用于核酸操纵的装置和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)的规定，要求2017年5月22日提交的美国临时专利申请号62/509,426的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本文所公开的装置和方法涉及核酸操纵，特别是在多重核酸组装期间。
背景技术
重组和合成核酸在研究、工业、农业和医学中有许多应用。可以使用重组和合成核酸来表达和获得大量的多肽，包含酶、抗体、生长因子、受体和其它可用于多种医学、工业或农业目的的多肽。也可以使用重组和合成核酸来产生遗传修饰的生物体，包含修饰的细菌、酵母、哺乳动物、植物和其它生物体。遗传修饰的生物体可以用于研究(例如，疾病的动物模型、理解生物过程的工具等)、工业(例如，作为蛋白表达的宿主生物体、用于产生工业产物的生物反应器、环境补救的工具、分离或修饰具有工业应用的天然化合物等)、农业(例如，具有增加的产率或增加的对疾病或环境压力的抗性的经修饰作物等)和用于其它应用。重组和合成核酸也可以用作治疗组合物(例如，用于修饰基因表达、用于基因治疗等)或用作诊断工具(例如，病症的探针等)。
事实上，核酸合成是合成生物学的重要领域。根据美国能源部(U.S.Departmentof Energy(DOE))在其2013年7月向国会提交的报告中所述，“合成生物学”是“新生物部件和系统的设计和大规模构建，以及出于个性化目的重新设计现有的自然生物系统，将工程改造和计算机辅助的设计方法与生物研究相结合”。DOE报告中已经将DNA合成和组装认定为合成生物学持续发展的根本性的挑战。具体地，“合成生物学实验的主要限制之一是合成和组装大型DNA构建体，这仍然是昂贵、缓慢且易错的”。工程改造新型生物制造系统将需要用于快速、廉价且准确合成和组装遗传设计的新方法。
已经开发了多种技术用于修饰存在的核酸(例如，天然产生的核酸)来产生重组核酸。例如，可以使用核酸扩增、诱变、核酸酶消化、连接、克隆和其它技术的多种组合来产生许多不同的重组核酸。经常使用化学合成的多核苷酸作为用于核酸扩增、诱变和克隆的引物或衔接子。
对固体支持物上从头核酸合成的技术也正在开发中。例如，可以在常见支持物上原位合成预定核酸序列的单链寡核苷酸，其中在支持物上的分开或离散的特征部(feature)(或点)上合成各预定核酸序列。
也存在可用于从头核酸组装的技术，其中制备(例如，在支持物上化学合成)和组装核酸来产生较长的感兴趣的靶核酸。例如，已经开发了不同的多重组装技术用于将寡核苷酸组装成能用于研究、工业、农业和/或医学的较大的合成核酸。
然而，尽管当前存在进展，但是当前可用的基于支持物的合成和组装技术的一个限制是鉴定和选择一个或多个感兴趣的靶标的能力。因此，需要高精度、高选择性核酸核酸单一化(singulation)和组装技术。
发明内容
在一方面中，提供了用于选择性排放和/或转移核酸的装置，该装置包括设置成与固体支持物上一个或多个特征部对齐的压电组件，从而在使用时，所述压电组件产生机械力，以从固体支持物选择性排放和/或转移一份量或多份量的核酸。该固体支持物包括多个离散特征部，各特征部上具有按份量的核酸或者与按份量的核酸关联。电源向压电组件提供了电流以生成机械力。
在一方面中，提供了用于选择性排放核酸的装置，该装置包括：a)设置成与固体支持物上一个或多个特征部对齐的压电组件，从而在使用时，所述压电组件产生机械力，以从固体支持物选择性排放一份量或多份量的核酸，其中所述固体支持物包括多个离散特征部，各特征部上具有按份量的核酸或者与按份量的核酸关联；和b)电源，用于向压电组件提供电流以生成机械力。
在另一方面中，提供了用于选择性排放核酸的装置，该装置包括：(a)包含多个离散特征部的固体支持物，各特征部上具有按份量的核酸或者与按份量的核酸关联；(b)设置成由固体支持物选择性排放一份量或多份量的核酸的压电组件；和(c)电源，用于向压电组件提供电流以生成机械力，从而排放一份量或多份量的核酸。
在各种本公开的装置的各种实施方式中，由装置选择性排放的所述份量的核酸可以包含一个或多个寡核苷酸。在各种实施方式中，由装置选择性排放的所述份量的核酸可以包含一个或多个寡核苷酸。一个或多个寡核苷酸可以处于干燥环境(例如，与固体珠相关联)或液体环境(例如，水性溶液中)中。一个或多个寡核苷酸最初可被(共价或非共价地)固定于一个或多个特征部，并且可以经由化学、酶促和/或激光切割将其释放到所述份量的核酸中。在一实施方式中，激光可以用于通过切割光可激活接头来将一个或多个寡核苷酸选择性释放到所述按份量的核酸中。
在一些实施方式中，装置的固体支持物可以具有固定于其上的多个寡核苷酸。例如，具有不同序列的各寡核苷酸可以位于离散、可寻址的特征部上。在一些实施方式中，各特征部可以包含固定于其上的多个寡核苷酸。在一些实施方式中，固体支持物可以是包含多个珠的多孔板或微阵列。
在一些实施方式中，压电组件包括压电元件的矩阵，其中各压电元件可以设置成对应一特征部。
在某些实施方式中，压电组件包括单一压电组件。在一些实施方式中，单一压电元件可以是针。该装置可以还包括运输组件，其被设置成将针移动到所需特征部。
在另一方面中，提供了用于核酸组装的方法，该方法包括：(a)提供包含多个离散特征部的第一固体支持物，各特征部上具有按份量的核酸或者与按份量的核酸关联；(b)使用压电组件从第一特征部选择性排放(和/或移动)一份量或多份量的核酸到第二特征部；其中第一特征部包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有与第二特征部中的第二寡核苷酸互补或与之重叠的序列；和(c)组装第一和第二寡核苷酸。
在一些实施方式中，压电组件包括压电元件的矩阵，其中各压电元件可以设置成对应一特征部。在一些实施方式中，压电组件包括压电元件的矩阵，其中各压电元件设置成对应一特征部。在一些实施方式中，各份量的核酸包含一个或多个寡核苷酸。在一些实施方式中，各份量的核酸可以包含一个或多个寡核苷酸。一个或多个寡核苷酸可以处于干燥环境(例如，与固体珠相关联)或液体环境(例如，水性溶液中)中。在一些实施方式中，各特征部可以包含固定于其上的多个寡核苷酸。一个和多个寡核苷酸可以经由化学、酶促和/或激光切割释放到所述份量的核酸中。在一些实施方式中，第一特征部和第二特征部可以位于相同的固体支持物。在某些实施方式中，第一特征部可以位于第一固体支持物且第二特征部可以位于第二固体支持物。
在其它另一方面中，提供了用于选择性排放核酸的装置，该装置包括：a)设置成与固体支持物上一个或多个特征部对齐的组件，从而在使用时，所述组件产生机械力，以从固体支持物选择性排放一份量或多份量的核酸，其中所述固体支持物包括多个离散特征部，各特征部与按份量的核酸关联；和b)电源，用于向组件提供电流以生成机械力。
在其它另一方面中，提供了用于选择性排放核酸的装置，该装置包括：(a)包含多个离散特征部的固体支持物，各特征部与按份量的核酸关联；(b)设置成由固体支持物选择性排放一份量或多份量的核酸的组件；和(c)电源，用于向组件提供电流以生成机械力，从而排放一份量或多份量的核酸。在一些实施方式中，组件设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移实现一份量或多份量的核酸的转移。在一些实施方式中，组件是声学组件或压电组件。
在一些实施方式中，各份量的核酸包含一个或多个寡核苷酸。在某些实施方式中，一个或多个寡核苷酸处于干燥环境或液体环境。在一些实施方式中，各份量的核酸是溶液液滴。
在一些实施方式中，各特征部具有固定于其上的多个寡核苷酸。在某些实施方式中，固体支持物是包含多个珠的多孔板或微阵列。在一些实施方式中，组件包括压元件的矩阵，其中各元件设置成对应一特征部。
在一些实施方式中，一个和多个寡核苷酸经由化学、酶促和/或激光切割释放到所述份量的核酸中。
