结直肠癌标志物及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种结直肠癌标志物及其应用，尤其涉及一种结直肠癌标志物、引物对、核酸探针、芯片、试剂盒及其应用。
背景技术
结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内新增病例数约为100万/年，死亡人数约50万。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在各类癌症中发病率排名第三，致死率排名第四，近55％的发病案例发生在较发达国家。在年龄小于40岁的人中发生率较低，但随着年龄增加发生率亦逐渐增高。通常认为饮食习惯的西方化会增加CRC发病率，但目前美国及其他高收入国家发病率却保持稳定甚至下降，推测与乙状结肠镜检查及结肠镜下的息肉切除术的增加有关。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。
结直肠癌的诊断方法主要包括X射线检查、肠镜检查和癌胚抗原检查。其中，癌胚抗原对早期病例的诊断价值不大，肠镜检查虽然准确度高，但创伤性较大。随着人类基因组计划的完成以及高通量测序技术的发展，基因筛查技术已成为一种新的结直肠癌诊断方法，在结直肠癌的早期诊断中有显著的优势。因此，针对结直肠癌的早期诊断和筛查，提供一种结直肠癌标志物，辅助结直肠癌的早期诊断，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种结直肠癌肿瘤标志物、引物对、核酸探针、芯片、试剂盒及其应用。本发明提供的结直肠癌肿瘤标志物能够用于结直肠癌病人的早期筛查和诊断。
本发明是基于发明人的如下发现所获得的：
人体肠道微生物组包含了数量巨大的微生物，它们参与食物药物代谢、人体免疫调节，在保持人体健康中起着极其重要的作用。有大量文献报道芽孢菌、共生梭菌和具核梭杆菌与结直肠癌有很强的相关性，研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后效果测试的手段：因此本研究想通过测定肠道中芽孢菌、共生梭菌和具核梭杆菌的特定基因，来对结直肠癌的发生与发展进行早期检测和及时干预治疗。
在有case-control的人群中对芽孢菌、共生梭菌和具核梭杆菌的特异性基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测，确定基因的量，分析并验证这些基因预测结直肠癌的概率。以开发结直肠癌患者的肠道微生物基因检测试剂盒，为广大人群提供快速简便的结肠癌早期筛查、诊断的有效措施。为实现结直肠癌的早期预警、诊断和干预提供依据。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一方面，本发明提供了一种结直肠癌标志物，所述结直肠癌标志物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，通过这些标志物可以反映结直肠癌的情况。
本发明的第二方面，本发明提供了一组引物对，所述引物对能够特异性扩增本发明第一方面所述的结直肠癌标志物。
在优选的实施例中，所述引物对为SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9，其中SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9中每两个相邻编号的核酸序列为一对。通过这些引物对，能够特异性扩增SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，从而可以用作结直肠癌的早期诊断和检测。
在本发明的一个实施例中，所述引物对SE SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5可以扩增生物标志物SEQ ID NO:1，所述引物对SE SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以扩增生物标志物SEQ ID NO:2，所述引物对SE SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9可以扩增生物标志物SEQ ID NO:3.
