全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建
技术领域
本发明涉及生物信息学技术领域，具体涉及一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库及构建。
背景技术
DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起着至关重要的作用。
甲基化测序的一个金标准是全基因组重亚硫酸盐测序(Whole genome bisulfitesequencing，WGBS),简称BS-seq。其检测原理是用重亚硫酸氢盐处理，将基因组中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后进行的PCR扩增过程中，采用U碱基耐受的聚合酶，将U碱基识别为胸腺嘧啶(T)，实现C->T的转化，与原本具有甲基化修饰的C碱基分开来，从而达到将未修饰C碱基和甲基化修饰C碱基分开的目的。WGBS可以将～95％未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，可覆盖70～99％的胞嘧啶，实现单碱基分辨率的甲基化测序。
根据重亚硫酸氢盐转化(BS)在传统建库中加入的步骤，可分为BS前建库和BS后建库法。由于目前的PCR过程，不能完整保留甲基胞嘧啶(mC)的信息，转化前的文库不能进行扩增，因此，第一种先建库后BS方法，是对接头连接的dsDNA进行BS转化，如中国专利文献CN104532360B中公开的全基因组甲基化测序文库及其构建方法。在上述的先建库后BS方法中，BS转化过程中会造成大量的模板降解(0.1～99.9％)，接头连接-dsDNA起始量越低，模板降解地越多，并且BS前建库策略需要采用甲基化的接头连接dsDNA，以避免接头在BS转化过程中发生转化，造成建库失败。故而，第一种先建库后BS的方法要求起始量>200ng，且构建的文库中AT占比>80％，碱基不平衡；
第二种BS后建库方法，先进行重亚硫酸氢盐转化会产生大量的片段化的单链DNA，需要将单链DNA合成为dsDNA，常见的有两种：直接单链连接和随机引物扩增。多数采用的策略是随机引物扩增单链DNA。随机引物扩增法，则需要4N,6N,8N,9N长度的随机引物，以单链为模板，合成双链DNA。随机引物法的测序reads，在3’末端的结合具有一定的偏好性，表现在3’-末端的SNPs较多，比对率较低(～50％)，因此会损失大量的测序数据。一些研究者发现，采用特殊的单链连接酶，加一段tail和测序接头直接连接，对单链模板的利用率更高，更适合低起始量物质的建库。单链连接策略可实现对低起始量物质的甲基化检测，然而建立的文库依然存在AT占比>80％，碱基不平衡的缺陷，而且它将Illumina的P5和P7截断序列连接在单链上，很难实现其他平台的测序兼容性。
由上述可见，基于亚硫酸氢盐转化的建库方法构建的文库AT占比>80％，碱基不平衡缺陷，上机检测需要混和其他全基因组文库进行测序，操作不便，同时构建的文库测序数据使用率较低，有效数据仅占测序量的20～30％。
发明内容
因此，本发明要解决的第一个技术问题在于现有技术中的基于重亚硫酸氢盐转化构建的甲基化测序文库存在碱基不平衡，测序数据使用率低的缺陷，进而提供一种DNA甲基化转化试剂盒，可以进行“C”到“T”的转化，各成分的使用量低，成本低，且转化率高，可满足测序的要求，避免使用重亚硫酸氢盐转化，使得构建的全基因组甲基化测序文库碱基平衡，测序数据使用率高。
本发明要解决的第二个技术问题在于现有技术中的基于重亚硫酸氢盐转化构建的甲基化测序文库存在碱基不平衡，测序数据使用率低的缺陷，进而提供一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库及构建，上述构建的全基因组甲基化测序文库碱基平衡，测序数据使用率高。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种DNA甲基化转化试剂盒，包括TET酶反应液，所述TET酶反应液包括如下独立包装的组分：TET酶氧化缓冲液；所述TET酶氧化缓冲液包括如下微摩尔份的组分：HEPES或Tris–Cl(20-167)×103份，NaCl(100-333)×103份，α-KG或2-oxoglutarate 3.3×103份，抗坏血酸6.67×103份，和三磷酸腺苷4×103份；所述TET酶氧化缓冲液pH＝8.0。
优选的，所述TET酶氧化缓冲液包括如下的组分：HEPES或Tris–Cl(20-167)mM，NaCl(100-333)mM，α-KG或2-oxoglutarate 3.3mM，抗坏血酸6.67mM，和三磷酸腺苷4mM；所述TET酶氧化缓冲液pH＝8.0。
进一步的，所述TET酶反应液还包括独立包装的Fe(NH4)2(SO4)2溶液，所述Fe(NH4)2(SO4)2溶液中Fe(NH4)2(SO4)2的浓度为0.75-1.5mM。
进一步的，所述TET酶反应液还包括独立包装的TET酶液，所述TET酶的浓度为8-10.5μM。
进一步的，所述TET酶包括TET1酶或TET2酶。
在所述的试剂盒中，还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂。
优选的，所述吡啶硼烷还原剂包括独立包装的如下微摩尔份的组分：吡啶硼烷溶液，吡啶硼烷浓度为10M；和醋酸钠溶液，醋酸钠浓度为3M，pH＝4.3。
本发明提供了所述的试剂盒在全基因组甲基化测序、DNA甲基化测序或靶向区域DNA甲基化测序中的用途。
本发明提供了一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库构建方法，包括使用所述的试剂盒进行“C”到“T”的转化。
