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一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用

2021-02-14 13:51:49

一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用。

　　背景技术

　　DHA激酶/FMN环化酶(Dha kinase/FMN cyclase)属于二羟基丙酮激酶家族，有一个不同于其它激酶的蛋白结构，该酶使二羟基丙酮磷酸化，催化FAD形成核黄素4’,5’-磷酸。

　　人的DHA激酶/FMN环化酶发生突变会对人类健康造成严重影响。在对某些糖尿病患者的外周血进行基因测序的过程中，均发现患者的DHA激酶/FMN环化酶发生了突变，因此，对人的DHA激酶/FMN环化酶突变的检测对判断人体是否患有相关疾病具有一定的指引作用。

　　发明内容

　　本发明目的在于提供一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用。

　　本发明技术方案包括：

　　第一方面，提供一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

　　第二方面，提供一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

　　第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据上述所述人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的核苷酸序列，与人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。

　　优选地，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列；

　　或，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:4所示的碱基序列；

　　或，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:5所示的碱基序列。

　　第四方面，提供一种试剂，所述试剂中含有用于检测上述人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的引物对。

　　优选地，其所述引物对包括下述任一上游引物与下述任一下游引物的组合：

　　上游引物为如SEQ ID NO:8～NO:23中任一所示的碱基序列；

　　下游引物为如SEQ ID NO:24～NO:40中任一所示的碱基序列。

　　第五方面，提供一种特异性识别人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的单克隆抗体，由上述的试剂制备而成，其可与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列特异性结合。

　　第六方面，提供一种用于检测人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。

　　优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。

　　本发明提供了一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用，将大量糖尿病患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的DHA激酶/FMN环化酶的突变蛋白，根据该人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为糖尿病的基因诊断提供指引作用，为相关疾病的诊断和治疗提供一定的理论基础。

　　上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

　　附图说明

　　图1是本发明实施例一提供的一种比对结果示意图；

　　图2是本发明实施例一提供的一种基因芯片布局图；

　　图3是本发明实施例二提供的一种显色结果示意图；

　　图4是本发明实施例二提供的另一种显色结果示意图；

　　图5是本发明实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线；

　　图6是本发明实施例五提供的Western blot检测结果示意图。

　　具体实施方式

　　下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

　　下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　实施例一、基因芯片的制备

　　首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国发明专利中描述的检测方法，确定出人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

　　其次，根据人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。

　　1、核苷酸探针的设计

　　(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的核苷酸序列，与人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的特异性的核苷酸探针。

　　其中，核苷酸探针设计的原则如下：

　　①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；

　　②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个；

　　③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；

　　④核苷酸探针序列中与探针分子内部稳定二级结构配对的碱基长度应少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；

　　⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；

　　⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。

　　其中，人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白对应的氨基酸序列与人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白对应的氨基酸序列，Query序列与Sbjct序列之间的序列为比对结果，根据图1可知，人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白相对于人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白，有一部分氨基酸序列发生了缺失。根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的DHA激酶/FMN环化酶是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以在缺失位置之前与在缺失位置之后各选择若干个核苷酸序列(碱基序列的顺序不变)，生成核苷酸探针。

　　在本实施例中，根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式至少可以设计出如下几种优选地核苷酸探针：

　　如SEQ ID NO:3所示的核苷酸探针为：atggggatcc；

　　如SEQ ID NO:4所示的核苷酸探针为：catggggatc ca；

　　如SEQ ID NO:5所示的核苷酸探针为：aaggccatgg ggatcca。

　　(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。

　　2、检测人的DHA激酶/FMN环化酶是否发生突变的基因芯片的制备

　　为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，☆为实验组。

　　其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。

　　对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：

　　空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的污染监控指标。

　　阴性内参质控探针：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标，阴性内参质控探针包括的核苷酸个数可以与核苷酸探针的碱基个数相同，也可以不同。本发明实施例中，基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为：tgatgctgataattgcat。

　　阳性内参质控探针：是一段与检测基因有同源性的其他基因片段，在人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白中，选择与核苷酸探针对应的序列不同，且可以与核苷酸探针碱基的个数相同，也可以与核苷酸探针碱基的个数不同的一段核苷酸序列作为阳性内参质控探针。优选地，选取核苷酸个数与核苷酸探针碱基的个数相同的阳性内参质控探针。本发明实施例中，基因芯片所需的阳性内参探针序列可以为：gaactcggtg gc。

