一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法。
背景技术
ATAC-seq是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。
真核细胞将基因组DNA与组蛋白通过不同层次的折叠组装成染色质，这些精密组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的可接近性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或者染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响，进而导致各种疾病的发生与发展。目前该技术已被广泛应用于转录调控序列的鉴定。ATAC-seq技术可运用于所有真核细胞重编程的研究，在医学领域是重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等研究的新一代有利工具。
染色质结构在促进基因表达控制方面起着关键作用。转录因子结合的顺式元件通常与染色质区域的可接近性相关。因此，在植物基因组中识别这些可接近性区域，将有利于提高对转录因子结合、染色质状态和基因表达调控三者之间关系的理解。ATAC-seq现在通常被用于系统地鉴定动物基因组中的顺式调控区域和DNA足迹，然而，这种方法对植物物种的应用是一个挑战。在植物中，细胞壁和细胞器的存在、稳定细胞系的缺乏阻止了该技术在植物中的应用。植物染色质提取物中常含有线粒体和叶绿体等细胞器基因组，由于细胞器基因组也可以被Tn5转座酶接近并切割，因此降低了用于酶切植物基因组的Tn5转座酶活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，降低了植物叶片细胞壁及亚细胞器中基因组带来的实验干扰，采用优化过的实验条件，通过两轮磁珠分选，保留最佳上机测序文库大小，从而得到高质量上机数据，为植物叶片易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：
S1：植物组织(幼嫩组织)样本经酶解液TS2和裂解液TS1处理后，得到细胞核悬浮液A；
S2：对细胞核悬浮液A中的细胞核进行染色(DAPI染色)、分选，得到细胞核B；
S3：对细胞核B进行转座反应与纯化，得到转座产物C；
S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；转座产物C的取样量为1～100ng，优选取样量为40～60ng；
S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；
S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。
作为优选，S1具体步骤如下：取200～300mg植物组织，用刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状，加入2.5～3.0mL酶解液TS2酶解4h去除细胞壁；4℃、300～400rpm离心10min后弃上清；加入2.5～3.0mL预冷的裂解液TS1，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min，得到完全裂解后的混合液；将混合液过滤两次，所得滤液分布于不同密度的分层液中，1000～1300rpm离心20～25min，收集分离的细胞核，加入600μL裂解液TS1，得到细胞核悬浮液A。
分层液配置方法如下：取9倍体积的分层原液，加入1倍体积的10×磷酸缓冲液，得到100％的分层液，取2.5mL 100％分层液，加入2.5mL 1×磷酸缓冲液，得到50％分层液，其它密度的分层液依次使用100％分层液和1×磷酸缓冲液配制；10×磷酸缓冲液的配制方法如下：1.37M NaCl，20.7mM KCl，100mM Na2HPO4·12H2O，17.6mM KH2PO4；1×磷酸缓冲液的配制方法如下：9倍体积的超纯水加入1倍体积的10×磷酸缓冲液，混合均匀。
作为优选，S2具体步骤如下：将细胞核悬浮液A使用40μm无菌过滤器过滤，收集滤液进行细胞核染色并根据细胞核大小进行分选，分选的细胞核使用预先装入600μL裂解液TS1的离心管进行收集；显微镜下观察分选得到的细胞核质量后，将收集到的细胞核4℃、1000～1300rpm离心15min，弃上清，加入600μL洗涤缓冲液洗涤细胞核，1000～1300rpm离心10min后弃上清得到细胞核B。
作为优选，所述洗涤缓冲液组分构成如下：10mM Tris-HCl pH8.0，5mM MgCl2。
作为优选，S3具体步骤如下：取细胞核B立即进行转座反应，细胞核B加入Tn5转座酶后，37℃水浴反应30～70min；对水浴后的转座产物进行纯化，得到转座产物C。此步骤中细胞核数量及酶切时间是影响文库质量的关键因素，根据实验结果得出，40000个细胞核，酶切时间50min，能得到较好的实验结果，细胞核过多，酶切时间太短，会导致染色质未充分酶切，片段较大，影响上机成簇；细胞核太少，酶切时间长，会导致过度酶切，酶切异染色质区域。
作为优选，所述酶解液TS2组分构成如下：0.5％～1.5％纤维素酶，0.3％～0.6％果胶酶，0.3％～0.6％半纤维素酶，0.45～0.55M甘露醇，20mM KCl，10mM、pH5.7的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，10mM CaCl2，0.1％牛血清白蛋白。该酶解液TS2的制备方法如下：混合纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、甘露醇、KCl、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物并置于56℃水浴10min，冷却至室温后，加入CaCl2和牛血清白蛋白，并用0.45μm滤膜过滤到培养皿中。
作为优选，所述裂解液TS1组分构成如下：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。
作为优选，S5中确定额外所需PCR循环数，其计算方式如下：根据荧光定量PCR曲线图，取最大荧光值1/4时对应的循环数为额外所需的循环数。该循环数的数值为0～7，优选4～6个循环。
