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生物标志物CBX8在子痫前期诊治中的应用

2021-02-09 19:35:20

生物标志物CBX8在子痫前期诊治中的应用

　　技术领域

　　本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在CBX8在子痫前期诊治中的应用。

　　背景技术

　　子痫前期(Preeclampsia,PE)，是妊娠期高血压疾病(hypertensive disorderscomplicating pregnancy,HDCP)的特殊类型，主要特征为:妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿和水肿，而分娩后血压恢复正常。由于地理、社会、经济和种族、文化等的差异，不同地区发病率不同。世界范围内，子痫前期发病率约为2％-8％，而我国子痫前期发病率偏高，约为9.4％。尽管越来越多的国家在不断改善母婴的健康，但每年死于妊娠相关性疾病的女性超过50万。

　　子痫前期的病因及发病机理至今尚未完全阐明，目前普遍认为，滋养细胞在子宫螺旋动脉侵入过浅和受限是子痫前期发病的关键环节。滋养细胞是构成胎盘结构的主要成分，对于胎盘形成及维持胎儿正常发育起着重要作用。在囊胚植入早期，滋养外胚层细胞即分化为两类滋养层细胞，即细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞，前者又有两种分化途径：与合体滋养层细胞融合或分化为绒毛外滋养层细胞。绒毛外滋养层细胞具有侵袭能力，一部分绒毛外滋养层细胞侵润至子宫内膜的深层、直至子宫肌层的内三分之一，称为间质滋养层细胞；一部分绒毛外滋养层细胞侵入母体子宫螺旋动脉，称为血管内滋养层细胞，并逐步取代血管内皮及血管平滑肌细胞，引起血管基底膜降解，重塑螺旋动脉(spiral artery，SPA)，形成高流、低阻SPA，以提供胎儿胎盘充足的血流量。胎盘形成过程中滋养细胞侵袭发生障碍，SPA侵入过浅，胎盘血流减少，一方面可引起胎儿宫内生长受限，另一方面滋养细胞将分泌某些细胞因子或激素，导致全身血管内皮功能损伤和炎症反应过度，引起高血压、蛋白尿等一系列临床症状，从而诱发子痫前期。滋养细胞与肿瘤细胞的浸润过程相似，不同的是滋养细胞的侵袭受到精细调控，此过程涉及复杂的细胞信号转导通路，但具体的分子机制尚未被完全阐明。研究子痫前期发病的分子机制，挑选新的、可靠的临床、生化或物理标记物对其发病进行预测，对于采取可能的预防措施以改善母儿预后、节约医疗资源具有重要的意义。

　　发明内容

　　为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与子痫前期发生发展相关的基因标志物，灵敏和特异性的实现子痫前期的诊断和治疗。

　　为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

　　本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂为检测CBX8基因或其表达产物的水平的试剂。

　　进一步，所述试剂包括：

　　特异性识别CBX8基因的探针；或

　　特异性扩增CBX8基因的引物；或

　　特异性结合CBX8基因编码的蛋白的抗体或配体。

　　进一步，特异性扩增CBX8的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

　　本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

　　本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

　　本发明的第四方面提供了一种核酸膜条，所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。

　　本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括CBX8的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。

　　进一步，所述抑制剂为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

　　本发明的第六方面提供了一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：

　　用待筛选物质处理表达或含有CBX8基因或其编码的蛋白的培养体系；和

　　检测所述体系中CBX8基因或其编码的蛋白的表达或活性；

　　其中，若所述待筛选物质可以抑制CBX8基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。

　　在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

　　在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。

　　本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：

　　a.本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用；

　　b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

　　c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

　　d.本发明第四方面所述的核酸膜条在制备诊断子痫前期的产品中的应用；

　　e.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用；

　　f.本发明第六方面所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；

　　g.CBX8在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；

　　h.CBX8在制备治疗子痫前期的候选药物中的应用。

　　附图说明

　　图1是利用QPCR检测CBX8基因在子痫前期患者中的表达情况；其中，A是胎盘组织中的表达水平，图B是血液中的表达水平；

　　图2是利用QPCR检测siRNA对CBX8基因表达的影响图；

　　图3是利用ELISA检测siRNA对CBX8蛋白表达的影响图；

　　图4显示MTT法检测CBX8对细胞增殖活性的影响图；

　　图5显示利用Transwell小室检测CBX8基因对细胞侵袭的影响图。

　　具体的实施方式

　　本发明经过广泛而深入的研究，首先通过高通量测序技术，筛选在子痫前期患者中呈现差异表达的基因，通过检测子痫前期患者中胎盘组织和血液中该基因的表达变化，进一步验证该基因与子痫前期发生发展密切相关。而后通过基因沉默技术抑制滋养细胞中该基因的表达后观察细胞活性、侵袭能力的改变，以明确该基因对滋养细胞侵袭性的影响及在子痫前期中的作用，并探讨其作用机制，为阐明子痫前期的分子机制提供线索。