　　需要说明的是，在基因芯片的点样过程中，按照基因芯片的布局点入阴性内参探针和阳性内参探针溶液；空白对照所用的试剂为1倍的点样缓冲液(10％海藻糖溶液)。

　　实施例二、基因芯片的应用

　　1、样品处理

　　(1)采集检测对象的血液1-3mL。

　　(2)取DEPC处理的1.5mL EP管，将其作为被检测样品处理管，在被检测样品处理管中加入检测对象的血液300μL，再加入Trizol 700μL，充分混匀，室温放置10min。

　　(3)加入140μL的氯仿，盖紧管盖，用力震荡，室温放置3-5min，置于离心机中，12000r/min，4℃离心15min，小心吸取离心管中上清，将吸取的上清转移到干净的离心管中。

　　(4)在储存有步骤(3)中上清的离心管中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。

　　(5)用1mL 75％的乙醇清洗一次，7500r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清，在超净台中干燥15min，加入10μLDEPC处理水溶解。

　　(6)所得产物为RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用 Kit纯化总RNA。

　　2、cDNA第一链和第二链一步法合成

　　(1)取2μg RNA于1.5mL的离心管中配置如下反应溶液：

　　其中，RNase-free Water的加入量XμL，是根据总体积11.5μL减去T7 Promotor primer的加入量5μL，再减去总RNA的加入量计算得来的。

　　(2)在65℃下保温10min，并冰浴5min，将5×First Strand Bμffer在65℃下预热5min。

　　(3)配置如下cDNA合成体系：

　　(4)将上述8.5μL混合均匀后加入变性后冰浴的RNA中。

　　(5)用枪头混匀之后离心。

　　(6)40℃反应2h。

　　3、aaUTP标记cRNA合成

　　NTP的配置：

　　分装成10管备用，注：50％PEG(聚乙二醇)使用之前40℃保温1min。同时按如下操作配置Transcription mix；

　　(1)配置Transcription mix

　　(2)加入60μLTranscription mix并混匀。

　　(3)PCR仪中热盖60℃，40℃反应2h。

　　4、cRNA纯化

　　QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。

　　(1)加入20μLRNase free水，加入350μLBuffer RLT并充分混匀。

　　(2)加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。

　　(3)将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasy柱子内≥8000g离心15-30s，弃去滤过液。

　　(4)吸取500μL Buffer RPE到RNeasy mini柱子内≥8000g离心洗涤15-30s弃去滤过液再用500μL Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2mL的套管将RNeasy mini柱子转入一新的1.5mL Eppendorf管中。

　　(5)吸取30μLRNase free的水静置1min，≥8000g离心洗脱1min。

　　(6)重复步骤(5)一次。

　　5、cRNA浓度测定

　　用分光光度计分析cRNA浓度。需要测定260nm和280nm处的吸光值来确定样品的浓度和纯度，A260/A280应接近2.0为较纯的cRNA(比值在1.9-2.1也可)。

　　6、cRNA样品荧光标记；

　　(1)取上述cRNA4μg并浓缩至6.6μL。

　　(2)加10μLDMSO混匀。

　　(3)加3.4μL的0.3M pH为9.0的碳酸氢钠(NaHCO3)并混匀。

　　(4)将上述20μL cRNA混合物加入到荧光染料Cy3中并混匀。25℃保温1h。

　　(5)加9μL的4M Hydroxylamine混匀后25℃保温15min。

　　7、荧光标记cRNA样品纯化

　　具体步骤同本实施例的步骤4中cRNA纯化的过程，本步骤不在赘述。

　　8、cRNA样品片段化和芯片杂交4×44K microarrays

　　(1)按下表配制片段化混合液然后在60℃温浴30min进行片段化。

　　(2)加入55μL 2×GEx Hybridization Buffer。

　　(3)取100μL杂交液滴加到芯片皿上，同时按芯片布局如图2所示分别滴加在空白、阴性、阳性、实验组位置上。盖上芯片并密封于杂交盒中，60℃滚动杂交16h。

　　9、芯片洗涤

　　洗液1(1L)配置：

　　洗液2(1L)配置：

　　洗液3：Stabilization andDrying Solution

　　(1)取出芯片于洗液1中洗涤1min；

　　(2)再将芯片放入洗液2中洗涤1min(37℃)；

　　(3)最后将芯片于洗液3中洗涤30s。

　　10、芯片扫描

　　将芯片在扫描仪中进行扫描，根据扫描结果确定检测对象的DHA激酶/FMN环化酶蛋白是否发生了突变。请参考图3和图4，图3所示的结果中，阴性对照无绿色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组为绿色荧光，那么表明检测对象的DHA激酶/FMN环化酶蛋白发生了突变。图4所示的结果中，阴性对照为无色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组无绿色荧光，那么表明检测对象的DHA激酶/FMN环化酶蛋白未发生突变。

