一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其应用。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是一类与磷脂酰肌醇连接的聚糖。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是一种膜性硫酸乙酰肝糖素蛋白，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在细胞的生长发育中起着重要的调控作用，与各种肿瘤的关系密切，包括肝癌、恶性黑素瘤、卵巢癌和乳腺癌等多种肿瘤，其在不同的肿瘤中发挥不同的作用，甚至可能起完全相反的作用。此外，由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在大部分的肿瘤中表达，而在正常人组织中几乎不表达，因此，对人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变的检测对判断人体是否患有肿瘤具有一定的指引作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其应用。
本发明技术方案包括：
第一方面，提供一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，提供一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据所述人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的核苷酸序列，与人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。
优选地，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
第四方面，提供一种特异性识别人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的单克隆抗体，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
第五方面，提供一种用于检测人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
第六方面，提供一种基于上述任一所述ELISA试剂盒检测人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的抗体的方法，包括：
a、使用所述包被缓冲液对上述单克隆抗体进行稀释，并将稀释后的所述单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
b、使用所述样品稀释液将检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育；
e、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
优选地，进一步包括：空白对照实验。
本发明提供了一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其应用，将大量肿瘤患者作为研究病例，对病例进行基因检测并进行分析，确定出人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖的突变蛋白，根据该人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为肿瘤的基因诊断提供的指引作用，实现肿瘤的早诊断、早发现和相关治疗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明实施例一提供的一种比对结果示意图；
图2是本发明实施例一提供的一种基因芯片布局图；
图3是本发明实施例二提供的一种显色结果示意图；
图4是本发明实施例二提供的另一种显色结果示意图；
图5是本发明实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线；
图6是本发明实施例五提供的Western blot检测结果示意图；
图7是本发明实施例六提供的为蛋白含量的标准曲线；
图8是本发明实施例六提供的Western blot检测结果示意图；
图9是本发明实施例七提供的为蛋白含量的标准曲线；
图10是本发明实施例七提供的Western blot检测结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、基因芯片的制备
首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国发明专利中描述的检测方法，确定出人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其次，根据人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。
1、核苷酸探针的设计
(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的核苷酸序列，与人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的特异性的核苷酸探针。
其中，核苷酸探针设计的原则如下：
①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；
②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过5个；
③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；
④核苷酸探针分子内部稳定二级结构配对碱基长度少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；
⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；
⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。
其中，人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白对应的氨基酸序列与人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖正常蛋白对应的氨基酸序列，Query序列与Sbjct序列之间的序列为比对结果，根据图1可知，人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白相对于人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖正常蛋白，在一个位置处发生了插入。根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以按照如下几种方式中的任一种方式设计核苷酸探针：
(1)选取插入位置的整条核苷酸序列生成核苷酸探针；
(2)在插入位置之前，和/或，在插入位置之后，各选择若干个核苷酸序列，该选择的若干个序列(碱基序列位置的顺序不变)与插入的整条核苷酸序列共同生成核苷酸探针；
(3)在插入位置之前选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的开始位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
(4)在插入位置之后选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的结束位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
