用于快速产生用于化合物筛选的类器官/球状体的微流体平台
技术领域
本公开涉及一种微流体(MF)平台，所述MF平台用于在接近于生理流动的条件下产生并生长大小一致的类器官和/或多细胞球状体(MCS)，并且将抗癌药递送到多细胞球状体以对药物功效进行通量筛选以便进行治疗处理。
发明背景
癌症仍然是世界范围内和加拿大人中的主要死亡原因：大约五分之二的加拿大人将在其一生中被诊断出患有癌症，其中一半的新病例为前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌(四分之一将死亡，而被诊断出患有癌症的60％将在诊断之后至少存活5年)。对于许多癌症患者，标准护理疗法涉及原发性肿瘤的手术切除。由于远侧部位处继发性肿瘤的生长，这种方法的成功往往意味着不成功。需要对增殖的转移细胞直接有毒性或将微转移锁定在其休眠状态的疗法。为了根除转移，在初次手术之后施用化疗，但是要评定和预测药物对在具有不同保护机能的环境中生长的尺寸范围为数十微米至数百微米的微肿瘤的有效性存在挑战。
阻碍癌症治疗(以及尤其是微转移)的发展的主要障碍之一是当前模型系统的限制。用于抗癌药筛选的常规模型包括以2D格式(在皮氏培养皿或孔板中)进行的体外研究和动物(单片)研究。动物模型价格高昂，既费力又费时。此外，除了人类疾病的相关问题之外，动物模型通常仅提供终点分析。通常，使用免疫失能的小鼠模型，但是可以确定的是，免疫系统对微转移微环境来说是至关重要的。那些确实使用同源模型(来源于与给定小鼠品系相同的遗传背景的肿瘤组织)的动物研究由于细胞因子和新陈代谢的差异也不能完全代表人体境况。
体外培养解决了一些动物研究的问题，但是大多数常规的体外药物筛选通过使用2D培养系统来进行。这些系统缺乏影响肿瘤行为的重要方面，诸如提供组织深度来进行肿瘤嵌合的3D结构，包括流体流动的功能方面和对氧含量的控制，并且不允许进行长时间的培养。还明显缺乏能够重现微转移，同时提供用于评估药物功效、毒性和新陈代谢的系统。
在2D环境中培养的细胞可能能够形成多细胞球状体(MCS)，但是这些球状体在其性质和表型上明显不同于在生理3D环境中生长的那些球状体，并且可能无法用作药物筛选的有效模型。复制微肿瘤的许多特征的恶性细胞的器官型多细胞球状体3D聚集体用作2D细胞培养物与动物模型之间的桥梁以克服上文所列的一些限制。
癌症球状体(即典型大小在数十微米至一毫米的范围内的致密癌细胞团)被广泛用作实体瘤的模型以用于细胞生物学的基础研究和临床应用，例如用于研究肿瘤对化学和放射疗法的响应。所述癌症球状体复制了肿瘤的许多特征，例如细胞间粘附、细胞-基质相互作用以及营养物和气体浓度的梯度。癌症球状体以若干种不同的方式，即通过组织的部分或完全解离，通过单独(分离)的癌细胞的生长和增殖，或通过致密团簇中的单独的癌细胞的聚集来制备。
然而，当前用于药物筛选的现有MCS模型具有以下限制中的至少一种：
(i)干扰药物筛选效率的宽泛的大小分布；
(ii)转移前微环境(微环境)对MCS治疗处理的作用知之甚少；
(iii)在未模拟自然连续流动条件的条件下进行药物递送；
(iv)低再现性；以及
(v)缺乏对药物功效的通量筛选。
在制备和使用多细胞球状体作为成瘤模型中的另一个重要的考虑因素是所述多细胞球状体的体外形成速率，为了达到数百微米的大小，这可能会从数天到数周变化。多细胞球状体在体外的快速生长是非常有利的。由于快速的形成和生长，通过从单独的细胞的致密悬浮液聚集所述单独的细胞而形成的多细胞球状体是特别有用的。不幸的是，使用这种方法产生的多细胞球状体通常是在不存在其细胞外基质(ECM)的情况下形成的，所述ECM是其自然微环境的主要组成部分之一，因为它为肿瘤生长提供了生物物理和生化线索。尽管通过细胞聚集产生的多细胞球状体中的癌细胞可以分泌ECM组分，但是这些ECM的组成是复杂的，由此很难理清每种ECM组分对癌细胞的生长和进展的影响。另一方面，已经在各种ECM，例如基质胶(Matrigel)、纤维蛋白或胶原蛋白中制备了通过单独的分离的癌细胞的生长形成的多细胞球状体，但是这个过程很慢并且它缺乏生理流动条件。
MCS产生和潜在应用中的另一个重要的考虑因素是其尺寸的一致性。用于通过细胞聚集产生多细胞球状体的现有方法(包括旋转培养、关于非粘附或悬滴方法的细胞聚集)产生具有宽泛的大小分布的多细胞球状体。例如，一群多细胞球状体可以具有从200到800μm变化的直径。多细胞球状体的高的多分散性给药物到球状体中心的扩散或缺氧对MCS命运的影响带来了不确定性。
发明内容
微流体技术(MF)提供了用于高效率地产生大小一致的多细胞球状体的平台。具体地说，MF系统是有利的，因为这些装置使得能够在流动状态下培养多细胞球状体并且在流动中将药物递送到多细胞球状体，这使得能够近似模拟肿瘤生长和进展以及化疗的自然动态条件。微流体技术还提供了多路复用能力，即探索各种不同因素及其对所含细胞，例如MCS大小和组成的影响，或在单个MF芯片上进行的单一系列的实验中以不同剂量递送的不同药物的效果。
因此，本公开涉及一种用于药物筛选的MF-MCS平台，所述平台可以在连续的接近于生理流动的条件下实现具有各种尺寸的大小一致的多细胞球状体的大阵列的生长，并且在动态条件下实现抗癌药到多细胞球状体的递送以对药物功效进行通量筛选以便进行治疗处理。
在本申请中公开的MF-MCS平台的优点包括但不限于：所述装置沿着每个排容纳大量多细胞球状体的能力(导致统计学上显著的结果)，大量平行的MCS排(使得能够筛选特定因素，例如药物剂量、不同药物的组合或MCS大小对药物功效的影响)，MCS生长需要少量恶性细胞和少量ECM(例如，原代细胞可以取自特定癌症患者)以及使在接近于生理流动的条件下进行的若干筛选过程并行化的能力。
这个特定的MF-MCS平台在抗癌药物筛选中，以及尤其是作为评估单独的患者的辅助化疗的输出中的预测工具具有巨大的潜力，从而在为特定患者选择治疗策略方面实现快速决策。相较于使用常规的药物筛选程序，使用这个平台，可以更高的准确度、在更短的时间内并以更少的资源实现对药物的筛选。
本公开提供了一种使用具有微孔阵列的微流体装置产生大小一致的多细胞球状体的方法。所述方法涉及若干个连续步骤。首先，用润湿剂填充包含与供应通道连接的平行排的微孔的微流体装置。所述润湿剂是不可混溶于水中的液体。例如，润湿剂可以是诸如油的有机液体。在下一个步骤中，用细胞悬浮液的包含用于水凝胶的前体的水性溶液替换供应通道和微孔中的所述试剂。接着，用所述试剂替换供应通道中的水相，这导致水凝胶前体溶液中形成细胞悬浮液的微滴的阵列，所述微滴被分到孔中。微滴之后被转换为充满细胞的水凝胶。随后，用连续流过微流体装置的细胞培养基替换供应通道中的试剂，并且水凝胶内的细胞被转换为多细胞球状体。
因此，本公开提供了一种在微流体装置中产生多细胞聚集体的方法，所述微流体装置包括：具有至少一个微孔的至少一个排；供应通道，针对每个排，所述供应通道沿着排的长度跨越并且每个微孔与供应通道流动连接，所述方法包括以下步骤：
将第一润湿剂引入到微流体装置的至少一个排的供应通道和对应的微孔中；将包含水性细胞悬浮液和水凝胶前体的溶液引入到微流体装置的至少一个排的供应通道和对应的至少一个微孔中以用所述溶液替换供应通道和至少一个微孔内的第一润湿剂；
将第二润湿剂引入到微流体装置的至少一个排的供应通道中以用第二润湿剂替换供应通道内的溶液，其中用第二润湿剂替换供应通道中的溶液在微流体装置的至少一个排的至少一个微孔内诱导了包含水性细胞悬浮液和水凝胶前体的微滴的形成；诱导微滴内的水凝胶前体的凝胶化以形成接种有细胞悬浮液的水凝胶；以及
将细胞培养基引入到微流体装置的至少一个排的供应通道中以替换供应通道中的第二润湿剂。
所述方法还可以包括以下步骤：使细胞培养基连续流动到微流体装置的至少一个排的供应通道中，其中细胞培养基促进细胞悬浮液的细胞生长和水凝胶内的多细胞聚集体的形成。
这个使细胞培养基流动到微流体装置的至少一个排的供应通道中的步骤促进在约1至约3天内形成多细胞聚集体。
第一润湿剂和第二润湿剂可以是相同的。
每种润湿剂可以是包含氟化油和表面活性剂的氟化油混合物。在此方面，表面活性剂可以是嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚。
水凝胶前体可以包含合成单体或聚合物、生物聚合物或其组合。
可以通过水凝胶前体的化学交联来获得水凝胶。
水凝胶前体可以是包含游离胺基的柔性聚合物前体与醛改性的纤维素纳米晶体或纤维的混合物。
水凝胶前体可以用生长因子和/或肽片段官能化。
可以通过水凝胶前体的物理交联来获得水凝胶。在此方面，水凝胶前体可以用生长因子和/或肽片段官能化。水凝胶前体可以是琼脂糖。
水凝胶的凝胶化可以在至少10分钟、约30分钟至1.5小时或约1至约1.5小时内发生。
多细胞聚集体可以是多细胞球状体，并且多细胞球状体可以是用癌细胞的水性悬浮液获得。
可选地，多细胞聚集体可以是类器官，并且水性细胞悬浮液可以是乳腺癌细胞或胰腺癌细胞的水性悬浮液。
多细胞聚集体可以具有至少40μm、约40μm至1000μm、约50至1000μm、约100μm至约1000μm或大于1000μm的直径。在此方面，多细胞聚集体可以具有范围为约50至300μm的直径。
至少一个微孔的高度大于至少一个微孔的直径。在此方面，至少一个微孔的高度比至少一个微孔的直径大约至少20％，或者比至少一个微孔的直径大约20％。
供应通道可以具有高度，并且其中至少一个微孔的高度大于供应通道的高度。在此方面，比率为至少约4.5或在约4.5至约5.5之间。
包含多细胞聚集体的水凝胶可以具有范围在约10Pa至数百kPa或50Pa至约100KPa或10Pa至约20KPa之间的刚度。在此方面，包含多细胞聚集体的水凝胶具有范围在约50Pa至约20Kpa之间的刚度。
水凝胶内的多细胞聚集体的形成可以包括大小一致的多细胞聚集体的大阵列，所述大小一致的多细胞聚集体具有范围为至少40μm、约40μm至1000μm、约50至1000μm、约100μm至约1000μm或大于1000μm的直径。