　　实施例三、特异性识别人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的单克隆抗体的制备

　　1、试剂的确定

　　该试剂中含有用于检测上述人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的引物对。

　　其中，根据人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白的ORF(如SEQ ID NO:6所示)，可以确定出人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白的ORF对应的碱基序列(如SEQ ID NO:7所示)。

　　进一步地，可以根据人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的碱基序列(如SEQ ID NO:2所示)，以及根据人的人的DHA激酶/FMN环化酶正常蛋白的ORF对应的碱基序列(如SEQ IDNO:7所示)，设计出如下上游引物和下游引物：

　　上游引物(F)：

　　如SEQ ID NO:8所示：cagctcctgc agggccaccg cgtggccctc

　　如SEQ ID NO:9所示：cgttctgacc tggacagcct caagggccgg

　　如SEQ ID NO:10所示：gtggcactgc tgtcgggtgg gggctctggc

　　如SEQ ID NO:11所示：catgagcctg cccatgctgg tttcataggg

　　如SEQ ID NO:12所示：aaggggatgc tgactggggt catcgcggga

　　如SEQ ID NO:13所示：gctgtgttca cctccccggc agtgggcagc

　　如SEQ ID NO:14所示：atcctggcag ccatcagggc cgtggcccag

　　如SEQ ID NO:15所示：gccggcacag tggggacgct ccttatcgtg

　　如SEQ ID NO:16所示：aagaactaca ctggggatcg gctcaacttc

　　如SEQ ID NO:17所示：ggcctggccc gggagcaggc ccgggctgaa

　　如SEQ ID NO:18所示：ggcatcccgg tggagatggt ggtgattggg

　　如SEQ ID NO:19所示：gacgacagcg ccttcactgt cctgaagaag

　　如SEQ ID NO:20所示：gcaggccggc gggggctgtg cggcaccgtg

　　如SEQ ID NO:21所示：cttatacaca aggtggcagg tgctctggct

　　如SEQ ID NO:22所示：gaggctggtg tggggctgga ggagatcgca

　　如SEQ ID NO:23所示：aagcaggtga acgtggtcac caaggccatg

　　下游引物(R)：

　　如SEQ ID NO:24所示：caggcccagg agagtgctgc acacccgttc

　　如SEQ ID NO:25所示：cagcaccagc gccatccgct tcgaggctga

　　如SEQ ID NO:26所示：gcctcctgca gcagtggaat caggggcctc

　　如SEQ ID NO:27所示：ctggggctcg gcaggggcta cccggctccg

　　如SEQ ID NO:28所示：cttccgccca gtaatggaga ctgcagccac

　　如SEQ ID NO:29所示：gttaggccag gctgctgcag tggtttcagc

　　如SEQ ID NO:30所示：atctatcagt ttcaggagag gctcatccac

　　如SEQ ID NO:31所示：cagcaggagg gtgagagaaa tgccaggcat

　　如SEQ ID NO:32所示：ctccagtgct gacatgaagg tgcccaccag

　　如SEQ ID NO:33所示：ggcacgggca atcttcaccc cgcggccctc

　　如SEQ ID NO:34所示：cagggagcgg acggtagcgt cggctatgat

　　如SEQ ID NO:35所示：gcccagttcc aggaatgaca ggccacccag

　　如SEQ ID NO:36所示：gttgttgacc atcatcacaa ctgaggagcc

　　如SEQ ID NO:37所示：gggctgcaca ggcacatggg acgcgttggt

　　如SEQ ID NO:38所示：ggtgtttgtc atgtggtcga gcatgagttt

　　如SEQ ID NO:39所示：cacaatctca tcggcggttg ccatctttat

　　如SEQ ID NO:40所示：ccggcgcaca ccagcttccc cgtggatccc

　　在本实施例中，试剂中含有的用于检测上述人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的引物对包括：上述任一上游引物与上述任一下游引物的组合。