　　CBX8基因

　　CBX8基因位于17号染色体长臂2区5带上，本发明中的CBX8包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，CBX8具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中CBX8基因(NM_020649.2)所示的序列。本发明的CBX8核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

　　本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

　　mRNA水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(northern blots)、核糖核酸酶保护试验和基于PCR的方法。当生物标志物是mRNA分子时，mRNA序列或其片段可以用于制备至少有部分互补的探针。然后采用例如基于PCR的方法、RNA印迹法(Northernblotting)或试纸条检测(dipstick assay)等任何合适的测定法，可以用探针检测样品中的mRNA序列。

　　所述测定方法可以根据所需mRNA信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(Northern blots)和基于PCR的方法(例如，qRT-PCR)。qRT-PCR等方法也可以对样品中mRNA的量进行准确定量。

　　任何合适的测定平台均可用于确定样品中mRNA的存在。例如，测定可以呈试纸条(dipstick)、膜(membrane)、芯片(chip)、盘(disk)、测试条(test strip)、滤器(filter)、微球(microsphere)、载片(slide)、多孔板(multiwell plate)或光纤(optical fiber)的形式。测定系统可以具有其上附着有与mRNA对应的核酸的固相支持物。所述固相支持物可包含例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物(precipitate)、凝胶、聚合物、薄片(sheet)、球、多糖、毛细管、胶片(film)、板或载片。所述测定组件可以制备后包装在一起作为用于检测mRNA的试剂盒。

　　核酸可存在于固相支持物上的特定可寻址位置中；每一个位置对应于生物标志物的mRNA序列的至少一部分。

　　在某些实施方案中，mRNA测定包括以下步骤：1)获得一种或多种生物标志物的表面-结合的探针；2)使mRNA群体与表面-结合的探针在足以提供特异性结合的条件下杂交；3)去除杂交步骤中未结合的核酸；和4)检测杂交的mRNA。

　　杂交可以在合适的杂交条件下进行，该条件的严格性可视需要而变化。典型的条件是在固体表面上在互补的结合成员之间，即在表面-结合的探针和样品中的互补mRNA之间足以产生探针/靶复合物。

　　在某些实施方案中，使用严格的杂交条件。包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间和洗涤条件的严格性在内的适当条件的选择，取决于实验设计，包括样品来源、捕获剂的种类、预期互补性的程度等等，并且可以作为常规实验手段由本领域普通技术人员来确定。

　　在mRNA杂交程序之后，将表面结合的多核苷酸洗涤以去除未结合的核酸。可以采用任何方便的洗涤方案进行洗涤。在某些实施方案中，洗涤条件是严格的。然后可以采用标准技术检测靶mRNA与探针的杂交。

　　当生物标志物是蛋白质、多肽或肽时，一些蛋白质检测和定量方法可以用于测量生物标志物的水平。在本文提供的方法中可以使用任何合适的蛋白质定量方法。在某些实施方案中，使用基于抗体的方法。可使用的示例性方法包括但不限于免疫印迹法(蛋白质印迹(western blot))、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、流式细胞术、流式细胞术微珠阵列和质谱法。ELISA的一些类型是常用的，包括直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。

　　芯片、试剂盒、核酸膜条

　　本发明提供了检测中CBX8基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CBX8所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合CBX8蛋白。

　　所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

　　本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

　　这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

　　本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测CBX8的表达。

　　作为本发明的一种可选择的实施方式，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

　　作为本发明更为优选的实施方式，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

　　更为优选的，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

　　本发明提供了一种核酸膜条，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

　　抑制剂和药物组合物

　　基于本发明的发现，本发明提供了一种(药物)组合物，所述(药物)组合物包含CBX8的抑制剂。在本发明中，组合物，药物组合物以及药物没有特殊说明，可以进行等同替代。

　　在本发明中，所述的CBX8的抑制剂包括抑制CBX8基因表达的物质、影响CBX8基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制CBX8基因表达产物活性的物质，作为对于降低CBX8基因的表达或活性有用的物质，从而可用于治疗子痫前期。举例来说，本发明的抑制剂可以是以CBX8基因为靶序列、且能够抑制CBX8基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。本发明的抑制剂也可以是以靶向CBX8蛋白的物质，包括抗体、配体、多肽等。

　　作为本发明的一种优选方式，所述CBX8的抑制剂是一种CBX8特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

　　在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染人早孕绒毛滋养细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中CBX8基因的表达水平，以促进妊娠滋养细胞的增殖。

　　本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

　　在本发明中，药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

　　在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

　　本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明中的药物组合物可以根据用药方式的不同制备合适的药物剂型。

　　本发明的药物还可与其他治疗子痫前期的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

　　下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

　　下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

　　下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物

　　1、样品收集

　　1)血清标本的收集

　　各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。

　　2)胎盘标本的收集

　　各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。

　　两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部45例标本中进行验证实验。

　　2、RNA样品的制备

　　利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

　　3、RNA样品的质量分析

　　将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

　　4、去除rRNA

　　使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

　　5、构建cDNA文库

　　利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

　　6、上机测序

　　使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

　　7、高通量转录组测序数据分析

　　对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

　　8、结果

　　RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胎盘组织相比，CBX8基因在子痫前期胎盘组织中的表达量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　实施例2 QPCR测序验证CBX8基因的差异表达

