基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法
技术领域
本发明涉及指纹图谱库及其构建方法，具体涉及一种国槐DNA指纹图谱库及其构建方 法。
背景技术
国槐Sophora japonica L.又名家槐、中国槐、槐米树等，属于豆科Leguminosaesp.槐属 Sophora L.，落叶乔木，树高可达到25米。原产地在我国北方，在我国有着深远的栽培历 史，早在秦汉时期，就已经有关于通道上夹路植槐的记载。国槐属于阳性树种，稍耐荫， 对土壤的要求并不严格，根系发达、生长快、移栽成活率高、适应能力强，此外还具有抗污染，耐烟尘，抗风等特点，能够极好的适应城市街道环境。国槐对氯化氢、氯气、二氧 化硫等许多有毒气体都有着较强的吸收及富集作用。国槐枝叶繁茂，夏秋可观花观叶，这 也使其能够成为城市良好的遮荫树种和行道树。此外，国槐在材用、药用、食用等方面也 具有重要的作用。目前关于国槐的研究还主要集中于繁殖技术、遗传转化以及种子表型性 状的变异等方面。
SSR(Simple Sequence Repeats)简单序列重复，又被称为微卫星标记，是将特异引物 PCR作为基础的最重要的分子标记之一。SSR是指通常由几个(一般为1～6个)核苷酸组 成的基因组内的基本单位经过PCR扩增，多次重复构成的一段DNA片段，在基因组内的不同位置都广泛，长度通常在200bp以下。用于SSR标记的引物是以微卫星重复序列两翼 的特定短序列为根据来设计的，作用是对重复序列本身进行扩增。扩增后的重复序列的长 度会有很大变化，所以这就成为基因多态性检测的一种行之有效方法。在植物群体中，微 卫星序列具有较高的多态性，且通常为共显性，能够非常好的鉴别出纯合子和杂合子。
遗传多样性是生物多样性的基础，群体的遗传多样性的分布在很大程度上受到迁移、 突变和天择等众多因素的影响，基因频率在一定的程度上会发生波动，即遗传多样性能够 在DNA水平上呈现出来。SSR分子标记技术是对DNA水平上遗传多样性的反映，能够反映生物种群间或个体间基因组中存在差异的特异性片段。SSR分子标记技术具有多态性高、数量丰富、在遗传上呈共显性、实验方法简单、结果稳定可靠等诸多优点，在进行亲缘关 系鉴定、标记辅助选择、品种鉴别和真实性及纯度鉴定、遗传图谱的构建等方面都具有重 要的研究及应用价值，是目前较为理想的一种分子标记。
目前，针对国槐指纹图谱数据库的构建报道较少，《国槐种子形态变异与品种/无性系 SRAP分子识别研究》中通过SRAP标记筛选12对引物Em9-Me12，构建SRAP指纹图谱， 将国槐10个品种及23份无性系品种区分开来，但是国槐品种中聊红槐仍是鉴别不出，其 鉴定品种有限且灵敏度不高，因此，亟待构建一种灵敏度高的指纹图谱库来区别鉴定国槐 的不同品种。
发明内容
针对上述问题，本发明利用SSR分子标记技术对部分国槐的遗传多样性进行分析，在 此基础上构建国槐SSR指纹图谱库，其研究结果将对国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配和杂种早期筛选提供科学依据。
本发明的第一个目的在于提供国槐DNA指纹图谱库，为从DNA水平鉴定国槐品种提供依据；
本发明的另一目的在于提供上述国槐品种标准DNA指纹图谱库的构建方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的国槐SSR标记指纹图谱的构建方法，包括16对筛选出的SSR标记引物，筛选出的16对引物扩增条带清晰，多态性好，扩增结果稳定。
所述16对SSR引物对序列见表1：
表1 16对国槐SSR引物序列
利用已建立好的国槐SSR反应体系(表3-4)，从100对引物中进行三次筛选，第一次将扩增出条带的引物保留，不能扩增出条带的引物在调整扩增体系仍不能扩增出条带时丢弃，第二次将扩增条带清晰的引物保留，通过调整体系仍扩增不出清晰条带的引物丢弃，第三次将扩增多样性好的引物保留，根据此程序筛选出16对条带清晰，稳定性强，多态性好的引物。
上述所述国槐DNA指纹图谱库的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)国槐各品种基因组DNA提取：采用改良的CTAB法进行提取；所述国槐品种DNA来自下表所述的国槐品种，见表2
(2)SSR标记的PCR扩增：用筛选出的16对SSR引物对上述提取的DNA进行PCR 扩增；
(3)毛细管电泳检测；
表2供试的233份国槐古树种质
优选的，所述的步骤(1)中改良的CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
a.65℃预热DNA提取缓冲液2×CTAB 700μL，β-巯基乙醇20μL，10％PVP140μL，充分混匀。
b.称取0.5g幼嫩国槐叶片，装入2mL离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min，至国槐叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的CTAB700μL，然后放入65℃水浴锅中水浴30min 左右，水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。
c.水浴后冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
d.吸取上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇，温和翻转至充分混合均 匀，室温12000rpm离心10min。
e.吸取上清液于新的离心管中，并加入2倍体积-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于 -20℃静放30min-1h。
f.用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀，用1mL 75％的乙醇和无水乙 醇洗涤2-3次，置于通风处吹干。
g.加60μLddH2O溶解DNA，-20℃保存待用。
所述步骤(a)中DNA提取缓冲液2×CTAB包括100mM Tris-HCl(PH8.0)，1.4mMNaCl， 50Mm EDTA(PH8.0)，2％CTAB；
进一步,优选的，所述的步骤(c)中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；