在所述的方法中，在TET酶反应液氧化步骤中，将待“C”到“T”转化的文库与所述TET酶反应液混合得到TET酶氧化反应体系，以50μL为计：
DNA文库，30～100ng；
Fe(NH4)2(SO4)2，终浓度95-105μM；
1×TET酶氧化缓冲液，10-20μL；
Tet酶，终浓度0.048-0.06μM；
无酶水补足至50μL。
在所述的方法中，在TET酶反应液氧化步骤中，反应条件为：于37℃，反应1-3h，随后加入蛋白酶K，于37-50℃孵育0.5h-1h。
在所述的方法中，将使用TET酶反应液氧化后的产物进行吡啶硼烷还原步骤中，将所述产物与吡啶硼烷还原剂混合，于37℃，850rpm下孵育16h-32h。
在所述的方法中，经“C”到“T”转化后的文库进行PCR扩增，所使用的PCR扩增酶包括KAPA HIFI Urail+聚合酶、NEB Q5Urail酶、Pfu Turbo Cx Hotstart聚合酶或Taq酶。
优选的，经“C”到“T”转化后的文库进行PCR扩增的反应程序为：98℃起始变性45sec；98℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，8个循环；72℃延伸1min；4℃，∞。
在所述的方法中，将扩增后的文库进行二代测序，测序平台包括但不限于Illumina平台、MGI或者Gene+Seq平台；优选的，所述测序平台为Gene+Seq平台。
在所述的方法中，待“C”到“T”转化的文库构建方法包括：
片段化DNA；
片段化DNA末端修复加A；
加A产物加接头得到加接头的dsDNA。
本发明提供了一种所述的方法构建的全基因组甲基化测序文库。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种DNA甲基化转化试剂盒，包括TET酶反应液，所述TET酶反应液包括独立包装的组分：TET酶氧化缓冲液；所述TET酶氧化缓冲液包括如下微摩尔份的组分：HEPES或Tris–Cl(20-167)×103份，NaCl(100-333)×103份，α-KG或2-oxoglutarate 3.3×103份，抗坏血酸6.67×103份，和三磷酸腺苷4×103份；采用上述试剂盒结合Fe(NH4)2(SO4)2以及TET酶可以进行DNA甲基化转化，将5mc(5位甲基胞嘧啶)氧化为5cac(5位羧基胞嘧啶)，上述氧化获得的5cac可以在还原剂作用下被还原为二氢尿嘧啶(DHU)，经过PCR测序识别为T，实现在非重亚硫酸氢盐条件下的DNA甲基化“C”到“T”转化，解决了现有技术中基于重亚硫酸氢盐转化构建的甲基化测序文库所存在的碱基不平衡，测序数据使用率低的缺陷，同时本发明的TET酶反应液在保证较高的转化率，进而保证构建的甲基化测序文库碱基平衡以及基因组比对率、覆盖深度满意的基础上，该配方还具有组分精简，利用所述TET酶氧化缓冲液进行氧化时，TET酶使用量极低，在配制TET酶氧化反应体系时，TET酶可以低至0.048-0.06μM，显著降低成本的效果。
2.本发明提供的一种DNA甲基化转化试剂盒，还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂；所述吡啶硼烷还原剂包括独立包装的如下组分：吡啶硼烷溶液，吡啶硼烷浓度为10M；和醋酸钠溶液，醋酸钠浓度为3M，pH＝4.3；上述还原剂可以将本发明的TET酶反应液氧化获得的5cac还原为二氢尿嘧啶(DHU)，经过PCR测序识别为T，实现在非重亚硫酸氢盐条件下的DNA甲基化“C”到“T”转化。
3.本发明提供的一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库构建方法，将待“C”到“T”转化的文库与所述TET酶反应液混合得到TET酶氧化反应体系，以50μL为计：DNA文库，30～100ng；Fe(NH4)2(SO4)2，终浓度95-105μM；1×TET酶氧化缓冲液，10-20μL；Tet酶，终浓度0.048-0.06μM；无酶水补足至50μL；上述TET酶氧化反应体系可以将5mc(5位甲基胞嘧啶)氧化为5cac(5位羧基胞嘧啶)，实现DNA甲基化“C”到“T”转化的第一步，在保证了DNA甲基化“C”到“T”转化具有较高的转化率，满足构建的文库测序要求的同时，还具有组分精简，TET酶使用量极低，显著降低成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例4中琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明实施例4中构建的文库质控图谱；
图3是本发明实验例中实施例3构建的甲基化测序文库与重亚硫酸盐文库的单核苷和二核苷比例图。
具体实施方式
实施例1 DNA甲基化转化试剂盒
本实施例提供的DNA甲基化转化试剂盒，包括独立包装的TET酶氧化缓冲液；
TET酶氧化缓冲液(pH＝8)由如下表1的组分组成：
表1、TET酶氧化缓冲液组成
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的Fe(NH4)2(SO4)2溶液，所述Fe(NH4)2(SO4)2溶液中Fe(NH4)2(SO4)2的浓度为1.0mM。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的TET酶液，所述TET酶的浓度为8μM。所述TET酶为wisegene的TET1酶。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂；
吡啶硼烷还原剂由如下表2的独立包装的组分组成：
