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一种改良的全长mRNA测序的建库方法

2021-02-15 12:38:06

一种改良的全长mRNA测序的建库方法

　　技术领域

　　本发明涉及建库方法，尤其涉及一种改良的全长mRNA测序的建库方法。

　　背景技术

　　由于技术的高速发展，人们对转录组学研究有了更深入认识，在此基础上，基因表达的研究也能进入更广阔的领域。在二代测序技术日趋成熟的今天，RNA测序技术(RNA sequenceing，RNA-seq)被广泛应用于很多疾病的研究。与传统的分析方法不同，因具有高通量分析能力且不受已注释转录组数量有限的限制，RNA-seq为新基因的发现奠定了技术基础。RNA-seq是一种强大的二代测序方法，该方法用于转录组研究的优势在于具有高度精确性，其对于基因表达的分析可细化到单个碱基水平。(Huang Y，Sanguinetti G.Statistical modeling of isoform splicing dynamics from RNA-seq time series data.[J].Bioinformatics，2016，32(19)：2965-2972.)随着二代测序技术的持续发展，RNA-seq的文库制备方法及分析软件同样也在快速更新。

　　目前已有许多二代测序平台可用于分析RNA样本，不同的平台有其优点及缺点。在开始测序之前，不同技术平台对于减少r RNA表征量有不同的策略。(Schuierer S，Carbone W，Knehr J，et al.A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples[J].BMC Genomics，2017，18(1)：442-455.)如去核糖体链特异性建库，polyA富集建库，SMARTseq建库等。其中，Poly(A)+富集样本中，oligodT包衣微丸是最常用的方法，可用来对包括编码mRNA在内的转录组进行量化分析，且成本低，耗时短。目前，应用广泛的polyA富集建库试剂盒有illumina、NEB、诺为赞等，它们均采用polyA beads富集，逆转录后加接头的方法进行建库，虽然它们操作不是很复杂，但是整个建库流程消耗时间较长，而且成本较高，每个样本460元。这对于大量进行RNA建库的实验室来说不仅成本高，而且也消耗时间成本。

　　发明内容

　　本发明的目的在于提供一种改良的全长mRNA测序的建库方法。

　　为实现上述目的，本发明提供一种改良的全长mRNA测序的建库方法，其特征在于，步骤为，

　　polyA富集和RNA片段化：将NEBNext Oligo d(T)25beads和RNA Binding Buffer进行充分混匀后，室温放置去除上清，再用2X RNA Binding Buffer重悬后加入RNA，进行PCR延伸，反复室温放置后重悬，用Wash Buffer将未结合的RNA去除；加入First Strand Synthesis Reaction Buffer孵育；

　　第一链和第二链合成：向上述所得中加入逆转录引物AM-SMART-Oligo进行孵育后，再加入试剂42℃反应，再加入AM-SMART-Oligo反应得到第一链和第二链；

　　优选的，加入逆转录引物AM-SMART-Oligo到上述得到的上清中，65℃孵育，反应后置于冰上；短暂离心，加入dNTP Mix，DTT，RNase Inhibitor，SMARTScribe RT，和RNase-Free Water后反复吹打混匀，42℃反应；再加入逆转录引物AM-SMART-Oligo和SMARTScribe RT，充分混匀，42℃，90min；70℃5min，得到第一链和第二链；

　　用Agencourt AMPure XP Beads纯化逆转录反应液：上述所得加入预先平衡到室温的AMPure XP Beads，充分混匀后室温孵育，磁力架放置使溶液完全清澈后去除上清；乙醇洗涤后去上清，乙醇挥发后加无核酸酶水混匀孵育，磁力架放置使溶液完全清澈后得到上清；

　　PCR富集：向上述所得加入试剂后进行PCR扩增从而实现PCR富集步骤；

　　纯化：用Agencourt AMPure XP Beads纯化PCR产物。

　　进一步，所述polyA富集和RNA片段化为，取NEBNext Oligo d(T)25 beads到无核酸酶的PCR管中，用5倍体积的2X RNA Binding Buffer洗beads，使彻底混匀，室温放置去除上清；用2.5倍体积的2X RNA Binding Buffer重悬beads，加入2.5倍体积的RNA后65℃反应；完全重悬后室温放置，再使其完全重悬后室温放置；去除上清，加入Wash Buffer混匀，室温放置，将未结合的RNA去除；去除上清，加入First Strand Synthesis Reaction Buffer后，94℃孵育。