(5)在缺失位置之前选择若干个核苷酸序列，与在缺失位置之后选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
(6)将包含有突变位置核苷酸的一条核苷酸序列作为核苷酸探针。
在本实施例中，根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式(2)设计一种优选地核苷酸探针如SEQ ID NO:3所示，该核苷酸探针为：tcaaggtgtc cagcctactg acagcagctt tgaagtacat agtgcatttc ccaagaaccg tgggtaaaga aaaagcatt
(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。
2、检测人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖是否发生突变的基因芯片的制备
为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，为实验组。
其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。
对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：
空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的污染监控指标。
阴性内参质控探针：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标，阴性内参质控探针包括的核苷酸位数可以与核苷酸探针的位数相同，也可以不同。本发明实施例中，基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为：tgatgctgat aattgcatag。
阳性内参质控探针：是一段与检测基因有同源性的其他基因片段，在人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白中，选择与核苷酸探针对应的序列不同，阳性内参质控探针包括的核苷酸位数与核苷酸探针的位数可以相同，也可以不同。优选地，选取核苷酸位数与核苷酸探针的位数相同的阳性内参质控探针。本发明实施例中，基因芯片所需的阳性内参探针序列可以为：catggcatgt ctgaaacagg aagtcacggg gcctcctcca ccgaggaggt gaatacacct ctgattttaa tcagttctg。
需要说明的是，在基因芯片的点样过程中，按照基因芯片的布局点入阴性内参探针和阳性内参探针溶液；空白对照所用的试剂为1倍的点样缓冲液(10％海藻糖溶液)。
实施例二、基因芯片的应用
1、样品处理
(1)采集检测对象的血液1-3mL。
(2)取DEPC处理的1.5mLEP管，为被检测样品处理管，在被检测样品处理管中加入检测对象的血液300μL，再加入Trizol 700μL，充分混匀，室温放置10Min。
(3)加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置3-5min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。
(4)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。
(5)用1mL75％乙醇洗一遍，7500r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清，在超净台中干燥15min，加入10μL DEPC处理水溶解。
(6)所得产物为RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN 纯化总RNA。
2、cDNA第一链和第二链一步法合成
(1)取2μg RNA于1.5mL离心管中配置如下反应溶液：
(2)65℃保温10分钟冰浴5分钟，提前把5×First Strand Bμffer在65℃预热5分钟。
(3)配置如下cDNA合成体系：
(4)将上述8.5μL mix加入变性后冰浴的RNA中。
(5)用枪头混匀之后离心。
(6)40℃反应2h。
3、aaUTP标记cRNA合成
NTP的配置：
分装成10管备用，注：50％PEG使用之前40℃保温1min。同时按如下操作配置Transcription mix；
(1)配置Transcription mix
(2)加入60μl Transcription mix并混匀
(3)PCR仪中热盖60℃，40℃反应2h。
4、cRNA纯化
QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。
(1)加入20μLRNase free水，加入350μL Buffer RLT并充分混匀。
(2)加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。
(3)将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasy柱子内≥8000g离心15-30sec，弃去滤过液。
(4)吸取500μL Buffer RPE到RNeasy mini柱子内≥8000g离心洗涤15—30sec弃去滤过液再用500μL Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2mL的套管将RNeasy mini柱子转入一新的1.5mL Eppendorf管中。
(5)吸取30μL RNase free的水静置1min,≥8000g离心洗脱1min。
(6)重复步骤(5)一次。
5、cRNA浓度测定
用分光光度计分析RNA浓度。需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)。
6、cRNA样品荧光标记；
(1)取上述cRNA 4μg并浓缩至6.6μL。
(2)加10μL DMSO混匀。
(3)加3.4μL的0.3M碳酸氢钠(NaHCO3)pH9.0并混匀。
(4)将上述20μL cRNA混合物加入到荧光染料Cy3中并混匀。25℃保温1h。
(5)加9μL的4M Hydroxylamine混匀后25℃保温15min。
7、荧光标记cRNA样品纯化
具体步骤同本实施例的步骤4中cRNA纯化的过程，本步骤不在赘述。
8、cRNA样品片段化和芯片杂交4x44K microarrays
(1)按下表配制片段化混合液然后在60℃温浴30min进行片段化。
(2)加入55μL 2X GEx Hybridization Buffer。
(3)取100μL杂交液滴加到芯片皿上，同时按芯片布局如图2所示分别滴加在空白、阴性、阳性、实验组位置上。盖上芯片并密封于杂交盒中，60℃滚动杂交16h。
9、芯片洗涤
洗液1(1升)配置：
洗液2(1升)配置：
洗液3：Stabilization and Drying Solution
(1)取出芯片于洗液1中洗涤1分钟；
(2)再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)；
(3)最后将芯片于洗液3中洗涤30秒。
10、芯片扫描
将芯片在扫描仪中进行扫描，根据扫描结果确定检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白是否发生了突变。请参考图3和图4，图3所示的结果中，阴性对照无绿色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组为绿色荧光，那么表明检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白发生了突变。图4所示的结果中，阴性对照为无色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组无绿色荧光，那么表明检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白未发生突变。
