用于筛选甲状腺癌中突变的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2015年12月31日申请的美国专利申请No.62/273,783和2016年12月28日申请的美国专利申请No.62/439,572,的权益和优选权，其内容在此处通过引用而整体并入全文。
技术领域
本技术涉及用于确定患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的患者能否从诊断手术(如腺叶切除手术(lobectomy))获益的方法。这些方法基于筛选患者的甲状腺结节和检测对应于特定组的甲状腺癌相关基因的靶核酸序列中的改变。还提供了在实践所述方法中使用的试剂盒。
背景技术
提供本技术背景的以下描述仅仅是为了帮助理解本技术，并且不承认描述或构成本技术的现有技术。
甲状腺癌是最常见的内分泌器官的恶性肿瘤，并且其发病率在美国和全世界范围内持续增加。Rahib L et al.,Cancer Res.74:2913-2921(2014)。甲状腺癌常发生在甲状腺结节中，甲状腺结节在一般人群中是常见的，尤其随着年龄的增长。然而，绝大部分的甲状腺结节是良性的。弄清良性结节和癌症之间的精确差异保证患癌患者接受适当的明确的治疗，不必要的治疗如诊断手术对于良性结节患者来说是可以避免的。细胞学检查后的甲状腺结节的超声引导细针穿刺(FNA)是常见的诊断方法，其在大多数情况下，允许检测癌症或者确立良性结节的诊断。然而，20％到30％的FNA细胞学样品产生3种类型的未确定细胞学诊断中的1种：意义不明的异型性/未确定意义的滤泡性病变(AUS/FLUS)、卵泡或嗜酸细胞(Hurthle细胞)肿瘤/疑似卵泡或嗜酸细胞(Hurthle细胞)肿瘤(FN/SFN)、和疑似恶性肿瘤(SUSP)，因此其会妨碍这些患者的临床管理。Gharib H.Endocr Pract.10:31–39(2004)；Greaves TS et al.,Cancer 90:335–341(2000)；Sclabas GM et al.,Am J Surg 186:702–710(2003)；Cooper DS et al.,Thyroid 16:109–142(2006)。
分子技术，即甲状腺结节中的最常见的突变标记(BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ)的7-基因小组和Affirma基因表达分类器为FNA细胞学提供显著的诊断改善，虽然利用两种方法的癌症检测的整体准确度并不十分高。Nikiforov YE et al.,J Clin Endocrinol Metab.94:2092–2098(2009)；Cantara S et al.,J Clin Endocrinol Metab.95:1365–1369(2010)；Ohori NP et al.,Cancer Cytopathol.118:17–23(2010)；Moses W et al.,World J Surg.34:2589–2594(2010)；Chudova et al.,J Clin Endocrinol Metab.(2010)；Alexander EK et al.,N Engl J Med.367:705–715(2012)。
由于硬化或钙化结节的事实，FNA样本中遗传学变化的检测会进一步复杂，同时具有大面积囊性退化或坏死的结节产生质量不足的FNA样本。而且，从福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)甲状腺组织分离的肿瘤DNA的质量通常是差的，因为FFPE过程中经常将DNA降解成小的片段和具有损伤其自身DNA碱基对的潜力。
因此，实际需要更稳固的和更敏感的方法来有效监测甲状腺结节样品中的遗传学变化的存在，尤其是在FFEP组织和FNA样品中。这些方法将会预测个体患者是否会从诊断手术(如叶切手术)中获益以及预测患者体内恶性肿瘤的整体风险。
本技术概述
一方面，本技术的所述方法和组合物用于确定患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的患者能否从诊断手术(如腺叶切除手术)获益的方法。在一些实施方案中，患者处于患有甲状腺癌的风险中，或怀疑患有甲状腺癌。认为本文公开的方法允许快速和灵敏地检测靶核酸序列中的下列突变：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX。本公开还提供了允许快速和灵敏地检测下列靶核酸序列中的易位：RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK。
一方面，本公开提供用于检测受试者中多个甲状腺癌相关基因中的至少一个突变的方法，所述方法包括(a)从获自所述受试者的FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第一组多个扩增子的末端上；和(d)使用高通量大规模并行测序来检测第一组多个扩增子中的至少一个中的至少一个突变。
在所述方法的一些实施方案中，第一组多个扩增子使用表1中公开的至少两个引物对产生。
在所述方法的一些实施方案中，所述检测的至少一个突变是下列基因中的突变：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX。在一个实施方案中，检测到的至少一个突变选自：AKT1E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T。
在一些实施方案中，使用不多于1ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用1-5ng、5-10ng、10-15ng、15-20ng、20-25ng、1-10ng或1-20ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用1-25ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用至少25ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。
此外或备选地，在一些实施方案中，所述方法包含检测所述受试者中RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的一个或多个中的基因融合产物，所述方法包括(a)从获自所述受试者的FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的每一个；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端；和(e)使用高通量大规模并行测序来检测第二组多个扩增子中的至少一个中的至少一个基因融合产物。
在所述方法的一些实施方案中，使用表2中公开的至少两个或多个引物来产生第二组多个扩增子。
在所述方法的一些实施方案中，检测到的至少一个基因融合产物是RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的易位。在某些实施方案中，检测的至少一个基因融合产物选自：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显子12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12、TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12、CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5、PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15、AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20、EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外显子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
在任何上述实施方案中，使用焦磷酸测序、可逆染料-终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、通过合成测序、通过连接测序或SMRTTM测序进行高通量大规模并行测序。
在所述方法的任何上述实施方案中，所述接头序列是P5接头、P7接头、P1接头、A接头或Ion XpressTM条形码接头(barcode adapter)。
此外或备选地，在一些实施方案中，第一组多个扩增子进一步包含独特的索引序列。此外或备选地，在一些实施方案中，第二组多个扩增子进一步包含独特的索引序列。
在所述方法的一些实施方案中，所述FNA甲状腺样品被诊断为AUS/FLUS、FN/SFN或SUSP。在所述方法的一些实施方案中，所述基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶是ΔZ05-金聚合酶或KAPA HiFi。在所述方法的一些实施方案中，所述具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶是AmpliTaq
另一方面，本公开提供选择患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的受试者进行诊断手术的方法，所述方法包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因中的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(d)选择进行诊断手术的受试者，如果检测到对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、RET、TERT和EIF1AX的第一组多个复制子中的至少一个中的突变。
在所述方法的一些实施方案中，第一组多个扩增子使用表1中公开的至少两个引物对产生。
在所述方法的一些实施方案中，检测的突变是选自：AKT1E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T。
在一些实施方案中，使用不多于1ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用1-5ng、5-10ng、10-15ng、15-20ng、20-25ng、1-10ng或1-20ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用1-25ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA来产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用至少25ng的从所述FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取的DNA产生第一组多个扩增子。
