条带。这些血清学检测存在很多问题：1)灵敏度低；2)在感染的前4-6周抗包柔螺旋体抗体的水平非常低；3)在一些个体中抗包柔螺旋体应答较弱；4)对免疫印迹的主观解释；以及5)在经抗体治疗或再次感染的个体中无法诊断包柔螺旋体感染。因为该测试检测抗体产生情况而非直接检测病原体，所以该测试无法在感染3周内检测感染。此外，该测试的特异性>80％，但是灵敏度仅为50-60％。目前对在美国情况的估计提示，尽管由于灵敏度较低，很多临床医生不要求做人类莱姆病检测，但要求进行的这一检测仍有约300,000。报告莱姆病的比率较低部分是由于临床医生目前可用的诊断工具的质量较差。
除了基于血清学的测定以外，还有一些其他新的测定方法已经开始出现在文献中和市场上。最近记述了莱姆病诊断的代谢组学方法(Mollins,C.R.等，Clin Infect Dis.2015年3月11日)。这种方法处于早期研发阶段，需要仪器密集型、技术先进的GC-MS分析，使得床旁检测(POC)难以进行。Ceres Nanosciences开发了一项基于纳米颗粒的测定法，该方法从尿液中浓缩莱姆病抗原并使用标准免疫测定技术检测其存在情况(Douglas,T.A.等，Biomaterials.2011Feb；32(4):1157-66；www.ceresnano.com)。尽管这项测定直接检测莱姆病抗原而非抗包柔螺旋体抗体，但是该测定使用免疫测定技术检测莱姆病抗原并需要进行>4小时，也使POC检测难以进行。
文献中记述了各种各样其他的莱姆病诊断测定法。一些包括基于直接DNA扩增的测定、基于培养的测定和其他直接检测莱姆病抗原的方法，如测量与抗体修饰的碳纳米管结合的莱姆抗原的基于晶体管的测定(Lerner,M.B.等，Biosens Bioelectron.2013年7月15日；45:163-7)。这些测定中的很多处于研发的早期阶段或已经产生了比目前CDC批准的双层级免疫测定法更差的结果。
本发明具有上述方法的若干优点，包括：1)DNA适体具有高亲和性、灵活以及易于产生和修饰，以代替在其他检测系统中使用的抗莱姆抗原抗体；2)基于纳米颗粒的抗原结合使得能够容易快速地从大量血液、血清或血浆中结合和分离抗原；3)SERS使信号放大106至1014倍使得能够进行超灵敏的莱姆病抗原检测；4)沿DNA适体专门放置的拉曼标记显着提高了基于SERS检测的特异性和灵敏度；以及5)从抗原结合至SERS检测，整个检测方法耗时<30分钟，使其非常适合于POC诊断应用。
从上述公开的内容可知，本发明具有非常广泛的应用。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
实施例
I.检测感染性疾病的试剂和方法(实施例1-4)
实施例1
针对催产素(OT)和催产素-gly-lys-arg(OT-GKR)的适体选择
利用Hoon等1所述的适体选择过程选择针对OT和OT-GKR的适体。在该方法中，生物素-OT和生物素-OT-GKR与磁性、生物素化的微球结合，这些微球作为易于收集的衬底将把与肽激素结合的DNA寡核苷酸与未结合的寡核苷酸分离。用作适体选择文库的寡核苷酸库由40个随机核苷酸组成，其侧翼为小段恒定DNA序列，所述小段恒定DNA序列可以作为适体选择后适体文库PCR扩增所必需的引物位点。适体文库的序列为：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-[N]40-AGATCGGAAGAGCAC ACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’(SEQ ID NO:1)
将这一寡核苷酸的翼侧区选择为与接头序列互补以用于在Illumina MiSeq测序平台上进行的DNA新一代测序(NGS)。
简言之，适体选择过程如下：
●将0.1ml Dynabeads m270用于针对靶标的各轮选择，将0.1ml Dynabeads用于各阴性选择
●用PBS将Dynabeads洗涤3次
●将用于阳性选择的Dynabeads在含100pmol生物素-OT或生物素-OT-GKR的PBS中在室温下(在不断旋转的条件下)孵育30min
●用PBS将与肽结合的Dynabeads洗涤3次
●用PBS+0.1％BSA将所有Dynabeads样品(OT、OT-OKR和2个用于阴性对照的样品)洗涤2次
●将适体选择文库DNA(在第一轮选择中，将15nmol DNA用于各选择；在随后的选择轮次中，使用90％从上一轮收集的适体文库)在95℃下孵育5min、在0℃下孵育5min以及在室温下孵育5min
●将DNA加入阴性对照Dynabeads并且在室温下在不断旋转的条件下孵育30min
●将来自阴性选择Dynabeads的上清液转移至与OT或OT-GKR结合的Dynabeads中——将样品在室温下在不断旋转的条件下孵育30min
