驼源纳米抗体基因库的构建方法
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体地涉及驼源纳米抗体基因库的构建方法。
背景技术
牛结核病(bovine tuberculosis)是一种死亡率极高的慢性人畜共患传染病，Ag85复合物最早被发现于牛结核分枝杆菌和卡介苗的培养液中，分子量约为30-32kDa。Ag85B是结核分枝杆菌免疫反应中重要的保护性抗原，可以增强机体中Th1型细胞的免疫应答。1993年，比利时科学家Hamers发现在骆驼科动物的血清中有一种天然缺失轻链的抗体。这些重链抗体(heavy chain-only antibodies,HCAb)的组成中没有轻链存在，并且缺少CH1保守区。重链抗体唯一的可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)通过铰链区与Fc片段相连，是重链抗体的抗原识别部位。VHH抗体的分子量只有15kDa左右，是已知最小的具有抗原结合功能的的抗体片段，VHH抗体与普通抗体相比具有高选择性，高特异性和高亲和力等特点，并且体积小，稳定性强和溶解度高。这些因其独特的结构决定的优点使得VHH抗体在药物研发及其它应用中更具有优势。
目前针对驼源抗体的筛选进行的大量的研究，例如，潘欣等于2013年10月在结核分枝杆菌Rv0733-6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定中公开了以已纯化的原核表达的Rv0733-6His整合抗原为包被抗原，从已构建达到109的羊驼非免疫单域重链抗体库中筛选针对该抗原的特异性重链可变区抗体。
再例如，吴越等于2017年公开了抗牛结核分枝杆菌VHH抗体库的构建与筛选，但是其中构建的抗牛结核分枝杆菌VHH抗体库的库容仅为106。
综上所述，目前缺少大容量、多样性更高的抗牛结核分枝杆菌的VHH抗体库。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明提供一种驼源纳米抗体基因库的构建方法，其包括以下步骤：
(1)免疫步骤：利用第一抗原体系首次免疫骆驼，然后利用第二抗原体系加强免疫骆驼，得到免疫后的骆驼，采取其血液；
(2)扩增步骤：提取所述血液中淋巴细胞的总RNA，逆转录为cDNA，以其作为模板扩增重链抗体可变区的基因片段，其中所述基因片段至少包括来自IgG2和IgG3的片段；
(3)转化步骤：将所述基因片段克隆至宿主细胞，得到驼源纳米抗体基因库。
在某些实施方案中，所述第一抗原体系包括BCG、弗氏完全佐剂和环二腺苷酸，且所述第二抗原体系包括BCG、弗氏不完全佐剂和环二腺苷酸。
在某些实施方案中，所述第一抗原体系中的BCG的浓度为0.20-0.30mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.120-0.130mg/ml，所述第二抗原体系中BCG的浓度为0.20-0.30mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.0620-0.0900mg。
在某些实施方案中，首次免疫与加强免疫的时间间隔为10-20天。
在某些实施方案中，所述骆驼为双峰驼和单峰驼。
在某些实施方案中，扩增时的引物包括P1-P5，其序列分别对应于SEQ ID NO:1-5。
在某些实施方案中，P1与P2组合使用；P3与P4、P5组合使用。
在某些实施方案中，使用pCANTAB5E载体将所述基因片段转化至所述宿主细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞为细菌和/或酵母。
本发明的驼源纳米抗体基因库的构建方法通过改进免疫步骤、扩增步骤以及转化步骤，使得到的基因库的库容大大提高，达到1×107以上，与传统的BCG抗体基因库的低库容(例如，106以下)相比，本发明的构建方法具有更大的应用价值。
附图说明
图1non扩增产物电泳图(1％琼脂糖凝胶)。从图右侧至左侧的泳道分别为DL2000DNA Marker(2000-1000-750-500-250-100bp)、non1、non2、non3。