表2、吡啶硼烷还原剂组成
实施例2 DNA甲基化转化试剂盒
本实施例提供的DNA甲基化转化试剂盒，包括独立包装的TET酶氧化缓冲液；
TET酶氧化缓冲液(pH＝8)由如下表3的组分组成：
表3、TET酶氧化缓冲液组成
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的Fe(NH4)2(SO4)2溶液，所述Fe(NH4)2(SO4)2溶液中Fe(NH4)2(SO4)2的浓度为0.75mM。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的TET酶液，所述TET酶的浓度为10.5μM。所述TET酶为NEB EM conversion module。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂；
吡啶硼烷还原剂由如下表4的独立包装的组分组成：
表4、吡啶硼烷还原剂组成
实施例3 DNA甲基化转化试剂盒
本实施例提供的DNA甲基化转化试剂盒，包括独立包装的TET酶氧化缓冲液；
TET酶氧化缓冲液(pH＝8)由如下表5的组分组成：
表5、TET酶氧化缓冲液组成
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的Fe(NH4)2(SO4)2溶液，所述Fe(NH4)2(SO4)2溶液中Fe(NH4)2(SO4)2的浓度为1.5mM。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的TET酶液，所述TET酶的浓度为9μM。所述TET酶为NEB EM conversion module。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂；
吡啶硼烷还原剂由如下表6的独立包装的组分组成：
表6、吡啶硼烷还原剂组成
实施例4全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法
本实施例提供了一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA片段化
取100ng～1000ng基因组gDNA进行打断(物理打断或者酶打断)，基因组gDNA包括人基因组gDNA和外源性内参DNA(在本实施例中外源性阳性内参DNA为甲基化的pUC19(Zymoresearch)，阴性内参为未甲基化的lambda DNA)，打断后的gDNA采用1X磁珠进行纯化，无酶水洗脱，洗脱体积67μL；
(2)末端修复和加A
1)取步骤(1)中的片段化DNA进行末端修复和加A，末端修复和加A反应体系如下表7，修复反应条件如下表8；
表7、末端修复和加A反应体系
注：末端修复&加A-缓冲液*由KAPA Hyper Prep Kit提供；末端修复&加A-酶混合物*由KAPA Hyper Prep Kit提供；
表8、修复反应条件
注：热盖温度为85℃。若直接进行接头连接反应，可将维持温度设定为20℃。
(3)连接反应
1)连接
将步骤(2)中末端修复和加A的产物使用连接酶连接加接头，得到加接头的dsDNA，所述连接反应体系如下表9；
表9、连接反应体系
注：*酶和缓冲液应新鲜配置；连接缓冲液，DNA连接酶，接头储液均由KAPABiosystems提供。
孵育条件：于20℃孵育时间15-30min。
2)连接后纯化
将步骤1)中的接头连接产物进行纯化，纯化体系如下表10；
表10、纯化体系
纯化步骤如下：
1)震荡混匀，离心。
2)室温孵育5-10min，使DNA与磁珠结合。
3)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。
4)吸去上清。
5)加入200μL的体积浓度80％乙醇。
6)静置30s。
7)吸掉乙醇。
8)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。
9)加入24μL无酶水洗脱DNA。
(3)TET酶氧化反应
取步骤(2)中获得的接头连接的DNA文库与实施例3提供的试剂盒中的TET酶反应液于冰上配置TET酶氧化反应体系(pH＝8)，如下表11：
表11、TET酶氧化反应体系
所述TET酶氧化步骤如下：
1)反应条件：37℃，反应1h-3h。
2)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中，37-50℃孵育0.5h-1h。
3)产物加入1.8X磁珠。
4)震荡混匀，离心。
5)室温孵育5-10min，使DNA与磁珠结合。
6)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。
7)吸去上清。
8)加入200μL的体积浓度80％乙醇。
9)静置30s。
10)吸掉乙醇。
11)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。
12)17-36μL的无酶水洗脱。
(4)吡啶硼烷还原反应
1)还原反应体系配置
取步骤(3)中获得的氧化的DNA文库与实施例3提供的试剂盒中的吡啶硼烷还原剂配置还原反应体系，按照下表12配制：
表12、还原反应体系配制
2)反应条件：37℃，850rpm孵育16h-32h。
3)采用离心柱(本实施例中采用Zymo-IC spin column)纯化DNA。洗脱体积21μL。
(5)文库扩增
1)PCR扩增反应配置：
取步骤(4)中获得的还原的DNA文库进行扩增，配置PCR扩增反应体系如下表13：
表13、PCR扩增反应体系
注：*所用的index依据所用平台和使用的接头而确定。推荐体系中的引物最终浓度为0.5–2μM.