此外或备选地，在一些实施方案中，用于筛选进行诊断手术的患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的受试者的方法包括检测受试者中下列基因的一个或多个中的基因融合产物：RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK，所述方法包括(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的每一个；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(e)选择进行诊断手术的患者，如果检测到对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的第二组多个扩增子的至少一个中的突变时。
在所述方法的一些实施方案中，所述第二组多个扩增子使用表2中公开的至少两个引物产生。
在所述方法的一些实施方案中，检测到的基因融合产物选自：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显子12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12、TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12、CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5、PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15、AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20、EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外显子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
在所述方法的一些实施方案中，所述接头序列是P5接头、P7接头、P1接头、A接头或Ion XpressTM条形码接头。
此外或备选地，在一些实施方案中，所述第一组多个扩增子进一步包含独特的索引序列。此外或备选地，在一些实施方案中，所述第二组多个扩增子进一步包含独特的索引序列。
在所述方法的一些实施方案中，所述FNA甲状腺样品被诊断为AUS/FLUS、FN/SFN或SUSP。在所述方法的一些实施方案中，所述基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶是ΔZ05-金聚合酶或KAPA HiFi。在所述方法的一些实施方案中，所述具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶是AmpliTaq
在所述方法的一些实施方案中，所述诊断手术是腺叶切除手术。
另一方面，本公开提供在具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者中预测恶性肿瘤风险的方法，所述方法包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第一组多个扩增子的末端上；和(d)当检测到对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、RET、TERT和EIF1AX的第一组多个扩增子的至少一个中的突变时，鉴定具有恶性肿瘤高风险的患者。
此外或备选地，在一些实施方案中，在具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者中预测恶性肿瘤风险的方法包括检测所述受试者中RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的一个或多个中的基因融合产物，其包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的每一个；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(e)当检测到对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的第二组多个扩增子的至少一个中的基因融合产物时，鉴定受试者具有恶性肿瘤高风险。
在所述方法的一些实施方案中，检测到的突变选自：AKT1E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T。在所述方法的一些实施方案中，检测到的基因融合产物选自：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显子12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12,TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12、CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5、PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15、AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12,、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20、EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外显子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
附图简要说明
图1显示了用于本技术方法的靶特异性扩增和文库制备的两步PCR试验方案。
图2A显示了表1中公开的引物对序列的最终浓度。图2B显示了表2中公开的引物对序列的最终浓度。
图3总结了试点验证研究的结果。使用本文公开的方法测定残余甲状腺样本以及5％Horizon标准突变混合物(Horizon Diagnostics，HDxTM参考标准，英国剑桥)。预先经由BARF等位基因特异性PCR(ASO)和RAS焦磷酸测序结果分析临床样本。
图4显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的批内再现性，同时检测单个核苷酸变异和插入/缺失。
图5显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的批内再现性，同时检测基因融合产物。
图6显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的批间再现性，同时检测单个核苷酸变体和插入/缺失。
图7显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的批间再现性，同时检测基因融合产物。
图8显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的分析灵敏度，同时检测FFPE样品(A)或FNA样品(B)中的单个核苷酸变体，以及FFPE样品(C)中的插入/缺失。还显示了存在于未稀释的或混合的样品内的不同突变型等位基因的预期的和观察到的频率。
图9显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的分析灵敏度，同时检测FFPE样品(A)或FNA样品(B)中的基因融合产物。
图10显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的分析物检测极限(最小的DNA输入需求量)，同时检测FFPE样品(A)或FNA样品(B)中的单个核苷酸变体。
图11显示了本技术的甲状腺癌筛选下一代测序(NGS)方法的分析物检测极限(最小RNA投入需求量)，同时检测FFPE样品(A)或FNA样品(B)中的易位。
图12(A)显示了使用本文公开的筛选方法的Horizon突变混合物对照样品(Horizon Diagnostics，HDxTM参考标准，英国剑桥)中已知变体的总回复。图12(B)显示了依照由平均值±2SD确定的已知变体的可接受频率范围(％)。
图13(A)提供了当使用本技术的基于NGS的甲状腺癌筛选方法和用于针对40个甲状腺临床样本和8个非甲状腺FFPE样本的甲状腺癌(BRAF、RAS、RET/PTC1/3、PAX8/PPARγ)7-基因小组时而获得的结果的比较。图13(B)总结了对于40个甲状腺临床样本的结果，所述样本经由本技术的基于NGS的甲状腺癌筛选方法和对于甲状腺癌的7-基因小组进行分析。2步PCR方法筛选BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中的突变，和RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK和ALK中的易位。
图14显示了不同DNA聚合酶关于GC富集TERT启动子扩增的对比性能。
图15(A)显示了从具有100-2000个测定输入拷贝范围的gBlack融合片段的选出RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK和ALK易位的回复。图15(B)显示了来自gBlack融合片段(400个输入拷贝)的THADA和FGFR2易位变体的回复。
发明详述
本公开提供用于确定患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的患者能否从诊断手术(如腺叶切除手术)获益的方法。这些方法基于筛选患者的甲状腺结节和使用基于高灵敏度PCR的NGS测定检测对应特定组的甲状腺癌相关基因的靶核酸序列中的变化。还提供了在实践所述方法中使用的试剂盒。
FFPE样本对于几乎每个疑似癌症病例的诊断是不可或缺的，并且估计的数百万个存档样品可以提供许多关于疾病进展和治疗的分子信息资源。虽然FFPE技术是保护组织以用于下游分子分析的标准并且方便存档，但是在福尔马林溶液中保存组织导致了大量的蛋白与其他蛋白、与核酸的交联，以及导致了核酸片段化。FFPE技术可以导致DNA的部分变性并且可以导致对DNA碱基对本身的损害，从而损害NGS测定的准确度。而且，甲状腺活检样本中可用的总核酸的量通常是有限的(<10ng DNA和RNA组合起来)，从而使得检测FFPE组织或FNA样品中的遗传学改变变得极其困难。传统NGS流程一般要求至少10-50ng的核酸输入。
本技术的一个目的是开发基于高灵敏度PCR的NGS筛选测定，其从来自FFPE样品和FNA样品的总核酸输入要求来看是经济的，并且可以同时检测特异性靶向的外显子、启动子区域、或预筛选组的甲状腺癌相关基因的其他基因区域中的广泛突变。
在一个方面中，本文公开的方法要求较少的来自FFPE样本或FNA样品的DNA输入，相较于其他现有的基于PCR的NGS甲状腺癌筛选测定法。
