一种捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种快速捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法的专利申请。
背景技术
自2001年2月人类基因组计划草图发表、2007年个人基因组全基因组序列的测序完成以来，分子生物学进入了后基因组时代。后基因组时代一个重要目标就是注释基因组序列，鉴定人类所有遗传功能原件，并且构建基因组的复杂调控网络。为此，2003年美国科学家启动了一个“DNA元件百科全书”计划（Encyclopedia of DNA Elements，简称ENCODE），其目标之一是找到人类基因组中所有的功能原件。
众所周知的是，生物分子功能是由其结构所决定的，功能元件在调控其靶基因时，在空间上需要和其靶基因形成特定的三维结构才能发挥其调控作用。因此，通过分析细胞核内染色质的空间结构，可以极大帮助我们了解DNA片段的功能，以及基因的表达调控模式。
现有关于染色质短片段之间相互作用位点研究方法主要有下列几种：1、荧光原位杂交技术，2、染色体构像捕获技术（3C），3、依赖基因芯片进行的构像捕获技术（4C），4、Hi-C高通量延伸技术(3C)，5、染色体免疫吸附-3C技术（ChIP-3C），6、蛋白质介导的位点之间检测方法（ChIA-PET）。其中染色质构象捕获技术是一种通过定量手段(PCR产物的有和无、产量的高和低)来对DNA之间是否存在相互作用进行定性研究的技术方法，其主要操作技术包括甲醛交联、限制性酶切、稀释和连接、解交联、DNA纯化与PCR鉴定等方面。具体操作时，通过一对分别与选定的2段DNA配对的引物进行PCR扩增，通过PCR产物的有无、产量的高低等，就可以对是否存在相互作用进行初步的定性判断。
但总体而言，由于研究对象不同，基于染色质构象捕获技术进行染色质短片段之间相互作用位点进行分析和研究时，其操作方法和具体结果也并不完全相同，因而需要进一步加强研究。
发明内容
本申请以染色体构象捕获技术为基础，以HeLa S3细胞系为模型，构建了一种快速捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法，从而为基因表达调控、DNA片段功能研究奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下，一种捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法，以HeLa S3细胞系为分析对象为例，具体包括如下步骤：
（1）细胞周期同步化培养，对HeLa S3细胞系进行培养，使细胞周期同步化；
（2）提取细胞核：对步骤（1）中同步化后HeLa S3细胞进行甲醛交联、甘氨酸解交联处理后，细胞裂解液裂解细胞，离心收集细胞核；
（3）制备测序文库：
对步骤（2）中所提取细胞核进行MboI酶切；
在上述酶切产物中加入biotin-11-dUTP 、dCTP、 dGTP 、dATP和Klenow Fragment进行生物素化反应处理后，用连接酶进行连接；
利用蛋白酶K对连接反应液进行消化以解交联；
提取DNA，电泳并回收400~1000bp片段；
向所回收片段中加入dNTP和Klenow Fragment (3’→5’exo-)进行反应，反应结束后，加入连接酶、3’端‘T’突出的Pair-end adapter1和Pair-end adapter2（双端测序连接体1和双端测序连接体2），继续反应；
用磁珠吸附法去除不含生物素标记的DNA，并收集生物素化的DNA备用；
（4）扩增测序文库：
50μL反应体系设计如下：
0.4 Mm PE引物，0.2 mM dNTPs，1.25U Ex Taq DNA聚合酶，5 μL DNA模板，ddH2O加至50μL；
具体PE引物序列设计如下：
PE PCR Primer 1.0：
5' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，
PE PCR Primer 2.0：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3'；
PCR反应后，对PCR扩增产物进行电泳，并染色分析，同时回收产物进行测序分析；
（5）测序比对和分析定位：根据测序结果，与人类基因组集合进行比对分析。
