一种新型的人源Fab噬菌体展示载体
技术领域
本发明涉及噬菌体展示技术领域，具体为一种新型的人源Fab噬菌体展示载体。
背景技术
噬菌体展示技术是利用噬菌粒载体或噬菌体载体，将多肽或蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或者蛋白与特定的噬菌体衣壳蛋白融合表达，展示在噬菌体表面的一种技术，通过这种技术所展示的多肽或者蛋白可以一定程度上保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于靶分子的特异性识别和结合，且保证了该分子基因型和表达型的统一。
噬菌体技术近年来已成为探测蛋白空间结构，探索受体与配体之间相互作用的结合位点，寻找高亲和力和生物活性的配体分子的有效工具，在蛋白组学等多个生物学研究领域有着深远的影响，为研究蛋白分子的相互识别，细胞免疫，肿瘤治疗及新型疫苗的研制等做出了巨大贡献，噬菌体展示的载体主要分为噬菌粒展示载体和噬菌体展示载体两大类，噬菌粒载体是一类带有噬菌体复制起始点的质粒载体，它巧妙的组合了质粒和噬菌体的特征，是一种人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体，噬菌粒需要辅助噬菌体(helper phage)来提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白，它在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，可以像噬菌体或质粒一样复制。
噬菌粒载体pComb3是在噬菌粒载体pBluescript的基础上，由美国Scrips研究所创建的，已被广泛运用于天然时间菌体抗体库的构建和Fab段抗体的表达，噬菌体载体pComb3的构建是将抗体的重链Fd链(VH和CH1)与噬菌体外壳蛋白III(pIII)上的C端区域相连接形成的融合蛋白，重链Fd/pIII融合蛋白和轻链蛋白(VL-CL)基因分别被置于Lac启动子/控制子的序列控制之下，翻译成蛋白后分别通过pelB先导序列被导入细菌的细胞膜间隙，重链Fd通过与pIII融合镶嵌在膜上，而轻链则独自分泌入膜间隙，重链和轻链在膜上组装成有活性的Fab抗体。
对于商业化的pComb3载体来说，只在重链Fd前后和轻链蛋白前后加入了酶切位点，但对于一般建库，重链CH1区和轻链CL区都是高度保守的，连入可变区片段时，需要通过overlap PCR将这些保守的恒定区与可变区连接起来后，再连入载体，这样大大增加了工作量，overlap PCR会引入不确定的碱基突变从而导致序列错误，同时对VH的过度扩增可能会造成可变区基因多样性下降。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型的人源Fab噬菌体展示载体，解决了连入可变区片段时，工作量较大，及overlap PCR容易导致序列错误，同时对VH过度扩增可能会造成可变区基因多样性下降的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种新型的人源Fab噬菌体展示载体，在载体XbaI酶切位点前连入了人源轻链保守区序列CL，在载体SpeI酶切位点前连入了人源重链保守区序列CH1，在载体SacI酶切位点后连入了一段1006bp的插入片段VL-insert，在载体XhoI酶切位点前连入了一段914bp的插入片段VH-insert。
优选的，在连入的轻链保守区CL和插入片段VL-insert中加入了HindIII酶切位点。
优选的，将6His标签密码子序列更改为：CACCATCACCATCATCAC。
本发明还公开了一种新型的人源Fab噬菌体展示载体的改造步骤：
S1、插入片段的扩增，对人源轻链保守区序列CL进行扩增，对人源重链保守区序列CH1进行扩增，对轻链可变区插入片段VL-insert进行扩增，对重链可变区插入片段VH-insert进行扩增；
S2、插入片段的连接，将人源轻链保守区序列CL、人源重链保守区序列CH1、轻链可变区插入片段VL-insert和重链可变区插入片段VH-insert通过overlap PCR的方法连接起来；
S3、原载体酶切；
S4、Fab-insert片段酶切；
S5、酶切后载体和插入片段的连接和转化，转化后的克隆进行菌液PCR检测。
本发明还公开了一种新型的人源Fab噬菌体展示库的构建步骤：
