一种高通量测序接头、其制备方法及其在超低频突变检测中的应用
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种高通量测序接头、其制备 方法及其在超低频突变检测中的应用。
背景技术
随着高通量测序技术的逐步成熟，其应用的领域也越来越广泛，从产前筛 查到肿瘤的诊断，而且随着精准医疗的推进，基因测序作为精准医疗的前端， 行业面临爆发性的增长机遇，但同时在实际操作中也面临一定的挑战。肿瘤是 高度异质性的，其中致病突变可能以极低比例存在，比如小于0.1％～0.01％，甚 至更低，而目前最准确的高通量测序本身的单个碱基的错误率就在0.2％左右， 再加上众所周知的DNA聚合酶的固有错误率(10-7～10-5)，因此，目前常规的建 库方法是不可能做到1％甚至是更高的检测精度的，而这种误差使得我们很难检 测到一些低频的变异(小于1％)。尽管目前已经有多种针对低频突变的改进的 建库测序方法，但在实际应用中还是存在许多的局限性。
目前针对低频突变的检测方法大致分为个性化建档深度测序分析方法 (Cancer Personalized Profiling by deep sequencing，以下简称CAPP-seq)、单分 子滚环扩增(circle sequencing)、环化单分子扩增和重测序检测(Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology，以下简称cSMART) 三类。
CAPP-seq的实验流程并没有进行大的改动，只是在深度测序的前提下对信 息分析流程进行了一些优化，通过对双端测序的重叠部分的原始reads进行重叠 序列矫正降低测序错误率来提高检测精度，但是这种方法并不能消除实验方法 带来的错误。
单分子滚环扩增技术利用单分子滚环复制的形式对模板分子进行多次扩 增，形成一种来源于同一模板的序列连接在一起的长链，将长链进行打断处理 后进行文库的构建，随后对这些来源于同一模板的扩增子进行测序，通过后期 的信息分析方法对这些来源于同一模板的扩增产物进行分析来降低测序以及实 验带来的错误。但是这种方法应用有两个限制点：1)单链分子环化效率较低， 对于微量样本会造成模板丢失；2)需要比较长的测序读长。
cSMART技术由贝瑞和康自主研发(国际专利，专利号US 20140234850A1)。 该技术首先在全部循环肿瘤DNA片段两端添加带有标签序列的特制接头，然后 将添加接头的循环肿瘤DNA片段环化，在突变位点附近设计背靠背式引物进行 反向PCR扩增，富集目标DNA片段，获得线性化的PCR扩增产物，对扩增后 产物进行高通量测序，测序后的序列有3种：(1)起止位点和标签序列均相同 的序列，识别为原始血浆中同一条游离DNA片段经PCR扩增获得的产物，只 进行一次计数；(2)起止位点相同但标签序列不同的序列，识别为原始血浆中 不同的游离DNA片段，进行分别计数；(3)起止位点不同的序列，识别为原始 血浆中不同的游离DNA片段，进行分别计数。采用这样的计数方法即可准确识 别携带有基因突变的循环肿瘤DNA序列，并将测序结果还原回血浆原始循环肿 瘤DNA片段数量，但是这种方法应用有以下几个限制点：1)因需要通过反向 PCR扩增富集目标DNA片段，所以仅能针对已知位点的基因变异；2)在同一 管中扩增多个位点时，引物设计比较困难；3)实验流程繁琐。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高通量测序接头。
本发明的另一个目的在于提供一种高通量测序接头的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供高通量测序接头在超低频突变检测中的应 用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种高通量测序接头，所述接头为Y字型接头，所述Y字型接头包括第一 链和与所述第一链部分互补的第二链，所述第一链包括文库扩增引物序列A、 测序引物序列、单链来源区分序列和GT碱基，所述第二链包括C碱基、与所 述第一链互补的单链来源区分序列、与所述第一链部分互补的测序引物序列、 模板来源区分序列、样本区分序列和文库扩增引物序列B。
本技术方案中测序接头包含有模板区分序列和单链区分序列，根据模板来 源序列可以将测序reads归结为同一分子家族，根据单链来源区分序列可以将同 一分子家族的序列分为正义链的一组和负义链的一组，根据突变出现的位置可 以剔除目的DNA分子在PCR扩增中引入的错误、测序过程中引入的错误，从 而提高突变检测的精度。
作为本发明所述高通量测序接头的优选实施方式，所述单链来源区分序列 为随机序列。
作为本发明所述高通量测序接头的优选实施方式，所述模板来源区分序列 为随机序列。
作为本发明所述高通量测序接头的优选实施方式，所述单链来源区分序列 的长度为2～6bp。
作为本发明所述高通量测序接头的优选实施方式，所述模板来源区分序列 的长度为2～4bp。
作为本发明所述高通量测序接头的优选实施方式，所述第一链的核苷酸序 列为：5＇－AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTNNGT－3＇；
所述第二链的核苷酸序列为：5＇－CNNAGATCGGAAGAGCAC ACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG －3＇；