　　进一步，所述第一链和第二链合成为，加入逆转录引物AM-SMART-Oligo到上述得到的上清中，65℃孵育5min，反应后置于冰上；短暂离心，加入dNTP Mix，DTT，RNase Inhibitor，SMARTScribe RT，和RNase-Free Water后反复吹打混匀，42℃，60min；再加入SMART-Read1-TSO引物和SMARTScribe RT，充分混匀，42℃，90min；70℃5min，4℃保存；

　　进一步，所述AM-SMART-Oligo序列如SEQ ID NO：1所示，AM-SMART-Oligo序列如SEQ ID NO：2所示。

　　进一步，所述PCR富集步骤中，PCR的体系为，

　　任选的，PCR的反应程序为，98℃30秒，98℃10秒，65℃75秒，15个循环；65℃5分钟。

　　进一步，所述Index(X)Primer/i7 Primer序列由SEQ ID NO：3，index反向互补序列，SEQ ID NO：4所示序列组成，Universal PCR Primer/i5 Primer序列如SEQ ID NO：4所示。

　　本发明所述逆转录引物序列如下所述：

　　AM-SMART-Oligo：

　　5biotin-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNSEQ ID NO：1；其中N为简并碱基。

　　AM-SMART-Oligo：

　　5biotin-GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTrGrGrG

　　其中GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT为DNA，见SEQ ID NO：2；rGrGrG为RNA。

　　Index(X)Primer/i7 Primer：

　　5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTA[index反向互补序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′

　　其中CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTA 如SEQ ID N0：3所示，

　　GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T 如SEQ ID N0：4所示，其中33位的C硫代修饰。

　　其中index反向互补序列选自如下序列：

　　Universal PCR Primer/i5 Primer：

　　5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3′

　　SEQ ID N0：5，其中57位的C(硫代修饰)。

　　本发明开发了一种低成本、快速的、高效率的改良的全长mRNA测序的建库方法。与NEB的建库试剂盒相比，建库速度快，操作简单，仅需6步，建库效率一致，而且建库成本大大降低。与传统的SMARTseq建库方式相比，本发明可检测全长转录本，而不是仅限于polyA3‘端，而且效率更高。

　　有益效果：

　　1、本发明改良的SMARTseq建库方法，成本低，其成本是NEB建库试剂盒的1/7。

　　2、常规建库(NEB)需进行10个步骤，耗时8h，而使用该方法进行建库，建库步骤少，仅需6个步骤，操作简单，6h即可完成建库流程。

　　3、本发明的核心逆转录引物，可以将polyA富集的RNA全部逆转录出来，而不只是附件mRNA的3‘端，除了可以分析差异基因的表达量外，还可以进行融合基因和可变剪切等分析。