在一些实施方式中，装置包括激光，所述激光用于通过切割光可激活接头来将一个或多个寡核苷酸选择性释放到所述份量的核酸中。在一些实施方式中，组件包括单一元件。在某些实施方式中，单一元件可以是针。
在一些实施方式中，装置包括运输组件，其被设置成将针移动到所需特征部。
在一方面中，提供了核酸组装的方法，该方法包括：(a)提供包含多个离散特征部的第一固体支持物，各特征部与按份量的核酸关联；(b)使用组件从第一特征部选择性排放一份量或多份量的核酸到第二特征部，其中第一特征部包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有与第二特征部中第二寡核苷酸互补或与之重叠的序列；和(c)组装第一和第二寡核苷酸。在一些实施方式中，组件设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移实现一份量或多份量的核酸的转移。在某些实施方式中，组件是声学组件或压电组件。在一些实施方式中，组件包括压元件的矩阵，其中各元件设置成对应一特征部。
在某些实施方式中，各份量的核酸包含一个或多个寡核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个寡核苷酸处于干燥环境或液体环境。
在具体实施方式中，该方法包括将一个和多个寡核苷酸经由化学、酶促和/或激光切割释放到所述份量的核酸中。在一些实施方式中，固体支持物是包含多个珠的多孔板或微阵列。在某些实施方式中，各特征部具有固定于其上的多个寡核苷酸。
在一些实施方式中，第一特征部和第二特征部位于相同的固体支持物。在某些实施方式中，第一特征部位于第一固体支持物且第二特征部位于第二固体支持物。
在另一方面中，核酸组装的方法包括：a)提供包含多个离散特征部的第一固体支持物，各特征部与按份量的核酸关联；b)将一份量或多份量的核酸由第一特征部选择性转移到第二特征部，其中第一特征部包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有与第二特征部中第二寡核苷酸互补或与之重叠的序列；和c)组装第一和第二寡核苷酸。
在一些实施方式中，各份量的核酸包含一个或多个寡核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个寡核苷酸处于干燥环境或液体环境。在某些实施方式中，该方法还包括将一个和多个寡核苷酸经由化学、酶促和/或激光切割释放到所述份量的核酸。
在一些实施方式中，固体支持物是包含多个珠的多孔板或微阵列。在一些实施方式中，各特征部具有固定于其上的多个寡核苷酸。在某些实施方式中，第一特征部和第二特征部位于相同的固体支持物。在具体实施方式中，第一特征部位于第一固体支持物且第二特征部位于第二固体支持物。
附图简要说明
当前公开的实施方式将参考下述附图进一步说明。所示附图不一定按比例绘制，而强调一般着重于说明本公开实施方式的原理。
图1显示了一实施方式中的2-芯片多重核酸组装。
图2A显示了用于组装延伸的寡核苷酸的示例性方法。
图2B显示了用于组装延伸的寡核苷酸的示例性方法。
图3显示了一实施方式中完全或部分组装的靶核酸以及选定的靶核酸的单一化。
图4显示了用于组装延伸的寡核苷酸和/或完全或部分组装的靶核酸的示例性方法。
图5显示了用于组装延伸的寡核苷酸和/或完全或部分组装的靶核酸的示例性方法。
虽然上述指定的附图阐述了本公开的实施方式，但是也考虑了其它实施方式，正如讨论中所提到的。本公开以称述而非限制的方式示出了示例性的实施方式。本领域普通技术人员可以设计许多其它修饰和实施方式，它们落入当前公开的实施方式的原理的范围和精神。
发明详述
本文所公开的装置和方法设计核酸操纵，特别是在多重核酸组装期间。在一些实施方式中，基于压电的单一化可以用于在多重核酸组装之前、期间和/或之后由例如合成寡核苷酸选择性地挑选一个或多个靶标，所述合成寡核苷酸可以已经合成和/或固定于固体支持物上。在一些实施方式中，用于靶标的解离(例如，气溶胶解离或液体解离)的任何方法可在从例如合成寡核苷酸进行多重核酸组装之前、期间和/或之后与本文所述的方法联用，以单一化或分离相应份量的核酸中的靶标，所述合成寡核苷酸可以已经合成和/或固定于固体支持物(例如，微阵列、芯片和/或珠)上。在一些实施方式中，来自一个或多个离散位置(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50或更多特征部或地址(address)；多至并且包括固体支持物上的所有特征部)的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50或更多个)寡核苷酸同时解离。在某些情况中，只有选定的寡核苷酸从固体支持物解离，而其它寡核苷酸保持结合。作为一个非限制性示例，液体解离可以用于从支持物在选定位置解离寡核苷酸，并且这些解离的寡核苷酸可以通过任何手段(例如，通过使用压电或声学组件，使用实现机械位移(displacement)的任何手段的转移，或者通过使用另一方法转移，如与另一固体支持物接触)转移至另一支持物(第二固体支持物)或相同支持物上的另一特征部。
定义
方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语汇集在此。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一个元件”表示一个元件或者一个以上的元件。
本文所用术语“约”表示在20％以内，更优选10％以内并且最优选5％以内。术语“基本上”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。
本文所用“多个/多种”表示超过1个/种，例如，2、3、4、、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个/种，例如25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个/种，或其间任何整数。
“组装体”或“组装”表示其中短DNA序列(构建寡核苷酸)以特定顺序附连以形成较长DNA序列(靶寡核苷酸)的过程。“亚组装体”、“亚组装寡核苷酸”、“亚构建寡核苷酸”或“亚构建体”表示这样的中间步骤或产物，其中构建寡核苷酸的子集经附连以形成亚构建体，所述亚构建体为最终靶标的部分。“亚组装”表示通过组装构建寡核苷酸的子集产生“亚组装体”或“亚构建体”。
“CEL”或“粘性末端连接”指使用彼此之间至少部分互补的粘性末端以预设计的顺序接合DNA片段的过程。粘性末端可以通过限制性酶消化生成，或可以例如在固体支持物上直接合成。
本文所用“芯片”指具有附连于平坦表面的许多寡核苷酸的DNA微阵列。芯片上的寡核苷酸可以是任何长度。在一些实施方式中，寡核苷酸为约10-1,000、20-800、50-500、100-300或约200个核苷酸，或更长或更短，或之间的任何数字或范围。寡核苷酸可以是双链或单链的。
本文所用“互补”或“互补性”表示，按照标准沃森克里克(Watson-Crick)互补规则，两个核酸序列彼此之间能够至少部分碱基配对。例如，两个粘性末端可以是部分互补的，其中一个突出端的区域与另一个突出端的区域或全部互补且退火缺口(如果存在)可以通过在聚合酶和单个核苷酸存在的情况下进行链延伸而被填充，然后或同时进行连接反应。
如本文所用，“构建体”指包括完整靶序列的DNA序列。通常认为，该构建体是已经组装的。“亚构建体”表示完整靶序列的部分，其通常是分级组装期间的中间产物。