　　针对每一种组合生成的引物对(引物(F)和引物(R))，执行下述PCR扩增步骤。

　　2、检测对象的DNA为模板进行PCR扩增

　　以检测对象的DNA为模板进行PCR扩增，获得人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白基因完整片段，并连接pMD19-T Vector(Takara公司)，进行测序。然后由专门的生物公司制备抗体，是一种人源化或嵌合型抗体。其中，制备出的单克隆抗体可与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列特异性结合。将制备的抗体采用ELISA法测定含量。

　　实施例四、用于检测人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒

　　本实施例中，ELISA试剂盒的组成为：包被有实施例三所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的DHA激酶/FMN环化酶蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。

　　其中，上述各个组成的参数至少可以为如下一种参数：

　　ELISA酶标板可以为96孔的ELISA酶标；

　　酶标二抗可以是稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗人IgG；其中，稀释倍数可以是8000倍。

　　包被缓冲液可以是1×PBS，pH:7.4；

　　ELISA酶标板洗涤液可以是含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；

　　显色液可以是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；

　　终止液可以是2mol/L的硫酸溶液。

　　实施例五

　　在本发明实施例中，将糖尿病患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该糖尿病患者的DHA激酶/FMN环化酶蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：

　　a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/mL，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h。

　　b、使用样品稀释液将糖尿病患者的DHA激酶/FMN环化酶蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的DHA激酶/FMN环化酶蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；

　　c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；

　　d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；

　　e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；

　　f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；

　　g、在酶标仪上测定波长为450nm处的吸光值。

　　h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的吸光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；其中，可以使用ELISACalc软件绘制该标准曲线，根据该ELISACalc软件可以获知回归系数R2＝0.99847，因此，本次测定有效。将检测得到的波长为450nm处的吸光值代入标准曲线即可求得糖尿病患者的DHA激酶/FMN环化酶蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测糖尿病患者血清样品中DHA激酶/FMN环化酶蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图5，为吸光值的标准曲线。其中，X轴为吸光值，Y轴为对应的浓度。

　　i、Western blot鉴定

　　1、制胶

　　(1)清洗玻璃板并擦干；

　　(2)参考分子克隆方法配制SDS-PAGE胶：

　　A.下层分离胶配制体系(Total Volum：15mL)

　　B.上层积层胶浓缩配制体系(Total Volum：8mL)

　　(3)在每个胶板中加入相应体积的下层分离胶，再加入1mL的无菌ddH2O，压平分离胶，待分离胶凝固后，用滤纸吸干制胶板中剩余的水分，而后加入上层浓缩胶，插入梳子后等待上层浓缩胶凝固。

　　2、蛋白上样电泳：

　　(1)拔下梳子，做好孔道标记，加入5×SDS电泳缓冲液，随后给蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，沸水浴加热3-5min，上样；

　　(2)先用80V电压进行电泳，待条带跑过浓缩胶之后，换用100V电压跑大约100min。

　　3、转膜及孵育：

　　(1)先把PVDF膜在甲醇中活化约30s。分别将凝胶、海绵垫和PVDF膜预先在电转移缓冲液中平衡30min。按滤纸-胶-膜-滤纸的顺序夹好，按照黑面对黑面的原则放入转膜器中，加入制冷器(冰袋)，在冰中以150mA的电流跑约120min；

　　(2)完成后将膜取出，立刻放入5％的脱脂牛奶中，摇床上轻轻室温封闭1h；

　　(3)PBST清洗已封闭的膜，清洗3次，每次10min；

　　(4)加入稀释到相应倍数的一抗，4℃摇床过夜孵育；

　　(5)回收一抗，PBST清洗膜3次，每次10min；

　　(6)二抗(用3％的牛奶以1:5000-1:10000稀释)室温孵育膜2h；

　　(7)用PBST清洗膜3次，每次10min；

　　(8)Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒A、B液等体积混匀后，逐滴滴加在PVDF膜上；

　　(9)FluorChem E FE0511中曝光成像，实验用Image J分析。

　　其中，一抗是公司制备的人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白单克隆抗体，二抗是辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。

　　j、Western blot检测结果分析：按照Western blot实验步骤显示结果，如图6所示，其中，图6中的Marker用于表征标记蛋白的大小。与空白对照相比，仅在实验组128KD附近出现明显条带，其中，DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白分子量大约为128KD，表明该糖尿病患者的DHA激酶/FMN环化酶蛋白确实存在突变。