本文所公开的方法用于预测患者是否处于患有甲状腺癌的风险中，或者预测具有疑似患有甲状腺癌风险的患者能否从诊断手术(例如叶切手术)中获益。此外，本技术的方法用于在患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的受试者中预测恶性肿瘤的风险。因此，在FFPE过程期间的DNA降解/部分DNA变性似乎不会影响本技术筛选测定的灵敏度。
定义
如本文所用，除非另有说明或从上下文来看显见的，关于数字的术语“大约”通常被认为包括在数字的+/-1％-5％(大于或小于1％-5％)范围内的数字。
如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增(amplify)”或“扩增(amplification)”指的是增加核酸序列总体在样品中的呈现的方法。核酸扩增方法，例如PCR、等温方法、滚环法等，是本领域技术人员所熟知的。在扩增反应中体外产生的特定核酸序列的拷贝称之为“扩增子”或“扩增产物”。
术语“接头”指的是短的、化学合成的核酸序列，其可用于连接到核酸序列的末端从而促进其连接到另一个分子上。接头可以是单链或双链的。接头可以并入用于PCR扩增或测序的短(通常少于50个碱基对)的序列。
如本文所用，基因或基因产物(如标记基因或基因产物)的“改变”指的是在该基因或基因产物内存在一个或多个突变，与正常或野生型基因相比，其影响该基因或基因产物的量或活性。与正常的或健康组织或细胞(如对照)中的基因或基因产物的数量、结构和/或活性相比，遗传改变可以导致癌症组织或癌症细胞中的基因或基因产物在数量、结构和/或活性上的变化。例如，与正常的、健康组织或细胞相比，与甲状腺癌相关联的改变可以在癌症组织或癌症细胞中具有改变了的核酸序列(如突变)、氨基酸序列、染色体易位、染色体内倒置、拷贝数、表达水平、蛋白水平、蛋白活性。示例性突变包括但不限于点突变(如沉默、错义或无义)、缺失、插入、倒置、连接突变、复制、易位、染色体间或染色体内重排。突变可以出现在基因的编码区域或非编码区域。在某些实施方案中，所述改变与表型相关，如癌症表型(如甲状腺癌风险、进展或治疗的响应能力的一个或多个表型)。在一个实施方案中，所述改变与下列的一个或多个相关：针对甲状腺癌的遗传风险因子、阳性治疗响应预测因子、阴性治疗响应预测因子、阳性预后因子、阴性预后因子或诊断因子。
术语“癌症”或“肿瘤”可互换地使用，并且其指的是具有的致癌细胞的典型特性的细胞的存在，例如不可控的增殖、永生性(immortality)、转移潜能、快速生长和增殖率和某些特征性的形态学特点。癌症细胞通常以肿瘤形式存在，但这些细胞在动物中单独存在，或者可以是非致瘤的癌症细胞。如本文所用，术语“癌症”包括恶化前的，以及恶性的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是甲状腺癌。
如本文所用的关于多聚核苷酸(即核苷酸(如寡核苷酸或靶核酸)序列)的术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”指的是碱基配对原则。如本文所用的核酸序列的互补序列是指当与核酸序列比对使得一个序列的5’末端与另一个序列的3’末端配对时，处于“反平行关联”的寡核苷酸。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”互补。某些在天然存在的核酸中不常见的碱基可能包括于本文所述的核酸中。这些核酸包括，例如，肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(Locked Nucleic Acids，LNA)、和肽核酸(Peptide Nucleic Acids,PNA)。互补性不需完美；稳定的双链体可以包含错配的碱基对，退化的或不匹配的碱基。核酸技术领域中的那些技术人员可以根据经验考虑到许多变量来确定双链体的稳定性，所述变量包括，例如，寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率。互补序列还可以是RNA序列与DNA序列的互补或者其互补序列，并且也可以是cDNA。
如本文所用，“对照”是用于比较目的在实验中使用的备选样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。如本文所用的“对照核酸样品”或“参考核酸样品”指的是来自对照或参考样品的核酸分子。在某些实施方案中，参考或对照核酸样品是野生型或非突变的DNA或RNA序列。在某些实施方案中，纯化或分离所述参考核酸样品(如，将其从天然状态下去除)。在另一些实施方案中，所述参考核酸样品来自非肿瘤样品，如来自相同或不同受试者的正常邻近肿瘤或任何其他非癌症样品。
如本文所用的“检测”指的是确定样品中感兴趣的核酸中的改变或突变的存在。检测不要求方法提供100％灵敏度。
如本文所用的“基因”指的是包括对于RNA的生产所必需的调控和编码序列的DNA序列，所述RNA可能具有非编码功能(如核糖体或转运RNA)或者可能包括多肽或多肽前体。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分(只要保留了所需的活性或功能)编码。虽然核酸序列可以以DNA形式显示，但是本领域中的普通技术人员可识别出相应的RNA序列具有相似的序列，其中胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，即“T”被“U”取代。
在核酸扩增反应的背景下，“热启动”指的是一种方案，其中至少一种关键试剂从反应混合物中被截留(或者，如果存在于反应混合物中，则试剂保持无活性)直至温度升高至足以提供一种或多种引物的必需的杂交特异性。“热启动酶”是一种酶，通常是核酸聚合酶，其能够充当热启动方案中的“截留”或非活性试剂。例如，一些热启动酶可以由经化学修饰的酶获得。热启动酶的实例包括ΔZ05-金聚合酶(Gold polymerase)、KAPA HiFi和AmpliTaq
术语“5′-3′外切核酸酶活性”指的是核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，其中从核酸链的5'末端去除核苷酸，例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段则没有。
“基本上缺乏5′-3′外切核酸酶活性”的聚合酶指的是相比Taq DNA而言具有50％或者更少(如，<25％，<20％，<15％，<10％)的5′-3′外切核酸酶活性的聚合酶。测定5′-3′外切核酸酶活性的方法和测定条件在例如美国专利No.5,466,591中描述。缺乏5′-3′外切核酸酶活性DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段；缺少N-端235氨基酸的栖热水生菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶(如美国专利No.5,616,494中所述和本领域中通常称之为“Stoffel片段”)。其他实例包括热稳定性DNA聚合酶，其具有充分的缺失(如N端缺失)、突变、或修饰以清除或失活负责5′-3′外切核酸酶活性的结构域，例如ΔZ05聚合酶、ΔZ05-金聚合酶等。参加，例如U.S.Pat.No.5,795,762。
如本文所用术语“杂交”指的是如下的过程：两个充分互补的核酸链(在一段约至少14至25个核苷酸上至少约65％互补，至少75％，或至少90％互补)在适当严格条件下彼此退火从而通过在互补碱基对间形成氢键以形成双链体或异源双链核酸分子。杂交通常地和优选地在探针长度核酸分子下进行，优选15-100核苷酸长度，更优选18-59核苷酸长度。在Sambrook等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y中描述了核苷酸杂交技术。杂交和杂交强度受这些因子如核酸间的互补性程度、涉及的条件严格性、和形成的杂交物的热熔点(Tm)的影响。本领域技术人员理解如何估计和调整杂交条件的严格性，以致具有至少所需互补性的程度的序列可以稳定的杂交，而那些具有较低互补性的序列不会杂交。例如杂交条件和参数，参见，如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等，1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.。在一些实施方案中，特异性杂交在严格的杂交条件下发生。特异性针对靶核酸的寡核苷酸或多聚核苷酸(如探针或引物)将会在适当的条件下与靶核酸“杂交”。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换地使用，并且指的是个体有机体、脊椎动物、哺乳动物或人。在优选的实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“文库”指的是核酸序列的集合，如源自全基因组、亚基因组、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段或其组合的核酸的集合。在一个实施方案中，一部分的或全部的文库核酸序列包含接头序列。该接头序列可以位于一端或两端。该接头序列用于如测序方法(如NGS方法)、扩增、反转录或克隆入载体中。
文库可以包含核酸分子的集合，如靶核酸序列(如肿瘤核酸序列)、参考核酸序列或其组合。在一些实施方案中，所述文库的核酸序列可以源自单个受试者。在其他实施方案中，文库可以包含来自多于一个受试者(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多个受试者)的核酸序列。在一些实施方案中，来自不同受试者的两个或更多文库可以组合在一起以形成具有来自多于一个受试者核酸序列的文库。在一个实施方案中，所述受试者是患有癌症或肿瘤或处于患癌症或肿瘤风险的人。
“文库核酸序列”指的是核酸分子，如DNA、RNA或其组合，所述核酸分子是文库的成员。通常地，文库核酸序列是DNA分子，如基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，文库核酸序列是片段化的如剪切的或酶促制备的基因组DNA。在某些实施方案中，所述文库核酸序列包含来自受试者的序列和非源自受试者的序列，如接头序列、引物序列或其他允许识别的序列，如“条形码(barcode)”序列。
如本文所用术语“多重聚合酶链式反应(multiplex PCR)”指的是两个或多个PCR产物或扩增子的扩增，所述产物或扩增子各自使用不同引物对填充。
如本文所用的“下一代测序或NGS(Next-generation sequencing or NGS)”指的是任何测序方法，所述方法确定任一个体核酸分子的核苷酸序列(如单个分子测序)或以高通量平行方式克隆扩增个体核酸分子的代用品(proxy)(例如，同时对大于103、104、105或以上分子进行测序)。在一个实施方案中，文库中的核酸物质的相对丰度可以通过计算经测序实验产生的数据中的同源序列存在的相对数量来估计。下一代测序方法例如在Metzker,M.Nature Biotechnology Reviews 11:31-46(2010)中有描述。