进一步,优选的，所述的步骤(d)中氯仿、异戊醇体积比为24:1；
优选的，所述的步骤(2)中SSR-PCR反应体系见表3
表3 SSR-PCR国槐反应体系的组成
优选的，所述的步骤(2)中SSR-PCR反应程序采用采用touch-down程序，具体如表 4：
表4 PCR扩增反应程序
本发明采用touch-down程序是为了有效避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优 化过程。Touch-down PCR程序每循环降低0.5℃都会造成每个循环PCR产物量的较大差异， 相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。
优选的，所述的步骤(3)中毛细管电泳检测，用16对筛选出的已标记不同荧光的引物进行PCR扩增，在96孔上样板的每个孔中分别加PCR产物、甲酰胺和GS-500LIZ分 子量内标混匀，离心，变性，4℃冷却后离心，DNA测序仪ABI3730xl DNA analyzer (Appliedbiosystems,Foster City,USA)进行自动荧光检测。利用Gene-Marker2.2.0软 件(SoftGenetics LLC,USA)读取结果，并记录每个位点片段大小。
进一步，优选的，所述PCR产物、甲酰胺、GS-500LIZ分子量内标的用量比为0.3μL：9.5μL：0.5μL；
进一步，优选的，所述变性为95℃变性5min。
通过上述方法所构建的国槐SSR指纹图谱库见实施例结果分析中表7。
本发明所述构建方法在国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配和杂种早期筛 选中的应用。
本发明国槐SSR指纹图谱库是在利用SSR分子标记技术对部分国槐的遗传多样性进行 分析的基础上进行构建，其研究结果将对国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配 和杂种早期筛选提供科学依据。
本发明的有益效果为：
1、应用本发明国槐DNA指纹图谱库鉴别国槐品种具有重复性好、稳定可靠、检测快速的优点，为利用SSR分子标记技术鉴别国槐品种提供了依据。本发明使国槐品种鉴别不再受时空条件的限制。
2、本发明国槐SSR指纹图谱库是在利用SSR分子标记技术对部分国槐的遗传多样性 进行分析的基础上进行构建，其研究结果将对国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合 选配和杂种早期筛选提供科学依据。
说明书附图：
图1引物1302扩增结果MDL50 DNA Marker。
图2引物756扩增结果MDL50 DNA Marker。
图3引物2844扩增结果MDL50 DNA Marker。
图4引物1820扩增结果MDL50 DNA Marker。
图5引物1663扩增结果MDL50 DNA Marker。
图6引物1970扩增结果MDL50 DNA Marker。
图7引物2114扩增结果MDL50 DNA Marker。
图8引物1060扩增结果MDL50 DNA Marker。
图9引物2541扩增结果MDL50 DNA Marker。
图10引物2028扩增结果MDL50 DNA Marker。
图11引物2434扩增结果MDL50 DNA Marker。
图12引物2270扩增结果MDL50 DNA Marker。
图13引物3049扩增结果MDL50 DNA Marker。
图14引物1527扩增结果MDL50 DNA Marker。
图15引物953扩增结果MDL50 DNA Marker。
图16引物1609扩增结果MDL50 DNA Marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1)国槐材料
本研究的实验材料为233份国槐古树种质(表1)，主要来自山东潍坊、泰安、东营、临沂、菏泽、烟台、滨州、德州、淄博、济宁、日照、聊城、枣庄的国槐古树。所有国槐 古树种质均为2012年从原生地采集整理后嫁接保存于山东省林业科学研究院饮马泉苗圃及 章丘实验基地。本研究采用的国槐古树种质材料基本涉及山东省内各市、县、乡的国槐古 树。
2)国槐基因组DNA提取
国槐基因组DNA的提取采用改良的CTAB法，以国槐的幼嫩叶为材料进行提取。并根据国槐体内含有酚类和蛋白较多等特点加以改良。
1、65℃预热DNA提取缓冲液2×CTAB(100mM Tris-HCl(PH8.0),1.4mM NaCl,50MmEDTA(PH8.0),2％CTAB)700μL,β-巯基乙醇20μL，10％PVP140μL，充分混匀。
2、称取0.5g幼嫩国槐叶片，装入2mL离心管中，加入直径约为2mm的钢珠两粒，放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒，用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min，至国槐叶片呈细粉末状，向每个离心管中迅速加入预热的CTAB700μL，然后放入65℃水浴锅中水浴30min 左右，水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。
3、水浴后冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，v/v/v)，温和 翻转至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
4、吸取上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,v/v)，温和翻转 至充分混合均匀，室温12000rpm离心10min。
5、吸取上清液于新的离心管中，并加入2倍体积(约1mL)-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇，于-20℃静放30min-1h。
6、用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀，用1mL 75％的乙醇和无水乙 醇洗涤2-3次，置于通风处吹干。
7、加60μLddH2O溶解DNA，-20℃保存待用。
3)16对核心SSR引物的筛选