　　4、本发明的建库效率与NEB建库试剂盒一致，但操作更为简单，成本更低，分析比对的差异基因数目与NEB相当，是一套快速经济型的建库系统。

　　附图说明

　　图1是改良SMARTseq建库原理图。

　　图2是本发明polyA富集和RNA片段化步骤中根据需要的片段大小调整孵育时间参照图。

　　图3是改良SMART Library毛细管电泳图(15个循环)。

　　图4是NEB建库试剂盒的Library毛细管电泳图(17个循环)。

　　图5是改良SMART Library毛细管电泳图(15个循环)。

　　图6是传统SMART毛细管电泳图(15个循环)。

　　图7是本发明转录本覆盖均一性分布图。

　　图8是NEB转录本覆盖均一性分布图。

　　图9是本发明与NEB建库方法基因表达量(RPKM)相关性散点图。

　　图10是本方面方法两次独立建库重复性比较结果图。

　　图11是NEB建库方法两次独立建库重复性比较结果图。

　　具体实施方式

　　下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或

　　类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的

　　实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明

　　具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所

　　用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

　　本发明的建库流程

　　1.准备RNA片段化缓冲液

　　在新的无核酸酶的管中加入如下试剂：

　　5×First-Strand Buffer8μl；

　　Nuclease-free water 12μl；

　　Total Volume20μl(2×)。

　　注意在冰上操作。

　　2.polyA富集和RNA片段化

　　2.1.在PCR管中，用无核酸酶水将lugRNA稀释到25ul体积，冰上操作。

　　2.2.取10ul NEBNext Oligo d(T)25beads到无核酸酶的PCR管中。

　　2.3.用50ul的RNA Binding Buffer(2X)洗beads，用枪头吹打6次，彻底混匀。

　　2.4.将PCR管置于磁力架上，室温2min

　　2.5.去除上清，注意不要碰到beads

　　2.6.将PCR管从磁力架上取下

　　2.7.重复2.3-2.6

　　2.8.用25μl of RNA Binding Buffer(2X)重悬beads，加入步骤1中25ul RNA。

　　2.9.将PCR管放在PCR仪中，65℃，5min，4℃，hold，热盖关闭。

　　2.10.当温度到达4℃时，将PCR管取出

　　2.11.用枪反复吹打6次，将beads彻底重悬。

　　2.12.室温放置5min

　　2.13.用枪反复吹打6次，将beads彻底重悬。

　　2.14.室温放置5min

　　2.15.将PCR管置于磁力架上，室温2min，将beads和液体分离。

　　2.16.去除上清，注意不要碰到beads

　　2.17.将PCR管从磁力架上取下

　　2.18.加入100μl Wash Buffer，用枪反复吹打混匀。

　　2.19.将PCR管置于磁力架上，室温2min，将未结合的RNA去除。

　　2.20.去除上清，注意不要碰到beads

　　2.21.将PCR管从磁力架上取下

　　2.22.重复2.18-2.21

　　注意：将上清完全去除是十分重要的。可以将pcr管短暂离心后置于磁力架上，用10ul枪将剩余液体全部去除，注意不要碰到beads。

　　2.23.加入步骤1中准备的First Strand Synthesis Reaction Buffer 7μl，94℃孵育2min，然后直接置于磁力架上。

　　根据需要的片段大小调整孵育时间，见图2。

　　其中* Dilute 1μg total RNA with 10μl RNase-Free Water.