水凝胶前体可以是以下任一种水凝胶的水凝胶前体或水凝胶前体的组合：胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、海藻酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、透明质酸、纤维素衍生物、多肽以及这些聚合物与用生物聚合物或合成单体或聚合物官能化的纳米颗粒的混合物。
至少一个微孔可以是多个微孔。
本公开提供了一种在微流体装置中用多细胞聚集体进行化合物筛选的方法，所述微流体装置包括：具有多个微孔的至少一个排；供应通道，针对每个排，所述供应通道沿着排的长度跨越并且每个微孔与供应通道流动连接，所述方法包括以下步骤：
将第一润湿剂引入到微流体装置的至少一个排的供应通道和对应的微孔中；
将包含水性细胞悬浮液和水凝胶前体的溶液引入到微流体装置的至少一个排的供应通道和对应的微孔中以用所述溶液替换供应通道和微孔内的第一润湿剂；
将第二润湿剂引入到微流体装置的至少一个排的供应通道中以用第二润湿剂替换供应通道内的溶液，其中用第二润湿剂替换供应通道中的溶液在微流体装置的至少一个排的微孔内诱导了包含水性细胞悬浮液和水凝胶前体的微滴的形成；
诱导微滴内的水凝胶前体的凝胶化以形成接种有细胞悬浮液的水凝胶；
将细胞培养基引入到微流体装置的至少一个排的供应通道中以替换供应通道中的第二润湿剂；
使细胞培养基连续流动到微流体装置的至少一个排的供应通道中，其中细胞培养基促进细胞悬浮液的细胞生长和水凝胶内的多细胞聚集体的形成；
通过将包含化合物的溶液在一段时间内引入到供应通道中的至少一个中来使所选择的多细胞聚集体暴露于所述化合物；以及
评定暴露于所述化合物的多细胞聚集体的活力。
所述化合物可以是药物。
多细胞聚集体可以是多细胞癌症球状体并且所述化合物可以是抗癌药。
多细胞癌症球状体可以获自从癌症患者组织分离的原代细胞。
所述方法包括筛选多种化合物，并且可以筛选化合物的多个浓度。
可以将包含多细胞聚集体的水凝胶从微孔释放到供应通道中并且移动到对应的供应出口以从微流体装置提取水凝胶。
本公开提供了一种用于在水凝胶支架中产生多细胞聚集体的微流体装置，所述微流体装置包括：
具有至少一个微孔的至少一个排，所述至少一个微孔中的每一个具有直径和高度；
具有高度的供应通道，针对每个排，所述供应通道沿着排的长度跨越，并且在供应通道的一端处具有入口开口并且在供应通道的相对端处具有出口开口，
其中每个微孔与对应的供应通道流动连接。
至少一个微孔可以是多个微孔。
每个微孔的高度可以大约大于每个微孔的直径。在此方面，每个微孔的高度可以比每个微孔的直径大约至少20％。每个微孔的高度可以大于供应通道的高度，并且每个微孔的高度与供应通道的高度的比率为至少约4.5。
微孔的高度与供应通道的高度的比率可以是在约4.5至约5.5之间。
至少一个微孔和对应的供应通道可以由PDMS制成。
溶液可以包含水性细胞悬浮液，所述水性细胞悬浮液包括多种不同类型的细胞。
溶液可以包含水性细胞悬浮液，所述水性细胞悬浮液包括多种不同类型的细胞。
水凝胶前体可以包含温度响应性聚合物。温度响应性聚合物可以包括用温度响应性聚合物分子使其表面官能化的CNC。CNC可以在其表面上接枝有聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物链。
CNC可以用N-异丙基丙烯酰胺和N,N′-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯的共聚物官能化。
本公开提供了一种用于在水凝胶支架中产生多细胞聚集体的微流体装置，所述微流体装置包括：
具有多个微孔的至少一排，每个微孔具有直径和高度；
具有高度的供应通道，针对每个排，所述供应通道沿着排的长度跨越，并且在供应通道的一端处具有入口开口并且在供应通道的相对端处具有出口开口；并且
其中每个微孔与对应的供应通道流动连接，并且微孔的高度比微孔的直径大约至少20％，并且微孔的高度与供应通道的高度的比率为至少约4.5。
通过参考以下具体实施方式和附图，可以实现对本公开的功能和有利方面的进一步理解。
附图说明
现将参考附图仅通过举例描述实施方案，在附图中：
图1A是根据一个实施方案的微流体装置的片段的示意图，其示出了五(5)排孔和将孔互连到试剂供应以产生MCS的2D阵列的通道。
图1B是图1A的微流体装置的展开图，其示出了与对应的通道流体连通地连接的其中一排中的若干个孔。
图1C是根据一个实施方案的微流体装置的展开图，其示出了与对应的通道流体连通地连接的其中一排中的若干个孔以及其相应的尺寸。
图2A是根据一个实施方案的使用高密度细胞悬浮液以MF方式产生ECM-MCS的示意性侧视图，其从上图到下图示出了在产生MCS的过程中的不同阶段。
图2B是编有索引的ECM-MCS的2D阵列的示意性侧视图。
图2C是根据一个实施方案的使用低密度细胞悬浮液以MF方式产生ECM-MCS的示意性侧视图，其从上图到下图示出了在产生MCS的过程中的不同阶段。
图3示出了根据一个实施方案的微流体装置的多个层的组装的分解透视图。
图4示出了形成a-CNC/明胶水凝胶的示意图。
图4A示出了对不含细胞的琼脂糖水凝胶球状体的过度溶胀的优化的明场图像。
图4B示出了使用聚合物浓度为1重量％的水凝胶前体实现的不含细胞的水凝胶球状体的荧光图像的非限制性实例。
图5示出了在改变a-CNC浓度的情况下的a-CNC/明胶水凝胶的杨氏模量的变化。
图6示出了在改变明胶浓度的情况下的a-CNC/明胶水凝胶的杨氏模量的变化。
图7示出了在改变a-CNC与明胶的浓度比(R)的情况下的用于细胞培养的水凝胶的Darcy渗透率的变化。水凝胶的总浓度(Ca-CNC+C明胶)是2.5重量％。
图8示出了来自a-CNC浓度为1重量％且明胶浓度为2重量％的水凝胶中的MCF-7细胞的在A)第1天，B)第8天和C)第21天之后的活力和MCF生长(比例尺：100μm)。
图9示出了MCF 7细胞在具有不同a-CNC浓度和2重量％的明胶浓度的a-CNC/明胶水凝胶中在21天的细胞培养内的细胞活力。
图10示出了MCF 7细胞在具有变化的a-CNC和2重量％的明胶浓度的水凝胶中在21天时段内实现的MCF生长的变化。
图11示出了MCF 7细胞在具有变化的明胶浓度和1重量％的a-CNC浓度的水凝胶中在21天时段内实现的MCF生长的变化。
图12示出了在21天培养之后从MCF-7乳腺癌细胞生长的形成于a-CNC/明胶浓度分别为0.5重量％和2重量％的a-CNC/明胶中的乳腺癌MCS的免疫荧光染色。A)通过DAPI(蓝色)对MCS进行的免疫染色；B)通过Alexa Fluor 488兔E-Cadherin单克隆抗体(绿色)对MCS进行的免疫染色；C)通过Alexa Fluor 568Phalloidin(红色)对MCS进行的免疫染色；以及D)由A)、B)和C)所示的MCS的图像(比例尺为50μm)。
图13示出了患者来源的胰腺癌细胞第1天在a-CNC和明胶浓度分别为0.5重量％和2重量％的水凝胶中的活力。通过钙黄绿素AM(绿色)和乙锭均二聚物-1(红色)对细胞进行染色。绿色和缺少红色表示水凝胶中的高细胞活力(比例尺为20μm)。
图14示出了原代胰腺类器官在具有不同组成的a-CNC/明胶水凝胶中的培养。
图15示出了在A)第1天，B)第9天和C)第14天的来自乳腺肿瘤活检的多细胞癌症球状体的生长(图像取自芯片上的水凝胶中的相同位置。a-CNC和明胶浓度分别为0.5重量％和2重量％)以及D-F)在第8天之后在a-CNC/明胶水凝胶中从乳腺癌患者来源的细胞生长的MCS的不同视图(a-CNC和明胶的浓度分别为0.5重量％和2重量％)(比例尺为50μm)。
图16示出了充满MCF 7的a-CNC/明胶微凝胶(水凝胶组成：0.75重量％的a-CNC、2重量％的明胶)的微流体制备。
图17示出了MCF 7乳腺癌细胞第1天在微流体装置上在a-CNC和明胶浓度分别为0.5重量％和2重量％的水凝胶中的活力(具有充满细胞的水凝胶的微流体装置的片段的明场图像(左图)和荧光显微镜图像(右图))。通过钙黄绿素AM(绿色)和乙锭均二聚物-1(红色)对细胞进行染色。绿色和缺少红色表示微流体装置上的水凝胶中的高细胞活力(比例尺为200μm)。
图18示出了由琼脂糖微凝胶中所充满的高密度MCF-7细胞形成的球状体。(A)处于37℃的含高密度MCF-7细胞悬浮液(60％)的琼脂糖溶液的微滴。微滴悬浮在氟化油中。(B)在细胞培养1天之后的充满了MCF-7细胞(60％)的培养基的琼脂糖微凝胶。
图19示出了在第1天由MCF 7细胞在a-CNC/明胶水凝胶中形成的高密度球状体的明场图像。CaCNC＝0.75重量％，C明胶＝2重量％，流速＝0.02mL/h(比例尺为200μm)。
图20示出了在第1天由MCF 7细胞在a-CNC/明胶水凝胶中形成的高密度球状体的明场图像和荧光图像。BCaCNC＝0.75重量％，C明胶＝2重量％，流速＝0.02mL/h(比例尺为200μm)。
图21示出了在第1天由MCF 7细胞在a-CNC/明胶水凝胶中形成的低密度球状体的明场图像。CaCNC＝0.75重量％，C明胶＝2重量％，流速＝0.02mL/h(比例尺为200μm)。
图22示出了在第7天由MCF 7细胞在a-CNC/明胶水凝胶中形成的低密度球状体的明场图像。CaCNC＝0.75重量％，C明胶＝2重量％，流速＝0.02mL/h(比例尺为200μm)。
图23示出了由MCF 7细胞在微流体装置中的aCNC/明胶水凝胶中形成的低密度球状体的生长特征。CaCNC＝0.75重量％，C明胶＝2重量％，流速＝0.02mL/h。
图24示出了在R＝0.5(●)，R＝1.0(▲)和R＝2.0(■)下凝胶化时间对C总的依赖性。插图：在凝胶化之前(左图)和之后(右图)的a-CNC/明胶水凝胶的照片。
图25示出了在C总为2.5重量％和6.0重量％下变化的R对水凝胶的杨氏模量的影响。
图26示出了在C总为2.5重量％和6重量％下水凝胶渗透率随变化的R而变化。
图27示出了FITC-葡聚糖在具有多细胞球状体的a-CNC/明胶微凝胶内的渗透；(a)充满细胞的a-CNC/明胶水凝胶(0.75重量％的a-CNC和2重量％的明胶)的明场图像；(b)用1mg/mL的70kDa FITC-葡聚糖溶液以1mL/h的流速灌注通道30分钟之后的充满细胞的a-CNC/明胶水凝胶的荧光图像；(c，d)用不含染料的培养基以1mL/h的流速(像在b中那样)对充满细胞的水凝胶灌注(c)10秒和(d)100分钟之后的荧光图像。比例尺为200μm。细胞密度为1000个细胞/μL；以及(e)充满细胞的水凝胶的平均荧光强度随不含染料的培养基的洗涤时间而变化。