　　以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

　　序列表

　　<110> 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司

　　<120> 一种人的DHA激酶/FMN环化酶突变蛋白及其应用

　　<160> 40

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 528

　　<212> PRT

　　<213> 智人种(Homo sapiens)

　　<400> 1

　　Met Thr Ser Lys Lys Leu Val Asn Ser Val Ala Gly Cys Ala Asp Asp

　　1 5 1015

　　Ala Leu Ala Gly Leu Val Ala Cys Asn Pro Asn Leu Gln Leu Leu Gln

　　202530

　　Gly His Arg Val Ala Leu Arg Ser Asp Leu Asp Ser Leu Lys Gly Arg

　　354045

　　Val Ala Leu Leu Ser Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Ala His Ala

　　505560

　　Gly Phe Ile Gly Lys Gly Met Leu Thr Gly Val Ile Ala Gly Ala Val

　　65707580

　　Phe Thr Ser Pro Ala Val Gly Ser Ile Leu Ala Ala Ile Arg Ala Val

　　859095

　　Ala Gln Ala Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr

　　100 105 110

　　Gly Asp Arg Leu Asn Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gln Ala Arg Ala Glu

　　115 120 125

　　Gly Ile Pro Val Glu Met Val Val Ile Gly Asp Asp Ser Ala Phe Thr

　　130 135 140

　　Val Leu Lys Lys Ala Gly Arg Arg Gly Leu Cys Gly Thr Val Leu Ile

　　145 150 155 160

　　His Lys Val Ala Gly Ala Leu Ala Glu Ala Gly Val Gly Leu Glu Glu

　　165 170 175

　　Ile Ala Lys Gln Val Asn Val Val Thr Lys Ala Met Gly Ile His Gly

　　180 185 190

　　Glu Ala Gly Val Arg Arg Ile Lys Met Ala Thr Ala Asp Glu Ile Val

　　195 200 205

　　Lys Leu Met Leu Asp His Met Thr Asn Thr Thr Asn Ala Ser His Val

　　210 215 220

　　Pro Val Gln Pro Gly Ser Ser Val Val Met Met Val Asn Asn Leu Gly

　　225 230 235 240

　　Gly Leu Ser Phe Leu Glu Leu Gly Ile Ile Ala Asp Ala Thr Val Arg

　　245 250 255

　　Ser Leu Glu Gly Arg Gly Val Lys Ile Ala Arg Ala Leu Val Gly Thr

　　260 265 270

　　Phe Met Ser Ala Leu Glu Met Pro Gly Ile Ser Leu Thr Leu Leu Leu

　　275 280 285

　　Val Asp Glu Pro Leu Leu Lys Leu Ile Asp Ala Glu Thr Thr Ala Ala

　　290 295 300

　　Ala Trp Pro Asn Val Ala Ala Val Ser Ile Thr Gly Arg Lys Arg Ser

　　305 310 315 320

　　Arg Val Ala Pro Ala Glu Pro Gln Glu Ala Pro Asp Ser Thr Ala Ala

　　325 330 335

　　Gly Gly Ser Ala Ser Lys Arg Met Ala Leu Val Leu Glu Arg Val Cys

　　340 345 350

　　Ser Thr Leu Leu Gly Leu Glu Glu His Leu Asn Ala Leu Asp Arg Ala

　　355 360 365

　　Ala Gly Asp Gly Asp Cys Gly Thr Thr His Ser Arg Ala Ala Arg Ala

　　370 375 380

　　Ile Gln Glu Trp Leu Lys Glu Gly Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Gln

　　385 390 395 400

　　Leu Leu Ser Lys Leu Ser Val Leu Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser

　　405 410 415

　　Ser Gly Ala Leu Tyr Gly Leu Phe Leu Thr Ala Ala Ala Gln Pro Leu

　　420 425 430

　　Lys Ala Lys Thr Ser Leu Pro Ala Trp Ser Ala Ala Met Asp Ala Gly

　　435 440 445

　　Leu Glu Ala Met Gln Lys Tyr Gly Lys Ala Ala Pro Gly Asp Arg Thr

　　450 455 460

　　Met Leu Asp Ser Leu Trp Ala Ala Gly Gln Glu Leu Gln Ala Trp Lys

　　465 470 475 480

　　Ser Pro Gly Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Thr Lys Ala Val Lys Ser

　　485 490 495

　　Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Thr Lys Asn Met Glu Ala Gly Ala Gly