本文所用“特征部(feature)”指固体支持物，例如，芯片、多孔盘或微阵列上的离散位置(或点)。在一些实施方式中，寡核苷酸可以合成于和/或固定于特征部。离散特征部的排列可以存在于固体支持物上，用于组存、定向(routing)、扩增、释放和以其它方式操纵寡核苷酸或互补寡核苷酸进行进一步的反应。在一些实施方式中，各特征部是可寻址的：也即，各特征部位于支持物上特定的预定、预记录位置(即“地址”)。因此，各寡核苷酸分子位于支持物上已知和确定的位置。各寡核苷酸序列能由其在支持物上的位置来确定。可以选择特征部的大小来使得在所述特征部上形成微体积(例如，1-1000微升、1-1000纳升或1-1000皮升)的液滴，每个液滴保持互相分离。如本文所用，特征部通常(但不必需)由特征部间(interfeature)间隔分离，从而确保两个相邻特征部之间的液滴不会融合。特征部间通常在其表面上不携带任何寡核苷酸，并且对应惰性空间。在一些实施方式中，特征部和特征部间可在其亲水性或疏水性性质上不同。
本文所用“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“基因”或本文所用其它语法等同形式表示共价接合在一起的至少两个核苷酸，其为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸是任意长度的聚合物，包括，例如，10、20、50、100、200、300、500、1000等，但是不限于这些具体的示例。如本文所用，“寡核苷酸”可以是包括至少两个共价结合的核苷酸残基的核酸分子。在一些实施方式中，寡核苷酸长度可以是10-1000个核苷酸。例如，寡核苷酸长度可以是10-500个核苷酸，或500-1000个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度可以为约20-约800个核苷酸(例如，约20-400个核苷酸长度，约400-800个核苷酸长度)。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度可以为约50-约500个核苷酸(例如，约50-250个核苷酸长度或约250-500个核苷酸长度)。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度可以为约100-约300个核苷酸(例如，约100-250个核苷酸长度或约150-300个核苷酸长度)。然而，可以使用更短或更长的寡核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链核酸。本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且指核苷酸的天然产生或非天然产生、合成的聚合物形式。总言之，术语“核酸”包括“多核苷酸”和“寡核苷酸”，其中“多核苷酸”可以表示较长的核酸(例如，超过1,000个核苷酸，超过5,000个核苷酸，超过10,000个核苷酸等)，而“寡核苷酸”可以表示较短的核酸(例如，10-500个核苷酸，20-400个核苷酸，40-200个核苷酸，50-100个核苷酸等)。
本公开所述核酸分子可以从天然产生的核苷酸形成，例如形成脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子。或者，核酸可以包括结构修饰以改变其性质，诸如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)中的情况。用天然产生的碱基或人工碱基的核酸分子的固相合成为本领域熟知。应当理解的是，这些术语包含从核苷酸类似物中生成的RNA或DNA的等同物、类似物和应用于要描述的实施方式时的单链或双链多核苷酸。本公开中可用的核苷酸包含例如天然产生的核苷酸(例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，核苷酸的天然或合成修饰、和人工碱基。在一些实施方式中，核酸的序列不天然存在(例如，cDNA或互补的DNA序列，或人工设计的序列)。
核酸核苷中的核苷通过磷酸二酯键连接。当用字母序列表示核酸时，应理解核苷从左至右是5’至3’的顺序。按照IUPAC注释法，“A”表示腺嘌呤，“C”表示胞嘧啶，“G”表示鸟嘌呤，“T”表示胸腺嘧啶，“U”表示核糖核苷，尿苷。另外，也存在当超过一种核苷酸可能出现在该位置时使用的字母：“A”(即，弱相互作用，2H键)表示A或T，“S”(强相互作用；3H键)表示G或C，“M”(对于氨基)表示A或C，“K”(对于酮)表示G或T，“R”(对于嘌呤)表示A或G，“Y”(对于嘧啶)表示C或T，“B”表示C、G或T，“D”表示A、G或T，“H”表示A、C或T，“V”表示A、C或G并且“N”表示任何碱基A、C、G或T(U)。应理解的是，核酸序列并不限于4种天然的脱氧核苷酸，但也可包括核糖核苷或非天然核苷酸。核苷酸序列中的“/”或括号中给出的核苷酸表示替代性的核苷酸，例如作为DNA序列中T的替代的RNA序列中替代性的U。因此，U/T或U(T)指示可以是U或T的一个核苷酸位置。同样，A/T表示核苷酸A或T；G/C表示核苷酸G或C。由于U和T之间的功能同一性，因此本文对于U或T的任何描述均应当被认为是公开了T或U中的另一个。例如，述及序列UUCG(位于RNA)时应当也被理解为公开了序列TTCG(位于对应DNA)。仅处于简化的目的，本文仅描述这些选项中的一个。互补核苷酸或碱基是那些能够碱基配对的碱基，诸如A和T(或U)；G和C；或G和U(摇摆碱基配对)。
本文所用“压电组件”或“压电元件”表示利用压电推进力来生成移动所述份量的核酸从一个位置到另一位置的机械力的装置或装置的部分。在一些实施方式中，如此生成的机械力足以在可切割接头处切割靶核酸，所述靶核酸通过所述可切割接头附连至固体支持物。通常，某些晶体或陶瓷展现出这样的特性，通过所述特性它们在机械力存在的情况下生成电场。这些材料还经历逆压电效应，因此它们生成因施用的电场而导致的内部机械应变。这是用于核酸弹射(ejection)的后一种作用(latter effect)。压电组件可以具有压电元件的板、网格或矩阵的形式。压电组件还可以具有单一压电元件的形式，诸如喷嘴或针。
本文使用的术语“固体支持物”、“支持物”和“基质”可互换使用，并且是指多孔或无孔固体(例如，溶剂不可溶)材料，在其上合成或固定聚合物例如核酸。本文使用的“多孔”是指所述材料包含有基本一致直径(例如纳米范围内)的孔。多孔材料可以包含但不限于，纸张、合成过滤器等。在这种多孔材料中，反应可以在孔中进行。支持物能具有很多形状中的任何一种，例如销型、条、板、平盘、杆状、弯曲、圆柱形结构、颗粒(包括但不限于，珠、纳米颗粒等)。在一些实施方式中，支持物是平面的(例如，芯片)。支持物可有可变宽度。固体支持物可以是有组织的孔的矩阵或网络，诸如微阵列。在一些实施方式中，支持物可以包括多个珠或颗粒，任选地位于一个或多个多孔板中。
支持物可以是亲水性的或能够呈现出亲水性的。所述支持物可以包括但不限于，无机粉末如二氧化硅、硫酸镁、和氧化铝；天然聚合材料，特别是纤维素材料和纤维素衍生材料，例如包含纤维的纸，如滤纸、色谱纸等；合成或改性的天然产生的聚合物，如硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、玻璃、可控孔度玻璃、磁性可控孔度玻璃、陶瓷、金属等；这些材料或单独使用或与其它材料(诸如但不限于本文所列的这些)联用。
本文所用的术语“阵列”是指为进一步反应存储、定向、扩增和释放寡核苷酸或互补寡核苷酸的离散特征部的排列。阵列可以是平面的。在一实施方式中，支持物或阵列可以是可寻址的。可寻址的支持物或阵列可以能够直接控制单独分离的体积如液滴。
如本文所用术语“固定的”表示与固体支持物结合的寡核苷酸，它们可以通过其5'端或3'端附连。结合支持物的寡核苷酸可以通过核苷酸序列(如简并结合序列)或接头(如光可激活接头或化学接头)固定于支持物。应理解的是，3'端是指所述5’端的下游序列，而5’端是指所述3’末端的上游序列。例如，寡核苷酸可通过不参与后续反应的核苷酸序列或接头固定在芯片上。某些固定方法由Nimse等,Sensors 2014,14,22208-22229综述，其公开通过引用其全部内容纳入本文。