实施例三、特异性识别人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的单克隆抗体的制备
1、根据人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的碱基序列(如SEQ ID NO:2所示)设计上游引物如SEQ ID NO:4所示，以及，下游引物如SEQ ID NO:5所示：
上游引物(P)：ggagccagtt ctaactggac
下游引物(F)：ctgggccact tgtgcact
2、检测对象的DNA为模板进行PCR扩增
以检测对象的DNA为模板进行PCR扩增，获得人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白基因完整片段，并连接pMD19-T Vector(Takara公司)，进行测序。然后由专门的生物公司制备抗体，是一种人源化或嵌合型抗体。将制备的抗体采用ELISA法测定含量。
实施例四、用于检测人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒
本实施例中，ELISA试剂盒的组成为：包被有实施例三所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
其中，上述各个组成的参数至少可以为如下一种参数：
ELISA酶标板可以为96孔的ELISA酶标；
酶标二抗可以是稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗人IgG；其中，稀释倍数可以是8000倍。
包被缓冲液可以是1×PBS，pH:7.4；
ELISA酶标板洗涤液可以是含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；
显色液可以是3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；
终止液可以是2mol/L的硫酸溶液。
实施例五
在本发明实施例中，将肝癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该肝癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将肝癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99791，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得肝癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测肝癌患者血清样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图5，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
1、制胶
(1)清洗玻璃板并擦干；
(2)参考分子克隆方法配制SDS-PAGE胶：
A.下层分离胶配制体系(Total Volum：15mL)
B.上层积层胶浓缩配制体系(Total Volum：8mL)
(3)在每个胶板中加入相应体积的下层分离胶，再加入1mL的无菌ddH2O，压平分离胶，待分离胶凝固后，用滤纸吸干制胶板中剩余的水分，而后加入上层浓缩胶，插入梳子后等待上层浓缩胶凝固。
2、蛋白上样电泳：
(1)拔下梳子，做好孔道标记，加入5×SDS电泳缓冲液，随后给蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，沸水浴加热3-5min，上样；
(2)先用80V电压进行电泳，待条带跑过浓缩胶之后，换用100V电压跑大约100min。
3、转膜及孵育：
(1)先把PVDF膜在甲醇中活化约30s。分别将凝胶、海绵垫和PVDF膜预先在电转移缓冲液中平衡30min。按滤纸-胶-膜-滤纸的顺序夹好，按照黑面对黑面的原则放入转膜器中，加入制冷器(冰袋)，在冰中以150mA的电流跑约120min；
(2)完成后将膜取出，立刻放入5％的脱脂牛奶中，摇床上轻轻室温封闭膜1h；
(3)PBST清洗已封闭的膜，清洗3次，每次10min；
(4)加入稀释到相应倍数的一抗，4℃摇床过夜孵育；
(5)回收一抗，PBST清洗膜三次，每次10min；
(6)二抗(用3％的牛奶以1:5000-10000稀释)室温孵育膜2h；
(7)用PBST清洗膜三次，每次10min；
(8)Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒A、B液等体积混匀后，逐滴滴加在PVDF膜上；
(9)FluorChem E FE0511中曝光成像，实验用Image J分析。
其中，一抗是公司制备的人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白单克隆抗体，二抗是辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
j、Western blot检测结果分析：按照Western blot实验步骤显示结果，如图6所示，其中，图6中的Marker用于表征标记蛋白的大小。与空白对照相比，仅在实验组81KD附近出现明显条带，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的分子量大约为81KD，表明该肝癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白确实存在突变。
实施例六
在本发明实施例中，将恶性黑素瘤患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该恶性黑素瘤患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将恶性黑素瘤患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99980，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中恶性黑素瘤患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测恶性黑素瘤患者血清样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图7，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图8，图8中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组81KD附近出现明显条带，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的分子量大约为81KD，表明该恶性黑素瘤患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白确实存在突变。
实施例七
在本发明实施例中，将卵巢癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该卵巢癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将卵巢癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99981，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中卵巢癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测卵巢癌患者血清样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图9，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图10，图10中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组81KD附近出现明显条带，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白的分子量大约为81KD，表明该卵巢癌患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白确实存在突变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司