其中，NN表示单链来源区分序列；第二链中TCAC右边的4个N所形成 的序列表示模板来源区分序列；ATCT左边的4个XXXX所形成的序列表示样 本区分序列，即index序列，样本区分序列对每一个样本来说是固定的；随机碱 基N为A、T、C、G中的任何一种。
本发明还提供一种上述高通量测序接头的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计高通量测序接头的两条单链序列；
(2)合成两条所述单链序列；
(3)将合成的两条所述单链序列进行特异性退火，得到双链的测序接头；
(4)将多对步骤(3)制备的测试接头进行等比例混合，得到混合的高通 量测序接头。
上述高通量测序接头的制备方法简单，无繁琐的实验过程。
本发明还提供一种构建超低频突变测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括测 序接头，所述测序接头为上述任一项测序接头。
本发明还提供一种超低频突变测序文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)采用上述试剂盒构建全基因测序文库；
(2)对全基因测序文库进行杂交捕获，得到含有目的片段的测序文库；
(3)对捕获后含有目的片段的测序文库进行扩增，得到目的文库。
上述技术方案中采用所述测序接头在测序文库构建实验流程上完全没有改 动，操作简单方便，无需进行优化条件。
本发明还提供一种超低频突变的检测方法，根据以上所述方法构建超低频 突变测序文库，上机测序，获得测序数据，对测序数据进行变异位点分析，获 得变异位点数据。
上述超低频突变的检测方法根据模板来源序列可以将测序reads归结为同一 分子家族，根据单链来源区分序列可以将同一模板的序列分为正义链的一组和 负义链的一组。突变位点数据可以分为以下三种情况：1)在一个分子家族中的 正义链组或者负义链组只出现一次、或者少数几次的突变，而且互补的负义链 组或者正义链组没有出现同样的突变，这说明这种突变是随机错误，或者是PCR 过程中后引入的复制错误，或者是测序机器判读碱基有误，说明样本在该位置 没有突变；2)在一个分子家族中的正义链组或者负义链组统一出现，但在与之 互补的负义链组或者正义链组不出现，这说明这种突变是在PCR的第一个循环 中引入的复制错误，或者是非对称突变；3)在分子家族中的正义链组或者负义 链组统一出现，而且与互补的负义链组或者正义链组出现对应的突变，这说明 这种突变是真的、可信的，从而能够排除文库扩增或者测序判断有误导致的突 变，提高检测的精确度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本技术方案中测序接头包含有模板区分序列和单链区分序列，根据模 板来源序列可以将测序reads归结为同一分子家族，根据单链来源区分序列可以 将同一分子家族的序列分为正义链的一组和负义链的一组，根据突变出现的位 置可以剔除目的DNA分子在PCR扩增中引入的错误、测序过程中引入的错误， 从而提高变异检测的精度。
(2)使用本发明的测序接头在测序文库构建实验流程上完全没有改动，操 作简单方便，无需进行优化条件。
附图说明
图1为文库T778(1％频率)的2100检测图。
图2为文库T779(0.1％频率)的2100检测图。
图3为文库M778(1％频率)的2100检测图。
图4为文库M779(0.1％频率)的2100检测图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施 例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施 例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
一、接头序列制作
(1)设计合成序列
分别合成S1和S2序列，S1和S2各代表一组序列。
S1：(5＇-3＇)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTC CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNGT
S2：(5＇-3＇)：p*CNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA GTCACNNNNXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
备注：p*为磷酸化修饰
在S1序列中，包含2～6个随机碱基N组成的单链来源区分序列，因其位于 Y字型接头的双链互补区域，为了形成随机碱基N，则需要合成多条序列后混 合而成。随机碱基N，可能是A、T、C、G中的任何一种，若单链区分序列为 2个碱基，则需要合成42＝16条序列，若单链区分序列为3个碱基，则需要合成 43＝64条序列，依次类推。本实例以2个碱基的单链来源区分序列为例，合成如 表1所示的序列。
表1