●从Dynabeads中移除上清液并用PBS+0.1％BSA将Dynabeads洗涤3次，并且用PBS将Dynabeads洗涤1次
●将具有结合适体文库DNA的Dynabeads在-20℃下保存，直至准备进行PCR扩增和分析
●在PCR分析后，将约20％的各样品送至Illumina MiSeq仪器进行NGS DNA测序，并将剩余部分用于产生单链标准DNA(ssDNA)以用于进行下一轮的适体选择
●使用不对称PCR产生ssDNA，随后对DNA的反向互补链进行λ核酸外切酶消化高通量DNA测序
在进行适体选择后，使用在寡核苷酸的5’-末端加入Illumina TruSeq通用接头序列的引物，以及在寡核苷酸的3’-末端含有6-碱基条码的TruSeq索引引物，对与Dynabeads结合的寡核苷酸进行PCR扩增。表1.3显示了用于NGS分析所产生的四个样品。带下划线的序列表示在DNA测序程序中区分混合样品所需的6碱基条码。
表1.3显示TruSeq索引条码的反向PCR引物寡核苷酸
PCR扩增后，对样品进行测序。将大约等摩尔量的四个样品混合并在MiSeq测序仪的单一泳道上运行，该测序仪能够在过夜分析中将20,000,000条DNA链测序。将仪器设置为读取长度至多为50bp的序列，允许在每个测序反应中完整地确定随机序列。通过在测序反应前用PCR加入适体的6碱基条码，来识别与各样品相关的序列。
生物信息学
为了分析由Illumina MiSeq高通量DNA测序仪产生的序列数据，通过修订Latulippe等4中所述的方法研发用于适体分析的分析工具。
首先，将来自Illumina MiSeq DNA测序仪的数据按DNA条码分类，并进行数学过滤以除去人为因素序列，例如含有长段均聚物的序列。随后对来自单一样品的所有序列进行比较，并对样品中所有的精确匹配进行计数并按序列出现的次数进行排序。将各样品中最常见的5000条序列导出到Microsoft Excel表。针对各样品(即，OT、OT-GKR或阴性对照)所产生的序列总数，对各样品特定序列出现的次数进行归一化处理。将来自OT选择的最常出现的样品与来自OT-GKR选择和阴性对照选择的序列进行比较，标记出OT选择中特有的序列。将这些序列标记为潜在的OT适体。将相同的分析用于分析OT-GKR选择以产生作为潜在OT-GKR适体的适体。
表1.4显示了这些分析的结果。在前30条序列中，仅有1个催产素适体序列是OT文库特有的，且在前5000条阴性对照序列中不存在(后缀为R的寡核苷酸编号)。还有2条序列是OT特有的且在阴性对照序列中很罕见(在～5x 106条序列中出现少于5次)(后缀为Y的寡核苷酸编号)。对于前30条OT-GKR序列而言，发现了两条特有的序列，并且发现了1条序列是OT特有的且在阴性对照序列中很罕见。
根据表1.4中所示的结果，合成下述寡核苷酸并对其进行针对OT和OT-GKR结合的检测：
催产素
5’-ATGCAAATTAGCATAAGCAGCTTGCAGACCCATAATGTC-3’(SEQ ID NO:6)
5’-ATAGTGTTATTAATATCAAGTTGGGGGAGCACATTGTAG-3’(SEQ ID NO:7)
5’-CTTGTTTACGAATTAAATCGAAGTGGACTGCTGGCGGAA-3’(SEQ ID NO:8)
催产素-GKR
5’-TAAACGTGACGATGAGGGACATAAAAAGTAAAAATGTCT-3’(SEQ ID NO:9)
5’-ATGCAAATTAGCATAAGCAGCTTGCAGACCCATAATGTC-3’(SEQ ID NO:6)
5’-AGTTGCCATACAAAACAGGGTCGCCAGCAATATCGGTAT-3’(SEQ ID NO:11)
实施例2
适体修饰的银纳米粒子(Ag-NP)的合成以及用其进行催产素检测
使用Leona5所述的文献方法进行Ag NP的合成，其中通过在存在葡萄糖和柠檬酸盐的条件下还原硫酸银合成NP。简言之，合成方法包括通过加入硫酸从硝酸银水溶液中析出硫酸银。制备5x 10-4M刚刚析出的硫酸银的水溶液，将12.5mL该溶液与柠檬酸盐(1mL)和葡萄糖(500μL)的1％溶液混合。使用微波消解系统(Anton Parr Multiwave 3000)加热该溶液，使用三次加热程序，其中溶液的温度在30秒内升至120℃，并在该温度下保持30、60或90秒。然后通过离心15分钟纯化NP，随后除去上清液并置换成经蒸馏的去离子水以降低柠檬酸盐浓度。
每个温度程序所产生的Ag NP均显示出与文献中报道的相比毫不逊色的光谱特征(图5，版块A和版块B)5,6。在401nm处可见吸收最大值，其最大值一半处的宽度值为60nm，与文献中56nm的值相当5。由于等离子体共振与粒径密切相关，因此根据将这些数据与文献7比较的结果确定NP为20至25nm。