如本文所用的“寡核苷酸”指的是在骨架上具有核酸碱基序列的分子，所述骨架主要由以明确的间隔存在的相同单体单元构成。所述碱基按照其可以和具有与寡核苷酸碱基互补的碱基序列的核酸结合的方式设置在骨架上。最常见的寡核苷酸具有磷酸糖单元的骨架。在2'位置处不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸和在2'位置处具有羟基的寡核糖核苷酸间会产生差异。寡核苷酸还可以包括衍生物，衍生物中羟基的氢被有机基团(如烯丙基)取代。所述方法的作为引物或探针的寡核苷酸一般是至少大约10-15个核苷酸长，并且优选至少大约15-25个核苷酸长，即使在所述方法中可能使用更短或更长的寡核苷酸。精确的大小将会取决于许多因素，所述因素反过来取决于寡核苷酸的最终作用或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括例如化学合成、DNA复制、质粒或噬菌体DNA的限制性内切酶消化、反转录、PCR或其组合。寡核苷酸可以由下列来修饰：如添加甲基、生物素或异羟洋地黄毒苷(digoxigenin)基团、荧光标签，或者使用放射性核苷酸。
如本文所用，术语“引物”指的是寡核苷酸，其当置于与靶核酸链互补的引物延伸产物被诱导的合成条件下时能够充当核酸序列合成的起始点，所述合成条件即为在适当的缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅酶因子等)中的不同核苷三磷酸和聚合酶的存在下在和在适用的温度下。可以通过例如添加甲基、生物素或异羟洋地黄毒苷基团、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰一个或多个引物核苷酸。引物序列无需反映模板的精确序列。例如，非互补核苷酸序列可以与引物的5′端连接，引物的其余部分和链基本上互补。本文所用的术语引物包括所有形式的引物，所述引物可以是合成的，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸修饰的引物、标签引物等。如本文所用的术语“正向引物”意指退火成dsDNA的反义链的引物。“反向引物”退火成dsDNA的有义链。
如本文所用，“引物对”指的是一起用于扩增关注核酸的指定区域的正向和反向引物对(即左引物对和右引物对)。
如本文所用，“样品”指的是用于测试关注核酸中存在的突变的物质。释放或以其他方式提供用于检测的核酸的处理方法可包括核酸操作的步骤。生物样品可以是体液或组织样品。在一些情况下，生物样品可以由血液、血浆、血清、尿液、排泄物、表皮样品、阴道样品、皮肤样品、脸颊拭子、精液、羊水、培养的细胞、骨髓样品、肿瘤活检、抽吸绒毛和/或绒毛膜绒毛、培养的细胞等构成。还可以使用新鲜的、固定的或冻结的组织。在一个实施方案中，所述样品可以以冻结的样品或以甲醛或多聚甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)的组织制品进行保存。例如，样品可以包埋在基质例如FFPE块或冻干样品中。以EDTA、ACD或肝素作为抗凝血剂收集的约0.5至5ml全血样品是适用的。在一些实施方案中，所述样品是FNA样品。
如本文所用的关于本技术方法的术语“灵敏度”是检测异源序列群体中的预选序列变体的方法的能力的量度。方法针对F％的变体具有S％的灵敏度，如果给定样品中预选序列变体以样品中序列的至少F％存在，所述方法可以以预选的C％置信度来检测预选序列，即次数的S％。举例来说，方法针对5％的变体具有90％灵敏度，如果给定样品中的预选变体序列以样品中序列的至少5％存在，所述方法可以以99％的预选可信度(即10次中有9次)，来检测预选序列(F＝5％；C＝99％；S＝90％)。
如本文所用的关于寡核苷酸引物的术语“特异的”意指当寡核苷酸和核酸比对时，所述引物的核苷酸序列与待扩增的核酸的部分具有至少12个碱基的序列一致性。特异性针对核酸的寡核苷酸引物是一种在严格杂交或洗脱条件下能够与关注靶标杂交而与不关注核酸基本上不杂交的引物。较高的序列一致性是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和更优选至少98％的序列一致性。
如本文所用的“特异性”是从人工序列或其他密切相关序列中区别出真实存在的预选序列变体的方法的能力的量度。其是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可能是由于在样品制备过程中引入到关注序列的差错、测序差错、或像假基因或基因家族成员这样的密切相关基因的无意测序引起。方法具有X％的特异性，如果其应用于N总序列的样品集，其中X真(Xtrue)是真正变体和X非真(XNot true)是非真正变体，所述方法选出非真正变体的至少X％作为非变体。例如，方法具有90％的灵敏度，如果其应用于1000个序列的样品集，其中500个序列是真正变体和500个是非真正变体，所述方法选出该500个非真正变体序列的90％作为非变体。示例性特异性包括90、95、98和99％。
如本文所用的术语“严格的杂交条件”指的是与下列一样严格的杂交条件：在50％甲酰胺、5xSSC、50mM NaH2PO4、pH 6.8、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5x Denhart's溶液中在42℃杂交过夜；用2x SSC、0.1％SDS在45℃洗涤；和用0.2x SSC、0.1％SDS在45℃洗涤。在另一个实例中，严格的杂交条件不应该允许在一段20个连续核苷酸上相差超过两个碱基的两个核酸杂交。
如本文所用，术语“靶序列”和“靶核酸序列”指的是待分析样品中的待检测和/或待定量的特异性核酸序列。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是为获得获益的或所需的临床结果的行为，所述结果包括但不限于疾病或状态(如退化、局部或完全的)的一个或多个标志或症状的减缓或改善、减少疾病的程度、疾病的稳定性(如不恶化、实现稳定疾病)状态、疾病状态的改善或减轻、疾病进展率或时间、和缓解(不论部分或总体)。
甲状腺癌
在乳头状甲状腺癌(PTC)中发生的最常见突变是BRAF和RAS中的点突变，以及RET/PTC和NTRK1重排。所有的这些能够活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在超过70％的PTC中发现了这些互相排斥的突变。Adeniran AJ et al.,Am J Surg Pathol.30:216–222(2006)；Kimura ET等，Cancer Res.63:1454–1457(2003)；Soares P et al.,Oncogene 22:4578–4580(2003)；Frattini M et al.,Oncogene 23:7436–7440(2004)。在滤泡性甲状腺癌中最常见的畸变是RAS突变或PAX8/PPARγ重排。这些突变也是互相排斥的，并且在70％-75％的滤泡性甲状腺癌中出现。Nikiforova MN et al.,J Clin Endocrinol Metab.88:2318–2326(2003)。
涉及PI3K/AKT信号通路的遗传学改变也在甲状腺癌中发生，尤其是进展的和去分化肿瘤中。Garcia-Rostan G等，Cancer Res.65:10199–10207(2005)；Santarpia L等，J Clin Endocrinol Metab.93:278–284(2008)；Hou P等，Clin Cancer Res.13:1161–1170(2007)。已知发生于低分化的和间变性癌中的其他突变涉及TP53、AKT1和CTNNB1。Kondo T等，Nat Rev Cancer 6:292–306(2006)。甲状腺髓样癌(家族性和分散性)经常携带位于RET和RAS的点突变。de Groot JW et al.,Endocr Rev.27:535–560(2006)；Moura MM et al.,J Clin Endocrinol Metab.96:E863–868(2011)。其他体细胞突变(例如TSHR基因中的那些)已经在一些甲状腺结节中报道，虽然它们的患病率和诊断学仍不清楚。Garcia-Jimenez C&Santisteban P.Arq Bras Endocrinol Metabol.51:654–671(2007)；Nishihara E et al.,Endocr J.56:791–798(2009)。
NGS平台
在一些实施方案中，高通量、大规模并行测序使用可逆染料终止子进行通过合成法测序。在其他实施方案中，通过边序列边连接进行测序。下一代序列技术的实例包括但不限于焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序等。
Ion TorrentTM(美国生命技术公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)扩增子测序系统使用基于流动的方法，所述方法能够检测由于DNA复制中的非修饰的核苷酸的并入过程中的氢离子释放导致的pH变化。为了使用此系统，首先通过生成两侧有测序接头的DNA片段来产生测序文库。在一些实施方案中，这些片段可以通过乳液PCR在颗粒上克隆扩增。然后将带有扩增模板的颗粒置于硅半导体测序芯片中。在复制过程汇总，芯片充满了一个接一个的核苷酸，并且如果核苷酸与芯片的特定微孔中的DNA分子互补，那么它将被并入。当核苷酸通过DNA分子中的聚合酶并入，质子会自然释放，其导致可检测的局部pH变化。然后溶液的pH在该孔中发生变化并由离子传感器检测到。如果在模板序列中出现均聚物重复，则将在单个循环中并入多个核苷酸。这会导致相应数量的释放氢和较高的成比例的电子信号。
454TM GS FLX TM测序系统(罗氏，德国)在大规模并行焦磷酸测序中使用基于光学的检测方法。焦磷酸测序利用DNA聚合，即每次添加一种核苷酸种类并且通过连接的焦磷酸盐的释放而射出的光来检测和定量添加到指定位置的核苷酸的数量。为了使用454TM系统，将接头连接的DNA片段固定于油包水乳液中的小DNA捕获珠，并且利用PCR进行扩增。将每个DNA结合的珠置于铬尖晶石(picotiter)板的孔中，测序试剂经板的孔递送。在测序运行期间，四种DNA核苷酸经整个铬尖晶石板装置以固定顺序依次添加。在核苷酸流动期间，与每个珠子结合的上百万拷贝的DNA被平行测序。当将与模板链互补的核苷酸添加到孔中时，核苷酸会并入现有的DNA链中，生成被仪器中的CCD相机记录的光信号。
基于可逆染料终止子的测序技术：首先将DNA分子附着在载玻片上的引物上并扩增，以形成局部克隆集落。添加四种类型的可逆终止子碱基(RT-bases)，和洗掉非并入的核苷酸。不同于焦磷酸测序，DNA一次只能延伸一个核苷酸。相机拍下荧光标记的核苷酸图像，然后以化学方法从DNA中去除带有末端3'阻断子的染料，允许进行下一轮。
