一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用。
背景技术
在表观遗传学中，甲基化是目前研究中相对较为深刻的。DNA的甲基化水平可以决定一个或者一类基因的表达或者抑制，对于细胞功能正常与否有着重要作用，进而影响人类的生命进程。所以，甲基化研究是表观遗传学研究的热门领域之一。基因组DNA水平的甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将一个甲基添加到胞嘧啶5’-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，原理如图1所示。
CpG岛(CpG island)是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp，CpG是胞嘧啶(C)—磷酸(p)—鸟嘌呤(G)的缩写，位于转录起始位点上游的启动子区域，看家基因的启动子CpG岛保持非甲基化状态，以保证看家基因的正常表达。组织特异性基因的CpG相对较少，并且在大多数组织中都处于甲基化状态。当启动子区域的CpG被甲基化时，转录受到抑制，该区域的CpG甲基化密度与转录抑制的程度有关。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化。抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化可致使相关基因表达下调，甚至不表达，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活，同时也能影响临近基因的正常表达。DNA的去甲基化破坏基因组印记，增加了患癌风险。
目前的甲基化研究方法中，主要包含：甲基化特异性PCR、重亚硫酸盐测序法、高分辨率溶解曲线法、基因组直接测序法等。最常用的方法是重亚硫酸盐的方法。该方法中，在重亚硫酸盐的作用下，DNA中未被甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，通过高通量测序检测出未被转化的胞嘧啶(C)，即为被甲基化修饰。
CN105002567A提供了一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，对样品基因组酶切和加A，获得5’末端具有磷酸化修饰和3’粘性末端A的DNA片段，将其与含有不同条形码序列的甲基化接头相连；连接产物分为两组，一组进行PCR扩增，另一组经重亚硫酸盐转化后再扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；两组PCR产物分别混合，选择相同的特定长度片段序列进行低循环PCR，扩增产物分别分离纯化构建高通量简化甲基化测序文库。该方法通量高、成本低、序列一致，无需参考基因组，在大量无参考基因组或参考基因组组装不全物种的DNA甲基化表观遗传学研究领域应用前景广阔。CN104532360A提供了一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA片段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头片段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库，通过采用不含dCTP的dNTP进行末端修复，避免了非甲基化C的引入，提高了甲基化程度分析的准确性。
但是，目前的研究中，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点。还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析。因此，提供一种甲基化修饰引物并用于以自身为对照进行甲基化位点分析，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用，本发明通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种Hemi-M甲基化修饰引物，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶；
其中，所述甲基化修饰包括：甲基化、羟甲基化等不能够被重亚硫酸盐处理转化为尿嘧啶(U)的修饰。
所述Hemi-M为甲基化Hemi-methylation的缩写。
在本发明中，发明人通过深入研究甲基化在表观遗传学中的作用，广泛探究甲基化研究方法的优缺点，发现甲基化检测的常用方中法，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点，还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析，因此结合甲基化反应的特性与测序文库的要求，通过大量创造性实验，最终摸索设计得到了一种甲基化修饰引物，能够应用于甲基化检测领域，对DNA链中的胞嘧啶(C)进行甲基化保护，产生一条链正常，另一条链胞嘧啶(C)全部被甲基化胞嘧啶(mdC)代替，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，更好的定位甲基化位点。
第二方面，本发明提供一种PCR方法，所述方法为：采用如第一方面所述的甲基化修饰引物进行PCR扩增反应，对样本DNA链进行胞嘧啶保护，其中，所述PCR扩增的dNTP中的dCTP被mdCTP替代。
优选地，所述PCR扩增的反应循环数为1-3个循环，例如可以是1个、2个或3个循环。
具体地，所述方法为：将如第一方面所述的甲基化修饰引物与dNTP(含甲基化的mdCTP，不含未甲基化的dCTP)进行甲基化文库构建的CT转化步骤前的扩增反应，对DNA互补链进行胞嘧啶保护。
第三方面，本发明提供一种甲基化文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将DNA样品进行末端修复，3’端加A，甲基化接头连接；