在开始进行合成的3周以后采集NP的吸收光谱以证明NP的稳定性。对在离心前储存于含高浓度柠檬酸盐和葡萄糖的反应混合物中的NP，以及在NP合成的当天为降低柠檬酸盐浓度而经离心的NP的吸收光谱进行比较(图5，版块A)。吸收光谱彼此之间以及与在合成当天采集的光谱是相似的，表明基于微波的合成方法生产出了稳定的Ag NP，其能够作为用于催产素检测的可靠方法的基础。
然后使用模型SERS活性化合物巯基苯酚(MCP)证明这些Ag NP产生拉曼增强的能力。将MCP用于这些研究是基于下面两个重要的原因：其产生能够允许确定NP作为SERS衬底的作用的特征性拉曼光谱，并且其与Ag NP通过巯基连接相互作用，这类似于用巯基化适体对Ag NP表面进行修饰。在存在Ag NP和100μM硝酸钾溶液的条件下采集200μM MCP溶液的光谱，并将其与不含NP的相同溶液的光谱进行比较，结果表明NP的存在带来了5个数量级的增强(图2，版块B)。
使用Leona5所述的文献方法进行了Ag NP的成功合成，并且证明了所合成的Ag NP能够使光谱强度产生5个数量级的增加，在此基础上，本研究的这一方面专注于用巯基化DNA对Ag和Au NP的修饰。通常使用二硫化部分合成巯基化DNA，由于之后要用寡核苷酸修饰NP表面，而需要将二硫化物还原成巯基或二巯基部分。为了进行还原，采用三种方法：第一种包括在碱性条件下用二硫苏糖醇(DTT)将二硫化物还原8，在酸性条件下使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)将二硫化物还原9，或者简单地将二硫化物封端的DNA暴露于NP以促进二硫化物还原10。
使用单巯基或二巯基部分封端的寡核苷酸修饰的DNA进行表面修饰作用的研究。使用吸收光谱监测该方法的作用。NP的表面修饰通常包括在存在巯基修饰的DNA的条件下将NP孵育16-24小时，随后缓慢加入盐以促进NP表面DNA浓度的增加。通常以在2-5天的时间跨度内增量为50mM的速度缓慢加入盐至300mM的终浓度，旨在通过平衡DNA骨架中磷酸部分的电荷平衡以及减少排斥，来增加NP表面上DNA的浓度。可以对盐的状态进行调整以产生DNA修饰的NP SERS衬底。
对单巯基和二巯基封端的寡核苷酸的比较，涉及对用二巯基封端的寡核苷酸进行的表面修饰中两个参数的研究：用于活化二硫化物修饰剂的还原剂，以及用以增加NP表面上DNA浓度的盐的速率和浓度。通过检测表面等离子体吸收的保留情况监测表面修饰的作用。在存在二硫苏糖醇(DTT)9、(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)8的条件下以及不存在还原剂而将二硫化物与NP悬液10直接接触的条件下进行初始步骤，在该步骤中将二硫化物修饰的DNA还原以产生能够与Ag NP表面连接的二巯基封端。
如图2，版块C中所示，在暴露于二巯基封端DNA和加入25mM NaCl后，等离子体都是稳定的。将盐浓度增加至50mM导致产生了等离子体吸收第一次向更低能量迁移。进一步加入盐，将盐浓度增至总计100mM导致等离子体迅速丢失，提示产生了NP聚集。
平行进行各方法并使用吸收光谱监控(图2，版块D)。尽管表面等离子体的强度表明每种还原方法均能够成功添加二巯基修饰的DNA，但当加入氯化钠以增加NP表面的DNA浓度时，注意到了显著的差异。在不存在还原剂或存在TCEP的条件下向经修饰的Ag NP中加入25mM氯化钠的试样，未显著降低等离子体吸收的强度，但是将NP暴露于用DTT还原的二巯基修饰的DNA导致等离子体吸收的显著降低。对在存在各种二硫化物还原条件的情况下，与向经修饰的NP中加入氯化钠后等离子体吸收强度的变化情况进行比较(图2，版块E)，确证了用TCEP或在不存在还原剂的条件下制备的NP产生了Ag NP等离子的最佳保留。
采用两种方法对NP的表面修饰进行了确证：第一种，进行将未暴露于二巯基封端DNA的NP暴露于与DNA修饰的NP相同的氯化钠加入条件下的对照实验。这导致在加入25mM氯化钠后等离子体强度显著丢失(图2，版块E)。对表面修饰的第二种证明利用了存在于5’-末端的荧光FAM标记物。根据Mirkin及其同事建立的方法，通过将DNA修饰的NP暴露于0.1M DTT溶液，将FAM修饰的DNA从Ag NP表面除去11。在将样品离心以便将Ag与上清液分离后，经488nm的光照射后检测溶液的荧光(图2，版块F)。所得到的发射光谱表明成功地用二巯基修饰的DNA修饰了NP表面。发射光谱的相对强度表明在不存在还原剂条件下的表面修饰是最有效的，这证实了在吸收研究中所观察到的结果。
本申请中开发的方法有利于用单巯基或二巯基封端的适体寡核苷酸对拉曼活性Ag NP进行可靠的修饰。使用二巯基封端寡聚物生产的NP比使用单巯基封端寡聚物生产的NP更加稳定，并且可以将其用于所有随后对表面修饰方法进行的优化中。二巯基修饰的DNA适体替代物同样在5’-末端用荧光标记物FAM修饰。已发现二硫化物修饰物对于在NP表面上锚定DNA更加有效10，并且已将FAM封端的DNA用于通过荧光实验表明在NP表面上存在DNA11。根据这些结果，在所有随后的拉曼研究中使用在不存在还原剂的条件下制备，并且加入50mM NaCl以增加NP表面上DNA的浓度的Ag NP。