　　** Dilute 1μg total RNA with 10μl First Strand Reaction Buffer prepared in Section 1.

　　2.24.5min后，吸取5ul上清到新PCR管，置于冰上，直接进行下一步。

　　3.第一链和第二链合成

　　3.1.加入0.5ul 100uM逆转录引物AM-SMART-Oligo，到上一步得到的上清中。

　　3.2.65℃孵育5min，反应后置于冰上。

　　3.3.短暂离心，加入如下试剂：

　　反复吹打混匀，42℃，60min(9ul)。

　　3.4.加入0.5ul 100uM SMART-Read1-TSO引物和0.5ul SMARTScribe RT，充分混匀，42℃，90min(10ul)。

　　3.5.70℃5min，4℃hold。

　　4.用Agencourt AMPure XP Beads纯化逆转录反应液

　　上述所得加入预先平衡到室温的AMPure XP Beads中，充分混匀后孵育，乙醇，无核酸酶水洗涤，孵育，得到上清；

　　4.1.充分重悬AMPure XP Beads，将AMPure XP Beads提前室温放置30min，以平衡到室温。

　　4.2.加入9ul(0.9X)AMPure XP Beads，用枪吹打10次，充分混匀。

　　4.3.室温孵育5min。

　　4.4.短暂离心后，置于磁力架5min，直至溶液完全清澈。小心去除上清(注意不要碰到beads)。

　　4.5.将PCR管置于磁力架，直接加入200ul 80％乙醇洗beads，室温放置30s，小心去除上清。

　　4.6.重复步骤4.5

　　4.7.将PCR管短暂离心，置于磁力架上，用10ul枪吸取剩余液体。打开PCR管盖，让乙醇挥发完全。注意不要使beads过度干燥。

　　4.8.将PCR管取下，加入6.5ul无核酸酶水，反复吹打混匀，室温孵育5min，将PCR管置于磁力架上，直至溶液完全清澈。

　　4.9.吸取5ul上清到新PCR管中，继续下一步反应

　　5.PCR富集

　　5.1.向4.9中得到的5ul cDNA中加入如下试剂，冰上操作。

　　5.2.PCR反应程序：98℃30秒，98℃10秒，65℃75秒，15个循环；65℃5分钟。

　　5.3.取1ulPCR反应产物跑琼脂糖凝胶检测，120v，30min

　　6.用Agencourt AMPure XP Beads纯化PCR产物

　　6.1.充分重悬AMPure XP Beads，将AMPure XP Beads提前室温放置30min，以平衡到室温。

　　6.2.加入14.4ul(0.6X)AMPure XP Beads，用枪吹打10次，充分混匀。

　　6.3.室温孵育5min。

　　6.4.短暂离心后，置于磁力架5min，直至溶液完全清澈。小心去吸取上清到新PCR管中(注意不要碰到beads)，去除beads。

　　6.5.向上清中加入3.6ul(0.15X)AMPure XP Beads，用枪吹打10次，充分混匀。

　　6.6.室温孵育5min。

　　6.7.短暂离心后，置于磁力架5min，直至溶液完全清澈。小心去去除上清(注意不要碰到beads)，保留beads。

　　6.8.将PCR管置于磁力架，直接加入200ul 80％乙醇洗beads，室温放置30s，小心去除上清。

　　6.9.重复6.8

　　6.10.将PCR管短暂离心，置于磁力架上，用10ul枪吸取剩余液体。打开PCR管盖，让乙醇挥发完全。注意不要使beads过度干燥。

　　6.11.将PCR管取下，加入20ul无核酸酶水，反复吹打混匀，室温孵育5min，将PCR管置于磁力架上，直至溶液完全清澈。

　　6.12.吸取19ul上清到新PCR管中，-20℃保存。

　　表1以下实施例所用的试剂购买厂家表

　　实施例1：与NEB试剂盒建库效率比较

　　本实施例将1ug TotalRNA作为input，取10ul Poly(A)mRNA Magnetic beads富集回收后，加入5×First-Strand Buffer将mRNA片段化，用我们自主研发的核心引物AM-SMART-Oligo和SMARTScribe Reverse Transcriptase(Clontech)进行第一链合成，然后加入SMART-Read2-TSO进行Template switching和延伸。用0.9X AMPure XP Beads回收cDNA，用NEBNext Q5Hot Start HiFi PCR Master Mix进行PCR富集，扩增15个循环。PCR产物用0.6X-0.15X AMPure XP Beads筛选回收。NEB试剂盒将400ng TotalRNA作为input，取10ul Poly(A)mRNA Magnetic beads富集回收后，加入5×First-Strand Buffer将mRNA片段化，进行第一链合成和第二链合成。用0.9X AMPure XP Beads回收cDNA后，进行末端修复和加接头。用0.5X-0.1X AMPure XP Beads筛选已加接头的cDNA片段，然后用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix进行PCR富集，扩增17个循环。最后用0.9X AMPure XP Beads回收PCR产物。将上述两种方法得到的用QIAxcel Advance(qiagen)进行毛细管电泳检测，结果见附图3-4，其中图3是改良SMART Library毛细管电泳图(15个循环)。图4是NEB建库试剂盒的Library毛细管电泳图(17个循环)。由于本发明采用1ug totalRNA作为input，pcr扩增15个循环，NEB采用400ng作为input，但是扩增17个循环，这相当于两种方法的input是一致的，毛细管电泳检测的结果，两者建库的浓度一致，综上，说明本发明与NEB建库试剂盒建库效率一致。