图2为non1建库克隆酶切鉴定电泳图(1％琼脂糖凝胶)。M：DL2502 DNA marker(100-250-500-750-1000-1500-)。
图3为non2建库克隆酶切鉴定电泳图(1％琼脂糖凝胶)。M：DL2502 DNA marker(100-250-500-750-1000-1500-)。
图4为non3建库克隆酶切鉴定电泳图(1％琼脂糖凝胶)。M：DL2502 DNA marker(100-250-500-750-1000-1500-)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
针对BCG建库时库容低的问题，本发明对常规的建库方法进行了改进，获得了更高的库容量。本发明为驼源纳米抗体基因库的构建方法，其能够获得更高的库容量，具体地，本发明驼源纳米抗体基因库的构建方法包括以下步骤：免疫步骤、扩增步骤和转化步骤。下面详细说明各步骤。
[免疫步骤]
本发明的免疫步骤包括利用第一抗原体系首次免疫骆驼，然后利用第二抗原体系加强免疫骆驼，得到免疫后的骆驼，然后采取免疫后的骆驼的血液。
本发明中，首次免疫采用第一抗原体系。优选地，第一抗原体系包括BCG、弗氏完全佐剂和环二腺苷酸。更优选地，第一抗原体系中的BCG的浓度为0.20-0.30mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.120-0.130mg/ml。进一步优选第一抗原体系中BCG的浓度为0.24-0.26mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.125-0.128mg。在制备第一抗原体系时，可将BCG溶液与弗氏完全佐剂以优选1:1的体积比进行混合，然后添加适量环二腺苷酸。优选地，BCG溶液的浓度为0.5-1.5mg/ml，更优选0.6-1.2mg/ml，还优选1.0mg/ml。
本发明中，加强免疫采用第二抗原体系。优选地，第二抗原体系包括BCG、弗氏不完全佐剂和环二腺苷酸。更优选地，第二抗原体系中的BCG的浓度为0.20-0.30mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.0620-0.0900mg/ml。进一步优选第二抗原体系中BCG的浓度为0.24-0.28mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.0625-0.0800mg。在制备第二抗原体系时，可将BCG溶液与弗氏不完全佐剂以优选1:1的体积比进行混合，然后添加适量环二腺苷酸。优选地，BCG溶液的浓度为0.5-1.5mg/ml，更优选0.6-1.2mg/ml，还优选1.0mg/ml。
本发明中，第一抗原体系中BCG的浓度与第二抗原体系中BCG的浓度可以相同，也可以不同，对此并无特别限定，只要满足上述范围即可。第一抗原体系中环二腺苷酸的浓度需大于第二抗原体系中环二腺苷酸的浓度。
在某些实施方案中，第一抗原体系中的BCG的浓度为0.25mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.125mg/ml，第二抗原体系中BCG的浓度为0.25mg/ml，环二腺苷酸的浓度为0.0625mg。
本发明发现通过在第一抗原体系和第二抗原体系中分别添加不同浓度的环二腺苷酸能够提高得到的基因库的库容，增加所得抗体的多种性。其原因不清楚，但是推测可能在于环二腺苷酸增强免疫，使免疫效价达到1:800以上，甚至1:1000以上，而这种免疫的增强可能在于得到更多不同抗体，从而使所得到的基因库的库容得以提高。需要说明的是，如果环二腺苷酸的量过高，则会引起骆驼体内的不良反应。如果含量过低，则库容的提高效果差。
本发明中，首次免疫与加强免疫为两次单独的免疫，两次免疫之间的时间间隔一般为10-20天，优选12-18天，更优选15天。免疫途径可为本领域已知的任何途径，优选皮下多点注射。首次免疫与加强免疫可构成一组免疫，本发明中可重复进行多组共免疫，例如，可以进行2-6组免疫。