实施例3
为便于用户使用以及提高灵敏度的样品制备
通过加入常用无机盐使NP密切靠近以形成“热点”非常适于本应用。已提出加入盐导致NP在溶液中聚集，由此导致NP的靠近，从而导致NP等离子体的“共享”，从而将振动光谱的增强增加至超出在单个的SERS活性NP存在的条件下所观察到的程度。
为了说明盐对NP产生拉曼散射增强的效能的作用，研究了加入两种常用盐(硝酸钾和氯化钠)的100μM溶液的作用。如图3，版块A所示，加入这两种盐导致光谱强度出现一个数量级的增加，其中加入硝酸钾产生的光谱强度比加入氯化钠产生的光谱强度高60％。这些结果构成了从这方面努力建立这种方法的基础。
基于对DNA修饰方法的成功研发，使用632.8nm和785nm的入射波长对所得材料进行拉曼解调，结果表明存在提示离散分子(如在5’末端纳入我们的序列的荧光FAM)的独特的、可重现的光谱特征。Mirkin及其同事针对多种染料证明了可以在存在寡核苷酸的条件下观察染料标记物指示性特征，并且基于与染料相关的强烈、独特的特征将其用于多重检测12。
进行第一项研究以确定在进行光谱分析前加入哪种盐添加物能够提供最强的光谱特征。如图3，版块B所示，加入KNO3产生了强度更高的拉曼特征，这可能是由于“热点”的形成导致光谱强度的协同性增加。与此观察结果一致，观察到在存在KNO3的条件下经5’-FAM封端DNA修饰的Ag NP的光谱特征最强。
被FAM所证实的强烈的光谱特征为开发催产素检测的方法提供了机会。5’-FAM尖锐、强烈的光谱特征与巯基苯酚(MCP)的强度不相上下，并且其提供了能够用作分析靶标替代物的光谱特征。FAM修饰适体与适体靶标的相互作用诱导来源于FAM的光谱特征强度的改变。
为了产生在其中能观察到来源于FAM和MCP光谱特征的Ag NP表面单层，将FAM DNA修饰的Ag NP暴露于不同浓度的MCP。对在Ag NP表面由FAM修饰和MCP(浓度范围为从4mM至4μM)组成的混合单层进行了研究，在MCP的浓度为4μM时最有效地观察到MCP和FAM两者的光谱特征(图3，版块C)。在NP表面的混合MCP/FAM DNA单层显示出独特的、易于分辨的来自MCP和FAM的光谱特征(图3，版块D)。在714cm-1和1050cm-1处的特征来自见于二巯基修饰的DNA5’末端的FAM染料，而在613cm-1、1010cm-1、1080cm-1和1175cm-1处的特征峰由MCP单层贡献。这两个不同的特征基团的存在表明可以将其用于比例分析，其中在引入分析物后来自FAM修饰DNA的特征峰将改变，而MCP的特征峰将保持恒定。
使用785nm的入射光对该系统进行进一步的研究显示了相似的光谱特征集合。将这些光谱特征转换为较低能量入射光的能力很重要，因为使用这种入射波长的仪器可以在市面上购得，相对便宜并且对于几乎没有接受过光谱学训练的人易于上手。对具有由4mM MCP和FAM修饰DNA组成的表面单层的Ag NP采集的光谱再次证明光谱特征可易于归为混合单层的两个组分。FAM修饰DNA贡献了在305cm-1、714cm-1和1050cm-1处的特征峰，而MCP贡献了在393cm-1、636cm-1、1010cm-1、1080cm-1和1175cm-1处的特征峰。这些光谱显示出近似于在633nm激发下观察到的特征峰以及785nm光谱特有的附加特征峰(图3，版块E)。
在光谱优化过程的第二个方面，考察了由与MCH或MCP偶联的拉曼标记DNA组成的混合单层，单层的信号强度以及对表面单层进行进一步修饰的影响。将Lin及其同事的工作成果作为研究各种表面修饰和新衬底的基础，其工作成果表明加入巯基己醇能够提高利用拉曼光谱的染料修饰的加压素的拉曼强度13，揭示了本应用在光谱方法中的进一步改进。
作为增加拉曼信号强度的方法，进行研究的第一种方法包括将1-巯基己-6-醇(MCH)加入FAM-DNA修饰的Ag NP中。在此前的靶向识别依赖于适体的基于拉曼的检测方案中，已经揭示了将该分子加入表面单层导致信号强度增加13。
将三个浓度(400μM、40μM和4μM)的MCH加入DNA修饰的Ag NP，在所有三个浓度下均显示了，两个来自FAM的光谱特征峰强度在714cm-1和1050cm-1处显著增加。在最低浓度下观察到了最大的增加(图3，版块F)，与此前观察到的巯基化分子在NP表面置换DNA相一致。利用这一现象从AG NP表面置换FAM修饰DNA，以证实NP成功进行了表面修饰(图2，版块F)。
使用MCP进行了一项与考察MCH对具有由FAM-DNA组成的混合表面单层(染料修饰适体的一种替代物)的Ag NP的拉曼强度影响的研究并行的研究，MCP是能够对催产素进行定量的内部标准品。为了鉴定最佳表面层的组成，将不同浓度的MCH和MCP加入FAM-DNA修饰的Ag NP，对与分别位于1050cm-1和1080cm-1处的MCP和FAM相关的两个最强光谱特征的基线校正强度进行比较。
