一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法。
背景技术
棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。据统计，2000—2009年我国通过国家审定及省级审定的棉花品种数量700多个。截止到2012年2月29日，已申请植物新品种保护的棉花品种达335个。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大规模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小,使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别愈加困难。同时由于形态鉴定的时效性差，工作量大，容易受到环境与主观因素的影响，品种多乱杂的现象难以得到有效控制。
DNA分子标记技术的发展促进了品种鉴定技术的进步。其中SSR标记技术以其扩增稳定、多态性丰富、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于水稻、玉米、棉花、小麦等农作物的品种鉴定。多色荧光检测技术是以不同颜色的荧光染料标记在SSR引物的5′端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小，这样既能提高检测效率又能保证数据的准确性。
然而，常规基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术构建我国棉花品种DNA 指纹库的方法，是将每对核心引物分别对待测样品进行SSR-PCR扩增反应，即进行单重SSR-PCR扩增反应，这样就得进行大量的SSR-PCR扩增反应，进而会大大地降低检测效率，尤其在进行大批量棉花品种DNA指纹库的构建时，检测效率非常低，而且在对扩增产物进行毛细管荧光电泳检测时，每次检测所用时间较长，这样也会降低检测效率。
发明内容
本发明提供一种基于毛细管四色荧光电泳检测和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种指纹库构建方法，能极大地提高检测效率，以克服现有技术存在的不足。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种基于毛细管四色荧光电泳检测系统和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将分布于棉花A亚组或D亚组全基因组26条染色体上的52对核心引物进行多重荧光PCR组合，其中每对核心引物标记有荧光染料，
所述核心引物的核苷酸序列如下表1所示：
表1
本发明依据以下多重荧光PCR组合的基本原则：①组合中标记相同荧光的各引物，其扩增产物片段范围不能交叉；②避开非特异扩增产物峰的相互影响；③采用四色荧光标记系统：其中，ROX为红色荧光，FAM为蓝色荧光，HEX为绿色荧光，分子量内标Liz-500为橙色。
所述52对核心引物的多重荧光PCR组合方式如下表2所示：
表2
(2)提取棉花DNA作为待测样品；
(3)使用步骤(1)中52对核心引物按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR-PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
(4)将步骤(3)中的PCR扩增产物进行毛细管四色荧光电泳检测与数据分析。
进一步地，所述52对核心引物分别取自棉花A亚组和棉花D亚组各26对。
进一步地，步骤(2)中所述提取棉花DNA包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mL RNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
进一步地，步骤(2)中所述提取棉花DNA包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μL SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μL体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/mL的1μL RNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μL TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
进一步地，步骤(3)中各个组合所对应pSSR-PCR扩增反应的反应液包括对应组合所有引物、PCR Buffer缓冲液、dNTPs、DNA模板、Taq HS聚合酶以及 ddH2O。
进一步地，步骤(3)中所述各个组合所对应pSSR-PCR扩增反应的反应液均为20μL，
