A型流感病毒检测基因芯片
技术领域
本发明涉及一种A型流感病毒检测基因芯片，属于生物芯片领域。
背景技术
流行性感冒(Influenza)简称流感,是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的一种急性呼吸道传染病。长期以来，流感一直是危害人类健康和公众安全的严重传染病，每年由此造成的经济损失也十分巨大。据世界卫生组织估计，每年全球流感患者约为6-12亿，其中约有3-5百万是重症流感患者，每年约有30-50万人死于流感。流感病毒在分类上属于正粘病毒科，根据核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)抗原性的不同，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒可以感染多种动物，是人类流感和动物流感的主要病原。A型流感病毒根据其表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，可分为不同的亚型，目前在水禽中已发现16种HA亚型和9种NA亚型。在过去的一个世纪里，A型流感病毒引发4次人类流感大流行。A型流感病毒不仅血清型复杂，遗传变异也十分活跃，变异的方式主要有核苷酸点突变积累引起的抗原漂移和不同毒株基因节段重配引起的抗原转换两种。研究表明，每1-2年，H1和H3流感病毒在人群免疫压力下都会发生一次大的抗原漂移，使疫苗接种预防效果和血清学诊断结果大打折扣。
近十多年来，禽流感病毒，包括H5N1、H9N2和H7N7亚型，特别是H5N1亚型病毒，在全球家禽中持续爆发流行。在一般认为流感病毒具有宿主限制性，即禽流感病毒一般不易突破宿主种间屏障直接感染人。但近年来发生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，越来越多的证据表明禽流感病毒，特别是H5N1病毒，已经逐步获得直接感染人的能力。自1997年香港禽流感事件，截止2008年3月，全球已有366例感染了H5N1病毒，其中死亡232例。根据以往大流感的经验和当前高致病性禽流感肆虐的严峻现实，H5N1病毒一旦获得在人际间传播的能力或与现在流行的人病毒基因重配，就可能引发新的流感大流行。因此必须面对的问题是应该采取何种策略和技术储备来应对可能到来的大流感。
流感病毒的有效检测技术对于指导临床预防和治疗流感具有重要意义，同时也是流感监测和控制世界性流感大流行的重要技术支撑。除了流感病毒，临床上引致人呼吸道疾病的病原体还有很多，包括某些病毒、细菌、支原体、螺旋体、寄生虫等，因此轻型流感及散发流感在临床上与普通感冒及其它病原引起的呼吸道疾病较难鉴别，对流感的确诊主要依靠实验室检测手段。自1933年流感病毒被第一次分离以来，发展出了许多不同的诊断方法，这些方法各有优缺点。目前流感的实验室诊断方法有病毒分离培养、检测抗体的血清学方法、检测抗原的免疫学方法和基于PCR的分子生物学方法。用鸡胚或细胞分离培养病毒是流感病毒鉴定的“黄金标准”，敏感性强，但需要3-7天时间，不适合早期诊断。血清学方法可以检测抗体，主要包括血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)、酶免疫试验(EIA)和间接免疫荧光法(IF)等。血清学检测需要采集患者急性期和康复期双份血清，属于回顾性诊断，具有流行病学意义，但对于急性早期诊断意义不大，且敏感性低。直接检测抗原方法有直接或间接荧光试验、酶联免疫试验等，时间为2小时-1天，适合早期快速诊断，但敏感性低，且不能进行大样本检测。分子生物学方法是针对病原核酸分子检测的一系列试验手段，主要包括RT-PCR、多重PCR、real-time PCR、NASBA等，这些方法都具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，可以对病毒进行定量和分型鉴定，但缺点是不能对大量临床标本进行同时平行检测和筛查。针对流感病毒亚型众多、血清型复杂和遗传变异迅速的特点，迫切需要建立一种敏感、特异的快速检测方法，能够在同一时间平行地对大量样品进行检测，同时能对检测病毒进行分型鉴定。近年来发展起来的基因芯片技术将为流感病毒的检测带来重大突破，完全能够满足对流感病毒检测的上述要求。
基因芯片，又叫DNA微阵列(DNA Microarray)，自诞生之日起经过科学家们十多年的努力，技术逐渐成熟完善，已广泛应用于医学的多个领域，包括基因表达的监测、基因功能的评价、疾病的分子诊断、药物筛选等。与传统方法相比，在传染性疾病的诊断上，基因芯片显示了无可比拟的优越性。基因芯片具有快速、敏感、特异、高通量的特点，可以平行地对大量病原和同一病原的多基因位点进行同时检测，在实际应用中能够实现微型化、集成化和自动化。近几年来许多病原微生物的检测都涉及到了基因芯片的研究并取得了令人振奋的进展，有些已经或正在实现产业化，显示了广阔的应用前景。基因芯片检测技术特别适合流感病毒宿主范围广、血清型多、变异快的特点。2001年Li等首次设计24对平均长度约500nt的探针制备芯片，结合多重PCR方法制备荧光标记靶DNA，通过与探针杂交结果表明可以对H1、H3、N1、N2和B型流感进行鉴定。之后少数学者运用不同的基因芯片制备策略对流感病毒的分型检测进行了深入研究，但现有研究成果普遍存在杂交时间较长，荧光标记效率低，杂交信号弱，检出率低的缺点，另外由于流感病毒本身基因变异很快，很难保证其保守序列永远不变，而目前的芯片的探针数目太少，一旦在其检测位点发生变异，则很可能导致检测结果的错误。