本文所用术语“化学切割”表示通过切割或降解对化学切割或降解易感的不稳定连接来释放固定的寡核苷酸，从而释放固定的寡核苷酸。例如，连接的区域可以包含这样的区域，所述区域经化学修饰以响应局部环境pH的变化而水解或降解。某些化学可切割接头由Leriche等,Bioorganic and Medicinal Chemistry 20(2012)571-582综述，其公开通过引用其全部内容纳入本文。作为非限制性示例，可以通过使用气态氨、水性氢氧化铵、水性甲胺或其混合物来水解切割P-O键而从固体支持物上的一个或多个特征部释放寡核苷酸，所述P-O键将3'-末端核苷酸残基的3’-O与通用接头附连。
本文所用术语“酶促切割”表示通过切割或降解含有对酶促降解易感区域的不稳定连接来释放固定的寡核苷酸，从而释放固定的寡核苷酸。示例性的可切割基团包括但不限于可以被蛋白酶切割的肽序列，所述蛋白酶诸如TEV蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，组织蛋白酶K，胱天蛋白酶1，和基质金属蛋白酶，以及诸如磷酸二酯，磷脂，酯和β-半乳糖基团的基团。某些酶可切割接头由Leriche等,Bioorganic andMedicinal Chemistry 20(2012)571-582综述，其公开通过引用其全部内容纳入本文。此外，连接可以包含易于被限制性酶切割的核酸序列。限制性酶切割位点的示例包括但不限于常见限制性酶，诸如AatI、AatII、AccI、AflII、AluI、Alw44I、ApaI、AseI、AvaI、BamHI、BanI、BanII、BanIII、BbrPI、BclI、BfrI、BglI、BglII、BsiWI、BsmI、BssHII、BstEII、BstXI、Cfr9I、Cfr10I、Cfrl3I、CspI、Csp45I、DdeI、DraI、Eco47I、Eco47III、Eco52I、Eco8lI、Eco105I、EcoRI、EcoRII、EcoRV、EcoT22I、EheI、FspI、HaeII、HaeIII、HhaI、Hin1I、HincII、HindIII、HinfI、HpaI、HpaII、KpnI、MboII、MluI、MroI、MscI、MspI、MvaI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NspV、PacI、PpuMI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SacII、SalI、Sau3AI、Sau96I、ScaI、ScrFI、SfiI、SmaI、SpeI、SphI、SrfI、SspI、TaqI、TspEI、XbaI和XhoI。可以使用本领域已知的其它限制性酶。
本文所用术语“光可激活接头的切割”表示通过切割或降解对光和/或来自光(诸如激光)的热量易感的不稳定连接来释放固定的寡核苷酸，从而释放固定的寡核苷酸。例如，因为向连接施用激光，所以连接区域可以被热量降解。其它光可切割基团(light-cleavable group)或光照可切割基团(photo-cleavable group)包括2-硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯，8-喹啉基苯磺酸盐/酯，香豆素，磷酸三酯，双芳基腙和双满(bimane)二-硫代丙酸衍生物。某些光可活化接头由Leriche等,Bioorganic and Medicinal Chemistry20(2012)571-582综述，其公开通过引用其全部内容纳入本文。
“靶标”或“靶寡核苷酸”指具有已知核苷酸序列(例如，如客户所预定)的待使用本文所公开的一种或多种方法鉴定、合成和/或组装的核酸。按照一些实施方式，可以计算机辅助方式设计和/或分析靶核酸序列来产生一组经解析的双链或单链寡核苷酸。如本文所用，术语“经解析的”表示靶核酸的序列已经描绘，例如以计算机辅助的方式，从而鉴定一系列相邻、连续的构建片段，所述构建片段一起包含靶核酸。相邻构建片段可以是单链或双链的并且可以通过合适数量(例如，3-20、3-30、3-40、3-50、4-20、4-30、4-40、4-50、5-20、5-30、5-40、5-50或其它合适数量)的核苷酸彼此重叠来促进组装。
本文使用的“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意为涵盖其后列出的项目和其等同物以及外加的项目。“由……组成”应被理解为封闭式的、与之相关的是有限范围的元素或特征。“基本由……组成”将范围限制在指定的元素或步骤但不排除那些并不实质上影响相关发明基础和新颖特征的元素或步骤。
本文所用术语“单一化(singulation)”可以指分子或一组基本等同的分子(例如，寡核苷酸)的鉴定和/或分离。术语“单一化”还可以指能够鉴定和/或分离单个分子或一组基本等同的分子(例如，寡核苷酸)的过程或状态。
本文所用术语“份量的核酸/按份量的核酸(volume of nucleic acid)”指位于特定(离散)位置或特征部处的寡核苷酸的同源或异源群体。按份量的核酸可以是“湿的”(即，可以包含一种或多种液态组成，包括但不限于，一种或多种缓冲溶液和/或水)或者可以是干的(即，不包含液态组成)。多份量的核酸可以存在于相应数量的特定(离散)位置或特征。作为非限制性的示例，3个份量的核酸将存在于3个特定(离散)位置或特征部，3个特定(离散)位置或特征处各自存在一体积的核酸。
合适领域的普通技术人员能够一般理解本文所使用的重组核酸技术、合成生物学和分子生物学领域内的其它术语。
合成寡核苷酸
合成寡核苷酸可以在多重核酸组装中用作构建寡核苷酸。为了组装靶核酸，一种策略是分析该靶核酸的序列并且将其解析成可以被组装(例如，连接)成靶核酸的两个或更多个构建寡核苷酸。。
在一些实施方式中，可以在组装之前扩增一个或多个构建寡核苷酸。为了促进扩增，一个或多个构建寡核苷酸和/或亚构建体可以被设计成包括一个或多个引物结合位点，在聚合酶链式反应中，引物可以与之结合或者退火。引物结合位点可以被设计成对所有构建寡核苷酸或其子集或两个或更多个亚构建体为通用的(即，相同的)。通用引物结合位点(和对应的通用引物)可以被用于在聚合酶链式反应中扩增具有这样的通用引物结合位点的所有构建寡核苷酸或亚构建体。还可以设计对一个或多个选择构建寡核苷酸和/或亚构建体具有特异性的引物结合位点，从而允许靶向且特异性扩增所述选择构建寡核苷酸和/或亚构建体。在一些实施方式中，所有引物结合位点是独特的。在一些实施方式中，一个或多个构建寡核苷酸和/或亚构建体可在一端或两端包含巢式或连续引物结合物位点，其中一个或多个外引物和内引物可以与之结合。在一示例中，构建寡核苷酸和/或亚构建体各自具有针对外引物对和内引物对的结合位点。外引物对中的一个或两个可以是通用引物。或者，外引物对中的一个或两个可以是独特的引物。在一些实施方式中，在组装前，单独扩增各构建寡核苷酸。构建寡核苷酸还可以被汇集至一个或多个库(pool)中用于扩增。在一个示例中，在单一的库中扩增所有的构建寡核苷酸。在某些实施方式中，扩增的构建寡核苷酸经由基于聚合酶的组装或连接来组装。扩增的构建寡核苷酸可以被分级地或连续地或以一步反应组装成靶核酸。
一个或多个引物结合位点可以被设计成被纳入最终靶核酸的构建寡核苷酸的部分。在一些实施方式中，各引物结合位点的所有或部分可以是构建寡核苷酸中心部分外的侧接区域形式，其中，中心部分被纳入最终靶核酸，并且侧接区域需要在组装前被移除。为此，一个或多个限制性酶(RE)位点可以被设计成允许侧接区域的去除。