组合1中20μL反应液包括：核心引物BA11-13上、下游各0.03μL，核心引物BD7-7上、下游各0.025μL，核心引物BD6-11上、下游各0.3μL，核心引物 A1-2上、下游各0.07μL，核心引物BD5-8上、下游各0.025μL，核心引物D12-2 上、下游各0.3μL，核心引物BA7-1上、下游各0.1μL，核心引物BD4-8上、下游各0.1μL，核心引物BA6-2上、下游各0.1μL，核心引物BD9-3上、下游各 0.3μL，核心引物BA9-11上、下游各0.1μL，且各核心引物的浓度均为 40μmol/L，2μL 10×PCR Buffer缓冲液，浓度为10mmol/L的dNTPs 0.4μL，浓度为60ng/μL的DNA模板2μL，浓度为5U/μL的Taq HS聚合酶0.25μL，12.45μL ddH2O；
组合2中20μL反应液包括：核心引物BA12-13上、下游各0.05μL，核心引物BA13-4上、下游各0.025μL，核心引物WD12-1上、下游各0.15μL，核心引物 D1-10上、下游各0.1μL,核心引物BA1-4上、下游各0.07μL，核心引物BD13-3 上、下游各0.08μL，核心引物BA5-4上、下游各0.2μL，核心引物BD7-17上、下游各0.15μL，核心引物BA7-5上、下游各0.05μL，核心引物BD6-3上、下游各0.3μL，核心引物A6-4上、下游各0.3μL，且各核心引物的浓度均为 40μmol/L，2μL 10×PCR Buffer缓冲液，浓度为10mmol/L的dNTPs 0.4μL，浓度为60ng/μL的DNA模板2μL，浓度为5U/μL的Taq HS聚合酶0.25μL，12.4μL ddH2O；
组合3中20μL反应液包括：核心引物BD10-1上、下游各0.04μL，核心引物 BD13-21上、下游各0.08μL，核心引物BA13-1上、下游各0.03μL，核心引物 BD8-13上、下游各0.03μL，核心引物BA5-10上、下游各0.2μL，核心引物BD9- 2上、下游各0.05μL，核心引物BA10-6上、下游各0.1μL，核心引物BD2-11 上、下游各0.35μL，核心引物BA12-15上、下游各0.35μL，核心引物BA10-9 上、下游各0.35μL，且各核心引物的浓度均为40μmol/L，2μL 10×PCR Buffer缓冲液，浓度为10mmol/L的dNTPs 0.4μL，浓度为60ng/μL的DNA模板2μL，浓度为5U/μL的Taq HS聚合酶0.25μL，12.19μL ddH2O；
组合4中20μL反应液包括：核心引物BD5-10上、下游各0.025μL，核心引物BD2-2上、下游各0.3μL，核心引物BA9-3上、下游各0.05μL，核心引物D3- 1上、下游各0.05μL，核心引物BA8-12上、下游各0.1μL，核心引物BD11-5 上、下游各0.06μL，核心引物D10-10上、下游各0.15μL，核心引物BA3-8上、下游各0.3μL，核心引物BD4-3上、下游各0.2μL，核心引物BA2-12上、下游各 0.3μL，且各核心引物的浓度均为40μmol/L，2μL 10×PCR Buffer缓冲液，浓度为 10mmol/L的dNTPs 0.4μL，浓度为60ng/μL的DNA模板2μL，浓度为5U/μL的 Taq HS聚合酶0.25μL，12.28μL ddH2O；
组合5中20μL反应液包括：核心引物EA8-12上、下游各0.03μL，核心引物 ED3-5上、下游各0.03μL，核心引物BD8-12上、下游各0.2μL，核心引物A2-3 上、下游各0.04μL，核心引物BD1-7上、下游各0.35μL，核心引物BD11-3上、下游各0.25μL，核心引物BA3-4上、下游各0.3μL，核心引物DA4-12上、下游各0.3μL，核心引物DA4-16上、下游各0.3μL，核心引物BA11-8上、下游各 0.35μL，且各核心引物的浓度均为40μmol/L，2μL 10×PCR Buffer缓冲液，浓度为10mmol/L的dNTPs 0.4μL，浓度为60ng/μL的DNA模板2μL，浓度为5U/μL 的Taq HS聚合酶0.25μL，11.05μL ddH2O。
进一步地，步骤(3)中所述pSSR-PCR扩增反应的程序为：94℃预变性 4min，1个循环；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环； 72℃延伸12min，1个循环；4℃保存待用。
进一步地，步骤(4)是取1μL PCR扩增产物加8.5μL去离子甲酰胺和0.5μL Liz-500分子量内标，于DNA分析仪上进行毛细管四色荧光电泳检测。
进一步地，步骤(4)中毛细管四色荧光电泳检测的条件为：预电泳15kV， 3min；2kV进样2s；电泳15kV，20min。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明基于多重荧光PCR组合的基本原则，将52对分布于棉花A亚组或D 亚组全基因组26条染色体上的核心引物进行了组合，实现了3个10重和2个11 重PCR组合，建立了适用于毛细管四色荧光电泳检测系统的多重SSR-PCR扩增体系与反应程序，并于ABI3730xl DNA分析仪上进行毛细管四色荧光电泳检测。本发明只需要进行5次pSSR-PCR扩增反应，极大地提高了检测通量，进而极大地提高了检测效率，尤其适合于大量材料的检测与分析；且在进行pSSR-PCR扩增反应时，由于Taq HS聚合酶的最适扩增温度为72℃，而32个循环后72℃延伸 12min就使得扩增产物均得到充分的加尾，保证扩增产物末端的高度一致性，避免因核心引物与样品间的差异造成加尾不充分，而且Taq HS聚合酶是热启动酶，能减少体系中非特异性扩增，这样在进行毛细管四色荧光电泳检测时不会出现一些杂峰；而且在对扩增产物进行毛细管四色荧光电泳检测时，进样时间由原来的10s降为2s，电泳时间由原来的40min降为20min，这样每次检测所用时间缩短，进而提高了检测效率；本发明中多重SSR-PCR扩增体系的构建以及毛细管四色荧光电泳检测，使检测效率提高了100倍以上，且通过分子量内标的自动比对获得扩增产物片段大小，减少人为读板误差的同时，最大程度的保证了数据结果的准确性与可靠性，该方法尤其适用于大批量棉花品种DNA指纹库的构建。