对范围从4至400μM的三个浓度的MCP，以及4和40μM两个浓度的MCH进行了检测。这一比较表明在加入中间浓度的MCP(40μM)时观察到MCP和FAM两者DNA光谱特征的最大增强(图3，版块F)。尽管直觉上会认为加入最低浓度的MCP(4μM)产生强度较低的1080cm-1特征峰，因为可用于表面修饰的MCP较少，但是将MCP的浓度增至400μM也会使光谱强度降低，提示在NP表面上的巯基化分子之间存在竞争。竞争的影响也反应在来源于FAM的拉曼强度上：加入400μM MCP导致强度降低，而加入4μM MCP导致1050cm-1特征峰的强度发生微小改变。
总之，这些研究提供了对优化基于SERS的用适体修饰的Ag NP对催产素水平的定量测定所必需的参数的理解。首次考察了向FAM-DNA修饰的Ag NP的表面加入巯基化分子的作用。对两个分子组分进行了检测：MCP(内部标准分子)，以及MCH(能够填充NP表面上未占据的空间，并促进表面上的分子有序化的分子)。这项研究表明需要在两种分子组分的浓度之间取得平衡，以提供针对FAM和MCP特征的最佳信号强度。
实施例4
基于适体修饰NP的催产素检测的效能
使用实施例3中建立的条件，研究了从含有靶标以及牛血清白蛋白的缓冲溶液中进行鉴定和定量的方法。在浓度范围从nM跨越至μM的溶液中对加压素(作为催产素的替代物)的浓度进行研究，以制备标准曲线并确定所提出方法的检测限。使用9-氨基酸催产素肽开发了该方法，并将其扩展用于12-氨基酸原-催产素。
为准备检测催产素靶向性的适体，使用He等(Analytica Chimica Acta 759(2013)74-80)报道的加压素靶向适体进行了对基于拉曼的激素检测的初步研究。由于加压素是与催产素类似的9氨基酸激素，并且其与催产素的差异仅为2个氨基酸，因此其是催产素非常好的替代物。用TAMRA修饰的尿嘧啶亚磷酰胺对加压素适体进行修饰，以使得适体在暴露于待鉴定的靶激素后发生结构改变：已知TAMRA具有不逊于FAM的强拉曼光谱特征，并且已将其用于类似的针对加压素的基于拉曼的检测方法。将TAMRA修饰的碱基插入适体上的位置22处，该位置距离NP表面最远，猜测在将适体修饰的NP暴露于加压素后，该位置产生TAMRA信号强度的最大差异。
采用两种方法对加压素适体修饰的NP的应答进行了研究。第一种通过将该系统暴露于加压素后观察到的改变，与将该系统暴露于催产素和物质P(与加压素的长度、尺寸和质量相似，但序列不同的神经肽)后观察到的改变进行比较，确定了基于适体的测定对靶分子进行区分的能力。第二项研究通过对使用具有仅由染料修饰适体组成的表面单层的NP，以及具有MCP或MCH的适体观察到的应答进行比较，确定了表面修饰的影响。
对三种蛋白应答的比较表明基于加压素适体的SERS测定对靶分子具有选择性(图4，版块A)。将适体修饰的NP暴露于浓度范围为从1nM至10μM的加压素显示出在拉曼光谱中1355cm-1处特征峰强度的线性增加。对暴露于类似浓度范围的催产素的应答进行检测时的情况并非如此，在所选定特征峰的强度与分析物的浓度之间几乎没有相关性。将该系统暴露于物质P后显示在浓度与特征峰强度之间存在一些相关性，但是该相关性不及使用加压素所观察到的。令人惊奇的是，MCP的存在显著增加光谱特征峰的强度，MCP旨在作为能够对拉曼信号的强度进行定量的内部标准品(图4，版块B)。已在加入MCH后观察到了在向单层加入第二种化合物后增强的这种作用。然而，在该设置中加入MCH未增加光谱特征峰的强度，并且抑制应答特征，其在VP浓度与特征峰强度之间无相关性。
除了使用适体修饰的NP对结构相似的激素分子(如，催产素和加压素)进行区分以外，我们的努力集中在提高光谱特征强度的重现性上，这是应用基于拉曼的分析常见的问题。重现性问题(特别是使用干燥样品时)通常与“热点”的存在或分析物所处的两个拉曼活性NP连接处的区域相关，其导致适体研发所针对的靶标出现异常大的信号增强。
实施例1-4的参考文献
(1)Hoon,S.等，BioTechniques2011,51,413.
(2)Stoltenburg,R.等，J Anal Methods Chem2012,2012,14.
(3)Schütze,T.等，PLoS ONE 2011,6,e29604.
(4)Latulippe,D.R.等，Anal.Chem.2013,85,3417.
(5)Leona,M.Proc.Natl.Acad.Sci.2009,106,14757.
(6)O’Donnell,D.等，Submitt.Publ.2013.
(7)Navarro,J.R.G.等，Analyst 2013,138,583.
(8)Liu,J.等，Nat.Protoc.2006,1,246.
(9)Thompson,D.G.等，Anal.Chem.2008,80,272805.