在一些实施方式中，该RE位点可以是II型RE位点，如IIP型或IIS型，和修饰的或杂交位点。IIP型酶识别4-8碱基对长度的对称(或回文)DNA序列，并且通常在该序列内切割。IIP型限制性酶的非限制示例包括：EcoRI、HindIII、BamHI、NotI、PacI、MspI、HinP1I、BstNI、NciI、SfiI、NgoMIV、EcoRI、HinfI、Cac8I、AlwNI、PshAI、BglI、XcmI、HindIII、NdeI、SacI、PvuI、EcoRV、NciI、TseI、PspGI、BglII、ApoI、AccI、BstNI和NciI。IIS型限制性酶使单双链充识别位点切下0-20个碱基。IIS型限制性酶的非限制性示例包括：BstF5I、BtsCI、BsrDI、BtsI、AlwI、BccI、BsmAI、EarI、MlyI(钝)、PleI、BmrI、BsaI、BsmBI、FauI、MnlI、SapI、BbsI、BciVI、HphI、MboII、BfuAI、BspCNI、BspMI、SfaNI、HgaI、BseRI、BbvI、EciI、FokI、BceAI、BsmFI、BtgZI、BpuEI、BsgI、MmeI、BseGI、Bse3DI、BseMI、AcIWI、Alw26I、Bst6I、BstMAI、Eam1104I、Ksp632I、PpsI、SchI(钝)、BfiI、Bso31I、BspTNI、Eco31I、Esp3I、SmuI、BfuI、BpiI、BpuAI、BstV2I、AsuHPI、Acc36I、LweI、AarI、BseMII、TspDTI、TspGWI、BseXI、BstV1I、Eco57I、Eco57MI、GsuI和BcgI。这类酶和关于它们的识别位点和切割位点的信息可从供应商如新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Inc.，美国马萨诸塞州伊普斯威奇)处得到。
限制性酶(RE)位点可经甲基化，因此它们可用诸如MspJI、SgeI和/或FspEI的甲基化-敏感型核酸酶消化。这样的甲基化敏感性核酸酶共享IIM型和IIS型特性；因此，其只识别甲基化-特异性的4-bp位点mCNNR(N＝A或T或C或G；R＝A或G)，并且切割该识别序列外侧的DNA。
根据靶核酸设计构建寡核苷酸后，构建寡核苷酸可以通过商业供应商或本领域已知的任何方法合成或以其它方式供应。通常，寡核苷酸合成涉及许多化学步骤，其在整个合成过程中以循环或重复的方式进行，各循环向正在增长的寡核苷酸链添加一个核苷酸。循环中涉及的化学步骤是：去保护步骤，其释放官能团以供进一步链延伸，偶联步骤，其将核苷酸纳入待合成的寡核苷酸中，以及寡核苷酸合成中所用特定化学所需的其它步骤，诸如亚磷酰胺化学所需的氧化步骤。任选地，可以将加帽步骤插入该循环中，所述加帽步骤阻断在偶联步骤中不被延长的那些官能团。在寡核苷酸合成是以3'→5'方向进行的情况下，核苷酸可以被添加到末端核苷酸的5'-羟基，或者在寡核苷酸合成是以5'→3'方向进行的情况下，核苷酸可以被添加到末端核苷酸的3’-羟基。
为清楚起见，双链核酸的两条互补链在本文中被称为正链(P)和负链(N)。这种名称并不意在暗示链是编码序列的正义链和反义链。它们仅仅是指核酸(例如，靶核酸，中间体核酸片段等)的两条互补链，无关核酸的序列或功能。因此，在一些实施方式中，P链可以是编码序列的正义链，而在其它实施方式中，P链可以是编码序列的反义链。应当理解的是，本文提及的互补核酸或互补核酸区域是指具有互相反向互补使得它们能够以天然DNA典型的反向平行方式杂交的核酸或其区域。
在本公开的一些方面中，根据本文所述方法合成或制备的寡核苷酸可以被用作结构单元(building block)，用于感兴趣的寡核苷酸或靶多核苷酸(例如，具有预先确定或预定序列)的组装。
寡核苷酸可以使用本领域已知的方法在固体支持物上合成。。在一些实施方式中，多种不同的单链寡核苷酸被固定在固体支持物的不同特征部处。在一些实施方式中，结合支持物的寡核苷酸可通过其5'末端或其3'末端附连。在一些实施方式中，所述结合支持物的寡核苷酸可以通过核苷酸序列(如简并结合序列)或接头(如光可切割的接头或化学接头)固定在支持物上。应理解的是，3'端是指所述5’端的下游序列，而5’端是指所述3’末端的上游序列。例如，寡核苷酸可通过不参与后续反应的核苷酸序列或接头固定在支持物上。
本公开的某些实施方式可以利用固体支持物，其包括惰性基质和多孔反应层。多孔反应层可以提供用于固定预合成的寡核苷酸或用于合成寡核苷酸的化学功能性。在一些实施方式中，阵列的表面可以用这样的物质处理或包覆，所述物质包括合适的反应基团，用于固定或共价连接核酸。可以使用本领域已知且具有用于寡核苷酸固定或原位合成的合适反应基团的任何材料。
在一些实施方式中，可以处理多孔反应层从而包括羟基反应基团。例如，多孔反应层可以包括蔗糖。
根据本公开的一些方面，以3’磷酰基寡核苷酸封端的寡核苷酸可以3'→5'方向在固体支持物上合成，所述固体支持物具有与其连接的化学磷酸化试剂。在一些实施方式中，合成寡核苷酸之前，磷酸化试剂可与多孔层偶联。在示例性的实施方式中，磷酸化试剂可以与蔗糖偶联。例如，磷酸化试剂可以是2-[2-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基磺酰基]乙基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺。在一些实施方式中，3'磷酸化的寡核苷酸可以从固体支持物释放，并且根据本文所述方法进行后续修饰。在一些实施方式中，3’磷酸化的寡核苷酸可以使用气溶胶解离或液体解离释放。在一些实施方式中，3’磷酸化的寡核苷酸可以使用气态氨、水性氢氧化铵、水性甲胺或者这些组分中的两种或更多种的混合物从固体支持物释放。
在一些实施方式中，可以设计用于组装的合成的寡核苷酸(例如，具有设计的或预定的序列、大小和/或数量)。可使用标准DNA合成化学(例如，通过使用亚磷酰胺方法)来生产合成的寡核苷酸。可使用如本文详述的任何合适技术在固体支持物(包括但不限于微阵列)上合成合成的寡核苷酸。可在扩增之前将寡核苷酸从微阵列上洗脱下来或在微阵列上扩增寡核苷酸。应当理解的是，不同的寡核苷酸可以被设计为具有不同的长度。
在一些实施方式中，寡核苷酸是合成的(例如，在阵列形式上)，如美国专利号7,563,600、美国专利申请序列号13/592,827和/或公开为WO 2014/004393的PCT/US2013/047370中所述，其通过引用将其全部内容纳入本文。例如，可以在常见支持物上原位合成单链寡核苷酸，其中在基底上的单独或离散的特征部(或点)上合成各寡核苷酸(例如，给定序列的个别寡核苷酸或相同序列的超过一个寡核苷酸)。在一些实施方式中，单链寡核苷酸结合到所述支持物或特征部的表面上。本文所用的术语“阵列”是指为进一步反应存储、定向、扩增和释放寡核苷酸或互补寡核苷酸的离散特征部的排列。阵列可以是平面的。在一实施方式中，所述支持物或阵列是可寻址的：所述支持物包含在所述支持物上特定预定位置(即“地址”)上的两个或更多离散的可寻址特征部。因此，阵列上的各寡核苷酸分子位于所述支持物上已知和确定的位置。各寡核苷酸序列能从其在所述支持物上的位置来确定。在一些实施方式中，各特征部(支持物上确定的位置)可以具有超过一个寡核苷酸，但是仅在位于该特征部的各寡核苷酸具有相同的序列时。另外，可寻址的支持物或阵列能够直接控制单独分离的体积如液滴。可以选择限定特征的大小来使得在所述特征上形成微体积的液滴，每个液滴保持互相分离。如本文所述，多个特征通常(但不必需)由特征部间的间隔分离从而确保两个相邻特征部之间的液滴不会融合。特征部部间通常在其表面上不携带任何寡核苷酸，并且对应惰性空间。在一些实施方式中，特征部和特征部间可在其亲水性或疏水性性质上不同。