T1、以人源淋巴细胞cDNA文库为模板，PCR扩增人源抗体的重链可变区和轻链可变区；
T2、轻链库的构建：用SacI和HindIII在37℃条件下孵育10h，65℃失活酶10min，酶切该新型人源Fab噬菌体展示载体及人源轻链可变区扩增片段；然后16℃连接过夜，65℃失活酶10min，进行原载体和轻链可变区片段的连接；用常规电转化方法将连接产物电转至噬菌体展示宿主菌TG1中，其电转条件为600Ω,10μF,1.8kV；电转完成后，取一部分转化菌梯度稀释后铺在含有Amp抗生素的2YT固体培养基上，在37℃条件下培养过夜，最终根据长出的克隆数计算全部菌中有效转化菌的数目，该数目即为轻链库的库容。
T3、在轻链库的基础上连入人源重链可变区：先提取轻链库全部有效转化菌中的噬菌体展示质粒，用NcoI和XhoI在37℃条件下孵育10h，65℃失活酶10min，酶切轻链库噬菌体展示质粒及人源重链可变区扩增片段；然后16℃连接过夜，65℃失活酶10min，将重链可变区连入载体，形成完整的Fab抗体序列；用常规电转化方法将连接产物电转至噬菌体展示宿主菌TG1中，其电转条件为600Ω,10μF,1.8kV；电转完成后，取一部分转化菌梯度稀释后铺在含有Amp抗生素的2YT固体培养基上，放于37℃培养过夜，最终根据长出的克隆数计算全部菌中有效转化菌的数目，该数目即为人源Fab抗体噬菌体展示库的库容。
(三)有益效果
本发明提供了一种新型的人源Fab噬菌体展示载体。与现有技术相比具备以下有益效果：该新型的人源Fab噬菌体展示载体，通过在载体XbaI酶切位点前连入了人源轻链保守区序列CL，在载体SpeI酶切位点前连入了人源重链保守区序列CH1，在载体SacI酶切位点后连入了一段1006bp的插入片段VL-insert，在载体XhoI酶切位点前连入了一段914bp的插入片段VH-insert，一种新型的人源Fab噬菌体展示载体的改造步骤：S1、插入片段的扩增，S2、插入片段的连接，S3、原载体酶切，S4、Fab-insert片段酶切，S5、酶切后载体和插入片段的连接和转化，转化后的克隆进行菌液PCR检测，利用改造后的新型人源Fab噬菌体载体构建一个人源Fab噬菌体展示库，针对人源Fab抗体，直接将人源的重链CH1区和轻链CL区连入载体，并在其两端加入酶切位点，从而可以直接通过对载体的酶切连接，直接连入抗体重链和轻链可变区，而不需要通过overlap RCR连接恒定区和保守区，大大减少了工作量，提高了建库的质量和多样性，并且为了酶切载体时，更好的区分未切开质粒和已切开质粒，在重链可变区和轻链可变区各引入了一个1Kb左右的大片段，从而降低切胶回收线性质粒片段时未切开质粒的污染，简洁有效，提高了针对人源Fab噬菌体库的构建载体的正确率，具有一定的应用前景。
附图说明
图1为该新型人源Fab噬菌体展示载体图谱；
图2为本发明扩增片段的凝胶电泳图；
图3为本发明经过overlap后的连接片段fab-insert的凝胶电泳图；
图4为本发明原载体酶切前后载体的凝胶电泳图；
图5为为本发明fab-insert片段酶切前后载体的凝胶电泳图；
图6为为本发明PCR检测产物的凝胶电泳图；
图7为本发明步骤T2中转化菌PCR检测产物的凝胶电泳图；
图8为本发明步骤T3中转化菌PCR检测产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本发明实施例提供一种技术方案：一种新型的人源Fab噬菌体展示载体，在载体XbaI酶切位点前连入了人源轻链保守区序列CL：CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG；
在载体SpeI酶切位点前连入了人源重链保守区序列CH1：
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA；
在载体SacI酶切位点后连入了一段1006bp的插入片段VL-insert：ACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGAC；
在载体XhoI酶切位点前连入了一段914bp的插入片段VH-insert：
TTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAAACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAA。