作为优选，S6具体步骤如下：将扩增产物E分别纯化后，得到单一文库，测定单一文库的浓度，根据浓度将多个单一文库等摩尔浓度混合成混合文库，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，保留200～1000bp(优选200～700bp)的DNA片段得到分选后文库，使用核酸分析仪器进行文库质量检测，检测合格后得到上机文库。
作为优选，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，第一轮磁珠的体积比例为0.4×～0.9×，第二轮磁珠的体积比例为0.5×～1.0×。磁珠体积比例×的含义为：DNA磁珠与扩增产物E的体积比。优选的分选条件为第一轮磁珠体积比例为0.5×，第二轮磁珠体积比例为0.7×。
本发明的有益效果是：本发明首先对植物幼嫩组织进行前处理，酶解细胞壁后过滤，利用DAPI染色在流式细胞仪上分选收集细胞核，过滤细胞核，有效的降低了细胞壁及亚细胞器对实验数据的干扰。进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文库进行等摩尔混合，采用优化过的两轮磁珠比例分选得到高质量的上机文库，为广大科研人员研究植物幼嫩组织易接近转座酶核染色质高通量测序提供重要的实验方法参考。
附图说明
图1是本发明的方法流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
总实施方案：
一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：
S1：植物组织样本经酶解液TS2和裂解液TS1处理后，得到细胞核悬浮液A；
S2：对细胞核悬浮液A中的细胞核进行染色、分选，得到细胞核B；
S3：对细胞核B进行转座反应与纯化，得到转座产物C；
S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；
S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；
S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。
所述酶解液TS2组分构成如下：0.5％～1.5％纤维素酶，0.3％～0.6％果胶酶，0.3％～0.6％半纤维素酶，0.45～0.55M甘露醇，20mM KCl，10mM、pH5.7的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，10mM CaCl2，0.1％牛血清白蛋白。
所述裂解液TS1组分构成如下：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。
应用本发明的技术方案，在利用裂解液裂解植物细胞的过程中，可温和地破坏植物细胞的细胞膜，在不损伤细胞核的基础上将其释放。利用DAPI对细胞核染色进而根据其大小进行分选，可极大程度上减少植物细胞壁以及线粒体、叶绿体等细胞器中DNA的影响。利用Tn5转座酶，一方面，相对于MNase-seq等技术而言，所需的细胞数目少，另一方面，Tn5转座酶可在切割染色质活跃区域的同时，为切割好的片段加上接头序列，节约实验所需时间。利用qPCR确定额外所需循环数，可避免因PCR引入的偏好性以及扩增冗余等问题。利用两轮磁珠分选，可保留上机测序最佳文库大小，从而得到高质量上机数据。本发明利用多种技术手段，为植物叶片易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。
优选的，S1包括植物组织的称取，组织的匀浆，细胞壁的裂解，细胞膜的裂解，细胞核的过滤及纯化。
优选的，S2包括细胞核悬液的过滤，细胞核的DAPI染色，细胞核的分选，细胞核的洗涤。
优选的，S3包括染色质的Tn5转座酶处理，酶切产物的纯化。
优选的，S4和S5包括纯化DNA的PCR，PCR所需额外循环数的确定，剩余PCR产物的继续扩增。
优选的，S6包括PCR产物的纯化，纯化产物的片段筛选，文库浓度检测，文库质量的Bioanalyzer检测，文库的高通量测序，数据的生物信息学分析。
实施例1：
一种适用于牡丹花叶转座酶可接近性染色质分析的建库方法，参照图1的流程图，具体实施步骤如下：
(1)细胞核的分离。
a.称取200mg牡丹花叶。
b.用锋利的刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状。
c.加入2.5mL TS2酶解液酶解4h以去除细胞壁。TS2酶解液的配制为：0.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，0.3％半纤维素酶，0.5M甘露醇，20mmol/L KCl，10mmol/L MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，pH 5.7)混合液置于56℃水浴10min，冷却至室温后，加入10mmol/L CaCl2，0.1％BSA，并用0.45μm滤膜过滤。
d.酶解后，4℃、400rpm离心10min，弃去上清液。
e.沉淀加入2.5mL预冷的TS1裂解液，移液器反复吹打重悬后，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min。TS1裂解液的组成为：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mM β-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。
f.完全裂解后，用滤布过滤两次，收集滤液。
g.滤液用密度50％、45％、37.5％、35％分层液梯度离心，400～1300rpm离心20min。
h.收集分离的细胞核，加600μL TS1裂解液重悬。
(2)细胞核的DAPI染色和分选。
a.使用40μm的无菌过滤器对细胞核悬液进行过滤。
b.收集滤液用DAPI染色。
c.利用流式细胞仪，根据细胞核的大小进行分选，收集40000个细胞核。
d.收集的细胞核离心，4℃、1300rpm离心15min，弃去上清。
e.沉淀用洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤缓冲液的组成为：10mM Tris-HCl pH8.0，5mM MgCl2。
(3)Tn5转座酶反应。
a.转座酶修饰。转座酶包被接头序列：
Adapter1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.1)
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.2)，