寡核苷酸可以是单链核酸。然而，在一些实施方式中，可以如本文所述使用双链(至少部分)寡核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸可以是化学合成的，如本文所述。在一些实施方式中，合成寡核苷酸可以在使用前扩增。所得的产物可以是双链的。
一个或多个修饰的碱基(例如，核苷酸类似物)可以被纳入。修饰的例子包括但不限于下述的一种或多种：甲基化的碱基，如胞嘧啶和鸟嘌呤；通用碱基，如硝基吲哚、dP和dK、肌苷、尿嘧啶；卤代碱基，如BrdU；荧光标记的碱基；非-放射性标记物，如生物素(作为dT的衍生物)和地高辛(DIG)；2,4-二硝基苯基(DNP)；放射性核苷酸；偶联后修饰，如dR-NH2(脱氧核糖-Neb)；吖啶(6-氯-2-甲氧基吖啶)；和间隔物磷酰胺，其在合成中使用以向序列添加间隔物“臂”，如C3、C8(辛二醇)、C9、Cl2、HEG(六甘醇)和Cl8。
在各种实施方式中，合成的单链或双链寡核苷酸可以是非天然产生的。在一些实施方式中，合成的寡核苷酸可以是未甲基化的或以这样的方式经修饰的(例如，体外化学或生物化学修饰)，所述方式中它们变成半-甲基化的(只有一条链被甲基化)，部分-甲基化的(一条链或两条链上只有常规甲基化位点的部分被甲基化)，超甲基化的(一条链或两条链上超出常规甲基化位点被甲基化)，或以其它方式具有非天然产生的甲基化模式(一条链或两条链上常规甲基化位点中的一些被甲基化，和/或常规未甲基化的位点被甲基化)。与之相反，天然产生的DNA通常包含表观遗传修饰，如通过DNA甲基转移酶(DNMT)的体内甲基化，例如在DNA胞嘧啶环的C-5位置。DNA甲基化由Jin等,基因和癌症(Genes&Cancer)2011年6月；2(6):607–617综述，通过引用其全部内容将其纳入本文。
多重核酸组装
多重核酸组装可以用于制备一个或多个靶核酸，其中对于各靶核酸，多重构建寡核苷酸可以根据预设计的顺序彼此接触。构建寡核苷酸可以是单链的并且可以通过设计在正链和负链之间交替，因此一个构建寡核苷酸与另一构建寡核苷酸部分退火并且一起形成双链(至少部分)产物。构建寡核苷酸还可以使双链的并且可以设计成具有相容粘端，所述相容粘端彼此之间至少部分退火，从而以预设计的顺序对齐构寡核苷酸以形成双链产物。双链产物可以是无缺口的，并且在连接后产生靶核酸。双链产物可以包含可以通过聚合酶填充的缺口。
在一些实施方式中，组装可以平行的方式发生，其中同时制备多个靶核酸。例如，可以平行产生2-100,000、5-10,000、10-1000、100-500或其它数量的靶标。
组装可以使用分级、顺序和/或一步组装进行。仅举例来说，将寡核苷酸A、B、C和D(各自为构建寡核苷酸)分级组装成A+B+C+D靶标可以包括首先组装A+B和C+D(各自为亚构建体或亚组装体)，然后将A+B和C+D亚构建体组装成A+B+C+D(靶标)寡核苷酸。顺序组装可以包括组装A+B(原代亚构建体或亚组装体)，然后A+B+C(二级亚构建体或亚组装体)，最终A+B+C+D(靶标)。一步组装将A、B、C和D组合在一个反应中组合以产生A+B+C+D靶标。应当注意的是，可以将不同的策略混合，其中构建寡核苷酸的一部分使用一种策略组装，而另一部分使用不同的策略。
构建寡核苷酸可以是化学合成的，例如，如上所述的固体支持物上化学合成。在一些实施方式中，可以合成足够量的构建寡核苷酸，从而使在不需要扩增一个或多个构建寡核苷酸的情况下实现直接亚组装或完全组装。在某些实施方式中，化学合成后的构建寡核苷酸可首先经亚组装成亚构建体，其可以被扩增(例如，在基于聚合酶的反应中)，并且然后经进一步的组装成为二级亚构建体或最终靶标。在一些实施方式中，可以在组装之前扩增一个或多个构建寡核苷酸。在一些实施方式中，可以在组装之前扩增一个或多个亚构建体(或亚组装体)。最终，可以设计构建寡核苷酸和/或亚构建体以具有如本文所公开的一个或多个通用或特定(例如，独特)引物结合位点。
可以在固体支持物上进行组装，任选地通过微流体装置协助，诸如PCT公开号WO2011/066185和WO2011/056872中所公开的那些，其各自的公开通过引用其全部内容纳入本文。
PCT公开号WO2012/078312中公开了基于一固体支持物的组装策略，通过引用其全部内容纳入本文。简言之，在一些实施方式中，两个或多个芯片可以针对多重核酸组装设计。设计各芯片具有多个离散、可寻址特征部。例如，参照图1，芯片A设计成具有特征部A1、A2、A3、…An，而芯片B具有特征部B1、B2、B3、…Bn。A1和B1具有固定于其上的寡核苷酸，它们一起包含靶核酸X1，A2和B2具有固定于其上的寡核苷酸，它们一起包含靶核酸X2，…，而An和Bn具有固定于其上的寡核苷酸，它们一起包含靶核酸Xn。更多的芯片可以用于组装较长的靶核酸。单个芯片内的特征部由距离D(例如，10微米、15微米、20微米、25微米、30微米、35微米、40微米、45微米、50微米、55微米、60微米、65微米、70微米、75微米、80微米、85微米、90微米、95微米、100微米或任何合适的距离)分离。组装期间，两个芯片(例如，A和B)可以彼此面对面对齐，从而使特征部A1与特征部B1对齐，特征部A2与特征部B2对齐…，且特征部An与特征部Bn对齐。两个芯片之间的距离d足够小，从而使特征部A1、A2、A3、…An内的寡核苷酸可以分别与特征部B1、B2、B3、…Bn内的那些寡核苷酸接触。例如，如果寡核苷酸的长度平均是100bp，那么d可以是大约30纳米(3nm/bp x 100bp)。距离D和d可以设计成d<<D，以保证一个芯片中的寡核苷酸与另一芯片中的寡核苷酸接触，而不接触相同芯片上邻近特征部中的寡核苷酸。以此方式，特征部A1、A2、A3、…和An内的寡核苷酸可以与特征部B1、B2、B3、…和Bn内的那些寡核苷酸通过例如连接或基于聚合酶的组装进行组装。因此，组装的产物X1、X2、X3、…和Xn可以由一个或两个芯片经由例如化学、酶促或光-可激活切割释放。
图2A显示了用于在一个特征部组装延伸的寡核苷酸的示例性方法。寡核苷酸1-4各自表示待组装的靶核酸片段两条链的部分。寡核苷酸1可以固定于锚固芯片100的特征部上。寡核苷酸2-4可以经由例如本文所公开的基于压电的单一化与寡核苷酸1接触。组装可以通过这样发生：寡核苷酸1的互补部分与寡核苷酸2的碱基配对，寡核苷酸2的互补部分与寡核苷酸3的碱基配对，和寡核苷酸3的互补部分与寡核苷酸4的碱基配对。使用链延伸(至1与3或2与4之间存在任何缺口的程度)和/或连接反应，寡核苷酸1-4可被组装成双链产物。使用相同的策略，在单釜式反应中，或者通过系列添加，可以组装更多寡核苷酸。
图2B显示了用于使用两个芯片——锚固芯片100和构建芯片200组装延伸的寡核苷酸的示例性方法。寡核苷酸10固定于锚固芯片100的特征部上。提供寡核苷酸20，其与寡核苷酸10部分退火并且还包含这样的部分，所述部分具有与寡核苷酸30互补的序列。寡核苷酸30可以在构建芯片200上基于聚合酶的反应合成并且与下述部分互补或者包含下述部分，所述部分与固定于构建芯片200的寡核苷酸40具有序列互补性。和成后，寡核苷酸30可以由构建芯片200释放并且可以转移至锚固芯片100成为构建寡核苷酸30'。通过设计使构建寡核苷酸30'与寡核苷酸20退火，并因此使其与寡核苷酸10紧密接近。使用链延伸(至10与30'之间存在任何缺口的程度)和/或连接反应，寡核苷酸10、20和30'可被组装成双链产物。如同构建寡核苷酸30'，还可以由与构建芯片200相同或不同的构建芯片提供寡核苷酸20。使用相同的策略，在单釜式反应中，或者通过系列添加，可以组装更多寡核苷酸。
单一化(Singulation)