本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸探针，所述核酸探针能特异性捕获包括本发明第一方面所述的结直肠癌标志物。设计核酸探针捕获本发明所用到的结直肠癌标志物，能够实现结直肠癌的快速检测。
本发明的第四方面，本发明提供了一种芯片，所述芯片包含本发明第三方面所述的核酸探针，可用于捕获本发明第一方面所述的结直肠癌标志物，从而检测结直肠癌。
本发明的第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测本发明第一方面所述的结直肠癌标志物的试剂。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒包括以下至少之一：本发明第二方面所述的引物对；本发明第三方面所述的核酸探针；和/或本发明第四方面所述的芯片。
在本发明的优选实施例中，试剂盒还包括内参引物对。
在优选的实施例中，内参引物对序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。所述试剂盒可以用于检测结直肠癌。
本领域技术人员所理解的是，本发明所述的用途或方法所获得的相关数据或结果可以为科研提供研究资料，进而应用于科学研究。
附图说明
图1是30个候选标志物基因在重庆、香港、法国人群队列中的热力丰度图。
图2是重庆验证人群、香港人群、法国人群队列的ROC曲线图。
图3是重庆检测人群、香港人群、法国人群队列中微生物聚类图。
图4是T1P9引物在60个样本中的扩增曲线图。
图5是seq6:0-320引物在60个样本中的扩增曲线图。
图6是T1P26引物在60个样本中的扩增曲线图。
图7是以T1P9为引物在60个样本中扩增基因的相对表达水平图。
图8是以seq6:0-320为引物在60个样本中扩增基因的相对表达水平图。
图9是以T1P26为引物在60个样本中扩增基因的相对表达水平图。
图10是3种基因在结直肠癌样本与对照样本中相对丰度差异图。
图11是来自于Coprobacillus基因的ROC图。
图12是来自于Coprobacillus以及Clostridium symbiosum基因的ROC图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明要解决的技术问题是通过筛选一组新的结直肠癌标志物，然后利用这些结直肠癌标志物通过对结直肠癌病人的粪便微生物菌群DNA进行检测，从而实现无创低成本的早期筛查或诊断技术。例如可以通过高通量测序技术对待测者的粪便微生物菌群DNA中的核酸进行测序，来获得有关这些结直肠癌标志物的含量信息，从而表征待测者的患病情况。再例如可以借助于荧光定量PCR技术通过对待测者粪便微生物菌群DNA中的核酸进行表征，来获得关于这些结直肠癌标志物的含量信息，而且借助于荧光定量PCR技术进行检测，可以方便快速获得检测结果，有利于对于结直肠癌检测的推广和产业化。
为此，本发明提供了一种结直肠癌标志物，所述标志物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，通过这些标志物可以反映早期结直肠癌的情况。本发明通过宏基因组检测发现结直肠癌病患与健康人群肠道菌群的差异，鉴定筛选出30个与结直肠癌相关的微生物基因片段，通过计算基因片段对筛选结直肠癌准确率的贡献程度，筛选3个基因片段作为筛选结直肠癌的标记基因片段。
根据筛选的三种结直肠癌标志物，设计了能够特异性扩增三种生物标志物的引物对，即SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9，其中SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9中每两个相邻编号的核酸序列为一对。通过这些引物对，能够特异性扩增SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，从而可以用作结直肠癌的早期诊断和检测。
本发明还提供了一种核酸探针，所述核酸探针能特异性捕获包括3种结直肠癌标志物。通过设计的核酸探针捕获本发明所用到的结直肠癌标志物，能够实现结直肠癌的快速检测。本发明提供了一种芯片，所述芯片包含上述所述的核酸探针，可用于捕获结直肠癌标志物，从而检测结直肠癌。本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测本发明第一方面所述的结直肠癌标志物的试剂。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1生物标志物的筛选及验证
收集193份来源于中国重庆西南医院的粪便样本，包括98份结直肠癌病患样本(68份男性样本，30份女性样本)以及95份健康对照样本(49份男性样本，46份女性样本)。我们对其中52份结肠癌病患样本以及55份健康对照样本(来源于与病患具有相近饮食结构、生活习惯、生活环境的健康家庭成员)进行了宏基因组检测，以此来发现结直肠癌病患与健康人群肠道菌群的差异。在对上述样本检测的过程中，我们鉴定到30个与结直肠癌相关的微生物基因片段，其中有26个基因片段在结直肠癌患者样本中有所增加，有4个基因片段在健康对照样本中有所增加(图1)。图2受试者工作特征(ROC)曲线显示30个候选基因片段在结肠癌患者样本(52份)和健康对照样本(55份)中呈现显著的差异【AUC＝0.991，95％CI：0.976—1.000】，当将上述30个候选基因片段应用到剩余86个随机样本中(病患样本46个，对照样本40个)中时，同样在对照和实验样本中呈现显著差异【AUC＝0.932，95％CI：0.881—0.983】。
另外，还收集了已发表的来源于中国香港的75个结直肠癌病患样本、53个健康对照样本和来源于法国的53个结直肠癌病患样本、88个健康样本的宏基因组数据用于标志基因片段进一步的筛选及验证。