Helicos的单分子测序使用添加了polyA尾接头的DNA片段，所述DNA片段附着在流动细胞表面。在每轮中，添加DNA聚合酶和单一种类的荧光标记的核苷酸，形成表面固定的引物-模板双链体的模板依赖性延伸。读数由Helioscope测序仪完成。在获得平铺整个阵列的图像之后，化学切割和荧光标记的释放允许随后的延伸和成像循环。
通过合成法测序(SBS)，像“旧式”染料终止电泳测序，依赖于通过DNA聚合酶并入核苷酸来确定碱基序列。将具有附着接头的DNA文库变性成单链并移接于流动孔中，然后进行桥式放大以便在玻璃芯片上形成高密度的斑点阵列。可逆终止子方法使用可逆形式的染料终止子，即每次添加一个核苷酸，通过重复去除阻断基团来检测每个位置的荧光以允许另一个核苷酸的聚合。核苷酸并入的信号可以随已经全部使用过的荧光标记的核苷酸、磷酸盐驱动的光反应和氢离子传感而变化。SBS平台的实例包括Illumina GA和HiSeq 2000。个人测序系统(Illumina,Inc.)还通过使用方向终止子化学合成进行测序。
与利用合成方法的测序相反，通过连接方法的测序使用DNA连接酶来确定靶序列。此测序方法依赖于通过模板DNA链上的局部互补性使得相邻的寡核苷酸的酶促连接。此技术利用固定长度的所有可能寡核苷酸的分区，根据测序位置标记。对寡核苷酸进行退火和连接，并且用于匹配序列的通过DNA连接酶的优先连接，导致在此位置处的二核苷酸编码的色彩空间信号(通过释放荧光标记的探针，所属探针对应于与低聚糖一起的已知位置的已知核苷酸)。这种方法主要由Life Technologies’的SOLiDTM测序仪使用。在测序前，利用乳液PCR扩增DNA。所得的珠(每个仅包含相同DNA分子的拷贝)沉积在固体平面基底上。
SMRTTM测序基于通过合成方法的测序。在孔底具有捕获工具的零模式波导(ZMW)-小孔样容器中合成DNA。使用未修饰的聚合酶(附着于ZMW底部)和在溶液中自由流动的荧光标记的核苷酸进行测序。以这样的方式构建孔，即仅检测在孔底部发生的荧光。荧光标记在其并入DNA链时与核苷酸分离，留下未修饰的DNA链。
本技术的甲状腺癌筛选方法
本文公开了至少部分基于与甲状腺癌相关的预选组基因的方法和测定。这种预选的基因使得能够应用测序方法，特别是依赖于大量不同基因(例如来自甲状腺肿瘤样品或对照样品)的大规模平行测序的方法。
在一个实施方案中，本技术中特征的方法在多重的、多基因测定形式中使用，例如，并入来自大量基因中的大量不同遗传改变的多个信号的测定。
本技术中的方法基于基于以下原理：筛选患者的甲状腺结节中预选的一组甲状腺癌相关基因中的一个或多个改变的存在，其可用于确定患者能否从诊断性手术(例如，肺叶切除术)中受益，其中预选组的甲状腺癌相关基因对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX。在所述方法的一些实施方案中，通过测定多个扩增子来检测BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1A中存在的一个或多个突变，其中至少一个扩增子对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX的每个。此外或备选地，在一些实施方案中，所述方法包括筛选患者的甲状腺结节中的一个或多个选自由下列组成的组的基因中存在的易位：RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK。
与其他可比较的基于PCR的NGS筛选小组相比，本技术方法的显著优点是本文公开的筛选测定所需的最小DNA输入比其他可比较的甲状腺癌筛选小组低约5至10倍。例如，本文公开的方法的最小DNA输入为1ng，而其他NGS方案需要至少10ng(例如，ThyroSeq系列)。在本技术方法中应用的2步PCR方法允许提高有限遗传材料的富集，所述遗传材料从FFPE和FNA甲状腺样品中分离，且所述方法在检测临床相关的涉及甲状腺癌的遗传改变中具有高灵敏度。本技术的方法还放弃了在DNA或cDNA文库生成期间进行切口平移和接头连接步骤的需要，从而使所公开的方法更省时且更具成本效益。
一方面，本公开提供了用于检测受试者中多个甲状腺癌相关基因的至少一个突变的方法，所述方法包括(a)从获自所述受试者的FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第一组多个扩增子的末端上；和(d)使用高通量大规模并行测序来检测第一组多个扩增子中的至少一个中的至少一个突变。
在所述方法的一些实施方案中，检测到的至少一个突变是BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中的突变。在一个实施方案中，检测到的至少一个突变选自：AKT1E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T。
在一些实施方案中，使用不多于1ng的从FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品提取的DNA产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用1-5ng、5-10ng、10-15ng、15-20ng、20-25ng、1-10ng或1-20ng的从FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品提取的DNA产生第一组多个扩增子。在所述方法的一些实施方案中，使用至少25ng的从FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品提取的DNA产生第一组多个扩增子。
在所述方法的一些实施方案中，所述FNA甲状腺样品已经被诊断为AUS/FLUS、FN/SFN或SUSP。在所述方法的一些实施方案中，所述的基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶为ΔZ05-金聚合酶或KAPA HiFi。
在所述方法的一些实施方案中，使用引物对产生第一组多个扩增子，所述引物对识别和特异性杂交至下列的一个或多个：BRAF的外显子15，NRAS的外显子2、3或4，HRAS的外显子2、3或4，KRAS的外显子2、3或4，PIK3CA的外显子10或21，TP53的外显子5、6、7、8或9，CTNNB1的外显子3，PTEN的外显子5、6、7或8，TSHR的外显子9或10，AKT1的外显子3，GNAS的外显子8或9，RET的外显子10、11、12、13或15，TERT的启动子，和EIF1AX的外显子2、5或6。
在所述方法的一些实施方案中，使用表1中公开的至少两对、至少三对、至少四对、至少五对、至少十对、至少十五对、至少二十对或至少二十五对或更多的引物来产生第一组多个扩增子。
表1：用于DNA文库的引物对
FWD＝正向引物；REV＝反向引物
此外或备选地，本文公开的方法用于在受试者中检测在一个或多个以下中的基因融合产物：RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK，所述方法包括(a)从获自所述受试者的FFPE甲状腺样品或FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的每一个；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(e)使用高通量大规模平行测序来检测第二组多个扩增子中的至少一个中的至少一个基因融合产物。
此外或备选地，在所述方法的一些实施方案中，检测到的至少一个基因融合产物是RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的易位。在某些实施方案中，检测到的至少一个基因融合产物选选自：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12、TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12,CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5、PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15、AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20、EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外显子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
在所述方法的一些实施方案中，所述FNA样品已经被诊断为AUS/FLUS、FN/SFN或SUSP。在所述方法的一些实施方案中，具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶是AmpliTaq
此外或备选地，在所述方法的一些实施方案中，使用表2中公开的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少八个、至少十个或至少十二个或更多的引物来产生第二组多个扩增子。
表2：用于RNA文库的引物对
其中
Fwd＝正向引物；Rev＝反向引物；
“THADA_PPARG_iso1_1”指的是THADA_Exon27_F-PPARG_内含子2a_R_TAG；
“THADA_PPARG_iso2_1”指的是THADA_Exon27_F-PPARG_内含子2b_R_TAG；
“THADA_7p_1”指的是THADA_Exon27_F-Chr7p_非编码_R_TAG；
“THADA_IGF2BP3_1”指的是
THADA_Exon28_F-IGF2BP3_Exon4__R_TAG；
“TRA2A_THADA_1”指的是TRA2A_Exon7_F-THADA_Exon37_R_TAG；
“FGFR2_OFD1_1”指的是FGFR2_Exon16_F-OFD1_Exon3_R_TAG；和
“VCL_FGFR2_1”指的是VCL_Exon1_F-FGFR2_Exon18_R_TAG。
在任何上述实施方案中，单个引物、或引物对中的一个或两个引物包含与引物的靶特异性序列部分的5'末端连接的序列标签。这个序列标签是已知序列的短寡核苷酸，所述已知序列可以为随后的PCR反应提供装配位点。在某些实施方案中，使用含有序列标签的引物扩增对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX的特异性区域的扩增子以产生序列标记的扩增子。在其他实施方案中，使用含有序列标签的引物扩增对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的特异性区域的扩增子以产生序列标记的扩增子。
在任何上述实施方案中，序列标记用作经由后续PCR反应将特异性接头序列(也称为测序接头)并入至扩增子中的一端或两端上的机制。
在任何上述实施方案中，所应用的引物不包含接头序列(但包含序列标签)，且随后将寡核苷酸测序接头并入到随后的PCR反应中所得到的序列标记的扩增子的一端或两端。如图1所示，第一次PCR反应利用含有靶特异性序列和序列标签的引物对，其用作第二次PCR反应的引物位点。第二次PCR反应包含条形码序列和文库接头，所述接头使扩增子能够与流动细胞结合。