具体实施方式
将参考以下论述的细节描述本公开的各种实施方案和方面。以下描述和附图说明了本公开，并且不应被解释为限制本公开。描述了众多特定细节以提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，为了提供对本公开的实施方案的简要论述，并未描述熟知细节或常规细节。
如本文所使用，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应被解释为包括性和开放式的，而不是排他性的。确切地说，当在说明书和权利要求中使用时，术语“包含”和“包含”以及其变型意味着包括指定的特征、步骤或部件。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或部件的存在。
如本文所使用，术语“示例性”意指“用作实例、例子或例证”，并且不应被解释为比本文公开的其他配置优选或有利。
如本文所使用，术语“约”和“近似”意在覆盖可能存在于值范围的上限和下限中的变化，诸如性质、参数和尺寸的变化。在一个非限制性实例中，术语“约”和“近似”意指±10％或更少。
本公开涉及一种微流体(MF)装置以及将多细胞聚集体阵列形成到所述装置上的方法。多细胞癌症球状体(MCS)是尺寸为数十微米至约1mm的三维癌细胞聚集体，所述三维癌细胞聚集体复制了体内实体瘤的许多特征，包括细胞之间的细胞外基质(ECM)沉积、牢固的细胞-细胞连接和营养物浓度的梯度(Li,Y.和Kumacheva,E.,Science Advances(2018)4(4):eaas8998，名称为Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth anddrug screening)。出于本公开的目的，多细胞聚集体由自组织成三维排列的细胞的聚集体组成。另外，聚集体内的细胞可能已形成了特定的共用膜。多细胞聚集体可以是用干细胞或干细胞和其他细胞的组合获得的类器官。
可选地，多细胞聚集体可以是多细胞球状体。多细胞球状体可以由获自癌细胞系或获自从癌症患者组织分离的原代细胞的细胞构成。这类细胞可以获自从组织活检对单独的细胞进行的分隔和分离。取决于本文公开的当前方法或装置的用途，多细胞聚集体可以包含一个种类的细胞或多个不同种类的细胞，从而导致异质类器官或球状体。
根据一个实施方案，所述装置和方法可以用于筛选用于药物发现的化合物，用于理解所筛选的化合物的作用方式并且用于评估药效学和/或机制生物标志物。根据一个实施方案，所述装置和方法可能特别可用于筛选/研究环境的组成、结构和性质对MCS生长或不同细胞，例如免疫细胞与癌细胞之间的相互作用的影响，并且可用于筛选/研究细胞培养基的组成的作用。根据一个实施方案，所述装置和方法可能特别可用于通过在动态条件下将诸如抗癌药之类的药物递送到多细胞球状体或类器官而研究和/或筛选药物以进行治疗处理，当从高密度细胞悬浮液获得时，所述多细胞球状体或类器官两者都可以充当微肿瘤。
根据一个实施方案，所述装置和方法可能可用于在动态条件下在多细胞球状体或类器官上研究癌症扩散和/或筛选抗癌药物，当从低密度细胞悬浮液获得时，所述多细胞球状体或类器官两者都可以充当转移微肿瘤。
根据一个实施方案，本发明提供了研究不同阶段的癌性肿瘤，例如早期和晚期的癌性肿瘤的手段。从低密度细胞悬浮液获得的癌症球状体可以用于研究/模拟由单独的细胞形成的肿瘤生长。可选地，用高密度细胞悬浮液获得的癌症球状体可以用于研究/模拟在细胞将自身组织成癌性肿瘤之后的晚期的肿瘤生长。
根据一个实施方案，抗癌药可以靶向各种类型的癌症。例如，抗癌药可以靶向乳腺癌。可选地，抗癌药可以靶向胰腺癌。
本发明的一个优点是获自从癌症患者组织分离的原代细胞的多细胞球状体的使用使得有可能进行化合物的个性化筛选。根据一个实施方案，所述装置和方法可以在微流体装置中在连续的接近于生理流动的条件下提供各种大小的大小一致的多细胞聚集体的大阵列的形成。多细胞聚集体可能会生长成为大小一致的多细胞癌症球状体或类器官。根据一个实施方案，所述装置和方法可能可用于通过在动态条件下将化合物递送到多细胞聚集体来筛选这类化合物。
根据一个实施方案，本文公开的装置和方法可以提供诸如球状体或类器官的大小一致的多细胞聚集体的大阵列的形成，所述大小一致的多细胞聚集体可以从所述装置释放以从微流体装置提取球状体或类器官。这些球状体或类器官可以使用本领域技术人员已知的不同手段来释放(Li,Y.等人，Angew Chem Int Ed Engl(2017)56(22):6083-6087，名称为Supramolecular Nanofibrillar Thermoreversible Hydrogel for Growth andRelease of Cancer Spheroids；Li,Y.和Kumacheva,E.,Science Advances(2018)4(4):eaas8998，名称为Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drugscreening；以及Thérien-Aubin,H.,等人，Biomacromolecules(2016)17(10):3244-3251，名称为Temperature-Responsive Nanofibrillar Hydrogels for Cell Encapsulation)。可以通过由酶或化学品介导的水凝胶消化/裂解使用机械水凝胶破坏、水凝胶光降解来释放所述球状体或类器官。可选地，可以通过大幅度增大微流体装置中的流速来“冲走”球状体或类器官。根据另一个实施方案，可以通过在降低的生理上可接受的温度下诱导温度响应性水凝胶的液化来释放球状体或类器官。
根据一个实施方案，如图1A所示，微流体装置10具有多个平行排50。每个排50包括多个圆柱形微孔16，其中可以在微孔16中的接近于生理流动的条件下在模拟组织的水凝胶支架中生长多细胞聚集体的大阵列。针对每个排50，供应通道14沿着排50的长度跨越并且与相应的微孔16流动连通。供应通道14在其两端52处都具有暴露的开口，所述暴露的开口充当入口开口或出口开口以在给定排50内实现流体，诸如润湿剂、包含水性细胞悬浮液和水凝胶前体的溶液，以及细胞培养基的循环以便供应营养基质和/或待筛选的化合物。
图1B示出了来自图1A的其中一排50中的三个微孔16以及在微孔16与各种试剂源之间提供流动连通的供应通道14的区段的展开图。如图1B所示，微孔16具有直径12和高度18，并且供应通道14具有宽度13和高度20。
在一个实施方案中，微流体装置10的微孔16可以具有在约100至约1000μm之间的范围内的直径12和大约在约120至约1200μm之间的范围内的高度18。
根据一个实施方案，微孔的高度18大于微孔16的直径12。可选地，微孔16的高度18可以比直径12大至少20％以避免多细胞聚集体的过度生长和水凝胶到供应通道14中的溶胀。可选地，微孔的高度18可以比直径12大约20％。由于装置10的尺寸可以针对用户的偏好进行定制，因此只要维持每个微孔16的直径/高度比，微孔16的直径12就可以这类方式在微孔阵列上变化，使得所得的多细胞聚集体可以具有一定直径分布。获得具有多种直径的多细胞聚集体允许用户探索具有不同尺寸的多细胞聚集体的药物效能。
根据一个实施方案，为了实现充满细胞的前体微滴的形成并防止多细胞聚集体的过度生长和水凝胶在供应通道14中的溶胀，微孔16的高度18大于供应通道14的高度20。可选地，微孔16的高度18与供应通道14的高度20的比率是至少约4.5。所述比率取决于用于制造微流体装置的材料以及在本发明的方法和系统中使用的润湿剂。可选地，微孔16的高度18与供应通道14的高度20的比率是在约4.5至约5.5之间。当用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制得微流体装置并且所使用的润湿剂包含氟化油，诸如嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚时，发现这个比率是适宜的。然而，将了解，当使用不同的制造材料和润湿剂组合时，这个比率可以变化。在一个优选的实施方案中，微孔16的高度18比微孔16的直径12大约20％，并且微孔16的高度18与供应通道14的高度20的比率是在约4.5至约5.5之间。另外，可以通过调整水性溶液中的水凝胶前体的浓度来最小化过度溶胀。
维持尺寸18与20之间的这个比率使得在充满细胞的微滴的顶部与其中包含所述微滴的微孔16的顶部之间能够形成溢流体积。此溢流体积作用来通过为微孔16的z方向上发生的水凝胶溶胀和细胞的生长提供额外的体积而限制水凝胶过度溶胀或多细胞聚集体过度生长的风险。细胞溢出到供应通道14中是不期望的，因为它可能会导致多细胞球状体中由流驱动的细胞的损失。
微流体装置的制造
根据一个实施方案，如图3所示，微流体装置10可以包括四个不同的层。这些层包括第一层101，所述第一层包含具有安装的载玻片31的矩形有机硅基部32；以及第二层102，所述第二层是具有类似于第一层的厚度的基于有机硅的薄片35。第三层103同样由有机硅构成并且包含微孔16的阵列36，阵列36由一或多个排50构成，每个排50具有多个微孔16。各个排50中的微孔16中的每一个处于通向供应通道14的单独流动连接中，所述供应通道跨越排50的长度并且在供应通道14的两端处都包含暴露的开口。最终，第四层104具有基底38层，所述基底层也由硅构成并且附接到装置10的底侧。MF-MSF平台必须是坚固的，易于制造的并且具有相对低的单位成本。本领域技术人员将了解，可以使用除了基于有机硅的聚合物之外的聚合物材料。