本文所公开的寡核苷酸合成和多重核酸组装过程的任何步骤期间，可能需要由原始位置选择性排放和/或转移一个或多个核酸以进行进一步操纵。例如，在一些实施方式中，组装的X1、X2、X3、…和Xn靶核酸可以与一芯片(例如，锚固芯片)保持附连，所述芯片中可以进行一个或多个核酸的选择性挑选或单一化。或者，可以由芯片释放靶核酸，但是在选择性单一化之前仍然保持吸附于可寻址特征部内(例如，通过溶液的微体积保留)。可能需要选择性单一化以基于特定靶核酸在可寻址特征部上的位置选择感兴趣的特定靶核酸。在一些实施方式中，出于质量检查的目的，可以随机挑选一个或多个靶核酸。例如，可以从芯片上的n个特征部随机挑选m数量的靶核酸(例如，m<<n)并进行测序以确定组装质量。
本文所公开的单一化装置和方法的一个优势是选定核酸的无接触式弹射(contact-free ejection)，这就避免更换移液器吸头(机械挑选设备中可能使用)的需求。这还使潜在的交叉污染最小化，同时提供了大规模弹射和选择所需核酸的能力。
在一些实施方式中，可以通过使用压电组件实现选择性单一化。压电组件可以具有压电元件的板、网格或矩阵的形式，其可以置于固体支持物的上方、下方或作为固体支持物的整合部分，从而使各压电元件对应一特征部。通过例如使电流传导通过一个或多个元件，可以选择性激活压电元件，以生成机械力来排放、转移或以其它方式运输选择靶核酸。可以控制机械力，例如，使其足够强以在可切割接头处切割靶核酸，所述靶核酸通过该接头与芯片附连。或者，经由例如化学、酶促和/或光可激活切割，靶核酸可以之前已经被释放或者可以同时(相同时间)释放到按份量的核酸(例如，液体溶液的微体积)，并且可控制机械力可以足以排放、转移或以其它方式运输所述份量的核酸。在一些实施方式中，激光可以用于通过切割光可激活接头来选择性释放一个或多个寡核苷酸。
压电组件还可以具有单一压电元件(例如，喷嘴或针)的形式，可以将所述单一压电元件移动到选定的特征部，以排放、转移或以其它方式运输与所述特征部附连的靶核酸。在一些实施方式中，可以移动超过一个元件(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等元件)至选定的特征部，并且可以用于一次性排放、转移或以其它方式运输与所述特征部附连的靶核酸。在一些实施方式中，特征部本身可以包含压电材料，其中电流可以选择性地通过一个或多个特征部(相同时间或不同时间)以排放、转移或以其它方式运输与特征部附连的靶核酸。
在一些实施方式中，芯片上的各特征部可以设置成包括压电组件，从而在施用外部电场时拉伸或压缩压电组件，以使位于特征部的试剂(例如，在水溶液中或干燥环境中)移动。压电组件可以是各特征部的最外层，并且可以任选地经处理以具有允许寡核苷酸固定或沉积(进行沉积)的表面化学。或者，另一层材料(表面材料)可以置于压电组件的顶部，并且表面材料可以用于沉积或固定寡核苷酸。外部电场可以均匀地向所有特征部施加或者可以选择性地向一个或多个感兴趣的特征部施加。取决于压电组件的类型，当外部电场施加时，其可以拉伸或压缩压电组件，例如与位于特征部的试剂基本垂直的，以将试剂朝着远离特征部的方向排放、转移或以其它方式运输。在一些实施方式中，两个芯片可以对齐，因此，由第一芯片排放或转移的试剂可以被运输到第二芯片。试剂可以包括用于组装的一个或多个寡核苷酸，促进寡核苷酸运输的流体体积，以及用于连接、PCR和/或限制性反应的连接酶、dNTP、DNA聚合酶、限制性酶、和缓冲剂/盐中的一种或多种。
在一些实施方式中，除了芯片内包含的第一压电组件，可以添加第二压电组件以协助排放、转移或以其它方式运输试剂。第二压电组件可以具有压电元件的板、网格或矩阵的形式，其可以置于固体支持物的上方或下方，从而使各压电元件对应一特征部。第一和第二压电组件一起指导一个或多个特征部上试剂的受控运动。
合适的压电材料包括天然材料，诸如磷铝矿(AlPO4)，石英，和黄晶；或人造晶体，诸如磷酸镓单晶(Gallium orthophosphate(GaPO4))或硅酸镓镧(Langasite(La3Ga5SiO14))。合适的人工制造的陶瓷包括钛酸钡(BaTiO3)，钛酸铅(PbTiO3)，锆钛酸铅，铌酸锂(LiNbO3)，锂钽铁矿(LiTaO3)和钨酸钠(Na2WO3)。诸如聚偏氟乙烯(PVDF)的一些聚合物也可以是合适的。本领域技术人员将能够确定适用于本文所述组合物和方法的压电材料的类型。
这些压电材料可以纳入微电机系统(MEMS)致动器以实现核酸单一化。在一实施方式中，压电层可以在悬臂顶部制造，夹在电极之间，和/或以垂直方向竖立。可以在顶部和底部电极之间施加平行于压电层极化的电场，其可以在横向产生负应变，而其余的悬臂则不能。因此悬臂向上弯曲。在另一实施方式中，可以在悬臂顶部、交指状电极下制造压电层。电场可以在平面中，并且压电层竖立于(poled in)平面。当E平行于竖立时，压电层可以在其长度方向上产生正应变，从而使悬臂向下弯曲。在其它实施方式中，可以定位悬臂以实现核酸弹射
在一些实施方式中，还可以使用梳齿驱动(comb drive)致动器。梳齿驱动致动器通常包含两个交指状手指结构，其中一个梳齿固定，而另一个与兼容的悬架连通。通常，齿状物被布置成使得它们可以彼此滑过，直到各齿状物占据相对梳状物中的狭槽。压电材料两端的驱动电压导致桁架材料变形，进而导致可移动指状物向固定的指状物移位。机械力通过弹簧结构产生。如MEMS领技术领域普通技术人员通常所理解的，压电部件也可以以滑动粘附(slipstick)、尺蠖(inchworm)和/或升降鳍(flipper)等形式提供。
在某些实施方式中，压电材料可以是位于各特征部的固体支持物的整合组件。核酸可以结合在压电材料上。可以包括可选的柔性背衬材料。致动时压电材料中极化的变化可以用于凹射或凸射。
在一些实施方式中，可以使用声学组件实现选择性单一化。声学组件可以具有声学元件的板、网格或矩阵的形式，其可以置于固体支持物的上方、下方或作为固体支持物的整合部分，从而使各声学元件对应一特征部。选择性激活声学元件，以生成机械力来排放、转移或以其它方式运输选择靶核酸。可以控制机械力，例如，使其足够强以在可切割接头处切割靶核酸，所述靶核酸通过该接头与芯片附连。或者，经由例如化学、酶促和/或光可激活切割，靶核酸可以之前已经被释放或者可以同时(相同时间)释放到份量的核酸(例如，液体溶液的微体积)，并且可控制机械力可以足以排放、转移或以其它方式运输所述份量的核酸。在一些实施方式中，激光可以用于通过切割光可激活接头来选择性释放一个或多个寡核苷酸。
在某些实施方式中，选择性单一化可以通过任何方法实现，包括通过下述方法，其中组件设置成与特征部相互作用并通过机械位移实现一份量或多份量的核酸的转移。在一些实施方式中，在没有这类机械位移的情况下(例如，通过使用除了本文所述压电或声学元件以外的组件)，可以实现选择性单一化。作为非限制性示例，经由例如化学、酶促和/或光可激活切割，一个或多个特异性靶核酸可以之前已经被释放或者可以同时(相同时间)由固体支持物释放到按份量的核酸(例如，液体溶液的微体积)中，并且固体支持物(例如，微阵列、芯片或微孔板)可以置于另一个固体支持物附近，以使所述份量的核酸形成流体腔室，其将一个固体支持物上的一个特征部(可寻址点)与第二个固体支持物(例如，微阵列、芯片或微孔板)上的特征部连接。无论有无其它机械力(例如，诸如压电或声学元件所提供的)，这样的接触可以足以转移或以其它方式运输所述份量的核酸。在一些实施方式中，激光可以用于通过切割光可激活接头来选择性释放一个或多个寡核苷酸。