为测试30个微生物基因片段在不同人群肠道菌群的表现情况，我们对来自香港和法国的样本宏基因组数据进行了分析，得到与来自重庆地区的样本相似的结果，有26个基因片段在结直肠癌患者样本中有所增加，有4个基因片段在健康对照样本中有所增加(图1)，分别在对照和实验样本中呈现显著差异【HK，AUC＝0.894，95％CI：0.847—0.941】，【French，AUC＝0.824，95％CI：0.797—0.852】(见图2)，但评估的准确性有所降低。
为了更好的理解在香港和法国人群，30个基因片段呈现的评估准确度降低的问题，我们分析了3个群体(重庆、香港和法国)所有检测样本微生物的组成结构。非度量多维尺度分析和聚类分析(NMDS)显示相同地区样本的肠道菌群组成结构是相似的(见图3)，且香港地区样本的肠道菌群组成结构相较法国群体，离重庆地区样本更接近(见图3)。
根据首次筛选出来的30个候选基因片段在检测样本和健康样本中扩增程度差异的大小排序，计算基因片段对筛选结直肠癌准确率的贡献程度，我们选择了3个基因片段作为最终的筛选结直肠癌的标记基因片段：
(1)No.8122329，未知功能，芽孢菌属(Coprobacillus)：
引物名称：T1P9
特异序列：
AGCTGCTCTGTCAAGAGGAAAGTTCAATTCTTGAAGTGGAACACAAACATCACAAAGCAGTTTCTGAGAATGCTCCTGTTTAGTTTTTCTGTGAAGATGAACCCGTTTCCAACGAAATCTTCACAGAGGTCCACATATCCACTTGCAGAATCCAAAGAAAGAGAGTTTCAAAACTGCTCCATCAGCAGGATTGTTCACCTCTGTGAGTTGAATGCAGTCATCACAGGAAACATTCTGAGAATGCTTCTGTCTAGGTTTGATGTGAAGATATACCCGTTTCAAGGAAGGCCACAAAGTGGTCCAAATATCCACTTGCAGATTCTACAAAAAGAGTGTTTGAAAGCTGAACTATGA(SEQ ID NO:1 343bp)
(2)No.3742340，腈水解酶基因，共生梭菌属(C.symbiosum)：
引物名称：seq6:0-320；
特异序列：
ATGAAGAAATTTACCGTGGGAGTAATCCAAATGGATTCCCAGGACAATGTGGAAAAAAATCTGCAGACAGCCGTCGAATTTATCGGGGAGGCAGCCGCCAGGGGGGCAAAGCTGATTGCAATGCCGGAAAGCATGAATTATGTGGGGACGGATAATGCGGGACACGCGGAAAATATACCGGACGGCCCGACCTTTTGCCTGATGGCAGAGCAGGCGAAAAAACACCATGTATGGCTGCACTGCGGGAGTATCTATGAGAAGAATGAAAAGGATCCCAGACCTTATAATGCAACCATGGTTATCAGCCCGGAGGGAGAATTGGCGGCCAAATACCATAAAATACCCCCCTTCGACGTGATAATTCCGGACGGGCCGGTGAACAAAGAATCAGACCGTATCTGTCCGGGGAGTGAGATTGTTACGGTGGATACAGGGGAAGTCGGATGCCTGGGATTGTCGATCTGCTATGATATCCGTTTTGCGGAGATGTACCGGATCATGGCTCTGGAAGGCGCCCAGCTTCTGCTGACACCGGCAGATTTCACGATGCCGACCGGCAAAGATCACTGGGAGACCATTCTGCGCACCCGTGCAATAGAAAACGGATGCTACGTCATAGCTCCGGCCCAGTATGGCGTGAAACCGAATTTCCAGGCATATGCCAATTCTGTTGTCATCGATCCCTGGGGGAATGTAATTGCCCGCGCCTCCAACCGGCCGCAGGTTATTACCGCGGAAATTGATCTGGACTATCTTGCCCAGGTCCGCAGGCAGATTTTCACTTTGGAGAACCGCCGACCCGATGTATACAGCCTGGCAAGAAAGGTTTAG(SEQ ID NO:2 831bp)
(3)No.5053929，肽蛋氨酸亚砜还原酶，由MSRA基因编码，梭菌属(Fusobacterium)：
引物名称：T1P26。
特异序列：
ATGAAAGGGCTAAAAAAATTGTTTTTAGGAATTATGATGTTATTAATGGGAGCAGTAGCTTTTGGGGCAGAGATGGATTTGTCAAAGGTTACTTTAAAAGATGTGAATGGAATGAGTTATTCTTTTGGAAAAGATGGAAAACCAACTTATGTTAAGTTTTGGGCTTCTTGGTGTCCAATTTGTCTTTCTGGATTAGAAGATATAGATAATCTTAGCAAAGAAAAGAAAGATTTTGAAGTTGTTACTGTTGTTTCTCCTGGGTTAGTTGGAGAAAAGAAAACAGAAGATTTTAAAAAATGGTATAAATCTTTGGAATATAAGAATATAAAAGTTTTATTAGATGAGAAAGGTGAATTATCAAAGATATTAAATGTTCGTGTTTATCCAACTTCTGTTGTTGTAAATAAAGCTGGGAAAGCTGAAAAAGTTCTTCCAGGTCATTTAGAAAAAGCAGAAATAAAAAAATTATTTTCTTCTAAAATGATGATGAATGATAAAGGAATGAAAGACACTATGATGAAAGATAATCATATGATGAACGATGGAAAGATGAAAGATAACATGATGAAAGATGACAAAATGATGAATGATAAACATATGATGAAAGATGATAAAATGAGTATGGAAAAAAAACATCAATGTAAAACATGTTAA(SEQ ID NO:3654bp)