(10)Dougan,J.A.等，Nucleic Acids Res.2007,35,3668.
(11)Hurst,S.J.等，Anal.Chem.2006,78,8313.
(12)Cao,Y.C.等，Science 2002,297,1536.
(13)Yang,J.等，ACS Nano 2013,7,5350.
II.用于检测莱姆病的试剂和方法(实施例5-8)
莱姆病是由多种由蜱传播的病原体(如，革兰氏阴性螺旋体包柔螺旋体)引起的，并由硬蜱物种传播。其是美国主要的媒介传播的感染性疾病，每年报告的病例数稳步上升(CDC-国家病例–莱姆病http://www.cdc.gov/lyme/stats/chartstables/reportedcases_statelocality.html(2013年11月18日访问))。尽管在流行地区出现经典的莱姆病症状牛眼疹(游走性红斑或EM疹)即可立即开始治疗而无需进行诊断检测，但是有多达20％莱姆病病例未出现或未发现EM疹便继续发展出更不易于诊断的二期症状(Biesiada,G.等，Arch Med Sci 2012,8,978)。
目前CDC批准的诊断检测是由酶联免疫吸附测定(ELISA)以及随后的免疫印迹(IB)分析组成的双层级系统(Ellis,D.I.等，Analyst 2013,138,3871；Wu,X.等，Analyst 2013,138,3005)。检测的第二层级IB分析昂贵、耗时，且在技术上具有挑战性。双层级血清学莱姆病检测方案的固有缺陷包括解释结果的复杂性和抗体的生产对感染后时间的依赖性(DeBiasi,R.L.等，Current Infectious Disease Reports 2014,16,450)。如果过早(感染后6-8周)或过晚(感染后4-6个月)进行检测，可能不存在可检测水平的抗莱姆病抗体。这对于莱姆病而言格外成问题，因为该疾病的症状如发热、关节痛和“脑雾”是非特异性的，且难以诊断。在临床领域上认为该检测是非常不可靠的，以致于初级护理医师不愿意下达进行该检测的处方，很多医师认为他们对于该疾病的经验以及与患者的互动是更为可靠的诊断方法。这是一个重大的临床缺陷：对莱姆病的准确诊断使莱姆病能够通过短期使用简单抗生素得到治疗，并且将避免与未经治疗病例相关的花费和痛苦。尽管最近开发出并且在美国使用了很多血清学莱姆病检测，但是新的检测由于存在的抗原不足而显示出类似水平的假阳性和/或附加的假阴性(Wu,X.等，Analyst 2013,138,3005)；尚无能够代替已建立的、经CDC批准的双层级检测形式的方法。
灵敏度较低一直困扰着上述经CDC批准的检测，在作为对现行方案的改进而提出的检测中尚未对这一缺陷着手处理。无论测定系统的灵敏度较低是由于包柔螺旋体的免疫抑制性质、蜱虫媒介所分泌的物质，还是由于其他未知因素所造成的，很清楚的一点是在人血液或血清中检测莱姆病病原体包柔螺旋体，以及其他蜱传播病原体的高灵敏度测定方法，将为一线临床医生提供一种抗击这种疾病的宝贵工具，一种目前无法获得但是迫切需要的工具。
实施例5
针对包柔螺旋体表面蛋白OspA的适体选择
通过使用专门设计和制造的微柱产生了新的、高亲和性莱姆病特异性适体(图7，版块A)。这些柱用与靶标缀合的琼脂糖小珠或空白琼脂糖小珠(用于阴性选择)填充。可以将柱串联或并联运行，使其能够同时高效地对针对多个靶标选择适体。图7，版块B中所示的示意图说明了对RNA适体的选择，尽管可以通过简单地省去逆转录和转录步骤，使该系统适用于产生单链DNA适体。
适体研发过程利用称为经由双循环SELEX的RNA适体分离(RAPID-SELEX)的流水线适体选择过程进行，该方法省去了不必要的DNA扩增和纯化步骤(Szeto,K.等，PLoS ONE 2013,8,e82667)。RAPID-SELEX使得适体库从一组柱上洗脱后能够直接加入第二组柱，无需在各轮选择之间进行DNA扩增，避免了在各奇数轮后进行PCR扩增(Szeto,K.等，PLoS ONE 2013,8,e82667)。省去了每隔一轮的扩增和纯化步骤将各轮适体选择的平均时间缩短了约50％，将整个选择过程所需的时间缩短了67％至75％。
由康奈尔大学的生物技术资源中心(BRC)和生物信息中心联合使用高通量、新一代DNA测序(NGS)确定每轮微柱SELEX中选择的适体序列。Illumina NGS仪器每次运行能够产生2x 107–2x 108条DNA序列，便于对SELEX过程富集的DNA序列进行高度准确的统计学分析。
使用上文所述的方法，选出了结合和检测OspA的DNA适体：SEQ ID NO：67-72。
表2：OspA适体
使用荧光各向异性确定针对OspA产生的适体的灵敏度。图8显示了表明OspA适体与OspA蛋白结合的荧光各向异性实验的结果。各向异性随着靶蛋白浓度的增加而显著增加表明这种OspA DNA适体针对OspA蛋白的Kd＝2.2nM。
使用相同的方法产生了特异于包柔螺旋体OspC和BmpA的适体并对其进行了测序和表征。