(2)将步骤(1)处理后的产物采用第一方面所述的甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护；
(3)将步骤(2)处理后的产物进行重亚硫酸盐处理；
(4)将步骤(3)处理后的产物进行扩增添加索引序列，得到所述甲基化文库。
优选地，若步骤(1)所述的DNA样品为gDNA，所述方法还包括对DNA样品进行片段化处理的步骤。
本发明中，若步骤(1)所述的DNA样品为cfDNA，则可以直接用于步骤(1)。
优选地，所述步骤(1)之前还包括引入标签的步骤。
优选地，所述标签的结构为反向互补，正链3’端突出，5’端未被磷酸化，负链5’端被磷酸化。
优选地，所述3’端突出为悬突胸腺嘧啶。
优选地，所述标签含有鸟嘌呤和胞嘧啶，且与第一方面所述的甲基化修饰引物结合于同一条DNA链上，且标签序列的所有胞嘧啶全部被甲基化修饰。
优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端。
优选地，所述标签为一条oligo退火形成的茎环结构，且3’端突出，5’端磷酸化。
优选地，所述标签为两条oligo退火形成两端或一端互补配对，且3’端突出，5’端磷酸化。
本发明中，所述标签存在三种情况，当一条链退火形成茎环结构；第二种情况：当两条链发生两端互补配对时形成结构；第三种情况：当两条链发生一端互补配对形成结构，三种情况示意图如图5。
优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端，经过处理后形成5’端突出，延伸后形成两端为平末端带标签的DNA片段。
本发明中，步骤(4)所述索引序列与甲基化标签不同，用于区分不同的样本；因为不同的样本混合后共同检测，需要此索引序列区分不同的样本，是构建二代测序文库时均需添加的序列。
第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的甲基化修饰引物。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的甲基化修饰引物和/或如第四方面所述的试剂盒用于制备检测癌症的药物和/或试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的甲基化修饰引物，通过与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，减少将测序结果比对回基因组序列的复杂过程，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1为本发明中基因组DNA甲基化的原理图；
图2为本发明中随机标签(Barcode 1)引入DNA片段两端的示意图；
图3为本发明中利用甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护的示意图；
图4为本发明中的随机标签(Barcode 2)引入DNA片段两端的示意图；
图5为本发明中的引入标签的三种情况示意图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中，相关术语解释：
(1)甲基化标签：反向互补双链结构，正链的5’端磷酸修饰(P○)；当两条链退火后，负链在3’端悬突胸腺嘧啶。
(2)甲基化修饰引物：引物序列中，胞嘧啶被甲基化处理为5-甲基胞嘧啶(5-mdC)。
(3)mdC：无特殊说明，mdC指5-甲基胞嘧啶。
(4)Barcode：随机标签。
(5)甲基化引物：引物序列中，所有的胞嘧啶被甲基化修饰。
(6)纯化：如无特殊标注，实施例中的“纯化”指的是磁珠纯化。
(7)退火：两条全部或部分反向互补的DNA oligo在一定反应条件下，结合为双链DNA。
(8)加A：在DNA片段3’末端加上一个腺嘌呤碱基。
实施例1
(1)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1所示：
所述SEQ ID NO.1如下：
引物1：5’GA/mdC/TGGAGTT/mdC/AGA/mdC/GTGTG 3’
所述引物修饰方法如下：
上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶(C)在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdC)。
(2)样本处理：
若被处理样本为gDNA，利用NEB公司的片段化酶将2μg样本gDNA片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的DNA片段，片段化酶处理条件：37℃，43min，将片段选择后的DNA用30μL去离子水溶解；
若被处理样本为cfDNA，可以直接用于后续实验过程。
(3)利用试剂盒NEB文库准备试剂盒进行DNA末端修复，3’端加A，甲基化接头连接。
(4)胞嘧啶(C)保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表1所示体系进行反应：
表1
PCR循环条件如表2：
表2
(5)对上述产物进行纯化，纯化后按照ZYMO DNA重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。
(6)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表3所示体系进行反应：
表3
PCR循环条件如表4所示，：95℃-30s，[95℃-15s，61℃-30s，68℃-30s]15-18个循环，68℃-5min，4℃-保持。
表4
(7)对上述产物进行纯化，-20℃保存。
实施例2
(1)一种甲基化标签，所述甲基化标签正链与负链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2即Barcode F：5’NNNNNNNNTGAAT 3’
SEQ ID NO.3即Barcode R：5’