实施例2引物筛选
针对实施例1筛选获得的生物标志物特异性序列，设计特异性引物，对于每种特异性序列所设计的特异性引物进行引物测试：即通过普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测其条带，若目的条带大小与预期一致且条带单一，说明引物特异性好。经过检测发现，表2所示的引物可以用于扩增实施例1筛选得到的特异性序列，目的条带大小与预期一致且条带单一，扩增的特异性好。
表2特异性引物序列
实施例3结直肠癌检测应用
本实施例主要基于实时荧光定量PCR技术对结直肠癌患者和正常人粪便微生物菌群DNA进行测试，所示出的结果是按照实施例2提供的最佳引物所提供的结果。
1、样本采集
使用采样拭子分别采集30例结直肠癌病人和30例正常人粪便中心部分，保存于含有缓冲液的粪便采集管，旋紧管盖后，上、下颠倒5、6次，将保存液和粪便混合均匀。
标本的保存和运送：常温或者4℃冷藏保存。冷藏前标本长途运送可常温运输，冷藏后标本长途运送需采用干冰。
2、核酸提取
使用粪便基因提取试剂盒QIAamp DNA Stool Mini Kit，按照说明书提取粪便微生物菌群DNA，最后收集50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
3、PCR反应液配制
PCR反应液1：PCR反应缓冲液、T1P9特异性引物(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)、16S rDNA的内参引物(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11)；
PCR反应液2：PCR反应缓冲液、seq6:0-320特异性引物(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)、16S rDNA的内参引物(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11)；
PCR反应液3：PCR反应缓冲液、T1P26特异性引物(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)、16S rDNA的内参引物(SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11)；
其中，PCR反应缓冲液的成分：SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)，ddH2O；
PCR反应液中引物浓度均为：10pmol/μL。
4、实时荧光定量PCR检测
实验具体操作步骤如下：
(1)取3种不同的PCR反应液，按18μL/管分装成PCR反应管，备用。
(2)向PCR反应管中加入提取后的检测样本/健康样本的DNA溶液2μL，并盖紧管盖，一起放入ABI Prism 7300荧光定量PCR仪样品槽。
(3)双击ABI Prism 7300SDS软件，在New Document Wizard窗口中选择Assay，设定完成后按下Next，选择Detector按下Add将Detector加入plate Document按下Next，选定Plate Document中放样品的Wells后，点击Detector列中的Use框，从Task栏中选择Standard，从View列中选择Well Inspector输入样品名称，保存此PlateDocument，将档案种类存为SDS Document(*.sds)格式。检查PCR条件，将样品盘放入机器中，并准备收集data，在Plate Document上击Instrumennt，进入PCR设定窗口，设置温度及时间：95℃，3min，1个循环；95℃，5s；60℃，30min，40个循环；95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s，1个循环，点击Add Dissociation，在Results下点击Amplification Plot收集讯号，点击保存，按下Start开始进行PCR及讯号收集。
5、实时荧光定量PCR结果及分析
收集实时荧光定量PCR数据，输出结果，T1P9引物(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)在60个样本(30个对照样本+30个检测样本)中的扩增曲线图见图4，seq6:0-320引物(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)在60个样本(30个对照样本+30个检测样本)中的扩增曲线图见图5，T1P26引物(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)在60个样本(30个对照样本+30个检测样本)中的扩增曲线图见图6。经过分析3对引物在60个样本中扩增结果，运用2-ΔΔCt法进行计算样本扩增时的相对定量值，结果如表1所示：
表1、3对引物在60个样本中扩增结果