表3：OspC和Bmp适体
可以用EMSA和微板捕获测定对荧光各向异性进行补充，以确定DNA适体针对其靶点的结合亲和性。
实施例6
对OspA,OspC和BmpA适体与靶蛋白结合的表征
开发了用于对各适体与特定包柔螺旋体蛋白的结合亲和性进行检测和定量所必须的方法。可以使用多种方法证明靶标与潜在DNA适体寡核苷酸的结合。尽管电泳迁移率变动测定(EMSA)；荧光各向异性检测；DNA下拉测定；微板捕获测定可以用于确定适体对其靶标的亲和性，但是发明人有效地使用荧光各向异性确定针对OspA所产生的适体的灵敏度(图8)。简言之，针对浓度增加的靶标特异性适体，对荧光标记的靶蛋白(这里是OspA或OspC)进行测定。通过染料发射极化率的变化检测适体结合后荧光蛋白旋转速率的改变，提供了确定适体对其靶标的亲和性的迅速和可靠的检测方法。各向异性随着靶蛋白浓度的增加而显著增加表明OspA适体以约2.2nM的Kd结合。
当适体结合显著增加复合物的尺寸，结果导致溶液中的适体旋转速率显著降低时，荧光标记蛋白的各向异性检测是最有效的。尽管使用荧光各向异性有效地确定了OspA适体针对其靶标的Kd，但是其并不是适用于所有适体与靶点的相互作用。如果荧光各向异性未被证明是有效的，可以使用EMSA和微板捕获测定确定DNA适体针对其靶点的结合亲和性。
为了鉴定针对三个靶蛋白具有最高亲和性的适体，针对各包柔螺旋体蛋白合成和筛选了多达六个最常见的适体序列。浓度范围为0.1nM至100nM的莱姆病特异性适体用于这些实验；认为<1nM至5nM的结合亲和性足够使用。在实施例7和8中使用针对其特异性靶标具有最高亲和性的1号和2号适体。
实施例7
通过SERS对包柔螺旋体蛋白进行检测
用实施例5中优化的巯基化适体对纳米颗粒进行修饰(ApNP)，以用于捕获和检测包柔螺旋体特异性OspA、OspC和BmpA蛋白。使用简单的、已建立的文献方法合成Ag纳米颗粒，该方法包括在微波辐射下用柠檬酸钠还原硝酸银溶液(Leona,M.Proc.Natl.Acad.Sci.2009,106,14757)，或者从商业渠道购买Au NP(例如Ted Pella；Redding,CA或Nanopartz；,Loveland,CO)。
通过标准的巯基-金属相互作用用适体进行表面修饰，并使用等式1计算适于靶NP尺寸的适体的浓度(Taton,T.A.In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry；John Wiley&Sons Inc.:New York,2002)。
适体的量＝Anx Cn x Do x V (1)
An＝NP表面积(cm-2)；Cn＝颗粒浓度(颗粒L-1)；Do＝Ap密度(mol cm-2)；V＝反应体积(L)
为了确定表面修饰的效能，在Mirkin及其同事研发的荧光定量技术中使用荧光团修饰的莱姆病特异性适体(Demers,L.M.等，Anal Chem 2000,72,5535)。
用作为靶分子的替代物的拉曼活性染料修饰实施例5中研发的适体。其示意图见图9，版块A(图片来自Baker,B.R.等，J.Am.Chem.Soc.2006,128,3138)。为了证明这一原理，用TAMRA对被开发用于靶向加压素的适体进行修饰，TAMRA是已知具有强拉曼信号的分子(图10)(Cao,Y.C.等，Science 2002,297,1536)。拉曼信号强度随着加压素浓度的增加而增加，证明了将拉曼活性染料作为靶分子替代物的原理。将这种TAMRA修饰的适体暴露于相似的多肽(即，物质P和催产素；数据未显示)不导致拉曼信号强度的显著增加，表明基于适体的SERS检测方法能够检测其靶标并将靶标与结构非常相似的分子区分开。
图9，版块B显示了染料修饰的适体作为识别元件的原理，染料在序列中的位置以及染料的特性能够提供针对莱姆病相关蛋白的最佳灵敏度。用拉曼活性标记物在末端位置和多个内部位置对实施例5中研发的每个适体进行修饰。选择具有高信号强度和独特的光谱特征的染料(例如FAM、Cy3、Cy 3.5、Cy5和TAMRA)(图10)(Cao,Y.C.等，J.Am.Chem.Soc.2002,125,14676)使其易于被识别。在寡核苷酸合成过程中使用市售试剂将拉曼活性染料引入适体DNA序列。
首先使用研究级仪器进行拉曼研究以优化光谱方法。然后使用市售的便携光谱仪，使用785nm入射光(市售的台式或手持式便携拉曼光谱仪的常用波长)对这些方法进行重新测试。
各适体修饰的NP暴露于含有其设计针对的包柔螺旋体特异性蛋白中的一个的溶液中，使适体捕获该靶点。在存在并非研发的适体所针对的包柔螺旋体蛋白的条件下，对每个Ap NP重复这一过程，以确定Ap NP针对其靶分子的特异性。为了优化靶向捕获的孵育条件，研究了三个变量：NP表面的适体浓度，旨在稳定和优化拉曼光谱特征的添加物的浓度和组成，以及Ap NP与靶代谢物的孵育时间。研究了NP表面的适体浓度和孵育时间的最佳组合，以确定各分析物的检测限。将在这些研究中确立的检测限与已建立的标准生物学测定(如，市售莱姆病免疫测定法(例如，ELISA))的灵敏度进行比较，提供能够与后续研究进行比较的数值。