[扩增步骤]
本发明的扩增步骤包括提取骆驼血液中淋巴细胞的总RNA，逆转录为cDNA，以其作为模板扩增重链抗体可变区的基因片段，其中基因片段至少包括来自IgG2和IgG3的片段。
本发明中，淋巴细胞的分离可采用本领域已知的任何方法进行，优选采用离心法。离心获得的淋巴细胞可直接用于总RNA的提取。本发明中，总RNA的提取以及逆转录可采用本领域已知的方法。例如，通过商用试剂盒进行提取或逆转录。
本发明中，扩增时使用的引物优选为P1-P5，其序列分别对应于SEQ ID NO:1-5。通过上述引物能够更好的扩增可变区的序列，同时不会产生噪音。扩增时，优选使用P1与P2的组合来进行第一轮扩增，然后组合使用P3-P5进行第二轮扩增，从而得到不同可变区的基因片段。需要说明的是，通过使用上述P1-P5作为引物，同时以两轮扩增方式可以得到更多种不同的基因片段，从而增加所得抗体的多种性。其中上述方法得到的基因片段中至少包括来自IgG2和IgG3的基因片段。
[转化步骤]
本发明的转化步骤包括将基因片段克隆至宿主细胞，得到驼源纳米抗体基因库。
本发明中，转化可采用任何方法。可将基因片段直接转入进入宿主细胞。优选地，通过电转化方式，例如重组质粒电转化方式，从而提高转化率。转化率越高，库容越大。
在某些实施方法中，在转化之前还包括重组质粒的制备过程。优选地，重组质粒的制备包括以pCANTAB5E为载体，将上述基因片段插入该载体，然后将该重组载体转化至宿主细胞。宿主细胞的实例包括细菌和/或酵母。其中细菌优选大肠杆菌。
需要说明的是，除了上述步骤之外，本发明还可包括其他步骤。
实施例
1.BCG免疫骆驼
按表1进行免疫，每隔14天加强免疫一次，最后一次免疫结束15天后采血20mL。并测定免疫效价为1:800。
表1.骆驼免疫程序
2.扩增
2.1引物
P3引入SfiⅠ限制性内切酶酶切位点，P4、P5并引入NotⅠ限制性内切酶酶切位点。
表3.PCR扩增引物序列
2.2预扩增：
在冰盒中构建如下扩增体系：
设置扩增参数：94℃ 4min，94℃ 30s-55℃ 45s-65℃ 60s-35循环，65℃ 10min，4℃。
2.3将PCR产物作为第二轮PCR扩增模板进行扩增。第二轮扩增包括以下。
non1-non3扩增：
在冰盒中构建如下扩增体系：
设置拼接参数：94℃ 2min，94℃ 30s-55℃ 60s-65℃ 60s-35循环，65℃ 10min。
2.4将第二轮PCR产物电泳后切取符合大小的扩增片段，胶纯化回收。
3.亚克隆
3.1在冰盒中构建如下连接体系：
Insert 4μl
pMD19-T vector 1μl
Solution I 5μl
*Insert分别为VH(VH1为大于500bp的片段，VH2为小于500bp的片段)、VHH，每个Insert构建5个连接体系。
3.2设置拼接参数：
4℃连接过夜。
3.3将连接产物转化进入TG1感受态细胞，将每5个连接体系合并，加入5ml SOC-amp，150rpm轻摇90min后，取50μl涂布2YT-amp平板，剩余转化液250rpm摇培过夜。提取质粒。
3.4挑取平板上单菌落，培养后提取质粒，酶切鉴定，将酶切正确的质粒，进行核酸序列测定。
3.5亚克隆回收：
亚克隆产物涂布2YT-amp平板，获得单菌落，随机挑取4个/平板进行sfiI和NotI双酶切鉴定，取部分酶切鉴定阳性质粒进行序列测定分析。经Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，可以看出non1、non2及non3扩增序列与Genbank中单/双峰驼(Camelus dromedarius/bactrianus)VH基因同源性达到80％以上。
提取液态培养重组菌液，提取质粒，sfiI和NotI双酶切后，电泳切取插入片段，并进行柱纯化回收，测定浓度为：
non1(S+N酶切)：40.2ng/μl约40ng/μl
non2(S+N酶切)：30.5ng/μl约30ng/μl