根据一个实施方案，本文公开的四层装置可以使用本领域已知的软光刻技术用聚二甲基硅氧烷(PDMS)部分地制造。这种技术可以参见于http://www.elveflow.com/microfluidic-tutorials/soft-lithography-rev iews-and-tutorials/introduction-in-soft-lithography/introduction-about-sof t-lithography-and-polymer-molding-for-microfluidic/。软光刻涵盖了基于暴露的PDMS的图案化层的使用的一系列制造方法。在一个可能的实施方案中，可以通过使用软光刻沉积来形成如上所述的装置的四个硅层。
根据一个实施方案，装置10可以包括至少一个排或多个平行排，其中每个排具有至少一个孔。根据一个实施方案，装置10可以包括1至40个平行排50中的任意平行排，每个排50根据微孔16的大小可以包含1至300个孔，或可选地50至300个孔。
根据一个实施方案，装置10可以具有75x 50mm的总尺寸。当具有这类尺寸时，取决于微孔直径12，装置10可以具有2000-12000个微孔。第一层101和第二层102的尺寸为约75x50x 1mm。这两层在制造之后粘结在一起。将尺寸为75x 50x 0.5mm的第三层103粘结到第二层102，其中供应通道14和微孔16的特征面向第二层102。最终，将第四层104制造为包含填充有HBSS或其他生理盐水溶液的储存器以防止水从多细胞聚集体蒸发，然后粘结到第三层103。然后将装置10在烘箱中在115℃下加热12小时以激活所述层的疏水性。
在微流体装置层的微制造期间，当通过3D打印制备时，可以将硅原模粘附到PDMS模具，从而导致微孔形状和大小的畸变。由于微孔16的大小和形状两者对于多细胞聚集体的受控形成来说是至关重要的，因此所述制造方法可以包括解决这个问题的步骤。确切地说，在一个非限制性实例中，可以用三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气处理3D打印原模的表面。用于3D打印原模的处理基材可以是适合于实现足够的流体膜润滑的各种氟化/氯化的脂肪族硅烷。然后，在这个具体实施方案中，用H2SO4可控制地蚀刻原模的表面。为了对可能会导致微孔16的表面本身是粗糙的3D打印机的分辨率限制进行补偿，蚀刻是所需的。
在一个非限制性实施方案中，微流体装置层的制造方法和到装置10中的组装可以利用光刻法来制造微流体装置以用于MF-MCS平台、显微机械加工、蚀刻或激光消融。
在另一个实施方案中，微流体装置层的制造方法和到装置10的组装可以利用3D打印技术。3D打印的利用可以使微流体装置更具成本效益和多功能性。另外，通过3D打印技术制造微流体装置可以实现尺寸大于500μm的多细胞聚集体，诸如多细胞球状体的生长，并且实现不同大小的多细胞球状体在同一装置中的生长，从而对具有不同尺寸的微肿瘤实现药物筛选。
产生多细胞聚集体的方法
根据一个实施方案，提供了一种将多细胞聚集体阵列产生到微流体装置上的方法。如前所述，多细胞聚集体由自组织成三维排列的细胞的聚集体组成。多细胞聚集体可以是用干细胞或干细胞和其他细胞的组合获得的类器官。
可选地，多细胞聚集体可以是多细胞球状体。多细胞球状体可以由获自癌细胞系的细胞或获自从癌症患者组织分离的原代细胞的细胞构成。这类细胞可以获自从组织活检实现的分隔和分离。取决于本发明的用途，多细胞聚集体可以包含一个种类的细胞或多个不同种类的细胞，从而导致异质类器官或球状体。
根据一个实施方案，可以从高密度细胞悬浮液或低密度细胞悬浮液获得诸如多细胞球状体或类器官的多细胞聚集体。
根据一个实施方案，可以在微流体装置10的分开的排中的具有不同性质/特性的水凝胶中获得具有不同尺寸的诸如多细胞球状体或类器官的多细胞聚集体。
根据一个实施方案，可以在多步骤程序中形成多细胞聚集体，诸如类器官、多细胞球状体或球状体，所述多步骤程序包括：在微流体装置10的微孔16中从包含致密细胞悬浮液的水凝胶前体的溶液产生大小一致的微滴；以及进行水凝胶前体的化学或物理交联，从而将微滴转换为充满细胞的微米级水凝胶；以及MCS形成和生长。
根据一个实施方案，如图2A所示，一种使用本发明的微流体装置10从高密度细胞悬浮液快速产生大小一致的多细胞聚集体的方法。
所述方法可以包括以下步骤：
1)将第一润湿剂25a引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14和对应的微孔16中；
2)将包含高密度水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的溶液21引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14和对应的微孔16中以用溶液21替换供应通道14和微孔16内的第一润湿剂25a；
3)将第二润湿剂25b引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以用第二润湿剂25b替换供应通道14内的溶液21，其中用第二润湿剂25b替换供应通道14中的溶液21在微流体装置10的至少一个排50的微孔16内诱导了包含高密度水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的微滴24的形成。包含水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的微滴24的形成是由水性悬浮液与润湿剂25b接触时界面面积或表面能的降低所引起的；
4)诱导微滴24内的水凝胶前体22的凝胶化以在微孔16内形成接种有高密度细胞悬浮液23的水凝胶27；以及
5)将第一细胞培养基26引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以替换供应通道14中的第二润湿剂25b。
根据一个实施方案，包含高密度水性细胞悬浮液和水凝胶前体22的溶液21可以具有范围为1x107至10x107个细胞/mL的细胞浓度。例如，溶液21可以具有3x107个细胞/mL的细胞浓度以获得高密度球状体。
根据一个实施方案，如图2B所示，所述方法还可以包括以下步骤：在研究微孔16中的产物期间使第二细胞培养基26连续流动到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中，其中细胞培养基26促进细胞悬浮液23的细胞生长和水凝胶27内的多细胞聚集体28的形成。
根据一个实施方案，当细胞培养基26可以连续流动到微流体装置10的至少一个排50的支持通道14中时，可以维持连续的流动以促进在约1至约3天内形成诸如多细胞球状体或类器官的多细胞聚集体。
根据一个实施方案，第一细胞培养基和第二细胞培养基是相似的。可选地，它们可以是不同的。
根据另一个实施方案，可以使用如上所述的多步骤程序，但是使用如图2C所示的低密度细胞悬浮液来形成多细胞聚集体。
所述方法可以包括以下步骤：
1)将第一润湿剂25a引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14和对应的微孔16中；
2)将包含低密度水性细胞悬浮液23’和水凝胶前体22的溶液21引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14和对应的微孔16中以用溶液21替换供应通道14和微孔16内的第一润湿剂25a；
3)将第二润湿剂25b引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以用第二润湿剂25b替换供应通道14内的溶液21，其中用第二润湿剂25b替换供应通道14中的溶液21在微流体装置10的至少一个排50的微孔16内诱导了包含低密度水性细胞悬浮液23’和水凝胶前体22的微滴24的形成。包含水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的微滴24的形成是由水性悬浮液与润湿剂25b接触时界面面积或表面能的降低所引起的；
4)诱导微滴24内的水凝胶前体22的凝胶化以在微孔16内形成接种有低密度细胞悬浮液23’的水凝胶27；以及
5)将第一细胞培养基26引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以替换供应通道14中的第二润湿剂25b。
根据一个实施方案，包含低密度水性细胞悬浮液和水凝胶前体22的溶液21可以具有范围为100至1000个细胞/μl的细胞浓度。例如，溶液21可以具有1000个细胞/μL的细胞浓度以获得低密度球状体。
根据一个实施方案，可以通过使用包含具有多种不同类型的细胞的水性细胞悬浮液的溶液来获得诸如多细胞球状体和类器官的多细胞聚集体。
根据一个实施方案，诸如多细胞球状体或类器官的多细胞聚集体可以具有适合于给定应用或用途的多种直径范围。非限制性直径的范围可以是至少40μm，并且一些直径适合于在约40至约1000μm或约50至约1000μm或高于1000μm的范围内。可选地，多细胞聚集体可以具有范围为约50至300μm的直径。
根据一个实施方案，所述方法还可以包括以下步骤：将多细胞聚集体26从微孔16释放到供应通道14中并且将所述聚集体移动到对应的供应出口以从微流体装置10提取水凝胶27。可以使用本领域技术人员已知的不同手段来释放诸如球状体或类器官的多细胞聚集体26。可以通过由酶或化学品介导的水凝胶消化/裂解使用机械水凝胶破坏、水凝胶光降解来释放所述多细胞聚集体。可选地，可以通过大幅度增大微流体装置中的流速来“冲走”球状体或类器官。根据另一个实施方案，可以通过在降低的生理可接受的温度下诱导温度响应性水凝胶的液化来释放球状体或类器官。
根据一个实施方案，第一试剂25a和第二湿润剂25b可以是相同的。润湿剂25a和25b是不可混溶于水中的液体。例如，润湿剂25a和25b可以是诸如油的有机液体。
根据一个实施方案，润湿剂25a和25b包含氟化油。根据另一个实施方案，润湿剂25a和25b包含氟化油和表面活性剂。表面活性剂可以是但不限于：嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚。润湿剂的非限制性实例是与0.1重量％、0.5重量％或1重量％的嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚混合的氟化油。