可以进行其他表面修饰。例如，表面修饰可以包括PEG，用以涂覆纳米颗粒表面未被适体覆盖的部分。另选地，表面修饰可以包括烷基硫醇。
实施例8
对人莱姆病血清盘中的包柔螺旋体蛋白的快速检测
同在威尔康奈尔医学院的临床和转化科学中心和联合临床试验办公室合作对人莱姆病血清盘中的包柔螺旋体蛋白进行了快速检测。人血清盘获取自两个独立的来源：从SeraCare购买获得的莱姆病血清盘，该公司提供多种感染性和其他疾病状态的人血清盘(www.seracare.com/Products/Panels)；以及来自US CDC的莱姆病血清盘(Molins,2014doi:10.1128/JCM.01409-14)。这些血清盘包括来自未感染个体以及被包柔螺旋体感染的处于疾病不同阶段个体的血清。这些血清盘是临床前检测的理想选择。
对于这些研究而言，将5-10μL人血清(阴性对照或莱姆病阳性样品)用缓冲液稀释并与实施例6中所述的Ap NP混合。在Ap NP与包柔螺旋体靶蛋白结合后，将样品分成两半；一份在台式拉曼光谱仪上进行SERS分析，保留第二份用于使用市售包柔螺旋体免疫测定法进行的分析。上述血清盘包含来自未感染个体的血清并将其用作阴性对照。在这些研究中，对多个变量进行了直接研究，包括：最佳结合所需的时间；最佳信号所需的Ap NP浓度；检测包柔螺旋体蛋白所需人血清的最小量；以及OspA、OspC和BmpA测定的相对灵敏度。确定了基于SERS的包柔螺旋体测定的灵敏度和特异性。使用了多种统计学分析以确定优化人体内的包柔螺旋体检测所需的最佳诊断模型和截止值。
对来自感染的肩突硬蜱蜱虫的包柔螺旋体蛋白的快速检测
将实施例5、6和7中开发的测定方法用于阐述对感染的肩突硬蜱体内的包柔螺旋体的检测。使用获取自两个独立来源的蜱虫。对照的、未感染的肩突硬蜱若虫购自俄克拉荷马州立大学的蜱虫饲养机构。该蜱虫饲养机构是有偿服务机构，其提供供研究应用的处于各生命周期阶段的未感染的、实验室繁育的蜱虫。
与康奈尔大学自然资源系合作采集野生的感染包柔螺旋体的蜱虫。研究了环境条件对肩突硬蜱在其栖息地存活情况的影响。按照下述采集蜱虫：在五月至七月间其季节性活动的高峰期从野外采集肩突硬蜱的若虫(Falco,R.C.等，Am.J.Epidemiol.1999,149,771)。使用完善的拖拽取样法采集：将一片面积为一平方米的白布拖拽到森林中的植被和落叶之上(Schulze,T.L.等，J.Med.Entomol.1997,34,615)。这种布模拟了肩突硬蜱附着至的动物毛发纤维。在将其用于进一步分析之前，将若虫在卡瑞研究所于-80℃下保存。卡瑞研究所的研究表明多达55％的在纽约哈德逊河谷采集的肩突硬蜱若虫感染了包柔螺旋体(Aliota,M.T.等，Vector Borne Zoonotic Dis.Larchmt.N 2014,14,245)。
将5至10个实验室繁育或采集的蜱虫的若虫置于微量离心管中，并且在裂解缓冲溶液中用一次性匀浆器将其匀浆裂解。蜱虫破裂后，立即将匀浆试样迅速离心以除去碎片，并将提取物与实施例7中所述的Ap NP混合。在Ap NP与包柔螺旋体靶蛋白结合后，将样品分成两半；一份在台式拉曼光谱仪上进行SERS分析，保留第二份用于使用市售包柔螺旋体免疫测定法进行的分析。将获取自俄克拉荷马州立大学蜱虫饲养机构的实验室繁育的蜱虫若虫作为阴性对照。
对多个变量进行了直接研究，包括：最佳结合所需的时间；最佳信号所需的Ap NP浓度；检测Osp蛋白所需感染若虫的最少数量；以及OspA、OspB和OspC测定的相对灵敏度。确定了基于SERS的包柔螺旋体测定的灵敏度和特异性。
参考文献的并入
在整个申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请以及附图和序列表的内容通过引用整体并入本申请，如同每个独立的出版物或专利具体、独立地通过引用并入。如有冲突，以本申请(包括本申请中的任何定义)为准。
等同物
本领域技术人员将理解，在不脱离如所附权利要求所示的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上对本发明进行各种改变。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本申请所述发明的具体实施方式的许多等同物。虽然已经讨论了本发明的具体实施方式，但是上文的说明书是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书之后，对本领域的技术人员而言，本发明的许多变化可以变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求及其等同物的全部范围，以及说明书及其同样的变化来确定。此类等同物旨在被下述权利要求所包括。