<120> 一种人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖突变蛋白及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 1
Gly Ala Ser Ser Asn Trp Thr Thr Leu Pro Pro Pro Leu Phe Ser Lys
1 5 1015
Val Val Ile Val Leu Ile Asp Ala Leu Arg Asp Asp Phe Val Phe Gly
202530
Ser Lys Gly Val Lys Phe Met Pro Tyr Thr Thr Tyr Leu Val Glu Lys
354045
Gly Ala Ser His Ser Phe Val Ala Glu Ala Lys Pro Pro Thr Val Thr
505560
Met Pro Arg Ile Lys Val Ser Ser Leu Leu Thr Ala Ala Leu Lys Tyr
65707580
Ile Val His Phe Pro Arg Thr Val Gly Lys Glu Lys Ala Leu Met Thr
859095
Gly Ser Leu Pro Gly Phe Val Asp Val Ile Arg Asn Leu Asn Ser Pro
100 105 110
Ala Leu Leu Glu Asp Ser Val Ile Arg Gln Ala Lys Ala Ala Gly Lys
115 120 125
Arg Ile Val Phe Tyr Gly Asp Glu Thr Trp Val Lys Leu Phe Pro Lys
130 135 140
His Phe Val Glu Tyr Asp Gly Thr Thr Ser Phe Phe Val Ser Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Glu Val Asp Asn Asn Val Thr Arg His Leu Asp Lys Val Leu Lys
165 170 175
Arg Gly Asp Trp Asp Ile Leu Ile Leu His Tyr Leu Gly Leu Asp His
180 185 190
Ile Gly His Ile Ser Gly Pro Asn Ser Pro Leu Ile Gly Gln Lys Leu
195 200 205
Ser Glu Met Asp Ser Val Leu Met Lys Ile His Thr Ser Leu Gln Ser
210 215 220
Lys Glu Arg Glu Thr Pro Leu Pro Asn Leu Leu Val Leu Cys Gly Asp
225 230 235 240
His Gly Met Ser Glu Thr Gly Ser His Gly Ala Ser Ser Thr Glu Glu
245 250 255
Val Asn Thr Pro Leu Ile Leu Ile Ser Ser Ala Phe Glu Arg Lys Pro
260 265 270
Asp Pro Gly Phe Glu Gln Phe Lys Met Ser Glu Arg Leu His Gly Asn
275 280 285
Trp Ile Arg Leu Tyr Leu Glu Glu Lys His Ser Glu Val Leu Phe Asn
290 295 300
Leu Gly Ser Lys Val Leu Arg Gln Tyr Leu Asp Ala Leu Lys Thr Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Ser Ala Gln Val Ala Gln
325 330
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 2
ggagccagtt ctaactggac cacgctgcca ccacctctct tcagtaaagt tgttattgtt 60
ctgatagatg ccttgagaga tgattttgtg tttgggtcaa agggtgtgaa atttatgccc 120
tacacaactt accttgtgga aaaaggagca tctcacagtt ttgtggctga agcaaagcca 180
cctacagtta ctatgcctcg aatcaaggtg tccagcctac tgacagcagc tttgaagtac 240
atagtgcatt tcccaagaac cgtgggtaaa gaaaaagcat tgatgacggg gagccttcct 300
ggctttgtcg acgtcatcag gaacctcaat tctcctgcac tgctggaaga cagtgtgata 360
agacaagcaa aagcagctgg aaaaagaata gtcttttatg gagatgaaac ctgggttaaa 420
ttattcccaa agcattttgt ggaatatgat ggaacaacct catttttcgt gtcagattac 480
acagaggtgg ataataatgt cacgaggcat ttggataaag tattaaaaag aggagattgg 540
gacatattaa tcctccacta cctggggctg gaccacattg gccacatttc agggcccaac 600
agccccctga ttgggcagaa gctgagcgag atggacagcg tgctgatgaa gatccacacc 660
tcactgcagt cgaaggagag agagacgcct ttacccaatt tgctggttct ttgtggtgac 720
catggcatgt ctgaaacagg aagtcacggg gcctcctcca ccgaggaggt gaatacacct 780
ctgattttaa tcagttctgc gtttgaaagg aaacccgatc ctgggtttga gcagtttaaa 840
atgtcagaaa gattgcatgg gaactggatc agactgtact tggaggaaaa gcattcagaa 900
gtcctattca acctgggctc caaggttctc aggcagtacc tggatgctct gaagacgctg 960
agcttgtccc tgagtgcaca agtggcccag 990
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaaggtgtc cagcctactg acagcagctt tgaagtacat agtgcatttc ccaagaaccg 60
tgggtaaaga aaaagcatt 79
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagccagtt ctaactggac 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgggccact tgtgcact 18