由于水性溶液21在形成充满细胞的前体微滴24期间可以润湿微孔16和供应通道14的表面并且因此会干扰大小一致的微滴24的产生，在这种程度上，在水凝胶27内形成大小准确的多细胞球状体或类器官26的情况下，润湿剂25a被用于润湿微孔16和供应通道14的壁。当包含细胞23和水凝胶前体22的水性溶液21进入供应通道14和微孔16时，由水性溶液21组成的在微孔16中被油25包围的水相由于其减小的界面面积而呈现比在供应通道14中更为球形的形状。
润湿剂25b的作用是在孔16中形成在凝胶化之后会形成微凝胶的微滴，并且在溶液21由于微滴24捕获而包含于微孔16内时从供应通道14冲走溶液21。在将润湿剂25b引入到供应通道14中时，前体/细胞的混合物被灌注成微滴24并且被保留在微孔16中，因为微滴24会为了离开微孔16而不得不发生变形。
根据一个实施方案，将第一润湿剂25a引入到供应通道14和对应的微孔16中的第一步骤可以包括以下子步骤：首先用氟化油填充供应通道14和微孔16，然后用氟化油和表面活性剂的溶液，诸如氟化油和0.5重量％的嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚(PFPE-b-(PPG-PEG-PPG)-b-PFPE)的溶液替换所述氟化油。
充满了细胞的用于生长诸如多细胞球状体和类器官的大小一致的多细胞聚集体的水凝胶
为了实现用于各种筛选应用的足够的功能，可以在具有不同刚度和渗透率性质的各种环境中形成多细胞球状体或类器官。水凝胶支架的刚度和渗透率将模拟研究细胞通常存在于其中的环境的特性。因此，本领域技术人员将理解选择适当的水凝胶前体的需求和调节水凝胶前体的溶液的配方的需求以获得具有合适的特性，同时模拟从中获得形成多细胞球状体或类器官生长物的细胞的环境的水凝胶支架。
根据一个实施方案，可以通过使用合成单体或聚合物、生物聚合物或者聚合物和/或生物聚合物的组合的水凝胶前体来获得水凝胶支架。用于形成水凝胶的聚合物或生物聚合物的非限制性实例是胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、海藻酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、透明质酸、纤维素衍生物、多肽以及这些聚合物与用生物聚合物或合成聚合物官能化的纳米颗粒的混合物。
根据一个实施方案，水凝胶支架可以经由前体的化学交联、物理交联或化学交联和物理交联的组合来获得，只要在微流体装置内经受连续流动时，水凝胶支架保持完整即可。
根据一个实施方案，可以在不损坏微流体装置的情况下将微流体装置内的流动设定为高达20mL/h的流速。根据另一个实施方案，可以将在0.1至0.01mL/h之间的范围内的流速用于细胞培养和微滴产生。
技术人员将了解，可以使用任何水凝胶前体，只要1)前体和所得的水凝胶支架对细胞无毒且与所述细胞生物相容，2)获得所需的凝胶化时间、刚度、渗透率/扩散率、生物粘附性，并且3)在微流体装置内经受连续流动时，所得的水凝胶支架将是稳定的并承受住剪切力即可。技术人员还将理解，可以改变前体的量和交联度以获得具有所需特性，例如凝胶化时间、刚度、渗透率/扩散率的水凝胶支架，只要细胞可以在水凝胶支架中存活并且形成多细胞球状体或类器官即可。
根据一个实施方案，水凝胶前体可以用生长因子和/或肽片段官能化以促进细胞生长、存活和到球状体或类器官的转换。
根据一个实施方案，在使用本公开的产生多细胞聚集体的方法之前，技术人员可能已使用包含细胞悬浮液的宏观凝胶作为初次筛选来鉴别哪种水凝胶前体配方会带来具有合适的特性，诸如刚度和渗透率/扩散率的水凝胶。一旦已完成筛选并且已调节好水凝胶支架的性质，就可以使用微流体装置来制备多细胞聚集体。
根据一个实施方案，取决于所选择的前体，可以改变水凝胶支架的交联度和溶液中的前体的总量，以使得水凝胶支架的刚度能够从数十Pa调节到数十kPa以为细胞提供具有合适的刚度的环境。根据一个实施方案，水凝胶支架可以具有范围在约10Pa至数百kPa或约50Pa约100Kpa之间的刚度。根据另一个实施方案，水凝胶支架可以具有范围在约10Pa至约20kPa之间的刚度。技术人员将理解，水凝胶支架的机械性质应根据水凝胶支架所模拟的环境的机械性质进行定制。
例如，对于软组织和器官，刚度的范围可以为0.1kPa至1Mpa。针对脑组织的刚度的范围可以为0.1kPa至1kPa，针对皮肤、脾或胰腺组织的刚度的范围可以为1kPa至10kPA，针对腺体和肌肉组织的刚度的范围可以为8kPa至17kPa，针对肌腱组织的刚度的范围可以为30kPa至50kPa，针对软骨组织的刚度的范围可以为220kPa至550kPa，针对骨组织的刚度的范围可以为10MPA至15MPa，并且针对乳腺组织的刚度的范围可以为7kPA至30kPA(Liu,J.等人，Int.J.Mol.Sci.(2015)16:15997–16016，名称为Hydrogels for engineering ofperfusable vascular networks；Chen,H.等人，ACS Appl.Mater.Interfaces(2017)9:21059–21064(2017)，名称为Microfluidic Generation of High-Viscosity Droplets bySurface-Controlled Breakup of Segment Flow；Leipzig,N.D.和Shoichet,M.S.,Biomaterials(2009)30:6867-6878，名称为The Effect of Substrate Stiffness onAdult Neural Stem Cell Behavior；Levental,I.等人，Soft Matter(2007)3:299-306，名称为A.Soft Biological Materials and Their Impact on Cell Function；以及Lorenzen,J.等人，Rofo(2002)174(7):830-4，名称为MR elastography of the breast:preliminary clinical results)。技术人员将理解，这些范围可以根据公布来源以及还有方法用途来变化以对组织的刚度进行表征。
同样，取决于所选择的前体，在微流体装置10的微孔16中产生前体微滴并实现其凝胶化所需的凝胶化时间可以通过改变水凝胶支架的交联度和水凝胶前体的浓度来调节。取决于水凝胶前体的性质、水凝胶前体的浓度、水凝胶支架的交联类型和交联度以及所采用的凝胶化方法，凝胶化时间的范围可以是在约10分钟的量级至数小时之间。例如，凝胶化时间的范围可以为约30分钟至约1.5小时，并且更优选地为约1至约1.5小时，以实现充满细胞的微滴的产生并支持细胞活力。尽管更长的凝胶化时间是可能的，但是将了解，过长的凝胶化时间可能会因为细胞死亡而变得有问题和/或不合适。
根据一个实施方案，取决于所选择的前体，可以改变水凝胶支架的交联度和溶液中的前体的总量，以实现对水凝胶支架的渗透率的调节。适当的渗透率允许将营养物、化学品或药物从培养基输送到诸如球状体或类器官的多细胞聚集体。另外，适当的渗透率促进了细胞存活、细胞生长、到多细胞球状体或类器官的转换、多细胞球状体或类器官的存活以及所筛选的化合物到多细胞球状体或类器官的扩散。取决于所选择的前体、水凝胶支架的交联度和溶液中的前体的总量，水凝胶支架的渗透率可以为至少10-13cm2。例如，渗透率可以是在约10-13至约10-9cm2之间。
化学交联的水凝胶支架
根据一个实施方案，可以使用经由聚合物链之间的共价键合获得的任何化学交联的水凝胶支架，只要所述水凝胶支架具有合适的特性并且允许多细胞聚集体或球状体的形成和存活即可。交联形成可以通过添加小的交联剂分子，聚合物-聚合物缀合，光敏剂或通过由酶催化的反应来进行。
根据另一个实施方案，化学交联的水凝胶支架可以来源于包含游离胺基的柔性生物聚合物或聚合物和醛改性的纤维素纳米晶体(a-CNC)。由于CNC是平均长度和直径分别为100-300nm和5-20nm的组装成纳米原纤维网络的棒状的刚性纳米颗粒，因此所得的a-CNC来源的水凝胶支架可以具有类似于ECM蛋白的结构的支架结构。CNC可以通过在存在高碘酸盐的情况下在C2-C3键处实现氧化断裂来进行表面改性，这会在相应的碳原子处产生二醛基。存在于a-CNC上的醛与存在于柔性生物聚合物或聚合物上的游离胺基发生反应以形成亚胺交联，从而产生可以用于合成基于水凝胶的多细胞球状体的水凝胶支架。
根据另一个实施方案，化学交联的水凝胶支架是从如图4所示的存在于明胶上的游离胺基与存在于a-CNC上的醛基的交联获得。明胶是变性的胶原蛋白。所述明胶包含Arg-Gly-Asp(RGD)序列，所述RGD序列可用于结合到细胞表面上的整联蛋白受体，从而有利地使水凝胶支架具有生物粘附性。使用a-CNC/明胶水凝胶背后的基本原理是，a-CNC可以充当丝状构建块(负责纳米原纤维结构)，而明胶则可以充当生物粘附性软组分，从而产生模拟ECM环境的可以用于合成基于水凝胶的多细胞球状体的水凝胶。
使用a-CNC/明胶水凝胶的另一个优点是两种成分对于培养基中和水凝胶构建体中的各种细胞类型都是无毒的并且具有细胞相容性。
a-CNC/明胶水凝胶中的多细胞球状体
材料：
除非另外指明，否则A型明胶(300g bloom)、高碘酸钠、丙烯酸丁酯、9-乙烯基蒽、过硫酸钾、十二烷基硫酸钠和乙酸购自Sigma-Aldrich,Canada，并且不经进一步纯化就可使用。12.2重量％的水性CNC悬浮液购自University of Maine Process DevelopmentCenter，并且在使用之前对着Milli-Q等级的蒸馏去离子水(DI,18.2MΩcm电阻率)透析7天。
具有醛基的CNC的表面改性：