　　500 505 510

　　Arg Ala Ser Tyr Ile Ser Ser Ala Arg Leu Glu Gln Pro Asp Pro Gly

　　515 520 525

　　<210> 2

　　<211> 1584

　　<212> DNA

　　<213> 智人种(Homo sapiens)

　　<400> 2

　　atgacctcca agaagctggt gaactcggtg gctggctgtg ctgatgacgc tcttgctggc 60

　　ctggtggcct gcaaccccaa cctgcagctc ctgcagggcc accgcgtggc cctccgttct 120

　　gacctggaca gcctcaaggg ccgggtggca ctgctgtcgg gtgggggctc tggccatgag 180

　　cctgcccatg ctggtttcat agggaagggg atgctgactg gggtcatcgc gggagctgtg 240

　　ttcacctccc cggcagtggg cagcatcctg gcagccatca gggccgtggc ccaggccggc 300

　　acagtgggga cgctccttat cgtgaagaac tacactgggg atcggctcaa cttcggcctg 360

　　gcccgggagc aggcccgggc tgaaggcatc ccggtggaga tggtggtgat tggggacgac 420

　　agcgccttca ctgtcctgaa gaaggcaggc cggcgggggc tgtgcggcac cgtgcttata 480

　　cacaaggtgg caggtgctct ggctgaggct ggtgtggggc tggaggagat cgcaaagcag 540

　　gtgaacgtgg tcaccaaggc catggggatc cacggggaag ctggtgtgcg ccggataaag 600

　　atggcaaccg ccgatgagat tgtgaaactc atgctcgacc acatgacaaa caccaccaac 660

　　gcgtcccatg tgcctgtgca gcccggctcc tcagttgtga tgatggtcaa caacctgggt 720

　　ggcctgtcat tcctggaact gggcatcata gccgacgcta ccgtccgctc cctggagggc 780

　　cgcggggtga agattgcccg tgccctggtg ggcaccttca tgtcagcact ggagatgcct 840

　　ggcatttctc tcaccctcct gctggtggat gagcctctcc tgaaactgat agatgctgaa 900

　　accactgcag cagcctggcc taacgtggct gcagtctcca ttactgggcg gaagcggagc 960

　　cgggtagccc ctgccgagcc ccaggaggcc cctgattcca ctgctgcagg aggctcagcc 1020

　　tcgaagcgga tggcgctggt gctggaacgg gtgtgcagca ctctcctggg cctggaggaa 1080

　　cacctgaatg ccctggaccg ggctgctggt gacggcgact gtggcaccac ccacagccgt 1140

　　gcggccagag caatccagga gtggctgaag gagggcccac cccctgccag ccctgcccag 1200

　　ctgctctcca agttgtctgt tctgctcctg gagaagatgg gaggctcatc tggggcgctc 1260

　　tatggcctgt tcctgactgc ggctgcacag cccctgaagg ccaagaccag cctcccagcc 1320

　　tggtctgctg ccatggatgc cggcctggaa gccatgcaga agtatggcaa ggctgctcca 1380

　　ggggacagga ctatgctgga ttctctgtgg gcagcggggc aggagctcca agcctggaag 1440

　　agcccaggag ctgatctgtt acaagtcctg accaaagcag tcaagagtgc cgaagctgca 1500

　　gccgaggcca ccaagaatat ggaagctgga gccggaagag ccagttatat cagctcagca 1560

　　cggctggagc agccagaccc cggg 1584

　　<210> 3

　　<211> 10

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 3

　　atggggatcc 10

　　<210> 4

　　<211> 12

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 4

　　catggggatc ca 12

　　<210> 5

　　<211> 17

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 5

　　aaggccatgg ggatcca 17

　　<210> 6

　　<211> 575

　　<212> PRT

　　<213> 智人种(Homo sapiens)

　　<400> 6

　　Met Thr Ser Lys Lys Leu Val Asn Ser Val Ala Gly Cys Ala Asp Asp

　　1 5 1015

　　Ala Leu Ala Gly Leu Val Ala Cys Asn Pro Asn Leu Gln Leu Leu Gln

　　202530

　　Gly His Arg Val Ala Leu Arg Ser Asp Leu Asp Ser Leu Lys Gly Arg

　　354045

　　Val Ala Leu Leu Ser Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Ala His Ala