在S2序列中，包含2个随机碱基N组成的单链来源区分序列，4个随机碱 基N组成的模板来源区分序列，4个碱基组成的index序列。index序列对每一 个样本来说是固定的，在本事例中参照Illumina Treseq 8个碱基的index序列， 取其中靠近3′端的4个碱基。模板来源区分序列虽为随机碱基N，但因为其位 于Y字型接头的单链部分，直接合成随机碱基N即可。而单链区分序列，位于Y字型接头的双链互补区域，为了形成随机碱基N，则需要合成多条序列后混 合而成。随机碱基N，可能是A、T、C、G中的任何一种，若单链区分序列为 2个碱基，则需要合成42＝16条序列，若单链区分序列为3个碱基，则需要合成 43＝64条序列，依次类推。本实施例以2个碱基组成的单链来源区分为例，以序 列TAGC作为index94序列，合成如表2所示的序列。
表2
备注：S2组的16条序列的5′端进行磷酸化修饰修饰。
(2)使用无核酸酶水对每条序列的粉末进行稀释，得到100μM浓度的母 液，分别取等量的互补配对的S1母液和S2母液于PCR管中，放置在ABI 2720 PCR仪上，95℃变性5min，后关闭PCR仪待其自然冷却到室温。
(3)将退火好的16种双链接头序列进行等比例混合，接头制作完成。
二、样本制备
本实例采用Horizon Discovery公司的商业化标准品Multiplex I cfDNA Reference Standard Set作为待检样本。Catalogue#：HD778为1％突变频率的 cfDNA标准品，Catalogue#：HD779为0.1％突变频率的cfDNA标准品，每个频 率的标准品各取等量2份，分别用商品化的Illumina Truseq接头和本发明的接头 进行后续的建库捕获测序。其中，各标签接头和样本以及文库标号的对应关系 为表3所示：
表3
三、捕获前文库构建
(1)末端修复及加A
1)在PCR管里按下表配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
表4
2)放入PCR仪，按下表设置程序进行反应
表5
(2)末端修复II
1)在上步PCR管里按表6配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
表6
2)放入PCR仪，20℃，15min。请勿加热PCR仪盖子或将PCR仪的盖子 打开。
3)纯化
将AmpureXP磁珠溶液从4℃冰箱取出，室温孵育30分钟，充分混匀。
在文库管中加入88μL(0.8×体积)混匀的AmpureXP，Votex混匀5s，室 温放置5min。
短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。
在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。
在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min至溶液澄清， 吸除乙醇。
重复上一步。
室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显 著下降)。
加入21μL Low EDTA TE，室温孵育5min，短暂离心，将管子放在磁力架 上，静置大约5min至溶液变澄清，吸出20μL上清液至标记好的新PCR管中。
(3)扩增连接上了adaptor的文库
1)在PCR管里按表7配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
表7
2)放入PCR仪，按表8设置程序进行反应。
表8
3)纯化
充分混匀AmpureXP磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。
在文库管中加入50μL(1x体积)混匀的XP beads，Votex混匀5s，室温放 置5min。
短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。
在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。
在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min让磁珠沉降 后，吸除乙醇。
重复上一步。
室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显 著下降)。
加入20μL Low EDTA TE，室温孵育5min，短暂离心，将管子放在磁力架 上，静置大约5min至溶液变澄清，吸出上清液至标记好的新PCR管中。
四、捕获文库构建
(1)文库定量混合
取1μL文库进行Qubit 3.0定量，获得文库浓度。取1μL进行2100检测片 段大小，结果如图1、图2、图3和图4所示。其中图1为文库T778(1％频率) 的2100检测图；图2为文库T779(0.1％频率)的2100检测图；图3为文库 M778(1％频率)的2100检测图；图4为文库M779(0.1％频率)的2100检测 图；
将所构建的4个文库，HD778的2个文库混合在一起，HD779的2个文库 混合在一起，每个文库混合250ng，计算得到各文库所用体积，如表9所示：
表9
通过上表中的文库出库量来看，本发明接头的出库量显著高于对照组的 Illumina Truseq出库量。
(2)杂交
在PCR管里按表10配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