醛官能化的CNC根据由Prince等人描述的方案来制备(Prince,E.等人，Biomacromolecules(2018)19,1276-1284，名称为Patterning of StructurallyAmisotropic Composite Hydrogel Sheets，所述文献以引用的方式并入本文)。简而言之，用于产生a-CNC的CNC上的表面羟基的氧化是通过以4:1的高碘酸钠(NaIO4)/CNC重量比将NaIO4添加到1重量％的CNC悬浮液来执行。用乙酸将pH调整到3.5。用铝箔覆盖烧瓶以防止NaIO4的光分解。将悬浮液在25℃下搅拌2h，并且随后通过添加乙二醇来淬灭。将a-CNC悬浮液对着去离子水透析7天，每天替换两次，然后通过旋转蒸发来浓缩。
通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱法(ATR-FTIR)使用Bruker Vertex 70光谱仪利用1.85mm直径的金刚石单晶确认了CNC表面上醛基的存在。CNC表面的醛基含量通过以下方式来确定：首先经由分子内Cannizzaro反应在0.1M NaOH中将醛转化为羧酸基，并且随后用硫酸滴定来确定氢氧根离子的消耗量。
对明胶上的胺基的量化：
如由Prince等人所描述，使用TNBS(三硝基苯磺酸)测定来对明胶中的伯胺基的数量进行量化。简而言之，将明胶溶解在0.1M碳酸钠缓冲液(pH＝9)中直至0.5重量％的最终浓度。将三硝基苯磺酸(TNBS)添加到所述溶液直至0.1w/v％的最终浓度，并且将溶液在37℃下平衡4小时。在λ＝500nm处测量所述溶液的吸光度。通过针对包含0.1w/v％TNBS的0.1M碳酸钠缓冲液的β丙氨酸的标准溶液在λ＝500nm处测量所述溶液的吸光度来制作校准曲线。
a-CNC上的醛基与明胶中的胺基之间的摩尔比的表征：
明胶上的胺基与a-CNC上的醛基之间的摩尔比决定了互补的可交联基团的数量。如由Prince等人所描述，通过以下测定来确定摩尔比。a-CNC中的醛基的浓度通过以下方式来表征：首先使用分子内Cannizzaro反应在0.1M NaOH中将这些基团转化为羧酸基，并且随后用硫酸滴定来确定氢氧根离子的消耗量。醛含量被确定为是8050μmol/g CNC。明胶中的伯胺的浓度是通过TNBS测定来确定，并且被确定为是213μmol/g明胶。使用β-丙氨酸来制作校准曲线。
调节水凝胶前体配方以获得合适的特性：
为了实现对明胶/a-CNC水凝胶中的多细胞球状体的性质的准确控制，执行了利用宏观明胶/a-CNC水凝胶以及接种有乳腺癌细胞悬浮液(MCF-7)的宏观明胶/a-CNC水凝胶的一组实验作业。对于接种有b MCF-7细胞悬浮液的宏观明胶/a-CNC水凝胶，利用MCF-7细胞悬浮液的该组实验作业在a-CNC和明胶的前体溶液中具有3.4x 107个细胞/mL的细胞浓度。
使用宏观水凝胶并通过使用扫描电子显微镜(SEM)成像、流变测定法、溶胀测定法、机械表征、凝胶化时间表征、渗透率实验分析水凝胶来执行对水凝胶配方的表征和优化。
机械表征：
在循环压缩实验中使用以平行板几何结构操作的Mach-1机械测试仪(Biomomentum Inc.,QC)来确定水凝胶的杨氏模量。用于机械测试的水凝胶盘具有3.25mm的高度和14mm的直径。通过在z方向上以0.03mm/s的速率施加20％应变来压缩所述盘。通过拟合所得的应力-应变曲线的线性部分来确定水凝胶的杨氏模量。在测量之前，将所有水凝胶平衡24小时。
图5和图6示出了a-CNC明胶水凝胶的杨氏模量在变化的a-CNC浓度和2重量％的明胶浓度下的变化。随着a-CNC浓度的增加，水凝胶刚度也从0.3重量％的a-CNC下的1.8±0.7kPa增加到2.0重量％下的6.8±0.8kPa。
图25示出了在C总为2.5重量％和6.0重量％下变化的R对水凝胶的杨氏模量的影响。
水凝胶渗透率表征：
水凝胶渗透率通过使用如由Prince等人所描述的实验设置来表征。为了确定a-CNC/明胶水凝胶的Darcy渗透率，在由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制得的腔室中形成具有尺寸3mm×3mm×13.7mm(宽度×高度×长度)的水凝胶样品。使用全氟烷氧基烷管件(IDEXHealth&Science)来将腔室的端部连接到包含HBSS溶液的入口和出口储存器。通过相对于出口储存器的高度改变入口储存器的高度来将压差施加在水凝胶上。HBSS溶液受到压降的影响。通过测量出口储存器的质量在特定时间间隔内的变化来确定灌流通过水凝胶样品的HBSS溶液的体积流率(Qp)的值。Darcy渗透率被确定为：
其中A是水凝胶的横截面积(9mm2)，L是水凝胶长度(＝13.7mm)，ΔP是水凝胶上的压降，并且η是HBSS溶液的粘度(视作为1.002cP，水在室温下的粘度)。
在具有尺寸3mm x 3mm x 13.7mm(宽度x高度x长度)的腔室中制备水凝胶样品，所述腔室由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制成。将腔室的两个开口连接到各自包含10mL的HBSS的入口和出口储存器。使用全氟烷氧基烷管件(IDEX Health&Science)来将腔室的端部连接到包含HBSS的入口和出口储存器。通过相对于出口储存器的高度改变入口储存器的高度来将压差施加在水凝胶上。为确保施加到水凝胶的压降ΔP不会导致水凝胶结构的实质性变化，如对具有静态结构的多孔网络所预期，我们应确保对于水凝胶，在范围1500≤ΔP≤3490Pa内，ΔP与体积流率之间存在线性关系。
图7示出了用于细胞培养的水凝胶的Darcy渗透率的变化。水凝胶的总浓度(Ca-CNC+C明胶)是2.5重量％。渗透率随着a-CNC与
图26示出了在C总为2.5重量％和6重量％下水凝胶渗透率随变化的R而变化。
凝胶化时间的确定：
通过倒置测试确定宏观a-CNC/明胶水凝胶的凝胶化时间。在室温下每5分钟将包含500μL的a-CNC和明胶的混合悬浮液的1mL小瓶倒置。将凝胶化时间确定为是在倒置之后观察不到流动的时间。通过改变明胶与a-CNC浓度比以及另外通过改变a-CNC和明胶的总浓度来实现胶凝时间的变化。如图24所示，凝胶化时间根据明胶与a-CNC比以及a-CNC和明胶的总浓度来变化。图24显示在例示的配方下有可能将凝胶化时间调节为介于约10分钟至接近于70分钟之间。
根据一个实施方案，出于使用微流体装置在a-CNC/明胶水凝胶中制备多细胞球状体的目的，已发现，可以改变溶液中明胶的浓度以及a-CNC与明胶的浓度的比率，使得形成水凝胶所需的时间被调节为处在约10分钟至数小时之间的任意时间，但是优选地为约30分钟至约1.5小时之间，并且更优选地为约1至约1.5小时。尽管更长的凝胶化时间是可能的，但是将了解，过长的凝胶化时间可能会因为细胞死亡而变得有问题和/或不合适。
另外，当使用微流体装置将a-CNC/明胶水凝胶用于制备多细胞球状体时，通过改变a-CNC和明胶的总浓度以及a-CNC与明胶的质量比来控制凝胶化时间，以在粘度显著增加(花费约1小时)之前优化微滴的形成。
细胞培养：
在制备接种有人乳腺癌MCF-7细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在250mL聚苯乙烯组织培养瓶中培养细胞。向每个烧瓶添加具有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的10mL杜氏改良培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM-F12，GIBCO)，补充10％(v/v)胎牛血清(FBS，Invitrogen)和1％(v/v)青霉素/链霉素。在孵育器中存在恒定的5％CO2供应的情况下在37℃下孵育所述烧瓶。对于细胞传代，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25重量％，GIBCO)来使细胞从基底支撑物脱离。在脱离之后，添加5mL的新鲜培养基，并且将悬浮液在184×g和20℃下离心3分钟。去除上清液并且使团块重新悬浮在1mL新鲜培养基中。然后将300μL细胞悬浮液转移到新烧瓶中的新鲜培养基。每5天使细胞传代。
接种有人乳腺癌MCF-7细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶的制备：
在制备接种有人乳腺癌MCF-7细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在Hank平衡盐溶液(HBSS)中制备处于选定浓度的a-CNC悬浮液和处于选定浓度的明胶溶液，以便获得具有所需最终重量％浓度的a-CNC和明胶的a-CNC/明胶水凝胶。通过在紫外光(SterilaireLamp,254nm,345μW/cm2)中暴露5分钟来对两种溶液进行灭菌。然后将明胶溶液和a-CNC悬浮液与细胞悬浮液进行混合以得到最终的水凝胶组合物。细胞密度是500个细胞/孔。将细胞在96孔板中培养，并且在37℃下在恒定的5％CO2供应下孵育24小时，然后再向每个孔添加100μL的新鲜培养基。
例如，在制备接种有人乳腺癌MCF-7细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在Hank平衡盐溶液(HBSS)中制备3重量％的a-CNC悬浮液和10重量％的明胶溶液。通过在紫外光(Sterilaire Lamp,254nm,345μW/cm2)中暴露5分钟来对两种溶液进行灭菌。然后将明胶溶液和a-CNC悬浮液与细胞悬浮液进行混合以得到以下的最终水凝胶组合物：C总＝3重量％，C明胶＝2重量％并且Ca-CNC＝1重量％(a-CNC与明胶的重量比(R)为0.5)。细胞密度是500个细胞/孔。将细胞在96孔板中培养，并且在37℃下在恒定的5％CO2供应下孵育24小时，然后再向每个孔添加100μL的新鲜培养基。
存活/死亡测定和荧光染色：
在细胞培养的第1天、第8天和第21天，用钙黄绿素-AM(Invitrogen,Carlsbad；绿色荧光)和乙锭均二聚物-1(Invitrogen,Carlsbad；红色荧光)对细胞进行染色以鉴别活对死细胞。向每个孔添加100μL的测定溶液并且在37℃下孵育45分钟。然后通过荧光显微镜(Nikon,Eclipse Ti)来对细胞进行成像。