随着人类基因组测序工作的结束，现有分子生物学家研究重点早已开始转向功能基因组研究，并着重于特定基因组功能片段的分析和研究。由于很多功能元件在染色质座位上远离其靶基因，因而为我们发现和鉴定这些功能元件带来了较大困难。但是功能元件在调控其靶基因时，其在三维空间上则应接近或接触其靶基因，而这也为我们发现和鉴定这些功能元件带来了可能。
Hela S3(人宫颈癌细胞)细胞系，最早于1955年由Puck TT、Marcus PI和Cieciura SJ建系，含HPV-18序列，是一种用于与哺乳类动物的染色体突变、细胞营养等相关方面研究的模式细胞。本申请以HeLa S3细胞系为模型，利用染色质构象捕获技术，对HeLa S3细胞系的染色质在空间上的相互作用位点进行了初步捕获和分析，为寻找HeLa S3基因组中潜在的调控元件奠定了基础。
尽管染色体构想捕获技术及其衍生技术在解析染色质构象和研究基因表达调控机制已经得到了充分验证，但尚未见到该技术较好用于Hela S3细胞系分析的报道。本申请中，借助于染色体构想捕获技术，可以较好发现特异性的染色质与染色质之间的相互作用片段，而这些特异性相互作用可为基因的表达调控分析奠定基础，同时对于染色质的三维结构分析奠定基础。
本申请由于测序深度不够充足，因而对于相互作用位点数量产生数量上存在一定缺陷。但总体而言，对于方法的特异性却得到了较好验证。随着测序深度的增加，在分析染色质短片段与短片段相互作用方面相信会有更好的结果呈现。
附图说明
图1为对Hela S3细胞中人类基因组中染色质短片段之间相互作用位点的综合分析图。
具体实施方式
在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备情况简要介绍说明如下。
生物材料：
细胞株：HeLa S3，购买于北京协和细胞库；
相关引物合成及测序工作由上海生工生物工程有限公司完成提供；
主要试剂：
37%甲醛、PCR产物纯化试剂盒（NA1020），美国Sigma公司产品；
PCR胶回收试剂盒，美国Invitrogen™；
甘氨酸，北京化工厂产品；
胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美国HyClone公司产品；
RPMI 1640培养基，美国Gibco公司产品；
MboI、Klenow Fragment (3’→5’exo-)、T4 DNA连接酶，美国NEB公司产品；
Biotin-11-dUTP，立陶宛Fermentas公司产品；
主要仪器：
凝胶成像仪、PCR仪，均为ThermoFisher公司产品。
实施例1
在介绍具体实施例前，就本申请中部分生物学概念明确如下。
染色体与染色质：染色体由DNA和蛋白质组成的、一般存在于细胞核中的DNA载体；染色体和染色质是同种物质在不同时期的两种表现形式，两者是同种物质；一般细胞核中是以细丝状的染色质状态存在的，在细胞有丝分裂前期，染色质高度螺旋化变粗变短成为染色体。
基因与基因位点：基因是DNA上具有遗传效应的片段，DNA上的基因呈线性排列，有的片段有遗传效应，有的没有，而具有遗传效应的DNA片段才叫基因；基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。
本实施例所提供的快速捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法，以HeLa S3细胞系为分析对象，具体包括如下步骤。
（1）细胞周期同步化培养，对HeLa S3细胞系进行培养，使细胞周期同步化；具体而言：
用含10% FBS的BRMI 1640 培养液，在培养箱中37℃条件下培养HeLa S3细胞；再用无血清的培养液（BRMI 1640 培养液）过夜培养HeLa S3细胞，使细胞周期同步化。
（2）提取细胞核：对步骤（1）中同步化后HeLa S3细胞进行甲醛交联、甘氨酸解交联处理后，细胞裂解液裂解细胞，4℃离心收集细胞核；具体而言：
对步骤（1）中同步化后HeLa S3细胞进行离心（1000rpm 离心5min），收集同步化后细胞，并用PBS洗涤；然后加入终浓度2%的甲醛，常温放置10min以进行甲醛交联；
在上述甲醛交联后反应体系中加入终浓度为0.1M/L的甘氨酸，4℃下静置5min以进行解交联处理；
细胞计数后，用细胞裂解液(10mM的Tris （pH=8.0），10mM NaCl，0.4% NP-40，蛋白酶抑制剂PMSF，1mM/L)对上述甘氨酸解交联后反应体系内细胞进行裂解；
裂解完成后，4℃、4000rpm离心5min收集沉淀，即为细胞核。
（3）制备测序文库：
在步骤（2）所提取细胞核中，按1×106个细胞（细胞核）中加入100 U 的MboI酶的比例，进行酶切过夜；
