基于环形模板的DNA编码分子库及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于DNA编码分子库技术领域，尤其涉及一种基于环形模板的DNA编码分子库及其合成方法和应用。
背景技术
当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选已经成为新药物研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发。然而，传统的分子库和筛选由于筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂等，已经严重制约高通量筛选的发展和应用。近年来，DNA编码分子库技术逐渐发展起来，成为药物研发中的新兴筛选方法。在DNA编码分子库中，每一个化合物与一个特异性的DNA链相连接，成为一个特异条形码，从而实现对化合物的特异性编码。DNA编码分子库能够在极小的体系中，实现千万乃至上千亿级的高通量筛选。筛选结果可以通过PCR扩增和DNA测序进行解码分析，以获得苗头化合物用于药物的进一步研发。近年来，DNA编码分子库在新药研发领域中已经得到越来越多的认可并被广泛应用，成为大多数药企在新药研发中的一项重要支撑技术。
DNA编码分子库药物筛选技术与传统的高通量筛选相比，在分子库的合成速度、成本、筛选效率以及分子库通量方面展现了极大的优势。在DNA编码分子库药物技术的发展中，DNA编码分子库的合成技术与筛选技术是两个关键点，往往决定着药物筛选的成效。因此，发展新型的DNA编码分子库的合成技术具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于环形模板的DNA编码分子库及其合成方法，可以运用该方法合成更复杂，更多样化的分子库，以实现将一些重要的一步四元反应引入到多样化DNA编码分子库的合成之中。
进一步地，本发明还提供该基于环形模板的DNA编码分子库在药物筛选领域中的应用。
本发明是这样实现的：
一种基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法，提供带分支的环形模板A链，所述环形模板A链含有n1序列、n2r序列、n3r序列、n4r序列及R1结构单元；
B链，所述B链含有n2序列和R2结构单元；
C链，所述C链含有n3序列和R3结构单元；
D链，所述D链含有n4序列和R4结构单元；
所述n2r序列、n3r序列、n4r序列分别与所述n2、n3、n4序列碱基互补配对；
将所述环形模板A链与所述B链、C链、D链进行混合，使其反应合成环形DNA编码分子库。
相应地，一种基于环形模板的DNA编码分子库，所述DNA编码分子库为环形DNA编码分子库，该环形DNA编码分子库可以转化为线性DNA编码分子库，所述DNA编码分子库采用如上所述的DNA编码分子库的合成方法制备得到。
本发明的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法，首次实现了带有分支的环形模板的设计与合成，并且首次运用该分支环形模板来控制4个结构基团同时或者分步发生化学反应，实现了一步或者分步4元结构单元DNA编码分子库的合成，极大的丰富了DNA编码分子库的多样性。此外，本合成方法工艺简单，且合成速度快，适合大规模合成。
本发明提供的基于环形模板的DNA编码分子库，由带有分支的环形DNA制备得到，使得DNA编码分子库的多样性得到极大的扩展，有利于丰富药物研发的筛选分子库。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的环形模板A链、B链、C链、D链的结构示意图；
图2是提供的环形模板A链、B链、C链、D链耦合反应过程示意图；
图3是提供的环形模板A链、B链、C链、D链反应生成的环状DNA分子编码库及切断后获得的线性DNA分子编码库示意图；
图4是本发明提供的环形模板的合成过程示意图；
图5是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法中，环形模板的合成过程示意图；
图6是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法中，环形模板生成环形模板A链以及环形模板A链与B链、C链的耦合以及A﹑B﹑C链上的结构基团发生化学反应的过程示意图；
图7是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法中，环形模板A链与B链、C链上的结构基团反应得到的产物与D链进行耦合，并且与D链结构基团进一步反应的过程示意图；
图8是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法合成环状DNA编码分子库并进一步切断形成线性DNA编码分子库的过程示意图；
图9是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法中P4脱除保护基团转变为P5的高效液相色谱纯化图；
图10是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法过程中凝胶电泳追踪反应进程示意图；
图11是本发明实施例1提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法获得的线性DNA编码分子库质谱图；