Adapter2：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.3)
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.4)。
b.加入修饰后的Tn5转座酶和缓冲液进行转座反应。取10μL 5×TTBL Buffer(TruePrep Tagment Buffer L南京诺唯赞生物科技有限公司)，5μL Tn5转座酶，50ng DNA，移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，37℃水浴反应50min。
(4)酶切产物纯化
a.转座反应完成后，用Qiagen MinElute kit(全称是QIAGEN MinElute PCR Purification Kit，Cat No.28204)进行纯化。
b.酶切产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH指示剂I，市售)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column(市售)，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column(柱)放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入26μL Nuclease free water(无核酸酶水)，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(5)PCR富集
a.冰上配制以下混合液：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.各引物序列如下：
Custom Primer 1：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC index TCGTCGGCAGCGTCAGATGT-3’(SEQ ID No.5)
Custom Primer 2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT index GTCTCGTGGGCTCGGAGATG-3’(SEQ ID No.6)
P5：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’(SEQ ID No.7)
P7：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’(SEQ ID No.8)。
(6)qPCR确定额外循环数
a.冰上配制以下混合液，取5μL PCR产物进行反应，剩余产物置于冰上：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.根据qPCR结果计算额外所需循环数。计算方法为最大荧光值1/4处所对应的循环数。根据计算结果，额外所计需的循环数为7cycles，将剩余的样品放入PCR仪中继续反应。反之，则需对样品起始量及酶切时间进行优化调整。
(7)PCR产物纯化
a.PCR产物用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.PCR产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入22μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(8)文库质量评估1：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter(凝胶过滤柱)中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
数据结果如下：
(9)文库片段筛选
a.将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀。
b.根据洗脱溶液体积加入0.5×体积(25μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
d.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心取上清于新的EP管中。
e.在管中加入洗脱溶液体积的0.7×体积(35μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
f.室温孵育5min，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心去除上清。
g.保持样品始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％的乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
h.重复用酒精漂洗一次。
i.保持样品始终处于磁力架上，开盖室温干燥磁珠3min。
j.将样品从磁力架上取下来，加入适量的Nuclease free water。移液器吹打混匀，室温孵育5min。
k.样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，小心转移上清到新的离心管中。
(10)文库质量评估2：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“咔”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定
每个孔中没有气泡。
(11)文库上机
根据步骤(10)所得的文库浓度为4.68ng/μL，文库平均大小为294bp，摩尔浓度为24.49nM，将文库稀释到上机要求之后，采用Nextseq500 PE150策略进行测序，结果进行生物信息分析。
实施例2：一种适用于烟草叶片转座酶可接近性染色质分析的建库方法，参照图1的流程图，具体实施步骤如下：
(1)细胞核的分离。
a.称取200mg烟草叶片。
b.用锋利的刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状。
c.加入2.5mL TS2酶解液酶解4h仪去除细胞壁。TS2酶解液的配制为：1.3％纤维素酶，0.4％离析酶，0.3％果胶酶，0.4M甘露醇(pH 5.7)混合液置于56℃水浴10min，冷却至室温后，加入10mmol/L CaCl2，0.1％BSA，并用0.45μm滤膜过滤。