发明内容
本发明提供了一种用于A型流感病毒流行毒株检测和分型的基因芯片及其制备方法和使用方法，它可以成功建立了一整套快速、特异、灵敏的用于A型流感病毒流行毒株检测分型的基因芯片，该芯片能同时对包括人源、禽源、猪源等不同种属来源的A型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型进行检测和分型。
本发明采用了以下技术方案：一种A型流感病毒流行毒株检测和分型的基因芯片，它包括对H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四种亚型进行检测和分型的79条特异性寡核苷酸探针、两条质控探针和载体，两条质控探针为质控探针Ⅰ和质控探针Ⅱ，其中特异性寡核苷酸探针和质控探针Ⅰ分布在载体上，对H1N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
对H3N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
对H5N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
对H9N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
两条质控探针的序列
所述的载体为醛基化修饰玻璃基片或硅片。
本发明一种A型流感病毒流行毒株检测和分型的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：步骤一，探针的设计：根据NCBI中的Influenza Virus Resource数据库，对大量A型流感病毒序列进行比对，找到其绝对或相对保守序列，然后设计79条特异性寡核苷酸探针以及两条质控探针；步骤二，探针的合成，每条探针的5’端加C6氨基修饰,以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用纯水稀释成40uM，取15ul，和等体积2×芯片点样液混匀，使探针浓度达到20uM,装于384孔板，用芯片点样仪将探针点于载体上，点样完成后将芯片置于芯片杂交盒，同时在杂交盒底部放300ul纯水用于保持湿度，将杂交盒密封，37℃反应18h,使探针和芯片表面醛基共价结合，水合完成后用0.2％SDS清洗并用NaBH4封闭，离心干燥，贴上四样品型围栏，4℃密封保存。
在本发明制备方法步骤一中79条特异性寡核苷酸探针以及两条质控探针，探针长度在19-25bp，每条探针之间Tm值相差在5℃之内。在本发明制备方法步骤二中所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
本发明一种A型流感病毒流行毒株检测和分型的基因芯片的使用方法，其特征是它包括以下步骤：步骤一，流感病毒RNA的提取，使用TRIZOL常规方法提取病毒RNA；步骤二，RT—PCR：首先用Uni12引物将流感病毒RNA反转录成cDNA,再使用通用引物分别PCR扩增流感病毒的HA、NA基因片段全长，扩增后的PCR产物用QIAGEN PCR Purification Kit对进行纯化；步骤三，荧光标记：取纯化后的PCR产物，使用Klenow minus酶在PCR产物上进行荧光标记，将带有荧光标记的PCR产物用QIAGEN PCR Purification Kit纯化；步骤四，杂交：将纯化后的带有荧光标记的PCR产物和杂交液混匀，在基因芯片上盖上四样品型盖片，将12ul杂交体系加于盖片加样孔使其自动覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在20-45℃杂交1-5H；步骤五，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，将芯片依次在洗液0.1％SDS+2×SSC、0.1％SDS+0.2×SSC和0.2×SSC中各清洗1-5min，最后将基因芯片放入离心管中离心以去除表面液体；步骤六，扫描：将步骤五中清洗后的基因芯片通过芯片扫描仪进行扫描，同时保存扫描图像数据；步骤七，数据分析：根据扫描图像，确定出现荧光信号区域，以此来确定所检测样本中流感病毒的有无及亚型。
本发明使用方法的步骤三中的荧光标记采用cy3荧光染料。本发明使用方法的步骤四中杂交体系组分为去离子甲酰胺1.8ul，20×SSPE 2.4ul，50×Denhardt’s 0.6ul，质控探针Ⅱ1ul，带有荧光标记PCR产物3ul，纯水3.2ul。
本发明具有以下有益效果：本发明的探针覆盖面广，克服了某些芯片仅仅只设计一对或少数几对探针的缺点，对四个亚型都设计了多对探针，可有效避免由于流感病毒变异迅速而导致的漏检。本发明中所使用的荧光标记方法效率高，且在荧光标记过程中就可对待检测产物进行有效片段化，使得杂交反应效率得到极大提高，提高芯片检测敏感度。本发明可以检测不同种属来源的A型流感病毒，包括人、禽、猪等，具有很高的广谱性。
附图说明