图8示出了来自a-CNC浓度为1重量％且明胶浓度为2重量％的水凝胶中的MCF-7细胞的在A)第1天，B)第8天和C)第21天之后的活力和MCF生长。
图9示出了使用0.5重量％、1.0重量％和1.5重量％的a-CNC和2.0重量％的明胶浓度在21天时段内进行的细胞活力测定。使用荧光比色染料Alamar蓝来评定代谢细胞活性和细胞活力。如图9可见，对于0.5重量％的a-CNC和2.0重量％的明胶的水凝胶配方，细胞活力在第21天处明显更大。
图10示出了在不同的a-CNC浓度和2重量％的明胶浓度下从第0天到第21天用MCF7细胞获得的MCS。在具有变化的a-CNC浓度，即0.5重量％、1.0重量％和1.5重量％以及2重量％的明胶浓度的水凝胶中，MCS直径随时间而变化。对于每个a-CNC浓度，MCS在每个连续时间段内都显示出显著增长(p<0.005)。在第15天和第21天，与0.5重量％和1.0重量％相比较，在1.5重量％下从MCF 7细胞生长的MCS在统计学上是更低的(p<0.005)。
图11示出了MCF 7细胞在具有变化的明胶浓度，即0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、2.0重量％、2.5重量％、3.0重量％和3,5重量％以及1重量％的a-CNC浓度的水凝胶中在21天时段内实现的MCF生长的变化。在1.5重量％至3.5重量％的明胶浓度下，在每个连续时间段内都观察到了显著的MCS生长(p<0.005)。如图11可见，C明胶高于1.5重量％的水凝胶更有利于MCS生长。
免疫荧光测定：
使用免疫染色来评估细胞-细胞相互作用和细胞核组织。在3天培养之后，将在1.2X108个细胞/mL的细胞浓度下形成的具有多细胞球状体的a-CNC/明胶水凝胶与稀释于HBSS中的4％多聚甲醛进行混合。在室温下，以0.1mL/h的速率将下文使用的所有溶液注入到通道和微孔中。将4％多聚甲醛溶液在90分钟内注入到通道和孔中。随后，通过在90分钟内注入0.1M甘氨酸的HBSS溶液来冲走多聚甲醛溶液。然后，将0.5％Triton X-100的HBSS溶液在60分钟内注入到通道和孔中以渗透细胞。
为了去除过量的Triton X-100，用由0.05重量％的NaN3、0.1重量％的牛血清白蛋白、0.2体积％mL Triton X-100、0.05体积％mL Tween 20的HBSS组成的洗涤溶液(IF洗涤液)将聚合物-多细胞球状体洗涤30分钟。在此之后，将封闭溶液(含10％山羊血清的IF洗涤液)在90分钟内注入到通道和孔。用抗体溶液(Alexa Fluor 488兔E-Cadherin单克隆抗体，1:800的HBSS的稀释液，Cell Signaling Technology)替换封闭溶液，所述抗体溶液允许在4℃下孵育过夜。为了去除过量的抗体，在室温下用IF洗涤液对聚合物-多细胞球状体灌注60分钟。为了对细胞核进行染色，将0.5ng/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Lifetechnologies)的HBSS在10分钟内灌注到聚合物-多细胞球状体中。通过Nikon A1共聚焦显微镜来使CS的结构可视化并对所述结构进行成像。
3天培养之后对a-CNC/明胶-多细胞球状体进行的免疫染色使用来评估细胞-细胞相互作用和细胞核组织。图12示出了在21天培养之后从MCF-7乳腺癌细胞生长的形成于a-CNC/明胶浓度为0.5重量％的a-CNC和2重量％的明胶的a-CNC/明胶中的乳腺癌MCS的免疫荧光染色：图12A)通过DAPI(蓝色)对MCS进行的免疫染色；图12B)通过Alexa Fluor 488兔E-Cadherin单克隆抗体(绿色)对MCS进行的免疫染色；图12C)通过Alexa Fluor568Phalloidin(红色)对MCS进行的免疫染色；以及图12D)由图12A、图12B和图12C中的荧光图像构成的合并图像。图12所示的结果表明多细胞聚集体从细胞团转换为癌性球状体，所述癌性球状体可以充当癌性微肿瘤并且可能适合于筛选药物对肿瘤的效果。
接种有患者来源的胰腺癌细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶的制备：
在制备接种有患者来源的胰腺细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在48孔TC板中的50μL基质胶(8.8-9mg/mL)的圆形复合物中培养细胞。向每个孔添加具有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的1mL杜氏改良培养基(Advanced DMEM-F12，GIBCO)，补充2mMGlutaMAX、10mM HEPES、100U/mL抗生素-抗菌素、1X B-27补充剂、1.25mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10nM胃泌素(1-14)、50ng/mL重组人EGF、100ng/mL重组人头蛋白、100ng/mL重组人FGF-10、0.5mM A 83-01、10mM Y-27632、10mM烟酰胺、20％v/v Wnt-3a条件培养基以及30％v/v人R-Spondin1条件培养基。在孵育器中存在恒定的5％CO2供应的情况下在37℃下孵育所述孔板。对于细胞传代，使用1mL的TryLE Express溶液(Invitrogen)来使细胞脱离并且使基质胶分解。在细胞释放之后，将悬浮液添加到5mL的新鲜培养基并且在250×g和20℃下离心5分钟。去除上清液并且使团块重新悬浮在1mL新鲜基质胶中。然后将25μL的细胞悬浮液转移到新的孔板，并且添加1mL新鲜培养基。每5天使细胞传代。
在制备接种有患者来源的胰腺细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在Hank平衡盐溶液(HBSS)中制备3重量％的a-CNC悬浮液和10重量％的明胶溶液。通过在紫外光(Sterilaire Lamp,254nm,345μW/cm2)中暴露5分钟来对两种溶液进行灭菌。然后将明胶溶液和a-CNC悬浮液与细胞悬浮液进行混合以得到以下的最终水凝胶组合物：C总＝3重量％，C明胶＝2重量％并且Ca-CNC＝1重量％(a-CNC与明胶的重量比(R)为0.5)。细胞密度是500个细胞/孔。将细胞在96孔板中培养，并且在37℃下在恒定的5％CO2供应下孵育24小时，然后再向每个孔添加100μL的新鲜培养基。
图13示出了患者来源的胰腺癌细胞第1天在具有0.5重量％的a-CNC和2重量％的明胶的水凝胶中的活力。通过钙黄绿素AM(绿色)和乙锭均二聚物-1(红色)对细胞进行染色。绿色和缺少红色表示水凝胶中的高细胞活力。
图14示出了与基质胶相比较，原代胰腺类器官在具有不同组成的a-CNC/明胶水凝胶中的培养。箭头显示对于0.5重量％的a-CNC和2重量％的明胶在第5天和第7天存在大型癌症球状体，从而表明可以针对不同细胞调节水凝胶。
接种有患者来源的乳腺癌细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶的制备：
在制备接种有患者来源的乳腺癌的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，从解离的组织获得乳腺癌细胞。
在制备接种有患者来源的乳腺癌细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在48孔TC板中的50μL基质胶(8.8-9mg/mL)的圆形复合物中培养细胞。向每个孔添加具有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的1mL杜氏改良培养基(Advanced DMEM-F12，GIBCO)，补充2mMGlutaMAX、10mM HEPES、100U/mL抗生素-抗菌素、1X B-27补充剂、1.25mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10nM胃泌素(1-14)、50ng/mL重组人EGF、100ng/mL重组人头蛋白、100ng/mL重组人FGF-10、0.5mM A 83-01、10mM Y-27632、10mM烟酰胺、20％v/v Wnt-3a条件培养基以及30％v/v人R-Spondin1条件培养基。在孵育器中存在恒定的5％CO2供应的情况下在37℃下孵育所述孔板。对于细胞传代，使用1mL的TryLE Express溶液(Invitrogen)来使细胞脱离并且使基质胶分解。在细胞释放之后，将悬浮液添加到5mL的新鲜培养基并且在250×g和20℃下离心5分钟。去除上清液并且使团块重新悬浮在1mL新鲜基质胶中。然后将25μL的细胞悬浮液转移到新的孔板，并且添加1mL新鲜培养基。每5天使细胞传代。
在制备接种有患者来源的乳腺细胞的宏观a-CNC/明胶水凝胶之前，在Hank平衡盐溶液(HBSS)中制备3重量％的a-CNC悬浮液和10重量％的明胶溶液。通过在紫外光(Sterilaire Lamp,254nm,345μW/cm2)中暴露5分钟来对两种溶液进行灭菌。然后将明胶溶液和a-CNC悬浮液与细胞悬浮液进行混合以得到以下的最终水凝胶组合物：C总＝3重量％，C明胶＝2重量％并且Ca-CNC＝1重量％(a-CNC与明胶的重量比(R)为0.5)。细胞密度是500个细胞/孔。将细胞在96孔板中培养，并且在37℃下在恒定的5％CO2供应下孵育24小时，然后再向每个孔添加100μL的新鲜培养基。
图15示出了在A)第1天、B)第9天和C)第14天的来自乳腺肿瘤活检的多细胞癌症球状体的生长(图像取自水凝胶中的相同位置)。水凝胶包含0.5重量％的a-CNC和2重量％的明胶。以及D-F)在第8天之后在a-CNC/明胶水凝胶中从乳腺癌患者来源的细胞生长的MCS的不同视图(a-CNC和明胶的浓度分别为0.5重量％和2重量％)。