测序接头是序列已知的短寡核苷酸，所述寡核苷酸可以既为扩增也为邻近的、未知靶核酸的测序提供装配位点。同样的，接头允许将片段与流动细胞结合以用于下一代测序。在随后的PCR反应中可以将任何接头序列并入到序列标记的扩增子的一端或两端。
在一些实施方案中，在随后的PCR反应期间产生的所有正向引物包含相同的接头序列。在进行双链测序的一些实施方案中，在随后的PCR反应期间产生的所有正向引物包含相同的接头序列，且在随后的PCR反应期间产生的所有反向扩增子包含不同于正向扩增子的接头序列的相同接头序列。在一些实施方案中，所述接头序列进一步包括索引序列(也称为索引标签、“条形码”或多重标签(MID))。
在任何上述实施方案中，所述接头序列是推荐用于Illumina测序仪的P5和/或P7接头序列。参见，如Williams-Carrier et al.,Plant J.,63(1):167-77(2010)。在一些实施方案中，接头序列是推荐用于美国生命技术公司测序仪的P1、A或Ion XpressTM条形码序列。其他接头序列在本领域中是已知的。一些制造商推荐与他们提供的特定测序技术和机器仪器一起使用特定的接头序列。
此外或备选地，在任何上述实施方案中，对对应于来自多于一个的样品的BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX的特异区域的扩增子测序。在任何的上述实施方案中，对对应于来自多于一个的样品的RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的特异区域的扩增子测序。在一些实施方案中，对所有的样品同时并行测序。
在任何上述实施方案中，使用本文所述方法对对应于来自至少1、5、8、10、16、20、24、30、32、35、40、45、48、50、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376或多达384个不同样品中的BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX的特定区域的扩增子进行扩增和测序。在任何上述实施方案中，使用本文公开的方法对对应于来自1、5、8、10、16、20、24、30、32、35、40、45、48、50、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376或多达384个样品中的RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的特定区域的扩增子进行扩增和测序。
此外或备选地，在任何上述实施方案中，源自单个样品的接头标记的扩增子进一步包含索引序列，所述索引序列表明扩增子产生的来源、各样品的索引序列与来自所有其他样品的索引序列不同。同样地，索引序列的使用允许每个测序运行中多个样品混合和基于所述索引序列随后确定样品来源。在一些实施方案中，使用Access ArrayTM系统(Fluidigm Corp.，旧金山，加利福尼亚州)或Apollo 324系统在一个设置下通过同时扩增来自所述样品的核酸(Wafergen Biosystems，弗里蒙特，加利福利亚州)以产生带条形码(索引)的扩增子文库。
在任何上述实施方案中，使用含有索引序列的引物(例如正向引物和/或反向引物)产生带索引的扩增子。在文库制备期间可以包括这些作为“条形码”工具的带索引的引物以鉴定起源于特定样品来源的特定扩增子。当应用接头标记的和/或带索引的引物时，所述接头序列和/或索引序列在扩增期间并入扩增子中(与序列标签和靶特异性引物序列一起)。因此，所得到的扩增子是有测序能力的，并且不需要传统文库制备流程。此外，索引标签的存在允许来自多个样品来源的序列的差异。
在任何上述实施方案中，可以使用非连接接头的和/或非带索引的引物扩增扩增子，且在随后的PCR反应中可以随后将测序接头和/或索引序列并入到所得到的扩增子的一端或两端。在一些实施方案中，使用多重PCR方法产生扩增子文库。
对来自一个以上样品来源的带索引的扩增子分别定量，然后在高通量测序前混合。同样地，索引序列的使用允许每个测序运行中多个样品混合和基于所述索引序列随后确定样品来源。“多重技术(Multiplexing)”是多个接头标记的和带索引的文库混合到单个测序运行。当使用带索引的引物集合时，可以利用这个性能进行比较研究。在一些实施方案中，在测序前将来自多达48个不同来源的扩增子文库混合。
在产生接头标记的和任选索引标记的扩增子文库后，使用高通量、大规模平行测序对扩增子进行测序(即下一代测序)。在所述方法的一些实施方案中，使用454TM GS FLX TM焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、通过合成测序、通过连接测序或SMRTTM测序进行高通量大规模并行测序。在一些实施方案中，可以使用深度读取方法进行高通量大规模平行测序。
本技术的诊断和预后方法
另一方面，本公开提供用于选择患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的受试者进行诊断手术的方法，所述方法包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第一组多个扩增子的末端上；和(d)选择进行诊断手术的受试者，，如果检测到对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、RET、TERT和EIF1AX的第一组多个扩增子中的至少一个中的突变。
此外或备选地，在一些实施方案中，选择患有具有未确定细胞学的甲状腺结节的受试者进行诊断手术包括检测所述受试者中RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的一个或多个中的基因融合产物，包括(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于每个RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(e)选择进行诊断手术的受试者，如果检测到对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的第二组多个扩增子中至少一个中的突变。
另一方面，本公开提供在具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者中预测恶性肿瘤风险的方法，所述方法包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取DNA；(b)使用基本上缺乏5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第一组多个扩增子的DNA文库，其中至少一个扩增子对应于多个甲状腺癌相关基因的每一个，所述多个甲状腺癌相关基因包括BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX；(c)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第一组多个扩增子的末端上；和(d)当检测到对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、RET、TERT和EIF1AX的第一组多个扩增子的至少一个中的突变时，鉴定具有恶性肿瘤高风险的患者。
此外或备选地，在一些实施方案中，用于预测具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者中恶性肿瘤风险的方法包括检测所述受试者中一个或多个的RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的基因融合产物，其包括：(a)从获自所述受试者的FNA甲状腺样品中提取RNA；(b)将提取的RNA反转录成cDNA；(c)使用具有5’-3’外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶产生第二组多个扩增子的cDNA文库，其中至少一个扩增子对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的每一个；(d)通过聚合酶链式反应将接头序列并入第二组多个扩增子的末端上；和(e)当检测到对应于RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK的第二组多个扩增子中的至少一个中的突变时，鉴定受试者具有恶性肿瘤高风险。
在任何上述实施方案中，检测到的突变选自：AKT1 E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T。在任何上述实施方案中，检测到的基因融合产物选自：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显子12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12、TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12、CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5,PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15,AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20,EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外面子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
试剂盒
本公开还提供用于检测对应于预选组的本文所述的甲状腺癌相关基因的靶核酸序列中的变化的试剂盒。
本技术的试剂盒包含一个或多个引物对，所述引物对选择性杂交且用于扩增一个或多个选自以下的基因：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT、和EIF1AX。此外或备选地，本技术的试剂盒包含一个或多个引物对，所述引物对用于扩增和检测一个或多个选自以下基因中的易位：RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK。