在上述酶切过夜产物中加入终浓度为0.1mM 的biotin-11-dUTP 、dCTP、 dGTP 、dATP（每个物质的终浓度均为0.1mM）和Klenow Fragment （15 U），37℃水浴1h以补平缺口，再用T4 DNA连接酶（l40 U）进行连接（16℃连接4h）；
向连接反应液中加入终浓度为0.5μg/μL的蛋白酶K，55℃消化过夜以解交联；
酚氯仿抽提DNA，对抽提物进行2%琼脂糖胶电泳，回收400~1000bp片段。
向所回收片段中加入终浓度为0.1mM的dNTP、15U的Klenow Fragment (3’→5’exo-)， 37℃水浴30min；
水浴结束后，加入l000U的T4 DNA连接酶、终浓度为1μM的3’端‘T’突出的Pair-end adapter1和Pair-end adapter2（双端测序连接体1和双端测序连接体2，浓度分别均为1μM）， 16℃水浴过夜。
l×Binding & Washing 缓冲液冲洗磁珠后，加入100μL的生物素化DNA（即，上述处理后DNA），轻轻旋转1h；
然后用磁力架吸附磁珠，去除不含生物素标记的DNA，再加热释放生物素化的DNA（95℃，5min）收集所释放DNA备用。
（4）扩增测序文库：
在50μL反应体系中加入0.4 Mm PE引物，0.2 mM dNTPs，1.25U Ex Taq DNA聚合酶，5 μL DNA模板（步骤（3）最终所收集DNA）；
具体PE引物序列设计如下：
PE PCR Primer 1.0：
5' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，
PE PCR Primer 2.0：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3'；
98℃变性30s后，再根据下列条件进行PCR：98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸60s，18个循环后，72℃延伸5min。
对部分PCR扩增产物样品进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后进行Goldview II染色，用凝胶成像仪分析。
同时，对部分PCR扩增产物样品回收后，进行高通量测序，测序时采用50bp PE测序。
（5）测序比对和分析定位：根据测序结果，与人类基因组集合进行比对分析。
根据测序结果，与人类基因组集合数据库（数据库hg18，ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/H_sapiens/GFF/）进行比对分析。比对分析时，理论而言：两个染色质片段距离越远其随机连接概率越小，因此，为了增加结果的阳性率，我们只选择分析各染色质之间的相互作用情况。
在将测序结果与人类基因组集合数据库（hg18）比对后，去除能比对到基因组的多位置读序，最终得到17911349个读序，其中能比对到不同染色体的读序3764336对，占可用分析序列的42.03%，这些序列覆盖了250282不同染色质相互作用位点。
以相互作用位点次数大于2作为特异相互作用位点，最终一共捕捉到40047个相互作用位点。这些位点相互作用情况见图1，其中低可信度相互作用位点（相互作用次数小于20）共34229个；中可信度相互作用位点（相互作用次数小于50），共2293个；高可信度相互作用位点（相互作用次数小于500），共2443个；特异性相互作用位点（相互作用次数大于500），共1082个。
对这40047个相互作用位点进行注释，最终统计结果如下表所示：
不同元件之间相互作用次数
。
对上表分析可以看出，捕获到最多的是功能片段基因（基因参与相互作用30347次），这表明染色质在细胞核内折叠模式是以基因为中心，而基因周围围绕着许多调控元件；其次是重复序列（重复序列参与相互作用19679次），表明有的重复序列跟基因的转录活性、以及与维持染色质的三维构象有关。
序列表
<110> 漯河医学高等专科学校
<120> 一种捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工设计(PE PCR Primer 1.0)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工设计(PE PCR Primer 2.0)
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc tcttccgatc 60
t 61