图12是对本发明实施例2提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法获得的326400个化合物的DNA编码多肽分子库对链霉亲和素(streptavidin)蛋白的筛选过程示意图；
图13是对本发明实施例2提供的基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法获得的326400个化合物的DNA编码多肽分子库针对链霉亲和素(streptavidin)蛋白的筛选前后n4r区域的序列对比图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1、2、3，本发明提供一种基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法。该合成方法包括以下步骤：
步骤S01.提供带有分支的环形模板A链，该环形模板A链含有n1序列、n2r序列、n3r序列、n4r序列及R1结构单元；并提供B链、C链、D链，其中所述B链含有n2序列和R2结构单元，所述C链含有n3序列和R3结构单元，所述D链含有n4序列和R4结构单元；
其中，所述n2r序列、n3r序列、n4r序列分别与所述n2、n3、n4序列碱基互补配对，也即所述n2r序列、n3r序列、n4r序列分别为所述n2、n3、n4序列的互补序列(反义序列)；上述环形模板A链中的分支，是n2r序列、n3r序列、n4r序列中的任一种，如当所述分支为n3r序列，则n2r序列、n4r序列则在环状结构上，具体如图1所示。
优选地，所述环形模板A链还具有可切断连接基团，该可切断连接基团便于对所述环形模板A链与B链、C链、D链耦合反应得到环形DNA编码分子库进行切断而获得线性DNA编码分子库，具体的切断方法为光照或者化学方法。将环形DNA编码分子库转变成线性DNA编码分子库后，降低对靶点蛋白质的空间位阻，从而更加有利于分子库对蛋白质靶点的筛选。
优选地，上述R1结构单元具有若干活性官能团，这些活性官能团能够与所述R2结构单元、R3结构单元、R4结构单元上所含的官能团发生反应，从而使得B链、C链、D链上的结构单元转移到环形模板A链上。
进一步优选地，所述活性官能团为氨基、羧基、炔基﹑叠氮基﹑巯基﹑醛基中的任一种，当然本发明也可以是其他能够实现将R2结构单元、R3结构单元、R4结构单元接入R1结构单元中的活性官能团。
步骤S02.将所述环形模板A链与所述B链、C链、D链进行混合，使其反应合成环状DNA分子编码库，具体过程可参阅图2示意图。
步骤S02的反应为耦合反应，具体为环形模板A链上含有n2r序列、n3r序列、n4r序列以及R1结构单元，n1对环形模板A链自带的R1结构单元的化学结构进行编码，B链上的n2序列对R2结构单元的化学结构进行编码，C链上的n3序列对R3结构单元的化学结构进行编码，D链上的n4序列对R4结构单元的化学结构进行编码，在将环形模板A链、B链、C链、D链进行混合时，由于n2r序列、n3r序列、n4r序列与B链、C链、D链分别携带的n2、n3、n4序列成碱基互补配对，因而可以形成DNA双链，促进各个结构单元之间的化学反应，生成分子库的化合物。
进一步优选地，所述B链的n2序列和R2结构单元之间也携带有类似的可切断连接基团，在所述B链中的R2结构单元与R1结构单元生成化合物之后，也可以被切断；同理，所述C链的n3序列和R3结构单元之间也携带有类似的可切断连接基团，在所述C链中的R3结构单元与R1结构单元生成化合物之后，也可以被切断；同理，所述D链的n4序列和R4结构单元之间也携带有类似的可切断连接基团，在所述D链中的R4结构单元与R1结构单元生成化合物之后，也可以被切断。
步骤S02合成环状DNA编码分子库后，一方面可以切断B链、C链、D链中各个结构单元与其相对应的DNA序列的连接(B链中R2结构单元对应n2序列；C链中R3结构单元对应n3序列；D链中R4结构单元对应n4序列。)，降低空间位阻，另一方面也可以切断环形模板A链的可切断连接基团，或者同时将两部分进行切断，从而获得线性DNA编码分子库，具体可参阅图3所示的示意图。由此获得的线性DNA编码分子库将所合成的化合物转移至DNA的末端，为分子库对蛋白质靶点的筛选提供了更有利的可行性。
本发明的合成方法中，如果带有分支的环形模板A链在n1r(n1的互补序列)、n2r、n3r、n4r四个区域包含a，b，c，d种不同的DNA序列，而与之相对应的DNA编码的结构单元则为：B链(b种)﹑C链(c种)﹑D链(d种)。这样4组结构基团(结构单元，如R1结构单元、R2结构单元、R3结构单元、R4结构单元)之间的反应，就能够一步或者分步在分子库中生成a×b×c×d种不同的化合物。举例来说，如果a＝b＝c＝d＝1000，则该分子库的规模为：10004＝1012个化合物，具有极大的化学多样性，能够实现极高通量的分子库筛选。
本发明涉及的环形模板A链的合成，可以采用如图4所示的合成路径。具体地，按照常见的“分组-合并-分组(split-pool-split)”的方式合成整个分子库所需的DNA模板。a～c).在固相合成DNA的最后一步，引入一个双保护的分子，如可以是但不限于具有双保护的赖氨酸，其中α位的胺基将被用于成环，而ω位的胺基用对碱稳定的保护基进行保护，将被用作模板合成的反应位点。d).当DNA链从固相上切除纯化后，在一个夹板DNA的作用下，链中间的胺基和赖氨酸α位的胺基相互靠近，有效浓度升高；e).加入一个对称的双官能团的连接基团连接两个胺基，DNA链成环。f).去除保护基团之后得到最后的带有分支的环形DNA模板，该环形DNA模板上具有反应位点和可切断连接基团，将环形DNA模板中的n1序列对含有R1结构单元的化合物进行编码，再将R1结构单元接入所述反应位点，即可获得环形模板A链。
