一种构建人TCRbetaCDR3区文库的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效无偏差构建人TCR beta的 CDR3区高通量测序文库的所需的引物和文库制备方法。
背景技术
淋巴细胞通过其表面抗体识别特异性抗原来发挥免疫功能。其对抗原识别的特异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞能识别具有相同的抗原受体，识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(TCR)是T细胞特异识别和结合抗原肽-MHC 分子的结构，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95％的T细胞的受体由α亚基和β亚基构成，另外5％的受体由γ亚基和δ亚基构成，其比例会因为个体发育或疾病而变化。
TRB是编码TCR beta的基因座，其包含可变段(V)、多变段(D)、连接段 (J)和恒定区(C)4个基因片段，而V，D，J，C又分为若干等位基因，T细胞发育过程中TRB基因座内发生基因重组，为TCR beta的多样性提供了分子基础，另外通过在基因重组位点附近的碱基的随机插入和缺失等机制，最终产生了多样性的TCR，以满足机体识别多种多样的抗原的需要。
TCR beta的CDR3区由V基因片段末端、D基因片段、J基因片段前端及V、 D、J之间插入的核苷酸序列组成。TCR beta链按等位排斥的方式优先于TCR alpha 链的重排，能较好的反应T细胞的TCR特征。因此，对T细胞受体beta链CDR3 编码序列进行研究，具有重要意义。
TCR beta的C区靠近细胞膜，连接跨膜区和胞内的末端，而V区负责识别多肽-MHC复合体。每个亚基的可变区都包含三个高度易变的互补决定区(complementarity determining regions,CDR)，最重要的CDR3负责直接与 MHC所呈递的多肽结合，而且序列高度可变，故TCR的多样性主要由CDR3决定。随着高通量技术的发展，对整个T细胞群体TCR的CDR3区进行大规模平行测序已成为可能，通过对TCR beta的CDR3区进行测序，可以评价免疫组库中TCR beta 的多样性等参数，进一步可以分析免疫系统的应答发生机制及过程。
鉴于传统的扩增CDR3区需要多重PCR进行扩增，存在扩增过程中模板拷贝数和扩增效率难以控制，产物发生偏移，不能反应样本初始TCR分布等问题；同时，多种引物扩增会增加错配及相互干扰，导致扩增背景高，可重复性差等问题，最终导致测序结果不能真实反映样本情况。本发明采用5’RACE技术可较好避免建库过程中的扩增偏移，可无偏差的对人TCR beta库。利用Tn5酶能将DNA打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对TCR beta的高度可变区 (CDR3区)进行快速富集建库，实现了对样本中T细胞受体库的准确检测，通过标签序列，可增加测序样本数，减少测序成本，可应用各类含T细胞的组织样本的T细胞受体库分析，对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
发明内容
本发明的目的是建立一种高效无偏差的构建人TCR beta的CDR3区高通量测序文库的方法。
基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建人TCR beta CDR3区文库的方法按如下步骤进行：
1)提取人组织或全血总RNA。
2)以步骤1)提取的RNA为模板，以SEQ ID NO.1为引物逆转录合成cDNA，在逆转录酶作用下将SEQ ID NO.4连接至cDNA的3’端。
3)采用半巢式PCR特异性扩增TCR beta片段：使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5进行第一轮PCR；使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5进行第二轮PCR；其中SEQ ID NO.5作为通用引物，SEQ ID NO.3为在TCR alpha的C端序列，并带有测序接头。
4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物；使用Tn5建库试剂盒进行DNA打断，使用SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7进行测序接头连接，建库，质控。
5)文库用于illumina高通量测序平台测序。
序列表
其中，上表SEQ ID NO.4的序列中rG代表单脱氧鸟嘌呤(riboguanosine),+G 代表锁核苷酸修饰的鸟嘌呤(LNA)。
有益效果：
本发明涉及一种基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建人 TCR beta CDR3区文库的方法。本发明公布了通过5’RACE技术高效的，无偏差的扩增人TCR alpha的全长序列，利用Tn5酶进行快速打断富集CDR3区的建库所需的引物和文库制备方法，实现了对样本中T细胞受体库的准确检测，可应用各类含T细胞的组织样本的T细胞受体库分析，对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
附图说明：
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1 TCR beta文库图；
图2 TCR beta文库测序统计结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：
基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建人TCR beta CDR3区文库的方法，包括以下步骤：
步骤1提取人组织中的总RNA
使用Trizol法(Roche，Tripure Isolation Reagent)提取人组织或全血中总RNA 的提取方法，包括如下步骤：匀浆组织/全血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存，加入200ul氯仿/ml Trizol，颠倒混匀30s，室温放置3min。4℃，12000g离心15min。尽可能吸取上层水相至另一EP管，注意不要吸到中间层。按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。4℃，12000g离心10min。按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入体积比为 75％的乙醇，温和震荡，悬浮沉淀。4℃，8000g离心5min。吸去上清。室温晾干5-10min。用合适体积的无RNase水溶解RNA。
将所提取的RNA利用nanodrop one超微量紫外分光光度计测定浓度，检测结果显示，OD260/280在1.8-2.0之间。将所提取的RNA利用琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性。检测结果显示，28S和18S条带明显，5S条带不明显，28S/18S 在2.0左右。
上述检测结果表明步骤1所提取的RNA质量满足建库要求，能够用于后续建库。
2逆转录和模板转换：