d.酶解后，4℃，400rpm离心10min，弃去上清液。
e.沉淀加入2.5mL预冷TS1裂解液，移液器反复吹打重悬后，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min。TS1裂解液的组成为：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。
f.完全裂解后，用神奇滤布过滤两次，收集滤液。
g.滤液用密度50％、45％、40％、35％分层液梯度离心，400～1300rpm离心25min。
h.收集分离的细胞核，加600μL TS1裂解液重悬。
(2)细胞核的DAPI染色和分选。
a.使用40μm的无菌过滤器对细胞核悬液进行过滤。
b.收集滤液用DAPI进行染色。
c.利用流式细胞仪，根据细胞核的大小进行分选，收集40000个细胞核。
d.收集的细胞核离心，4℃，1300rpm离心15min，弃去上清。
e.沉淀用洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤缓冲液的组成为：10mM Tris-HCl pH8.0，5mM MgCl2。
(3)Tn5转座酶反应。
a.转座酶修饰。转座酶包被接头序列：
Adapter1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’
Adapter2：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’。
b.加入修饰后的Tn5转座酶和缓冲液进行转座反应。取10μL 5×TTBL Buffer，5μL Tn5转座酶，50ng DNA，移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，37℃水浴反应60min。
(4)酶切产物纯化
a.转座反应完成后，用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.酶切产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入26μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(5)PCR富集
a.冰上配制以下混合液(同实施例1)：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.各引物序列同实施例1。
(6)荧光定量PCR确定额外循环数
a.冰上配制以下混合液，取5μL PCR产物进行反应，剩余产物置于冰上：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.根据荧光定量PCR结果计算额外所需循环数。计算方法为最大荧光值1/4处所对应的循环数。根据计算结果，额外所需的循环数为6cycles，将剩余的样品放入PCR仪中继续反应。反之，则需对样品起始量及酶切时间进行优化调整。
(7)PCR产物纯化
a.PCR产物用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.PCR产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入22μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(8)文库质量评估1：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
数据结果如下：
(9)文库片段筛选
a.将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀。
b.根据洗脱溶液体积加入0.5×体积(23μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
d.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心取上清于新的EP管中。
e.在管中加入洗脱溶液体积的0.7×体积(32μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
f.室温孵育5min，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心去除上清。
g.保持样品始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％的乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
h.重复用酒精漂洗一次。
i.保持样品始终处于磁力架上，开盖室温干燥磁珠3min。
j.将样品从磁力架上取下来，加入适量的Nuclease free water。移液器吹打混匀，室温孵育5min。
k.样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，小心转移上清到新的离心管中。
a.利用Qubit 3.0进行文库浓度测定和Agilent 2100进行文库质量评估。
(10)文库质量评估2：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
(11)文库上机
根据步骤(10)所得的文库浓度为4.24ng/μL，文库平均大小为296bp，摩尔浓度为22.04nM，将文库稀释到上机要求之后，采用Nextseq500 PE150策略进行测序，结果进行生物信息分析。
实施例3：一种适用于玉米叶片转座酶可接近性染色质分析的建库方法，参照图1的流程图，具体实施步骤如下：
(1)细胞核的分离。
a.称取200mg玉米叶片。
b.用锋利的刀片在放置于冰上的培养皿中将组织切碎成匀浆状。
c.加入2.5mL TS2酶解液酶解4h仪去除细胞壁。TS2酶解液的配制为：1.5％纤维素酶，0.5％离析酶，0.5M甘露醇(pH 5.7)混合液置于56℃水浴10min，冷却至室温后，加入10mmol/L CaCl2，0.1％BSA，并用0.45μm滤膜过滤。
d.酶解后，4℃，400rpm离心10min，弃去上清液。
e.沉淀加入2.5mL预冷TS1裂解液，移液器反复吹打重悬后，转入离心管中并置于混匀器上100～150rpm振荡5min。TS1裂解液的组成为：20mM Tris-HCl pH 8.0，75mM KCl，15mM NaCl，0.5mM精胺，10mMβ-巯基乙醇，2％PVP，0.3％TritonX-100。