表10
用真空抽干机进行浓缩，温度≤70℃，直至文库浓缩完全。
按照表11配制Hybridization Mix，对于每一个浓缩后的DNA文库，分别加 入13μL的Hybridization Mix。
表11
用枪上下吹吸8-10次，然后盖紧管盖，高速涡旋振荡5s，短暂离心将管壁 液体收集到管底，室温孵育10min。
放入PCR仪，95℃加热10min。
用另一台PCR仪设置杂交程序(热盖温度设置为75℃)：
表12
取下样本，迅速将4μL的探针加入到文库混合液中，用枪上下吹吸混匀8-10 次。
再次确认所有的管盖已经盖紧，高速涡旋振荡5s，短暂离心，然后放回到 已设置好杂交程序的PCR仪中进行过夜杂交。重要：务必保证管盖盖紧，最小 化减少杂交混合液体积的蒸发，否则将会影响杂交效果。
(3)捕获和洗脱
Dynabeads M-270Streptavidin beads,提前30min拿出涡旋混匀置于室温平 衡。
金属浴预热至65℃。
a)配置洗脱工作液：
b)按表13配置1×工作液
表13
按表14进行温育工作液
表14
其余工作液置于室温。
a)冲洗Dynabeads M-270Streptavidin beads：
每个文库取100μL涡旋混匀的Dynabeads M-270Streptavidin beads于 0.2mL低吸附离心管中，将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清液。
加入200μL 1×Bead Wash Buffer，吹吸8-10次混匀。将管子放在磁力架上， 至溶液变澄清后吸除上清液。
重复上一步。
加入100μL 1×Bead Wash Buffer，吹吸8-10次重悬磁珠。将管子放在磁力 架上，至溶液变澄清后吸除上清液。
注意：此步骤结束后立马进入下一步骤。
b)捕获：
将杂交后的文库转入Beads管中，吹吸8-10次混匀。
放入PCR上，65℃孵育45min，热盖温度设为75℃。每隔12min将文库 取出涡旋3s，保证磁珠悬浮。
c)洗脱：
加入100μL经过65℃预热的1×Wash Buffer I，轻柔涡旋，瞬离。把管子 放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。
加入200μL经过65℃预热的1×Stringent Wash Buffer I，用枪上下吹吸至 少10次让bead重新悬浮，避免产生气泡。在金属浴上65℃孵育5min。把管 子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。
重复上一步。
加入200μL室温放置的1×Wash Buffer I，涡旋2min，瞬离。把管子放在 磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。
加入200μL室温放置的1×Wash Buffer II，涡旋1min，瞬离。把管子放在 磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。
加入200μL室温放置的1×Wash Buffer III，涡旋30sec，瞬离。把管子放 在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清液。
最后一遍冲洗完成后，短暂离心，再次置于磁力架上，确保所有的Wash Buffer被吸除。
加入20μL nuclease-free water，用枪上下吹吸至少10次让bead重新悬浮。
(4)杂交捕获后的PCR扩增
AMPure XP bead提前30min拿出涡旋混匀置于室温平衡。
在冰上按照表15体系配制PCR反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。
表15
确认将含有磁珠的反应液混匀后，将管子放入PCR仪中进行扩增，注意更 换管盖，PCR仪参数设置如表16所示。
表16
(5)纯化
充分混匀AMPure XP bead悬浮液，直至悬浮液颜色均一。
向PCR管中加入75μl(1.5X体积)混匀的AMPure XP bead悬浮液和PCR 扩增后的DNA文库，Votex混匀，室温放置5min。
短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约3min至溶液变澄清。
在磁力架上小心地吸除管中的上清液，枪头不要碰到磁珠。
在磁力架上，在每个管中分别加200μL 80％乙醇，静置1min至溶液澄清， 吸除乙醇。
重复上一步。
室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显 著下降)。
加入20μL nuclease-free water，在votex上混匀，室温放置5min。
短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。
吸取大约20μL上清液到一个新的标记好的1.5mL管中。
取1μL样品进行Qubit 3.0定量。取2μL样品进行qPCR定量。
五、库检上机
文库库检合格后上机，上机平台选择Illumina平台的Nextseq 500测序仪， 测序策略为PE150，双端index测序，每个文库的数据量为2G。