在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含单个引物对，所述引物对杂交至选自以下的单个基因的区域或外显子：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT、和EIF1AX。在其他实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，所述引物对杂交至选自以下的单个基因的一个或多个区域或外显子：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT、和EIF1AX。在某些实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，所述引物对包含与BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中的单个基因的区域或外显子特异性杂交的单个引物对。在某些实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，所述多个引物对包含多于一个杂交至对于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中每一个的一个或多个区域或外显子的引物对。
因此，本文考虑的是本技术的试剂盒可以包含识别和杂交至选自BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中的一个或多个基因的一个或多个区域或外显子特异性的引物对。在一些实施方案中，本技术的试剂盒可以包含识别和杂交至BRAF的外显子15、NRAS的外显子2、3或4、HRAS的外显子2、3或4、KRAS的外显子2、3或4、PIK3CA的外显子10或21、TP53的外显子5、6、7、8或9、CTNNB1的外显子3、PTEN的外显子5、6、7或8、TSHR的外显子9或10、AKT1的外显子3、GNAS的外显子8或9、RET的外显子10、11、12、13或15、TERT的启动子和EIF1AX的外显子2、5或6中的一个或多个的引物对。备选地，所述试剂盒可以包含会检测选自AKT1 E17K、BRAF V600E、BRAF K601E、KRAS G13D、KRAS G12V、KRAS Q61R、KRAS G12D、NRAS Q61R、NRAS Q61K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R、PIK3CA G914R、HRAS Q61R、RET M918T、TSHR R274W、TSHR A581S、TERT-124C>T和TERT-146C>T中的一个或多个突变的引物对。
此外或备选地，本技术的试剂盒可以包含引物对，所述引物对可以检测选自RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中的一个或多个基因中的易位。备选地，所述试剂盒包含引物对，所述引物对能检测选自以下的一个或多个基因融合产物：CCDC6(PTC1)外显子1/RET外显子12、PRKAR1A外显子8/RET外显子12、NCOA4外显子10/RET外显子12、NCOA4外显子9/RET外显子12、GOLGA5外显子7/RET外显子12、TRIM24外显子9/RET外显子12、TRIM33(PTC7)外显子16/RET外显子12、ERC1(ELKS)外显子11/RET外显子12、KTN1外显子30/RET外显子12、PCM1外显子29/RET外显子12、TRIM27外显子3/RET外显子12、HOOK3外显子11/RET外显子12、CREB3L2外显子2/PPARγ外显子5、PAX8外显子7/PPARγ外显子5,PAX8外显子8/PPARγ外显子5、PAX8外显子9/PPARγ外显子5、PAX8外显子10/PPARγ外显子5、ETV6外显子4/NTRK3外显子14、BRAF外显子8/MACF1外显子15、AKAP9外显子8/BRAF外显子9、AGK外显子2/BRAF外显子8、TFG外显子5/NTRK1外显子12、TPM3外显子10/NTRK1外显子12、TPR外显子21/NTRK1外显子12、ETV6外显子5/NTRK3外显子14、STRN外显子3/ALK外显子20、EML4外显子13/ALK外显子20、EML4外显子20/ALK外显子20,EML4外显子6/ALK外显子20、TFG外显子5/MET外显子15、UACA外显子17/LTK外显子10、AGGF1外显子5/RAF1外显子8、MACF1外显子60/BRAF外显子9、THADA外显子27/PPARG内含子2a、THADA外显子27/PPARG内含子2b、THADA外显子27/Chr 7p非编码(FUS7p)、THADA外显子28/IGF2BP3外显子4、TRA2A外显子7/THADA外显子37、FGFR2外显子16/OFD1外显子3、VCL外显子1/FGFR2外显子18和SND1外显子10/BRAF外显子9。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含表1中公开的一个或多个引物对。在某些实施方案中，所述试剂盒包含表2中公开的一个或多个引物对。在某些实施方案中，所述试剂盒包含表1和/或表2中公开的一个或多个引物对。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性和缺少5'→3’外切核酸酶活性或同时具有5'→3’和3’→5'外切核酸酶活性的酶、酶辅助因子如镁或锰、盐、链延伸核苷酸如脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、修饰的dNTPs、核酸酶抗性的dNTPs或标记的dNTPs，这些对进行测定或反应如扩增和检测对应于本文公开的特定组的甲状腺癌相关基因的靶核酸序列中的变化是必需的。
在一个实施方案中，本技术的试剂盒进一步包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列以确保在实验运行期间的测定的完整性。试剂盒进一步包含用于与参考核酸样品(如非肿瘤样品)比较在肿瘤样品中本文所述的预选组的甲状腺癌相关基因中的一个或多个的水平和/或活性的方法。所述试剂盒还包括使用说明书、自动化分析软件、容器、包装如用于商业销售的包装等。
本技术的试剂盒还可以包括进行任何所公开的NGS技术的其他所需试剂。例如，所述试剂盒可以进一步包含以下中的一个或多个：接头序列、条形码序列、反应管、连接酶、连接酶缓冲液、洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂，和检测方法。通常针对特定的扩增/检测技术优化试剂盒所用的缓冲液和/或试剂。试剂盒中还可以包括用于进行所述过程的不同步骤的这些缓冲液和试剂的使用方法。
本技术的试剂盒可以包含用于制备来自实体肿瘤测试样品中的核酸的成分，所述核酸用于随后的扩增和/或检测对应于特定组的本文公开的甲状腺癌相关基因的靶核酸序列中的变化。这些样品制备成分可用于制备来自组织样品的核酸提取物。用于以上所述方法的测试样品将会基于各种因素如测定格式、检测方法的性质、和用作待测定的测试样品的特定的组织、细胞或提取物发生变化。从样品中提取核酸的方法是本领域中熟知的，并且可以容易地适用于获得与所用系统相容的样品。用于从测试样品中提取核酸的自动样品制备系统是可商购的，如Roche Molecular System的COBAS AmpliPrep系统、Qiagen的BioRobot 9600和Applied Biosystem公司的PRISMTM6700样品制备公司。
实施例
实施例1：本技术甲状腺癌筛选NGS测定的设计
实验成果涉及设计高灵敏度的基于PCR的NGS测定，所述测定可提供更精准的具有不确定性细胞学的甲状腺结节中的癌症诊断，同时使用极小量的源自FFPE样品或FNA样品的DNA(～1ng)。
本技术方法检测14个靶基因中的体细胞突变和10个靶基因中的41个基因融合产物(易位)。参见表3.
表3：甲状腺癌筛选小组
设计甲状腺癌筛选小组以测定对应于表3中所列的14个基因的特定区域的靶核酸序列中(而非整个基因的每个外显子)的突变和RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中一个或多个中的特定基因易位。基于部分的来自TCGA和COSMIC数据库的数据、报道的突变频率、已知的热点等选择这些具体的靶核酸序列(或扩增子)。
实验的重点是开发完全基于PCR的NGS筛选测定(即基于扩增子的文库制备，随后NGS)以便检测对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX的特异性区域的扩增子中的遗传学改变和RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK中一个或多个中的易位。在开发本文所述的多重PCR方法时出现的技术挑战之一是超过20个引物对的最佳选择和浓度，所述引物对在一个反应中同时杂交和扩增对应于本文公开的甲状腺癌相关基因的特定区域的靶核酸序列。实现引物对的适当平衡是重要的问题，因为不同引物对的退火效率的差异导致不同扩增子的扩增中的强偏好，其导致样品中的一些扩增子的不充分覆盖并且强烈降低了测定的灵敏度。为了最大化测序能力，所有扩增子的扩增水平应当相似。此外，大量不同引物的存在导致引物二聚体形成的风险大大增加，从而降低了可重复扩增少量靶核酸的可能性。对应于BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX特定区域的不同扩增子的最佳长度范围在100bp-150bp之间。表1和2中公开了用于本技术方法中的PCR引物对的优化组。此外，如图14所示，富含GC的区域(例如TERT启动子)的扩增也被证明是具有挑战性的。图14显示了当在相同的实验条件下测试时(0.6ng/μL输入DNA)，缺乏5'-3'外切核酸酶活性的热启动DNA聚合酶(例如，ΔZ05-金聚合酶或KAPA HiFi)能够恒定地且成功地扩增富含GC的基因靶标(如TERT启动子)，这与其他DNA聚合酶不同。
实施例2：用于验证本技术甲状腺癌筛选试验的效率的方法
该实施例证明，本技术的高灵敏度的基于PCR的NGS测定可用于检测本文公开的预选组的甲状腺癌相关基因中的突变的方法。
方法使用Agencourt Formapure提取试剂盒从FNA样品或FFPE样品中收集全部核酸。使用Qubit DNA HS测定试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行DNA定量。筛选具有至少1ng DNA的样品用于NGS分析。使用低TE将DNA浓度>30ng/μL的样品稀释至5-10ng/μL。
DNA文库从各样品的提取的基因组DNA中产生PCR扩增子文库。通过PCR(使用表1中所列引物对)扩增在14个基因内的靶区域。每个反应包括2μL样品DNA(最小DNA输入需求量是0.2ng/μL)；表1中所列的正向和反向引物不包括TERT启动子特异性引物(图2A中显示了单个引物对的最终浓度)；10mM dNTPs；ΔZ05Master混合物(Celera)；和ΔZ05金聚合酶(Celera)。在下列条件下进行PCR扩增：
使用下列设置扩增TERT启动子的富含GC的区域：
在下列条件下进行TERT启动子的PCR扩增：
RNA文库使用SuperScript III第一链合成SuperMix试剂盒(Life Technologies)在下列条件下将提取的RNA反转录成cDNA。