f.完全裂解后，用神奇滤布过滤两次，收集滤液。
g.滤液用密度50％、47.5％、42.5％、37.5％分层液Percoll梯度离心，400～1300rpm离心25min。
h.收集分离的细胞核，加600μL TS1裂解液重悬。
(2)细胞核的DAPI染色和分选。
a.使用40μm的无菌过滤器对细胞核悬液进行过滤。
b.收集滤液用DAPI进行染色。
c.利用流式细胞仪，根据细胞核的大小对其进行分选。
d.收集的细胞核离心，4℃，1300rpm离心15min，弃去上清。
e.沉淀用洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤缓冲液的组成为：10mM Tris-HCl pH8.0，5mM MgCl2。
(3)Tn5转座酶反应。
a.转座酶修饰。转座酶包被接头序列：
Adapter1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’
Adapter2：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’。
b.加入修饰后的Tn5转座酶和缓冲液进行转座反应。取10μL 5×TTBL Buffer，5μL Tn5转座酶，50ng DNA，移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，37℃水浴反应50min。
(4)酶切产物纯化
a.转座反应完成后，用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.酶切产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入26μL Nuclease free water，室温放置2min,，13000rpm离心2min收集滤液。
(5)PCR富集
a.冰上配制以下混合液(同实施例1)：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.各引物序列同实施例1。
(6)荧光定量PCR确定额外循环数
a.冰上配制以下混合液，取5μL PCR产物进行反应，剩余产物置于冰上：
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
c.根据荧光定量PCR结果计算额外所需循环数。计算方法为最大荧光值1/4处所对应的循环数。根据计算结果，额外所需的循环数为7cycles，将剩余的样品放入PCR仪中继续反应。反之，则需对样品起始量及酶切时间进行优化调整。
(7)PCR产物纯化
a.PCR产物用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.PCR产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入22μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
h.
(8)文库质量评估1：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
数据结果如下：
(9)文库片段筛选
a.将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀。
b.根据洗脱溶液体积加入0.5×体积(25μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
d.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心取上清于新的EP管中。
e.在管中加入洗脱溶液体积的0.7×体积(35μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
f.室温孵育5min，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心去除上清。
g.保持样品始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％的乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
h.重复用酒精漂洗一次。
i.保持样品始终处于磁力架上，开盖室温干燥磁珠3min。
j.将样品从磁力架上取下来，加入适量的Nuclease free water。移液器吹打混匀，室温孵育5min。
a.样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，小心转移上清到新的离心管中。
(10)文库质量评估2：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gel matrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到spin filter中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease free water。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
(11)文库上机
根据步骤(10)所得的文库浓度为5.06ng/μL，文库平均大小为320bp，摩尔浓度为24.33nM，将文库稀释到上机要求之后，采用Nextseq500 PE150策略进行测序，结果进行生物信息分析。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 奥明（杭州）基因科技有限公司
<120> 一种适用于植物转座酶可接近性染色质分析的建库方法
<130> 2017.12
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 2
tctacacata ttctctgtc 19
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 4
tctacacata ttctctgtc 19
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgt 49
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatg 44
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agat 24