　　1、对CBX8基因差异表达进行大样本QPCR验证。

　　2、RNA提取

　　利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。

　　3、逆转录：

　　1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。

　　2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor 0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。

　　3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

　　4、QPCR检测CBX8的表达水平

　　1)引物设计

　　根据Genebank中CBX8基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

　　CBX8基因：

　　正向引物为5’-CTGACTAACCTGGAGAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

　　反向引物为5’-TTGGTCCGTGTTACTTTC-3’(SEQ ID NO.2)。

　　管家基因GAPDH的引物序列为：

　　正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)

　　反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)

　　2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix 10μl，cDNA 1μl，ddH2O 7μl。

　　3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

　　5、统计学方法

　　以GAPDH为内参，计算子痫前期胎盘组织与正常胎盘组织，子痫前期患者血液与正常孕妇血液中CBX8荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。

　　6、结果

　　结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇胎盘组织和血液中的CBX8基因的表达均显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　胎盘组织中的阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝40/45×100％＝89％，血液中的阳性检出率为41/45×100％＝93％，检测CBX8的表达水平可以用于子痫前期的辅助诊断。

　　实施例3 CBX8基因的沉默

　　1、细胞培养

　　人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

　　2、siRNA设计

　　针对CBX8基因的siRNA序列：

　　阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

　　正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

　　反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

　　siRNA1：

　　正义链为5’-UCCAUUUCACGAGGUAUUCCA-3’(SEQ ID NO.7)，

　　反义链为5’-GAAUACCUCGUGAAAUGGAAG-3’(SEQ ID NO.8)；

　　siRNA2：

　　正义链为5’-UAGAGAUAAUCUUUCCAACAA-3’(SEQ ID NO.9)，

　　反义链为5’-GUUGGAAAGAUUAUCUCUAGA-3’(SEQ ID NO.10)；

　　siRNA3：

　　正义链为5’-UUUUCUCUUUAAAAAAGCCUU-3’(SEQ ID NO.11)，

　　反义链为5’-GGCUUUUUUAAAGAGAAAAGA-3’(SEQ ID NO.12)

　　将细胞按1×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPIM-1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

　　将实验分为三组：对照组(HTR-8/SVneo)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA-NC与CBX8基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

　　3、QPCR检测CBX8基因的转录水平

　　3.1细胞总RNA的提取

　　采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

　　3.2逆转录步骤同实施例2。

　　3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

　　4、统计学方法

　　实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰CBX8基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

　　5、结果

　　结果如图2显示，相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载siRNA-NC，实验组能够显著降低CBX8基因的表达水平，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续的实验。

　　实施例4 ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中CBX8的蛋白表达

　　应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中CBX8蛋白水平。RNA干扰后48h，分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作流程定量检测细胞上清液中CBX8的浓度。

　　1、配置浓度为70000pg/ml的标准品，10倍稀释后，再进行2倍倍比稀释，共有7个稀释度。

　　2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加不同浓度梯度的标准品和待测样品各50μl。轻轻晃动混匀，酶标板加上盖，37℃反应2h。

　　3、弃去液体，晾干。每孔加200μl VEGF-C结合物。37℃，120min后，弃去孔内液体，晾干，PBS洗板3次。

　　4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光显色30min。

　　5、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。

　　6、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值。

　　7、计算样品的实际浓度。

　　8、结果如下图3所示，siRNA沉默HTR-8/SVneo细胞的CBX8基因，CBX8的蛋白含量也相应降低，说明沉默CBX8基因可以抑制CBX8蛋白的水平。

　　实施例5 MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性

　　1、细胞转染后24h，,0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在104个/ml；

　　2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；

　　3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；

　　4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。

　　5、结果

　　结果如图4所示，对照与转染siRNA1组的细胞的增殖水平无明显的差异(P>0.05)。

　　实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验

　　RNA干扰后48h后收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为106/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察CBX8基因沉默对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。

　　1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用，终浓度为1mg/ml。

　　2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。

　　3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为106/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。

　　4、24孔板中加入600μ1含20％血清的培养基，37℃、5％CO2孵箱内孵育36h。

　　5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。

　　6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。

　　7、数据处理

　　用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　8、结果

　　结果如图5所示，不同处理组的细胞在Transwell小室中培养后，实验组和对照组的穿膜细胞数出现了差异变化，siRNA1组细胞膜下室面的细胞数增加，说明CBX8基因影响早孕绒毛滋养细胞的浸润，提示CBX8可作为潜在靶标应用于子痫前期孕妇的治疗。

　　上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

　　序列表

　　<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

　　<120> 生物标志物CBX8在子痫前期诊治中的应用

　　<160> 12

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 18

　　<212> DNA