其中，Barcode F与Barcode R反向互补，Barcode R的5’端磷酸修饰
将Barcode F与Barcode R退火为标签Barcode 1，Barcode1为双链Oligo,每条链的序列即SEQ ID NO.2和NO.3相同，只是两条链互补形成双链结构。
(2)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如下：
SEQ ID NO.1即Primer 1：5’GA/mdC/TGGAGTT/mdC/AGA/mdC/GTGTG 3’
所述引物修饰方法如下：
上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdC)。
(3)样本处理：
若被处理样本为gDNA，利用NEB公司的片段化酶将2μg样本gDNA片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的DNA片段，片段化酶处理条件：37℃，43min。将片段选择后的DNA用30μL去离子水溶解；
若被处理样本为cfDNA，可以直接用于后续实验过程。
(4)片段化DNA末端修复，3’端加A：
利用试剂盒NEB文库准备试剂盒进行DNA末端修复，3’端加A。
(5)标签Barcode 1连接：上述产物不需经过纯化，按表5所示体系进行反应，示意图如图2所示：
表5
(6)将上述产物进行纯化，利用试剂盒NEB文库准备试剂盒进行DNA末端修复，3’端加A，甲基化接头连接。
(7)胞嘧啶保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表6所示体系进行反应，示意图如图3所示：
表6
PCR循环条件如表7所示：
表7
(8)对上述产物进行纯化，纯化后按照ZYMO DNA重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。
(9)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表8所示体系进行反应：
表8
PCR循环条件如表9所示：
表9
(10)对上述产物进行纯化，-20℃保存。
实施例3
(1)一种标签，所述标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.4即Oligo：5’
Oligo的5’端磷酸化修饰，且5’端五个碱基与3’端反向互补，退火后形成茎环结构，且3’端悬突胸腺嘧啶的标签Barcode 2，，所示Barcode 2的核苷酸序列序列即SEQ IDNO.4，只是退火后自身互补形成茎环结构：
(2)一种甲基化修饰引物，所述引物序列如下：
SEQ ID NO.1即Primer 1：5’GA/mdC/TGGAGTT/mdC/AGA/mdC/GTGTG 3’
所述引物修饰方法如下：
上述甲基化引物序列中，所有胞嘧啶(C)在合成时全部被修饰为5-甲基胞嘧啶(mdC)。
(3)样本处理：
若被处理样本为gDNA，利用NEB公司的片段化酶将2μg样本gDNA片段化处理，通过磁珠或者切胶的方法选择100-250bp的DNA片段，片段化酶处理条件：37℃，43min。将片段选择后的DNA用30μL去离子水溶解；
若被处理样本为cfDNA，可以直接用于后续实验过程。
(4)片段化DNA末端修复，3’端加A：
利用试剂盒NEB文库准备试剂盒进行DNA末端修复，3’端加A。
(5)标签Barcode 2连接：上述产物不需经过纯化，按表10所示体系进行反应，示意图如图4所示：
表10
(6)在上述产物中加入3μL的USER酶和3μL的虾碱性磷酸酶(rSAP)，37℃反应30min。
(7)标签延伸：将上述产物纯化后按表11所示体系进行反应：
表11
PCR循环条件：95℃-45s，61℃-30s，68℃-5min，4℃-保持。
(8)对上述产物进行纯化，利用试剂盒NEB文库准备试剂盒进行DNA末端修复，3’端加A，甲基化接头连接。
胞嘧啶保护：将甲基化接头连接后的纯化产物按表12所示体系进行反应：
表12
PCR循环条件如表13所示：
表13
(9)对上述产物进行纯化，纯化后按照ZYMO DNA重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理、纯化。
(10)终文库扩增加索引序列：将上述纯化产物按表14所示体系进行反应：
表14
PCR循环条件如表15所示：
表15
(11)对上述产物进行纯化，-20℃保存。
综上所述，本发明提供的一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶，其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰；本发明通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，减少将测序结果比对回基因组序列的复杂过程，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
<120> 一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用
<130> 2018年
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gamdctggag ttmdcagamd cgtgtg26
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
nnnnnnnntg aat13
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ttmdcannnn nnnn 14
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(15)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 4
catagdunnn nnnnnctatg t 21