　　505560

　　Gly Phe Ile Gly Lys Gly Met Leu Thr Gly Val Ile Ala Gly Ala Val

　　65707580

　　Phe Thr Ser Pro Ala Val Gly Ser Ile Leu Ala Ala Ile Arg Ala Val

　　859095

　　Ala Gln Ala Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr

　　100 105 110

　　Gly Asp Arg Leu Asn Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gln Ala Arg Ala Glu

　　115 120 125

　　Gly Ile Pro Val Glu Met Val Val Ile Gly Asp Asp Ser Ala Phe Thr

　　130 135 140

　　Val Leu Lys Lys Ala Gly Arg Arg Gly Leu Cys Gly Thr Val Leu Ile

　　145 150 155 160

　　His Lys Val Ala Gly Ala Leu Ala Glu Ala Gly Val Gly Leu Glu Glu

　　165 170 175

　　Ile Ala Lys Gln Val Asn Val Val Thr Lys Ala Met Gly Thr Leu Gly

　　180 185 190

　　Val Ser Leu Ser Ser Cys Ser Val Pro Gly Ser Lys Pro Thr Phe Glu

　　195 200 205

　　Leu Ser Ala Asp Glu Val Glu Leu Gly Leu Gly Ile His Gly Glu Ala

　　210 215 220

　　Gly Val Arg Arg Ile Lys Met Ala Thr Ala Asp Glu Ile Val Lys Leu

　　225 230 235 240

　　Met Leu Asp His Met Thr Asn Thr Thr Asn Ala Ser His Val Pro Val

　　245 250 255

　　Gln Pro Gly Ser Ser Val Val Met Met Val Asn Asn Leu Gly Gly Leu

　　260 265 270

　　Ser Phe Leu Glu Leu Gly Ile Ile Ala Asp Ala Thr Val Arg Ser Leu

　　275 280 285

　　Glu Gly Arg Gly Val Lys Ile Ala Arg Ala Leu Val Gly Thr Phe Met

　　290 295 300

　　Ser Ala Leu Glu Met Pro Gly Ile Ser Leu Thr Leu Leu Leu Val Asp

　　305 310 315 320

　　Glu Pro Leu Leu Lys Leu Ile Asp Ala Glu Thr Thr Ala Ala Ala Trp

　　325 330 335

　　Pro Asn Val Ala Ala Val Ser Ile Thr Gly Arg Lys Arg Ser Arg Val

　　340 345 350

　　Ala Pro Ala Glu Pro Gln Glu Ala Pro Asp Ser Thr Ala Ala Gly Gly

　　355 360 365

　　Ser Ala Ser Lys Arg Met Ala Leu Val Leu Glu Arg Val Cys Ser Thr

　　370 375 380

　　Leu Leu Gly Leu Glu Glu His Leu Asn Ala Leu Asp Arg Ala Ala Gly

　　385 390 395 400

　　Asp Gly Asp Cys Gly Thr Thr His Ser Arg Ala Ala Arg Ala Ile Gln

　　405 410 415

　　Glu Trp Leu Lys Glu Gly Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Gln Leu Leu

　　420 425 430

　　Ser Lys Leu Ser Val Leu Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ser Gly

　　435 440 445

　　Ala Leu Tyr Gly Leu Phe Leu Thr Ala Ala Ala Gln Pro Leu Lys Ala

　　450 455 460

　　Lys Thr Ser Leu Pro Ala Trp Ser Ala Ala Met Asp Ala Gly Leu Glu

　　465 470 475 480

　　Ala Met Gln Lys Tyr Gly Lys Ala Ala Pro Gly Asp Arg Thr Met Leu

　　485 490 495

　　Asp Ser Leu Trp Ala Ala Gly Gln Glu Leu Gln Ala Trp Lys Ser Pro

　　500 505 510

　　Gly Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Thr Lys Ala Val Lys Ser Ala Glu

　　515 520 525

　　Ala Ala Ala Glu Ala Thr Lys Asn Met Glu Ala Gly Ala Gly Arg Ala

　　530 535 540

　　Ser Tyr Ile Ser Ser Ala Arg Leu Glu Gln Pro Asp Pro Gly Ala Val

　　545 550 555 560

　　Ala Ala Ala Ala Ile Leu Arg Ala Ile Leu Glu Val Leu Gln Ser

　　565 570 575

　　<210> 7

　　<211> 1728

　　<212> DNA

　　<213> 智人种(Homo sapiens)

　　<400> 7