作为可切断连接基团，可以是具有连接两个胺基的双官能团连接基团。优选地，所述具有连接两个胺基的双官能团连接基团的原料可以是但不限于2,2'-二硫代二乙酸，3,3'-二硫代二丙酸，2,2'-二硫代二乙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)和3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)。
由此，本发明基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法可以获得带有分支的环状DNA编码分子库，并且可以转化为更加有利于靶点筛选的线性DNA编码分子库，该带有分支的环形DNA编码分子库是采用环形模板实现四个结构单元之间同时或者分步发生化学反应，实现一步或者分步4元结构单元DNA编码分子库的合成，突破了现有最多只能实现3个结构单元同时反应的局限，极大的提高了分子库的多样性，为DNA编码分子库在药物筛选中的应用提供了更多的可能性。
为更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法，其合成路径请参阅图5～8，具体包括以下步骤：
S1.提供如图5所示的DNA链P1，将P1与具有双保护的赖氨酸进行混合，此时，具有双保护的赖氨酸上的-COOH与P1上的-NH2发生反应，使得具有双保护的赖氨酸与P1连接，得到P2；
S2.对P2脱除Fmoc保护基团，获得P3；
S3.向P3中加入夹板DNA和2,2'-二硫代二乙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)，使得DNA链成环，并携带可切断连接基团，具体结构如P4；
S4.脱除MMT保护基团，并去除夹板DNA，采用高效液相色谱法进行纯化处理，获得如P5所示的环形模板；
S5.向P5中添加具有活性基团的化合物(如图6所示，作为R1结构单元)，使其与P5发生化学反应，脱除笏甲氧羰基(Fmoc)，获得环形模板A链，并向其中添加B链(含有n2序列和R2结构单元)，使环形模板A链与B链发生耦合，其结构单元R1与R2发生化学反应，经过光照使B链的DNA与结构单元R2断开，进一步通过凝胶电泳纯化后，加入C链(含有n3序列和R3结构单元)，经过光照使C链的DNA与结构单元R3断开，经过凝胶电泳纯化后，加入D链(含有n4序列和R4结构单元)，经光照使D链的DNA与结构单元R4断开，经过凝胶电泳纯化后，即可获得DNA编码分子库，在此基础上，向其中加入其他化合物，如使其继续与DNA编码分子库的化合物发生反应，得到如图7所示的P11的DNA编码环肽分子库，为了更好的降低空间位阻，通过二硫苏糖醇(DTT)或者磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)切断可切断连接基团，获得线性DNA编码分子库，如图7所示的P12。
为验证本实施例各个步骤获得的产物，还对各步骤进行监控，具体监测如图9、10、11所示。
其中，图9是由P4脱除MMT保护基团后，转化为P5的高效液相色谱纯化图。从图9可知，P4的氨基被MMT保护，在液相色谱中的出峰时间为31.609min，当脱除MMT保护基后，为裸露的氨基，其极性变大，在在液相色谱中的出峰时间为15.486min。
图10是凝胶电泳获得的产物和副产物追踪进程示意图。从图10可知，通过凝胶电泳可以除去经过光照切除的B﹑C和D链，得到纯度高的P7﹑P8﹑P9和P11产物。图11是获得的线性DNA编码分子库质谱图，从图11可知，其质荷比为29012，与P11产物的分子量相符。
实施例2
一种基于环形模板的DNA编码分子库的合成方法，其合成路径请参阅实施例1。该实施例2中，通过100个不同的DNA序列标签分别对100个不同的结构基团R进行编码，其中，B、C、D链分别对应的序列和相应结构基团种类为20种、30种、34种，而环形模板A链对应的种类为16种，因此合成了16×20×30×34＝326400个化合物的DNA编码多肽分子库。在整个DNA编码多肽分子库中，其中有一个特殊的“AAA”编码，用于对分子库中唯一含有生物素基团的结构单元进行编码，其编码位置位于n4r区域，具体如图12所示。
在合成该分子库之后，进行对streptavidin蛋白质靶点的筛选，并通过PCR扩增和DNA测序对所筛选出的化合物进行解码。具体地，DNA测序结果如图13所示。
由图13可知，在筛选之前，生物素的编码区域(n4r)为乱码，表明为混合序列，和预期一致；但是在筛选完成之后，n4r的序列清晰的显出AAA的序列被富集。由于测序数据显示的是分子库中DNA的反义序列，因此实际对应的分子库编码序列为“TTT”，因此证明了生物素的编码AAA被富集。
以上数据充分证明了本发明DNA编码分子库的合成方法，真正实现了4个结构基团的分子库的合成、表征，以及针对于蛋白质靶点的筛选和解码。需要指出的是，本发明在实际应用中，各个编码区域不仅仅限于上述实例中的三个碱基，而一般具有大约12个碱基；而理论上12个碱基的编码能力为：412，因此能对更大规模的分子库进行编码。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