六、数据分析
针对测序仪下机数据，结合样本信息表，采用Illumina bcl2fastq(v2.17)转 换软件，将Base calling文件转换成FASTQ格式文件。在总的FASTQ文件中进 行样本标签识别并拆分样本，同时进行随机分子标签的识别。对得到的序列进 行质控过滤后，采用BWA工具比对参考基因组。比对结果结合分子标签序列做 进一步的去除冗余分析。各个样本的质控数据分析结果见表17：
表17
上述结果表明，与对照的Illumina Truseq接头相比，使用本发明的接头减少 接头污染，提高可用数据的比例，此举降低了检测的成本。
通过唯一比对序列进一步分析样本的突变情况，并和预估值进行比对，结 果如表18所示：
表18
从表18中可以看出，实施例1的方法在1％突变频率标准品HD778的检测 中，本发明的接头和Illumina Truseq的接头都可以检出阳性位点，但本发明的接 头检测盒的突变位点频率与期望值具有很好的一致性；在0.1％突变频率标准品 HD779的检测中，本发明的接头检出全部的阳性位点，而IlluminaTruseq的接头 则未检出阳性位点。上述结果表明，本发明的接头制作简单，不改变现有的建 库流程，且能够检测低至0.1％的突变频率。
本发明测序接头制备流程简单，在超低频突变检测的应用中，能够提高检 测精度，可以准确检测到0.1％的突变频率。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州漫瑞生物信息技术有限公司
<120> 一种高通量测序接头、其制备方法及其在超低频突变检测中的应用
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<170> PatentIn version 3.3
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<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
catagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
cacagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 21
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
ccaagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 22
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 22
cccagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 23
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
ccgagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 24
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 24
cctagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 25
cgaagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 26
cgcagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 27
cggagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 28
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 28
cgtagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 29
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 29
ctaagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 30
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
ctcagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 31
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 31
ctgagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
<210> 32
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
cttagatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcacnnn ntagcatctc gtatgccgtc 60
ttctgcttg 69