利用已建立好的国槐SSR反应体系(表3-4)，从100对引物中进行三次筛选，第一次将扩增出条带的引物保留，不能扩增出条带的引物在调整扩增体系仍不能扩增出条带时丢弃，第二次将扩增条带清晰的引物保留，通过调整体系仍扩增不出清晰条带的引物丢弃，第三次扩增将多样性好的引物保留，根据此程序筛选出16对条带清晰，稳定性强，多样性好的引物，扩增结果如图1-图16.
SSR-PCR反应体系，见表3
表3 SSR-PCR国槐反应体系的组成
CR扩增反应程序(采用touch-down程序)，见表4
表4 PCR扩增反应程序
4)筛选出的16对核心SSR引物对供试品种进行PCR扩增：
16对核心引物见表2：
表2 16对国槐SSR引物序列
4)毛细管电泳
SSR荧光标记毛细管电泳技术是对SSR引物采用不同颜色的荧光染料进行标记，将不 同荧光标记的PCR扩增片段差异较大的产物与标准分子量样品(内标)混合后，在同一泳道进行电泳。毛细管电泳具有高效、灵敏、自动化等优势。用16对荧光标记引物对233份 国槐种质进行扩增，采用四重荧光毛细管电泳技术，同时完成对4对引物扩增条带的检测， 检测的效率得到显著提高
在96孔上样板的每个孔中分别加0.3μL纯化的PCR产物，9.5μL甲酰胺和0.5μL GS-500LIZ分子量内标，离心，95℃变性5min，4℃冷却后离心，利用DNA测序仪ABI3730 xl DNAanalyzer(Applied biosystems,Foster City,USA)进行自动荧光检测。利用 Gene-Marker2.2.0软件(Soft Genetics LLC,USAS)读取结果，并记录每个位点片段大小。
5)遗传多样性评价参数
观察荧光定量PCR扩增的结果，统计扩增出的条带。按照大写英文字母的顺序进行记 录，即同一位点的最大等位基因可记为A，其余的等位基因依次记为B、C、D、E等，如 果在某一位点上只扩增出一条带，则按照纯合基因型来处理。用PopGen32软件处理所得数 据，计算各位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望 杂合度(He)、Shannon多样性指数(I)、Nei遗传多样性指数(H)、固定指数(F)等， 这些是反应群体遗传多样性的基础指标。
平均等位基因数(Na):Na＝∑ai/n，ai为第i个位点上的等位基因数，n为测定位点总数；
平均有效等位基因数(Ne)：Ne＝∑ne/n,ne＝1/∑pi2,ne为单个位点上有效等位基因数， pi为单个位点上第i个等位基因频率，n为测定位点总数；
平均观察杂合度(Ho):实际观察到的杂合个体数占全部个体总数的比率；
平均期望杂合度(He):He＝∑he/n，he＝1-∑pi2,he为单个位点上的杂合度，pi为单个位 点上第i个等位基因频率，n为检测位点总数；
固定指数(F)：F＝1-Ho/He,Ho为实际观察杂合度，He为平均期望杂合度。当群体中纯合体过量时F＞0，当杂合体过量时F＜0。
6)指纹图谱的构建
指纹图谱代码构建方法参考杨柳燕等(2017)和贾会霞等(2015)图谱代码构建方法。
7)结果分析
a.国槐遗传多样性分析
16对SSR引物对山东省内采集的233份国槐古树种质进行毛细管电泳，共扩增出136 个等位基因，扩增产物长度介于80-250bp之间，每对引物扩增出的等位基因数4-13个不等， 平均每对引物扩增出8.5000个，多态性位点检出率为100％。等位基因数最少的为引物2541 和1527，扩增出4条多态性谱带，等位基因数最多的为引物2844，扩增出13条谱带。233 份国槐种质的有效等位基因数最大值为2128引物的5.4373，最小值为1820引物的2.5177， 平均有效等位基因数为3.8945。从表5中可以看出，不同位点的Shannon多样性参数差距 不是特别大，最大值为位点2844的1.9088，位点1527的Shannon多样性指数值最小为 1.1535，平均Shannon多样性指数(I)为1.5347，表明国槐的遗传多样性较高。国槐不同位点间的Shannon多样性指数从1.1535-1.9088不等，说明不同位点对国槐基因多样性程度的贡献不同。
有效等位基因数(Ne)和杂合度(Ho/He)是目前较为广泛使用的遗传多样性分析指数， 杂合度同时也反应群体中等位基因的丰富和均匀程度。从表6中可以看出，国槐233份种 质在16个位点上的有效等位基因数(Ne)在2.5177-5.4373之间，观察杂合度(Ho)在0.1682-0.8112之间，期望杂合度(He)在0.6041-0.8178之间，Nei遗传多样性指数在0.6028-0.8161之间，说明国槐种质的遗传多样性较高，但各位点对多样性的贡献差距不大。
表5 SSR位点的遗传多样性参数
观察杂合度(Ho)的最大值是0.8112，处于2128位点上，最小值是756位点的0.1682， 平均观察杂合度为0.6176；期望杂合度(He)的最大值是2128位点的0.8178，最小值是1820 位点的0.6041，平均期望杂合度为0.7301。固定指数F＝1-Ho/He，当F＞0时，国槐种质在 该位点的纯合体过量，当F＜0时，国槐种质在该位点的杂合体过量。由表6所示，国槐种 质在16个位点上的固定指数均大于0，756位点上的最大固定指数最大，为0.7757，2128 位点的固定指数最小，为0.0081，16个位点的平均固定指数为0.1417，总体表明，233份 国槐个体在16个位点上的杂合度不足。
表6 16个位点的杂合度和固定指数
b.指纹图谱库(指纹图谱代码构建方法参考王静毅等和马红勃等图谱代码构建方法)
利用16对SSR核心引物对233个国槐古树种质进行PCR分析，经毛细管电泳检测，统计得到所有233份国槐种质的指纹图谱库如表7。
每对SSR引物可以扩增出不同的多态性条带，依据扩增条带分子量从大到小的顺序记 录各个条带的分子量，再将引物按照固定顺序进行编号，依次为A、B、C······，如果一份材料经同一引物扩增出多条条带，则用“-”链接数字，每个品种的DNA经不同 的引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，便形成了该品种的 SSR指纹图谱代码(如某品种的SSR指纹图谱代码为A150B300-100C0，则表示该品种 经A引物扩增出现了分子量为“150bp”条带，经B引物扩增出现了分子量为“300bp” 和“100bp”两条条带，经C引物没有扩增出条带)
字母与引物名称的对应关系：
A：2541，B：2128，C：2114，D：1970，E：2844，F：3049，G：1609，H：1302，I：1060， J：2434，K：1820，L：1663，M：953，N：1527，O：2270，P：756
表7国槐古树种质SSR指纹图谱数据库
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制， 所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出 创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省林业科学研究院
<120> 基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法
<130> 2010
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgttgaat ggaatttgga cac 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctctctgaa tatctcttcc ccc 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attcggaaga ggttgttgac at 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
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<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
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<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
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<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
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<210> 15
<211> 23
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<213> 人工序列
<400> 15
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<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
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<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
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<210> 18
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<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
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<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
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<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
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<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
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<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
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<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
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<210> 25
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<212> DNA
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<400> 27
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<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
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<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
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<210> 30
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<212> DNA
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<400> 30
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<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
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<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
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