non3(S+N酶切)：30.2ng/μl约30ng/μl。
4.酶切片段
4.1构建如下酶切体系：
4.2将以上酶切体系置于37℃水浴中，酶切5小时。
4..加入3μl sfiI限制性内切酶并覆盖液体石蜡，置于50℃水浴中，酶切5小时。
4.4酶切结束，将酶切产物电泳后，切取符合大小的片段。
如图1所示，non1、non2、non3扩增的片段大小分别为约450bp，符合预期大小。电泳切胶回收，测定浓度：
non1:57ng/μl
non2:34ng/μl
non3:30ng/μl。
5.建库
5.1构建VH-pCANTAB5e/VHH-pCANTAB5e连接体系
按照公式：((载体量×插入片段长度)/载体长度)×3:1＝插入片段量制备10个连接体系，将连接体系置于4℃，孵育连接过夜。
5.2前期按Bio-Rad要求制备TG1感受态细胞，并置于-70℃冻存备用。
5.3电转(BIO-Rad)：
取TG1感受态细胞置冰上融化，将40μl感受态细胞与5μl连接产物轻混匀，置于冰浴中1min。设置电转仪2.5kv，1次电击。将待转物迅速转移到冰冷的电转杯中(0.2cm)，电击。迅速加入950μl 37℃预热的SOC培养液，快速轻柔混匀，转移至培养管中，150rpm，37℃孵育1小时。取转化产物50μl 10倍比稀释后，涂布SOBAG平板(Φ150mm)，30℃培养24小时。剩余转化产物，225rpm摇培过夜。
5.4酶切鉴定：
随机挑取SOBAG平板上10个单菌落，接种2×YT-A培养液中，振荡培养过夜后，提取质粒，按以下酶切体系进行酶切鉴定：
将以上酶切体系置于37℃水浴中，酶切3小时。加入0.5μl sfiI限制性内切酶并覆盖液体石蜡，置于50℃水浴中，酶切3小时。酶切结束，将酶切产物电泳。随机取酶切正确质粒，进行核酸序列测定分析。
5.5将摇培物，低速离心，弃上清，用新鲜2YT悬浮细胞，再次低速离心，弃上清，将菌沉用2YT(含15％灭菌甘油)悬浮后，冻存。
5.6结果
共取non1(S+N酶切，27ng×10个连接反应＝270ng)与pCANTAB5e(S+N)进行连接并电转化TG1感受态细胞，取转化液100uL分别稀释100×和10000×稀释液1mL后涂布2YT-amp平板。
获得单菌落：
共取non2(S+N酶切，27ng×10个连接反应＝270ng)与pCANTAB5e(S+N)进行连接并电转化TG1感受态细胞，取转化液100uL分别稀释100×和10000×稀释液1mL后涂布2YT-amp平板。
获得单菌落：
共取non3(S+N酶切，27ng×10个连接反应＝270ng)与pCANTAB5e(S+N)进行连接并电转化TG1感受态细胞，取转化液100uL分别稀释100×和10000×稀释液1mL后涂布2YT-amp平板。
获得单菌落：
重组抗体库酶切鉴定：
各连接转化后稀释液涂布抗性平板，随机挑取10个单克隆，酶切鉴定，正确率都为100％。结果如图2-4所示。
库容计算：
non1重组抗体库：
non2重组抗体库：
non3重组抗体库：
将non1、non2、non3三库混合组成驼源化的纳米抗体库，得到本发明的基因库。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁厦大学
<120> 驼源纳米抗体基因库的构建方法
<130> 1802291CN
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
catgccatga ctcgcggccc agccggccca gktgcagctc gtggagtcng gngg 54
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgccatga ctcgcggcct cgggggccgg ggtcttcgct gtggtgcg 48
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catgccatga ctcgcggcct cgggggcctt gtggttttgg tgtcttggg 49