　　实施例2：与传统SMART建库效率比较

　　在进行改良SMART与传统SMART比较时，分别采用1ug toalRNA作为input，取10ul Poly(A)mRNA Magnetic beads富集回收后，加入5×First-Strand Buffer将mRNA片段化，分别用我们自主研发的核心引物AM-SMART-Oligo与传统的逆转录引物，同SMARTScribe Reverse Transcriptase(Clontech)进行第一链合成，然后加入SMART-Read2-TSO进行Template switching和延伸。用0.9X AMPure XP Beads回收cDNA，用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix进行PCR富集，扩增15个循环。PCR产物用0.6X-0.15X AMPure XP Beads筛选回收。将上述两种方法得到的用QIAxcel Advance(qiagen)进行毛细管电泳检测，结果见附图5-6，其中图5是改良SMART Library毛细管电泳图(15个循环)。图6是传统SMART毛细管电泳图(15个循环)。在相同input量的情况下，改良的SMART方法建库效率更高，是传统的6倍。

　　实例3：比较本发明与NEB建库方法转录本覆盖度情况均一性结果比较

　　在理想条件下，reads在转录本上的分布应该呈现均一性。但是受RNA片段降解、打断随机性、GC含量、PCR扩增偏好性等因素的影响，reads在转录本上的分布将呈现一定的偏好性，这可能对后续分析结果产生影响。因此，除了统计reads在基因组水平及不同基因区域分布外，我们还对转录本reads覆盖均一性进行评估，结果见图7-8。图7是本发明转录本覆盖均一性分布图。图8是NEB转录本覆盖均一性分布图。图中的纵坐标为覆盖深度，横坐标为转录本5’端到3’端的相对位置百分比。由图7和图8可以看出，本发明的转录本均一性更好，无5’或3’偏好性，建库效果更好。

　　实例4：比较本发明与NEB建库方法全基因组reads分布图谱

　　本实施例使用STAR(Spliced Transcripts Alignments to a Reference，STAR)软件将测序数据与参考基因组进行比对，对测序区域覆盖区域及覆盖深度等作出综合评价。STAR该算法使用了未压缩后缀阵列中的连续最大可比对种子搜索，接着种子聚类和缝合过程，在众多RNAseq比对软件中，STAR具有较高的灵敏性。比对结果统计见表2。其中样品LTN为本发明方法建库，样品NEB为NEB建库试剂盒建库，二者比对到基因组上的百分比分别为75.61％，76.22％，比对率基本一致。

　　表2比对结果表

　　实例5比较本发明与NEB建库方法基因表达量(RPKM)相关性

　　在RNA测序中，RPKM(expected number of Reads Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)是每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数目，其同时考虑了测序深度和基因长度对reads技术的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法，计算公式如下：

　　并且将比对后得到的文件注释gene名称，最后得到基因的表达量，将所得的PRKM值取log2。将得到的两个样本的基因列表进行相关性分析，并做散点图，如图9。图9是本发明与NEB建库方法基因表达量(RPKM)相关性散点图，横坐标为本发明建库方法的log2(PRKM)，纵坐标为NEB建库试剂盒的log2(PRKM)，由图可以看出二者有很强的相关性(R2＝0.9205899)，说明两种建库方式差异不大。

　　实例6同一样本建库重复性比较

　　比较相同样本用本发明和NEB的建库方法分别两次建库的重复性。提取人乳腺癌细胞MCF7(可购自中国科学院细胞库，货号：TCHu 74)的总RNA，采用本发明的方法，先后进行了两次独立的建库操作，测序6G raw data。将两次建库数据进行比对分析，得到基因表达量的RPKM值，根据RPKM值进行相关性比较，得到图10，由图可看出，两次建库的相关性系数为0.9976689，相关性极高。样本SkbR1，提取总RNA，采用NEB建库方法，先后进行两次独立的建库操作，测序6G raw data。比对和相关性分析与样本604相同，得到图11。由图可看出两次建库的相关性系数为0.9980191。说明本发明的重复性与NEB建库试剂盒的重复性是一致的。

　　尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

　　SEQUENCE LISTING

　　<110> 耀极, 梁

　　爱默基因（厦门）生物科技有限公司

　　辽宁佰昊生物科技有限公司

　　<120> 一种改良的全长mRNA测序的建库方法

　　<130> AMJY-18003-CNI

　　<160> 5

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 39

　　<212> DNA