将步骤1获得的总RNA样本使用SmartScribe Reverse Transcriptase进行逆转录逆，具体如下体系:总RNA 0.2-2ng，浓度为10uM的逆转录引物C1(5’- TAGAACTGGACTTGACAGCG-3’,(SEQ ID NO.1))1ul，加入无RNase水至12ul，短暂离心，PCR仪中72度孵育3min，迅速冰上5min。再加入5X first strand buffer 4ul，dNTPs 2ul，DTT 0.5ul，RNA Inhibitor 0.5ul，SmartScribe Reverse Transcriptase 2ul，浓度为10uM的TSO(5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrG+G-3’,(SEQ ID NO.4))1ul，加水至20ul，短暂离心，PCR仪中42℃孵育90min，70℃10min， 4℃保持。
3第一轮PCR反应:
利用步骤2所得到的的产物使用KAPA HiFiHot Start ReadyMix(2X；KAPA Biosystems,KK2601)进行巢式PCR的第一轮PCR扩增，按如下体系准备1st PCR体系：
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5ul，浓度为1uM的SP(5’ -ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’,(SEQ ID NO.5))0.5ul，浓度为10uM的C2(5’- TTGGGTGTGGGAGATCTCTGC-3’,(SEQ ID NO.2))0.5ul，cDNA 1ul，补水至25ul, PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，循环15次；72℃延伸5min。
4第二轮PCR反应:
利用步骤3所得到的的产物使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X；KAPA Biosystems,KK2601)进行巢式PCR的第二轮PCR扩增，按如下体系准备2nd PCR体系：2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25ul，浓度为10uM的SP(5’- ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’,(SEQ ID NO.5))2ul，浓度为10uM的C3(5’- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCTCTGCTTCTGATGGCTCA-3’,(SEQ ID NO.3))2ul，第一轮PCR产物2ul，补水至50ul，PCR反应条件为：98℃预变性3min； 98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸6min，循环20次；72℃延伸5min。
5 Tn5酶建库：
上述步骤4PCR反应结束后，使用AMPure XP magnetic beads进行DNA纯化，具体步骤如下：将磁珠从冰箱拿出，恢复至室温。配制新鲜的体积比为80％的乙醇。吸取50ul beads加入到50ul 2nd PCR产物中，混合均匀，室温孵育5min。置于磁力架上至液体变澄清(约2min)，用移液器吸除上清。将200ul新制备的 80％乙醇加入到样本中，磁力架上30s，吸除上清。重复上一步。磁力架上风干约10min，将EP管从磁力架上取下，加入30ul水洗脱磁珠上的DNA，室温2min。将EP管从磁力架上至液体变澄清(约2min)，吸取上清至另一EP管即得纯化的PCR产物。
将纯化后的PCR产物使用TruePrep DNA Library PrepKit V2for Illumina的 Tn5酶进行建库，使用Qubit 2.0荧光计对DNA进行定量，取1ng产物进行Tn5转座酶建库。具体操作按试剂盒说明书进行：室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用；确认5×TS是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀；如有沉淀，37℃加热并涡旋振荡充分混匀，沉淀即可溶解。在PCR管中配制如下反应体系：5× TTBL 4ul，1ng DNA，TTE Mix V1 5ul，补水至20ul，轻轻吹打20次至充分混匀。放置在PCR仪中，55度10min；10度，保持。反应完成后立即向产物中加入5ul 5x TS，轻轻吹打充分，室温5min。在上述体系中加入以下成分：5×TAB10ul，PPM 5ul，TAE 1ul，浓度为10uM的IP5 (5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[ACGTCCTG]TCGTCGGCA GCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，(SEQ ID NO.6))5ul，浓度为10uM 的IP7 (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[TCGCCTTA]GTGACTGGAGTTC AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，(SEQ ID NO.7))5ul，总体积50ul。反应条件为：105℃，热盖；72℃，3min；98℃，30s；98℃，15s，60℃，30s，72℃， 3min，10-15循环；72℃，5min；4℃，保持。
其中[ACGTCCTG]和[TCGCCTTA]为标签序列，包括但不局限于illumia的测序标签序列，[]内的序列可以为任意经验证的能区分不同样本的8bp的短序列。
上述PCR反应结束后，利用VAHTS DNA Clean Beads进行文库片段选择纯化，具体步骤如下：将VAHTS DNA Clean Beads平衡至室温并充分涡旋。配制新鲜的体积比为80％的乙醇。取30ul磁珠加入到50ul PCR产物中，充分混匀，室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min)。用移液器吸取上清至另一EP管，加入7.5ul磁珠并充分混匀，室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min)，吸除上清。将200ul新制备的体积比为80％的乙醇加入到样本中，磁力架上30s，吸除上清。重复上一步。磁力架上风干约10min，将EP管从磁力架上取下，加入20ul水洗脱磁珠上的DNA，室温2min。将EP管从磁力架上至液体变澄清(约2min)，吸取上清至另一EP管，-20度保存。
文库纯化结束后，利用安捷伦2100生物芯片分析系统检测文库的纯度和大小，检测结果如图1所示：片段分布在300bp-550bp之间，平均长度400bp，插入片段平均长度280bp。将所得的文库通过illumina Nextseq 500平台进行测序，通过生物信息学分析高通量测序结果。
以上是实施例仅用于说明本发明的描述而非限定，基于本发明思想的形式上和细节上做出的各种改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