在另一实施方式中，核酸可以固定于微颗粒或珠。具有相同核酸的一个或多个珠可以置于单一孔或多孔板中。在一些实施方式中，各孔是具有对应压电或声学元件(或设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移实现一份量或多份量的核酸的转移的其它组件)的可寻址特征部，所述对应压电或声学组件在制动时可以弹射位于孔内的珠。在该实施方式中，可以在干燥环境中提供珠。在一些实施方式中，各孔是不具这样的对应组件的可寻址特征部，所述对应组件设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移(例如，压电或声学元件)实现一份量或多份量的核酸的转移。在这类实施方式中，多孔板可以置于另一(第二)多孔板或其它固体支持物(例如，芯片或微阵列)附近，从而使所述份量的核酸(例如，处于液体形式)形成流体腔室，所述流体腔体连接其上的一个特征部(可寻址点或微孔)与第二固体支持物(例如，微阵列、芯片或微孔板)上的特征部。无论有无其它机械力(例如，诸如压电或声学元件或者可以使用机械位移实现转移的任何其它元件所提供的)，这样的接触可以足以转移或以其它方式运输所述份量的核酸。还可以向孔添加液体以促进各种反应，诸如限制性消化、链延伸和连接。
图3显示了本文所述方法和/或组合物的示例性实施方式。提供了包括多个可寻址特征部200、210、220…等的锚固芯片100，所述可寻址特征部各自包括或连接了多个组装的核酸基因1(300)、基因2(310)、基因3(320)、基因X(340)、…等。可以进行一个或多个靶核酸诸如基因X(340)的选择性挑选或单一化。基因X的位置可以基于各特征部的地址确定。可以沉积溶液400的微体积，其可以包含所需试剂以实现靶核酸340的化学、酶促或光可激活切割。一旦切割并释放到溶液400中后，然后可以通过压电元件500选择性排放、转移或以其它方式运输靶核酸340。在一些实施方式中，可以用声学元件或设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移实现转移的其它合适的组件替换压电元件500。在某些实施方式中，对于转移靶核酸，不需要设置成与一个或多个特征部相互作用并通过机械位移实现转移的其它合适的组件(即，不存在元件500)。
应当指出的是，选择性挑选或单一化可以在完整组装后进行，和/或在组装期间，其中可以挑选一个或多个亚构建体进行进一步操纵，如扩增，测序和/或进一步组装。此外，还可以在组装之前选择性挑选(例如，选择或选取)构建寡核苷酸用于扩增，测序和/或组装。
基于液滴的组装
在一些实施方式中，本文所公开的选择性挑选或单一化可以用于操纵液滴，例如，由一个特征部转移一个或多个液滴至另一处，和/或由一个固体支持物至另一处。液滴形成和其应用公开于，例如，国籍公开号WO2010/025310、WO2011/056872、WO2011/066186；和美国专利号8,716,467和9,295,965，其各自全部内容通过用引用纳入本文。
图4和5显示了固体支持物诸如芯片上基于液滴的组装的实施方式。示例性靶核酸的解析的互补链的片段在图4部分A中描述为构建片段a-h。取决于靶核酸(例如，取决于靶核酸的长度和/或复杂性)，可以设计更多或较少构建片段。片段a的多个拷贝固定于芯片A上的一个或多个特征部，如a1、a2和a3，而片段b的多个拷贝固定于芯片B上的一个或多个特征部，如b1、b2和b3。芯片B上的各特征部可以如图4部分B所示被溶液滴覆盖。根据本发明的一个实施方式，片段b被切割、解偶联或以其它方式变成不与芯片B上的一个或多个特征部的表面结合，并且释放到液滴中。将芯片A与B对齐，从而使特征部a1-a3与特征部b1-b3相对。使芯片A和B彼此靠近，从而使覆盖特征部b1-b3的液滴由芯片B转移至覆盖芯片B上的特征部a1-a3，运输片段b的未结合的拷贝至特征部a1-a3。根据一个实施方式中，液滴的转移可以通过各种方式完成，包括但不限于，通过本文所公开的压电组件致动的振动或弹射，音波或超声振动或其它动力学措施。用于实现液滴转移的其它方法可以包括使用电湿润技术或其它电子措施。或者，调节或控制芯片A和/或芯片B上特征部或周围表面的亲水性和/或疏水性，或者特征部的大小或形状可用于实现将液滴从芯片B转移到A。
在图4部分C中，芯片A和B是分离的，转移的液滴现在覆盖芯片A上的特征部a1-a3。特征部经受适合使片段b与固定的片段a杂交的条件。在某些实施方式中，已经解析了片段，从而例如在杂交后，使片段a/b双链体在未结合的末端包含单链突出端。可以用与含有片段c多个拷贝的特征部对齐的特征部a1-a3重复该过程，然后用含有片段d多个拷贝的特征部重复该过程，以此类推，以使靶核酸以串联方式组装。或者，通过将片段a和b聚集在一个特征部并将片段c和d聚集在一个特征部，以此类推(分别形成片段a/b和片段c/d)，然后将片段a/b双链体与片段c/d双链体聚集在一起，可以分级的方式组装靶核酸。然后将组装的片段ac/bd双链体与相似组装的片段eg/fh双链体聚集在一起。可以反复地重复这类组装直到合成靶标(即，靶寡核苷酸)。
在图5部分A中，靶核酸的解析的互补链的片段以片段a-f示出。芯片A上，片段c和c的多个拷贝分别固定于特征部c和f。芯片B上，片段a、b、d和e的多个拷贝分别固定于特征部a、b、d和e。芯片B上的各特征部如图5部分B所示被溶液滴覆盖。根据本发明的一个实施方式，片段a、b、d和e被切割、解偶联或以其它方式变成不与芯片B上各特征部的表面结合，并且释放到位于各自相应特征部的液滴中。在芯片B上，特征部a和b的液滴合并成单个液滴，位置d和e的液滴也是如此。合并的液滴经历这样的条件，所述条件适合在一个合并的液滴中杂交片段a和b，并且在另一合并的液滴中杂交片段d和e，分别形成片段a/b和片段d/e。在某些实施方式中，已经解析了片段，从而在杂交后，例如，使片段a/b双链体在未结合的末端包含单链突出端，并且该单链突出端与部分片段c互补。如图5部分C所示，然后将芯片A和B对齐，从而使特征部a/b与特征部c相对，而特征部d/e与特征部f相对。将芯片A和B彼此靠近，从而使覆盖特征部a/b的合并的液滴由芯片B转移至覆盖芯片A上的特征部c，运输片段a/b双链体未结合的拷贝至特征部c；覆盖特征部d/e的合并的液滴由芯片B转移至覆盖芯片A上的特征部f，运输片段d/e双链体危机和的拷贝至特征部f。液滴再次经历适合杂交的条件，从而使片段a/b双链体的单链突出端与片段c杂交，而片段d/e双链体的单链突出端与片段f杂交。根据一个实施方式中，液滴的转移可以通过各种方式完成，包括但不限于，通压电材料致动的振动，音波或超声振动或其它动力学措施。用于影响液滴转移的其它方法可以包括使用电湿润技术或其它电子措施。或者，调节或控制芯片A和/或芯片B上特征部或周围表面的亲水性和/或疏水性，或者特征部的大小或形状可用于实现将液滴从芯片B转移到A。在图5部分D中，芯片A和B是分离的，转移的液滴现在覆盖芯片A上的特征部c和f。可以重复该过程以连续和/或分级的方式组装靶核酸。
本公开的各个方面可以单独使用、组合使用、或者以前面描述的实施例中未具体讨论的各种配置使用，因此在其应用上不限于在前面的描述中阐述的或者在附图中示出的部件的细节和布置。例如，一个实施方式中描述的方面可以以任何方式与其它实施方式中描述的方面组合。而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。
在权利要求中使用诸如“第一”，“第二”，“第三”等来修饰权利要求的顺序术语本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一要素的任何优先级、优先顺序或顺序、或者执行方法的行为的时间顺序，而是仅被用作标记，以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一要素(但使用了序数词则)来区分权利要求要素。
通过引用纳入
本文提到的所有发表物、专利和序列数据库条目在此通过引用全文纳入，就好像各个单独发表物或专利特定和单独地表明通过引用纳入。针对国际专利申请公开号WO2010/025310，WO2011/056872，WO2011/066186；和美国专利号8,716,467和9,295,965的参考文献通过引用将其全部内容各自纳入本文。