附图说明
图1为棉花品种莘547在多重荧光PCR组合1中的毛细管四色荧光电泳检测图；
图2为棉花品种莘547在多重荧光PCR组合2中的毛细管四色荧光电泳检测图；
图3为棉花品种莘547在多重荧光PCR组合3中的毛细管四色荧光电泳检测图；
图4为棉花品种莘547在多重荧光PCR组合4中的毛细管四色荧光电泳检测图；
图5为棉花品种莘547在多重荧光PCR组合5中的毛细管四色荧光电泳检测图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
构建棉花品种莘547的DNA指纹库，其中棉花品种莘547来源于中国农业科学院棉花研究所。
1、DNA提取
(1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2mL的离心管中；
(2)加入800μL DNA提取液(1％SDS，0.01mol/L EDTA 8.0，0.7mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下；
(3)水浴结束后，加入等体积800μL苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25：24：1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min；
(4)吸取上清液转移到另一2mL离心管中，加入1μL RNase酶 (10mg/mL)，混匀后37℃水浴30min。
(5)加入等体积800μL的苯酚：氯仿：异戊醇(其体积比依次为25：24： 1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。
(6)将上清液转移到另一2mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。
(7)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的离心管中，浸泡两次，第一次约2小时，第二次浸泡过夜。
(8)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μL TE(pH 8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
(9)紫外检测DNA浓度，用ddH2O将DNA原液稀释至使用浓度 60ng/μL，4℃保存备用，得到待测样品。
2、pSSR-PCR扩增
使用52对核心引物(核心引物的核苷酸序列见表1)按照多重荧光PCR组合方式组合得到的5个组合分别对待测样品进行pSSR-PCR扩增反应，得到PCR 扩增产物，52对核心引物的多重荧光PCR组合方式见表2，组合1、组合2、组合3、组合4以及组合5所对应pSSR-PCR扩增反应的20μL反应液分别如下表 3、表4、表5、表6以及表7所示，
表3
表4
表5
表6
表7
所述pSSR-PCR扩增反应的程序为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性 45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸12min，1个循环；4℃保存待用。该扩增反应体系32个循环后72℃延伸12min，使得扩增产物均得到充分的加尾，保证扩增产物末端的高度一致性，避免因引物与样品间的差异造成加尾不充分。
3、毛细管四色荧光检测
取1μL PCR扩增产物加8.5μL去离子甲酰胺和0.5μL Liz-500分子量内标，于 ABI3730xl DNA分析仪上进行毛细管四色荧光电泳检测，毛细管四色荧光电泳检测的条件为：预电泳15kV，3min；2kV进样2s；电泳15kV，20min，然后用 GeneMapper软件对检测结果进行数据采集与分析。进样时间由原来的10s降为 2s，电泳时间由原来的40min降为20min，这样每次检测所用时间缩短，进而提高了检测效率。
通过上述方法得到了棉花品种莘547的指纹信息，即构建了棉花品种莘547 的指纹数据库(简称指纹库)，棉花品种莘547的指纹信息如下表8所示，棉花品种莘547在多重荧光PCR组合1、组合2、组合3、组合4以及组合5中的毛细管四色荧光电泳检测图分别见图1、图2、图3、图4以及图5，其中各图中横坐标为扩增产物片段大小(bp)，纵坐标为峰高(代表荧光信号强度)。
表8
注：表中扩增片段大小为每对核心引物PCR扩增产物的片段大小。