图1为本发明A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的阵列结构示意图，每张芯片上分布有四个相同阵列。
图2所示为每个阵列上各探针排列布局。
图3所示为典型的A型流感病毒H1N1亚型芯片检测结果。
图4所示为典型的A型流感病毒H3N2亚型芯片检测结果。
图5所示为典型的A型流感病毒H5N1亚型芯片检测结果。
图6所示为典型的A型流感病毒H9N2亚型芯片检测结果。
具体实施方式
实施例一：根据图1和图2所示，本发明提供了一种用于对A型流感病毒流行毒株检测和分型的基因芯片，它包括对H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四种亚型进行检测和分型的79条特异性寡核苷酸探针、两条质控探针和载体，两条质控探针为质控探针Ⅰ和质控探针Ⅱ，特异性寡核苷酸探针和质控探针Ⅰ分布在载体上，载体为醛基化玻璃修饰基片，载体也可以为硅片、聚苯乙烯基片或尼龙基片，对H1N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列见表1，对H3N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列见表2，对H5N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列见表3，对H9N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列见表4，两条质控探针的序列见表5。
表1 对H1N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
表2 对H3N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
表3 对H5N1进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
表4 对H9N2进行检测和分型的特异性寡核苷酸探针的序列
表5两条质控探针的序列
本发明还提供了A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的制备方法，包括以下步骤：步骤一，探针的设计：根据NCBI中的Influenza Virus Resource数据库，运用Clustalx软件对大量A型流感病毒序列进行比对，找到其绝对或相对保守序列，然后运用Array Designer 4设计79条特异性寡核苷酸探针以及两条质控探针，每条探针的长度在19-25bp，每条探针之间Tm值相差在5℃之内，79条特异性寡核苷酸探针的序列以及两条质控探针的序列见表1、表2、表3、表4和表5；步骤二，探针的合成，在合成的同时在每条探针的5’端加C6氨基修饰,以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用纯水稀释成40uM，取15ul,加2×芯片点样液15ul于PCR管，用枪混匀，使探针浓度达到20uM,装于384孔板，用芯片点样仪将探针点于载体上，每点两个重复，每个阵列上横向14个点，纵向13个点，每块芯片上点制4个重复阵列，点样完成后将芯片放置于芯片杂交盒，同时在杂交盒底部放300ul纯水用于保持湿度，将杂交盒密封，37℃反应18h,使探针和芯片表面醛基共价结合，水合完成后用0.2％SDS清洗并用NaBH4封闭，离心干燥，贴上四样品型围栏，4℃密封保存。
根据图3，图4，图5和图6，本发明还公开了一种A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的使用方法，它包括以下步骤：
步骤一，流感病毒RNA的提取，使用TRIZOL常规方法提取病毒RNA；步骤二，RT—PCR：首先用Uni12引物将流感病毒RNA反转录成cDNA,再使用通用引物分别PCR扩增流感病毒的HA、NA基因片段全长，扩增后的PCR产物用QIAGEN PCR Purification Kit对进行纯化；步骤三，荧光标记：取纯化后的PCR产物，使用Klenow minus酶在PCR产物上进行荧光标记，荧光标记采用cy3荧光染料，将带有荧光标记的PCR产物用QIAGEN PCR Purification Kit纯化；步骤四，杂交：将纯化后的带有荧光标记的PCR产物和杂交液混匀，在基因芯片上盖上四样品型盖片，将12ul杂交体系加于盖片加样孔使其自动覆盖于阵列表面，杂交体系组份为去离子甲酰胺1.8ul，20×SSPE 2.4ul，50×Denhardt’s 0.6ul，质控探针Ⅱ1ul，带有荧光标记PCR产物3ul，纯水3.2ul，将基因芯片放入杂交盒内在20-45℃杂交1-5H；步骤五，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，将芯片依次在洗液0.1％SDS+2×SSC、0.1％SDS+0.2×SSC和0.2×SSC中各清洗1-5min，最后将基因芯片放入离心管中离心以去除表面液体；步骤六，扫描：将步骤五中清洗后的基因芯片通过芯片扫描仪进行扫描，同时保存扫描图像数据；步骤七，数据分析：根据扫描图像，确定出现荧光信号区域，以此来确定所检测样本中流感病毒的有无及亚型。