用R version 3.3.1软件进行Wilcoxon秩和检验分析3对引物在60个样本(30个健康样本和30个检测样本)中扩增差异显著性分析得出，T1P9引物在60个样本中扩增基因No.8122329(SEQ ID NO:1)的相对表达水平见图7，在对照和实验样本中相对表达丰度的差异显著性达到P＜0.05水平(见图10)；seq6:0-320引物在60个样本中扩增基因No.3742340(SEQ ID NO:2)的相对表达水平见图8，在对照和实验样本中相对表达丰度的差异显著性达到P＜0.05水平(见图10)；T1P26引物在60个样本中扩增基因No.5053929(SEQ ID NO:3)的相对表达水平见图9，在对照和实验样本相对表达丰度的差异显著性达到P＞0.05水平(见图10)。同时，密度曲线同样显示No.8122329(SEQ ID NO:1)和No.3742340(SEQ ID NO:2)基因片段相对表达丰度的在对照和实验样本中的具有显著差异性分布，而No.5053929(SEQ ID NO:3)基因片段则没有显示出显著性差异。
另外，应用T1P9引物扩增的基因片段作为标志基因片段No.8122329(SEQ ID NO:1)鉴定30个实验样本时AUC＝0.930，95％CI：0.904—0.955(见图11)。结合T1P9引物与seq6:0-320引物扩增的基因片段No.8122329(SEQ ID NO:1)和No.3742340(SEQ ID NO:2)作为标志基因片段鉴定30个实验样本时AUC＝0.935，95％CI：0.833—0.987(见图12)。AUC值：评价构建模型的好坏程度，越接近1越好；CI值：置信区间，落在这个范围内就成立，落在外面则不成立。
基于同一基因片段在对照和实验样本呈现的显著性表达差异，说明T1P9(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)、seq6:0-320(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)、T1P26(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)引物扩增的肠道菌群的标志基因片段SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3可用来进行结直肠癌患病的判定。
在本说明书描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳微健康基因科技有限公司
<120> 结直肠癌标志物及其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> Coprobacillus
<400> 1
agctgctctg tcaagaggaa agttcaattc ttgaagtgga acacaaacat cacaaagcag 60
tttctgagaa tgctcctgtt tagtttttct gtgaagatga acccgtttcc aacgaaatct 120
tcacagaggt ccacatatcc acttgcagaa tccaaagaaa gagagtttca aaactgctcc 180
atcagcagga ttgttcacct ctgtgagttg aatgcagtca tcacaggaaa cattctgaga 240
atgcttctgt ctaggtttga tgtgaagata tacccgtttc aaggaaggcc acaaagtggt 300
ccaaatatcc acttgcagat tctacaaaaa gagtgtttga aagctgaact atga 354
<210> 2
<211> 831
<212> DNA
<213> C. symbiosum
<400> 2
atgaagaaat ttaccgtggg agtaatccaa atggattccc aggacaatgt ggaaaaaaat 60
ctgcagacag ccgtcgaatt tatcggggag gcagccgcca ggggggcaaa gctgattgca 120
atgccggaaa gcatgaatta tgtggggacg gataatgcgg gacacgcgga aaatataccg 180
gacggcccga ccttttgcct gatggcagag caggcgaaaa aacaccatgt atggctgcac 240
tgcgggagta tctatgagaa gaatgaaaag gatcccagac cttataatgc aaccatggtt 300
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caggttatta ccgcggaaat tgatctggac tatcttgccc aggtccgcag gcagattttc 780
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<212> DNA
<213> Fusobacterium
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gttactgttg tttctcctgg gttagttgga gaaaagaaaa cagaagattt taaaaaatgg 300
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aagatattaa atgttcgtgt ttatccaact tctgttgttg taaataaagc tgggaaagct 420
gaaaaagttc ttccaggtca tttagaaaaa gcagaaataa aaaaattatt ttcttctaaa 480
atgatgatga atgataaagg aatgaaagac actatgatga aagataatca tatgatgaac 540
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcagtctcgc tagagtgccc 20