优选的，在连入的轻链保守区CL和插入片段VL-insert中加入了HindIII酶切位点。
优选的，将6His标签密码子序列更改为：CACCATCACCATCATCAC。
本发明还公开了一种新型的人源Fab噬菌体展示载体的改造步骤：
S1、插入片段的扩增，对人源轻链保守去序列CL进行扩增，对人源重链保守区序列CH1进行扩增，对轻链可变区插入片段VL-insert进行扩增，对重链可变区插入片段VH-insert进行扩增，其扩增片段的凝胶电泳图如图2所示，图2中Lane M:DL2000，Lane 1:VL-inser,1048bp，Lane 2:VL-CL(Kappa),426bp，Lane 3:VH-inser,965bp，Lane 4:VH-CH1,354bp
S2、插入片段的连接，将人源轻链保守去序列CL、人源重链保守区序列CH1、轻链可变区插入片段VL-insert和重链可变区插入片段VH-insert通过overlap PCR的方法连接起来，经过overlap后的连接片段fab-insert的凝胶电泳图如图3所示，图3中Lane M:DL10000，Lane 1:fab-insert,2688bp；
S3、原载体酶切，酶切前后载体的凝胶电泳图如图4所示，图4中Lane M:DL10000，Lane 1:pComb3XTT，Lane 2:pComb3XTT digested with SacI and SpeI；
S4、Fab-insert片段酶切，酶切前后片段的凝胶电泳图如图5所示，图5中Lane M:DL10000，Lane 1:fab-insert,2688bp；
S5、酶切后载体和插入片段的连接和转化，转化后的克隆进行菌液PCR检测，其产物进行凝胶电泳图如图6所示，图6中Lane M:DL10000，Lane 1-7:Top10/pATA-Fab-insert,2688bp；
本发明还公开了一种新型的人源Fab噬菌体展示库的构建步骤：
T1、以人源淋巴细胞cDNA文库为模板，PCR扩增人源抗体的重链可变区和轻链可变区，其PCR反应体系及反应条件如下：
T2、轻链库的构建：用SacI和HindIII酶切该新型人源Fab噬菌体展示载体及人源轻链可变区扩增片段载体酶切体系如下：
于37℃孵育10h，65℃失活酶10min，人源轻链可变区扩增片段酶切体系如下：
37℃孵育10h后，65℃失活酶10min，然后进行载体和片段的连接，其连接体系如下：
16℃连接过夜，65℃失活酶10min。用常规电转化方法将连接产物电转至噬菌体展示宿主菌TG1中，其电转条件为600Ω,10μF,1.8kV，电转完成后，取一部分转化菌梯度稀释后铺在含有Amp抗生素的2YT固体培养基上，放于37度培养过夜，最终根据长出的克隆数计算全部菌中有效转化菌的数目，该数目即为轻链库的库容，该轻链库的库容为1.6×10^9pfu，为了检测有效转化菌中是否转入了含有正确插入片段的质粒，对其进行PCR检测，其插入正确率达到了100％，其凝胶电泳图如图7所示，图7中Lane M:DL2000，Lane 1-22:转化菌轻链插入片段扩增产物，
T3、在轻链库的基础上连入人源重链可变区：先提取轻链库全部有效转化菌中的噬菌体展示质粒，用NcoI和XhoI酶切轻链库噬菌体展示质粒及人源重链可变区扩增片段载体酶切体系如下：
于37℃孵育10h，65℃失活酶10min，人源重链可变区扩增片段酶切体系如下：
37℃孵育10h后，65℃失活酶10min，然后将重链可变区连入载体，形成完整的Fab抗体序列，其连接体系如下：
16℃连接过夜，65℃失活酶10min，用常规电转化方法将连接产物电转至噬菌体展示宿主菌TG1中，其电转条件为600Ω,10μF,1.8kV，电转完成后，取一部分转化菌梯度稀释后铺在含有Amp抗生素的2YT固体培养基上，放于37度培养过夜，最终根据长出的克隆数计算全部菌中有效转化菌的数目，该数目即为人源Fab抗体噬菌体展示库的库容，该人源Fab抗体噬菌体展示库的库容为1.95×10^9pfu，为了检测有效转化菌中是否转入了含有正确插入片段的质粒，对其进行PCR检测，其插入正确率达到了100％，凝胶电泳图如图8所示，图8中Lane M:DL2000，Lane 1-22:转化菌完整的抗体Fab序列扩增产物；
对最终获得的Fab抗体库挑取了100个左右的克隆进行抗体序列测序分析，最终抗体序列的正确率达到了82.8％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