从来自每个样品的合成DNA产生PCR扩增文库。使用表2中所列的引物通过PCR扩增在RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK、THADA、FGFR2和ALK内的靶区域。每个反应含有5μL的样品cDNA；表2中所列的正向和反向引物(图2B中显示了单个引物对的最终浓度)；和2X AmpliTaq 360PCR master混合物(Life Technologies)。在下列条件下进行PCR扩增：
使用Apollo Ampure 1.8X实验方法(Agencourt)对PCR扩增子DNA和RNA文库进行两轮纯化。使用Qubit DNA HS测定试剂盒(Life Technologies)进行DNA定量。在下列条件下，通过第二次PCR反应将P5和P7接头序列(和索引序列一起)并入扩增子的末端。
使用Apollo Ampure 1.8X试验方案(Agencourt)对第二轮PCR反应的扩增子纯化。使用Qubit DNA HS测定试剂盒对DNA定量。通过稀释多个样品合并文库。每个文库池包含阳性对照DNA样品，包含具有已知频率的多种变体(Horizon Diagnostics,Waterbeach,Cambridge,UK)。按照厂商的方法使用MiSeq平台(Illumina)对每个文库池测序。具体地，将固定的模板克隆扩增以产生数百万个分子簇，每个分子簇含有～1,000个相同模板的拷贝。然后使用Illumina的通过合成测序技术对成簇的模板进行测序。单个NGS运行可以在Micro Flow单元(2x 150个循环)生成高达1.2GB的序列数据，或者在Micro Flow单元上生成4.5GB(2x 150个循环)的序列数据。
完成的运行的数据可在IDBS门户网站(http://sjcls0134.us.qdx.com:15100/portal/)中获得用于QC审查。检查每批次以满足最小覆盖深度(300)，以及阳性和阴性QC样品的性能。
结果如图3显示，在大致的预期频率检测阳性对照DNA样品(Horizon突变混合物)的所有已知的突变(包括SNV和INDEL)。在14个检测的临床样品中，5个具有已知突变(SJC-A05、A08、A09、D05、R-9955)，所有这些都通过本文公开的甲状腺癌筛选方法检测。而且，在5个突变阳性样品中的3个中检测到突变。例如，在样品SJC-A08中(图3)检测到与BRAF V600E突变一起的已知热点TERT启动子突变(-146C>T)。
此外，在先前被归类为突变阴性的8个临床样品中的1个中也检测到突变。例如，在R-10536中检测到KRAS G12V(2％)、BRAF V600E(3％)和AKT1E17K(3％)突变，其通过BRAF ASO和RAS焦磷酸测序测试BRAF和RAS阴性。所述RAS焦磷酸测序结果的重新评估显示KRAS G12V突变确实存在于R-10536中，然而当通过BRAF ASO测定时V600E BRAF突变仍然不可检测。
因此，这些结果证明本技术的甲状腺癌筛选测定可用于检测患有甲状腺癌风险或疑似患有甲状腺癌的受试者中本文公开的多个甲状腺癌相关基因中的至少一个突变的方法。
实施例3：本技术甲状腺癌筛选测定的精确度和分析灵敏度评价
具有已知变体(单核苷酸变体(SNV)、插入/缺失(INDEL)和基因融合)的8个样本在单次运行中测定三次，以及两次运行期间测定四次。此外，在精确度研究中包括FFPE和FNA样本(参见下列表格)。
批内精确度在所有3个批内重复中检测所有已知变体(SNV、INDEL、基因融合产物)。关于突变，样品QC1和QC4-6中变异频率的SD范围为0.1-5.8％(图4)。在样品QC2(EML4-ALK)和QC8(RET-PTC1)中检测到融合产物(图5)。
批间精确度在所有四个批间重复中检测到所有已知变体(SNV、INDEL、基因融合产物)。关于突变，样品QC和QC4-6中变体频率的SD范围为0.4-5.4％(图6)。在样品QC2(EML4-ALK)和QC8(RET-PTC1)基因中检测到融合产物(图7)。
分析灵敏度为了确定本技术方法的分析灵敏度，使用与正常甲状腺FFPE或突变/易位阴性FNA样本连续混合的4个临床样本(2个FFPE和2个FNA样本；其中2个是突变阳性和2个易位阳性)进行混合研究。关于检测突变，BRAF V600E和KRAS G12D SNV以及TP53 12-核苷酸缺失以低至1％的频率存在时均可检测到。TERT-228SNV(-124C>T)在以低至2％的频率存在时可检测到(图8)。因此，本文公开的方法能够在低至2％的频率下检测SNV和INDEL。
关于检测基因融合产物，在1:32混合的FFPE样品中检测到EML4-ALK易位(276个读数)，同时在1:32混合的FNA样品中检测到RET-PTC1易位(64个读数，图9)。因此，本文公开的方法能够在≥50个读数时始终检测基因融合产物。
检测极限研究为了确定本公开方法的最小样品需求，使用经低TE连续稀释的4个临床样品(2个FFPE和2个FNA样品；图10和11所示的2个突变阳性和2个易位阳性)进行稀释系列研究。关于检测突变，本技术方法能够以测试的最低DNA输入(0.1ng/μL，图10)检测到所有三个SNV(NRAS Q61R、TERT-250(-146C>T)、BRAF V600E)。但是，检测到的TERT-250频率偏离预期频率，水平低于0.3ng/μL。
关于检测易位，本技术的方法能够在测试的最低RNA输入处检测PAX8-PPARG易位(在21322个读数时为0.1ng/μL，图11)。相反地，RET-PTC1易位在0.3ng/μL或更高时可检测到(2812个读数，图11)。
准确性研究在多个设置中测试Horizon参考混合物(即QC1样品)以评估已知变体的回复率。基于混合计算的预期变体频率和观察到的变体频率如图12(A)中所示。通过本技术的方法检测所有已知变异，变体频率SD值范围为1.28-3.45％。参见图12(A)。图12(B)提供了已知变体的可接受频率范围。如图12(B)所示，AKT1E17K变体可接受频率范围的低点为2.5％。因此，10个验证运行中的1个(运行ID：MS-1，图12(A))未能检测到QC1样品中的AKT1E17K SNV，表明已知突变变体的98.75％(79/80)一致性回复。
设计含有选择的RET，PPARγ，NTRK1，NTRK3，BRAF，MET，LTK和ALK易位的二十六个合成双链gBlock DNA片段，并使用本技术的方法对合成双链gBlock DNA片段测定以评价这些融合变异的回复。图15(A)表明通过本技术的方法以100-2000的测定输入拷贝范围来检测所有26个合成的融合变体。设计含有THADA和FGFR2易位(以400个输入拷贝下)的7个合成的双链gBlock DNA片段，并使用本技术方法测定所述双链gBlock DNA片段以评价这些融合变体的回复。图15(B)显示当以400个拷贝存在时，通过本技术的方法检测所有7个合成的融合变体。
改进的诊断性能使用本技术的基于NGS的甲状腺癌筛选方法测定共计34个FNA甲状腺样本和14个FFPE样本(6个甲状腺，8个其他)，所述样本先前通过7基因甲状腺组小组(BRAF通过等位基因特异性PCR、RAS通过焦磷酸测序、PAX8-PPARG和RET-PTC1/3通过RT-PCR)或其他替代方法测试。
在产生有效NGS结果的40个测定的甲状腺样本中，通过7基因测定在15个样品中检测到15个变体(10个SNV，5个融合产物)。相反地，使用本技术的方法在20个样品中检测到24个变体(18个SNV，6个融合体)(参见图13(A)，总结于图13(B)中)。此外，12.5％(40个中的5个)甲状腺样本具有可操作的变体，使用本技术的基于NGS的甲状腺癌筛选方法检测所述变体，但不是常规的7基因甲状腺小组。鉴定这些可操作的变体可用于告知甲状腺癌受试者的疾病管理决定(例如，选择进行诊断性手术如肺叶切除术的受试者)。
表4表明与传统的7基因甲状腺小组相比，本技术的方法在检测具有非决定性FNA细胞学的样品中的突变方面显示出增强的灵敏度。
表4：检测具有非决定性FNA细胞学的样品中的突变
*2步PCR方法筛选BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、PIK3CA、TP53、CTNNB1、PTEN、TSHR、AKT1、GNAS、RET、TERT和EIF1AX中的突变，和RET、PPARγ、NTRK1、NTRK3、BRAF、MET、LTK和ALK中的易位。
根据表4，与7基因甲状腺小组相比，本技术的基于NGS PCR的甲状腺癌筛选方法检测到15％以上具有异常FNA细胞学结果的样品中的可操作变体。如表4所示，与7基因甲状腺小组相比，本技术的基于NGS的方法在具有非决定性FNA细胞学(AUS/FLUS、FN/SFN、SUSP)的样品中检测到两倍的可操作变体(即，10个样品对5个样品)。此外，与7基因甲状腺小组不同，本技术的方法在具有“良性”FNA细胞学的2个样品中检测到TSHR活化突变。这些诊断结果是有意义的，因为TSHR的M453T和F631L突变先前在甲状腺癌和甲状腺功能亢进甲状腺腺瘤/毒性多结节性甲状腺肿中分别有指示(Iosco&Rhoden,Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology(2009),http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/TSHRID290ch14q31.html)。此外，本技术的基于NGS的方法在100％表现出恶性FNA细胞学的样品中检测到可操作的变体。相反地，7基因甲状腺小组在仅有75％的具有恶性FNA细胞学的样品中检测到可操作的变体。因此，本文公开的方法可用于预测具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者的恶性风险，并指导这些受试者的治疗决定(例如，诊断性手术)。
这些结果表明，与常规的7基因甲状腺小组相比，本技术的基于NGS的甲状腺癌筛选方法具有改善的覆盖范围和灵敏度。因此，本技术的方法可用于预测具有非决定性甲状腺FNA细胞学结果的受试者中的恶性风险。本文公开的方法还可用于选择具有不确定细胞学的甲状腺结节的受试者以进行诊断手术。
等同物
本技术不限于本申请中描述的特定实施方案的方面，所述实施方案旨在作为本技术的各个方面的单个说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中是显而易见的。这些修改和变化旨在落入本技术的范围内。应理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。
此外，在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任何所列的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解所有语言(例如“至多”、“至少、“大于”、“小于”等)包括所述的数字，并且指的是随后可以分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
本文涉及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用整体并入，包括所有附图和表格，在某种程度上它们与本说明书的明确教导不矛盾。