2)反应条件：上述的PCR扩增反应程序如下表14：
表14、PCR扩增反应程序
3)上述PCR反应的产物，用0.9X磁珠清洗两次，洗脱体积27μL。
(6)转化率验证
采用外源性内参DNA进行转化率验证：
1)外源性内参Taq酶扩增反应
将步骤(5)得到的纯化后PCR产物，取2ng，进行PCR扩增。设置对照组：unmethylated pUC19 DNA和H2O作为对照组。按照下表15配置PCR扩增反应体系：
表15、PCR扩增反应体系
注：5mC_pUC19_Forward primer、5mC_pUC19_Reverse primer，均由Zymoresearch。
2)PCR扩增条件见下表16:
表16、PCR扩增条件
3)取上述步骤2)中>100ng PCR扩增产物，进行TaqαI酶切反应，反应体系配置如下表17：
表17、酶切反应体系
反应条件：65℃孵育0.5～1h.
4)取步骤3)的10ul酶切产物和步骤2)的PCR产物，加入6X荧光黄，1％～3％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果显示，转化成功的酶切文库能且仅能看到一条带(216bp)，未转化成功的酶切文库，可见清晰的两条带(39bp和176bp)。未经酶切的PCR产物，仅可见一条带。图1为部分转化成功的胶图，根据图1中计算3个样品全基因组甲基化“C”到“T”的转化率分别为70.4％,71.5％和64.49％。
(7)构建的文库经LabChip(安捷伦)质控，质控合格图谱如图2。
实施例5全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法
本实施例与实施例4基本相同，区别在于“(3)TET酶氧化反应”中使用实施例1提供的试剂盒中的TET酶反应液配制TET酶氧化反应体系如下表18所示：
表18、TET酶氧化反应体系
实施例6全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法
本实施例与实施例4基本相同，区别在于“(3)TET酶氧化反应”中使用实施例2提供的试剂盒中的TET酶反应液配制TET酶氧化反应体系如下表19所示：
表19、TET酶氧化反应体系
实验例实施例4构建的甲基化测序文库与重亚硫酸盐文库的比较
一、全基因组甲基化重亚硫酸氢盐的测序文库(以下简称重亚硫酸盐文库或WGBS文库)的构建方法：采用中国专利文献CN104532360B中公开的全基因组甲基化测序文库及其构建方法构建，其中“C”到“T”的转化处理采用重亚硫酸氢盐转化。
二、不同建库方案中的单碱基和二核苷碱基的比例
将实施例4构建的甲基化测序文库与重亚硫酸盐文库的A、T、C、G碱基比例进行统计，单核苷和二核苷比例如图3所示。重亚硫酸盐甲基化检测方法是将未甲基化的C转化为T碱基，实施例4的方案则实现甲基化修饰(mC和hmC等)的碱基进行T转化。可以看出，C比例从WGBS文库的1.4％，提高到本发明方案技术的20％；C占比从0.86％提高到4.2％；实施例4的方案C和CG占比与全基因组文库的预期C和CG占比(4.4％vs21％)相当。因此，本发明实施例4的方案构建的甲基化测序文库碱基平衡，无需混样上机。
三、基因组比对率和覆盖深度提高
对重亚硫酸盐文库和实施例4的甲基化测序文库采用Geneseq+2000测序，对原始数据进行去接头、去低质量过滤后，实施例4的甲基化文库的质控结果与重亚硫酸盐测序数据相比较，可看出在相当的测序量下，本方案的比对率、深度、覆盖度均优于重亚硫酸盐测序数据，质控参数的结果见下表20。
表20、不同技术方案二代测序质控参数
由上表可知，本发明构建的文库，测序数据较重亚硫酸氢盐转化文库在基因组比对率和覆盖度有一定提升。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