用乳腺癌MCF 7细胞、患者来源的胰腺癌细胞和患者来源的乳腺癌细胞获得的结果表明，可以将水凝胶调节为具有合适的特性以促进使用本公开的方法、系统和装置实现的诸如多细胞球状体或类器官的多细胞聚集体的形成。
使用微流体装置制备多细胞聚集体：
本文公开的微流体装置10可以用于在水凝胶支架内形成多细胞聚集体(图2A、图2B和图2C)。根据一个实施方案，MCF-7乳腺癌细胞悬浮液用于如图16、图17和图18所示在a-CNC/明胶水凝胶微滴内获得癌症球状体。
在第一时间，首先用混合有0.5重量％的嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚的氟化油处理微孔16和供应通道14的表面。接着，用含MCF-7乳腺癌细胞悬浮液的明胶和a-CNC的前体溶液填充供应通道14和微孔16。在2重量％的明胶和0.5重量％的a-CNC下，MCF-7乳腺癌细胞悬浮液对于低密度球状体具有1000个细胞/μl的浓度并且对于高密度球状体具有3x107个细胞/μl的浓度。在接下来的步骤中，用氟化油混合物替换供应通道14中的细胞/前体溶液，同时将细胞/前体溶液保留在微孔16中。这个步骤导致充满细胞的微滴24的阵列的形成。在1-1.5小时之后，微孔16中的前体明胶/a-CNC溶液被转换为水凝胶27，并且用细胞培养基替换供应通道14中的氟化油混合物以诱导细胞生长和多细胞球状体的形成。
通过将微流体装置在37℃下放置于孵育器中来刺激MCF-7乳腺多细胞球状体的生长。在孵育期间，对供应通道14供应恒定的细胞营养基质流。然后，通过执行各种成像步骤来测试乳腺癌细胞活力和MCS形成的进展，其中所述步骤包括在营养基质中实现不同时间暴露之后对微孔中的细胞培养物进行染色和荧光镜成像。
图16示出了具有0.75重量％的a-CNC、2重量％的明胶和最初细胞浓度为1000个细胞/μl的水凝胶前体溶液的组成的充满MCF 7的a-CNC/明胶微凝胶的微流体制备。
图17示出了MCF 7乳腺癌细胞第1天在具有0.5重量％的a-CNC和2重量％的明胶的a-CNC/明胶微凝胶中的活力。左侧图像对应于明场图像，并且右侧图像对应于微流体装置中的充满细胞的水凝胶的荧光显微镜图像。通过钙黄绿素AM(绿色)和乙锭均二聚物-1(红色)对细胞进行染色。绿色和缺少红色表示微凝胶中的高细胞活力。根据一个实施方案，有关低密度癌症球状体产生的有利结果可以用水凝胶组成：2重量％至5重量％的明胶和0.5重量％至1.5重量％的a-CNC以及100至1000个细胞/μL之间的任何细胞浓度获得。根据一个实施方案，优选的水凝胶组成为2重量％的明胶和0.75重量％的a-CNC。
根据一个实施方案，有关高密度癌症球状体产生的有利结果可以用水凝胶组成：2重量％至5重量％的明胶和0.5重量％至1重量％的a-CNC以及1至10x107个细胞/mL之间的任何细胞浓度获得。根据一个实施方案，优选的水凝胶组成为2重量％的明胶和0.5重量％的a-CNC。
物理交联的水凝胶支架
根据一个实施方案，可以使用经由聚合物链相互作用，诸如聚合物链之间的疏水、静电和氢键键合而获得的任何物理交联的水凝胶支架，只要所述水凝胶支架具有合适的特性，允许多细胞聚集体的形成和存活并且在微流体装置内经受连续流动时保持完整即可。
根据一个实施方案，水凝胶前体可以是物理胶凝聚合物，诸如琼脂糖。此实施方案是有利的，因为琼脂糖借此形成水凝胶的热固性凝胶化会导致完全形成的水凝胶支架既无细胞毒性又具有生物相容性。另外，琼脂糖的使用也有利于这种特定应用，因为琼脂糖可以用生长因子或肽片段容易地官能化以使凝胶结构具有生物活性。
根据一个实施方案，当前体为琼脂糖时，微孔和供应通道的表面可以用混合有0.1重量％的嵌段共聚物全氟化聚醚-b-(聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇)-b-全氟化聚醚的氟化油(HFE 7500,3M,Canada)处理。在这个细胞包囊过程的特定实施方案中，使用0.1重量％的PFPE-b-(PPG-PEGPPG)-b-PFPE的氟化油溶液。接着，可以用水性琼脂糖溶液或含细胞悬浮液的琼脂糖溶液填充供应通道和微孔，从而替换供应通道和微孔中的氟化油混合物。在接下来的步骤中，用氟化油相替换供应通道中的琼脂糖溶液或含细胞悬浮液的琼脂糖溶液。琼脂糖溶液的微滴被限制于孔中并且细胞被分到所述微滴中。然后将微流体装置的温度降低到4℃，以将琼脂糖溶液的微滴转换为凝胶。图4A和图4B中示出了这类水凝胶的所得的形成物，所述图示出了不含细胞的琼脂糖凝胶的明场图像和荧光图像。在凝胶化之后，用细胞培养基替换供应通道中的油相。
图18示出了由琼脂糖微凝胶中所充满的高密度MCF-7细胞形成的球状体：图18A)处于37℃的含高密度MCF-7细胞悬浮液(60％)的琼脂糖溶液的微滴[微滴悬浮在氟化油中]。图18B)在细胞培养1天之后的充满了MCF-7细胞(60％)的培养基的琼脂糖微凝胶。
温度响应性水凝胶
根据一个实施方案，水凝胶支架可以是温度响应性水凝胶，所述温度响应性水凝胶被设计用于1)模拟体内肿瘤环境的结构和机械性质并且允许多细胞癌症球状体或类器官的生长，以及2)在降低的生理上可接受的温度下液化以用于随后从MF装置释放球状体或类器官。
根据一个实施方案，水凝胶前体可以来源于纤维素纳米晶体(CNC)。例如，水凝胶前体可以是用温度响应性聚合物分子表面官能化的CNC的水性悬浮液。在非限制性实例中，这类改性的CNC可以是携带温度响应性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)的表面接枝分子的CNC(Li,Y.等人，Angew Chem Int Ed Engl(2017)56(22):6083-6087，名称为Supramolecular Nanofibrillar Thermoreversible Hydrogel for Growth and Releaseof Cancer Spheroids；Li,Y.和Kumacheva,E.,Science Advances(2018)4(4):eaas8998，名称为Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drugscreening)或者用N-异丙基丙烯酰胺和N,N′-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的共聚物官能化的CNC(Thérien-Aubin,H.等人，Biomacromolecules(2016)17(10):3244-3251，名称为Temperature-Responsive Nanofibrillar Hydrogels for Cell Encapsulation)。
MF-MSF平台在筛选中的应用
根据一个实施方案，所述装置和方法可以用于筛选用于药物发现的化合物，用于理解所筛选的化合物的作用方式并且用于评估药效学和/或机制生物标志物。根据一个实施方案，所述装置和方法可能特别可用于通过在动态条件下将诸如抗癌药之类的药物递送到多细胞球状体或类器官而筛选药物功效以进行治疗处理。根据一个实施方案，抗癌药可以靶向乳腺癌或胰腺癌。本发明的一个优点是获自从癌症患者组织分离的原代细胞的多细胞球状体的使用使得有可能进行化合物的个性化筛选。
根据一个实施方案，一种使用本公开的微流体装置10筛选化合物的方法。所述方法可以包括以下步骤
1)将第一润湿剂25a引入到微流体装置10的至少一个排的供应通道14和对应的微孔16中；
2)将包含水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的溶液21引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14和对应的微孔16中以用溶液21替换供应通道14和微孔16内的第一润湿剂25a；
3)将第二润湿剂25b引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以用第二润湿剂25b替换供应通道14内的溶液21，其中用第二润湿剂25b替换供应通道14中的溶液21在微流体装置10的至少一个排50的微孔16内诱导了包含水性细胞悬浮液23和水凝胶前体22的微滴24的形成；
4)诱导微滴24内的水凝胶前体22的凝胶化以在微孔16内形成接种有细胞悬浮液23的水凝胶27；
5)将一种或多种细胞培养基26引入到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中以替换供应通道14中的第二润湿剂25b；
6)使一种或多种细胞培养基26连续流动到微流体装置10的至少一个排50的供应通道14中，其中细胞培养基26促进细胞悬浮液23的细胞生长和水凝胶27内的多细胞聚集体26的形成；
7)通过将包含化合物的溶液在一段时间内引入到供应通道中的至少一个中来使所选择的多细胞聚集体26暴露于所述化合物；以及
8)评定暴露于所述化合物的多细胞聚集体26的活力。
根据一个非限制性实施方案，所筛选的化合物可以是药物、蛋白质、激素、抗体、纳米颗粒或毒素。
根据一个实施方案，筛选方法可以与获自不同癌细胞的多细胞球状体一起使用，并且所述化合物是抗癌药。另外，多细胞球状体可以获自乳腺癌，并且抗癌药靶向乳腺癌。可选地，多细胞球状体可以获自胰腺癌，并且抗癌药靶向胰腺癌。
根据一个实施方案，MCC可以获自从癌症患者组织分离的原代细胞以用于化合物的个性化筛选。
根据一个实施方案，可以通过使用包含具有多种不同类型的细胞的水性细胞悬浮液的溶液来获得多细胞球状体。
本公开的方法提供了在微流体装置上筛选多种化合物的机会。另外，本发明还提供了为每种筛选的化合物筛选多个浓度的机会。根据一个实施方案，可以将以不同剂量或药物组合供应的单独药物的溶液与营养基质一起供应到位于不同排50中的多细胞球状体。
根据一个实施方案，可以在同一微流体装置上对不同尺寸的多细胞球状体执行筛选。
在流动状态下染料在聚合物-MCS中的渗透
根据一个实施方案，所述装置和方法可以用于筛选用于药物发现的化合物，用于理解所筛选的化合物的作用方式并且用于评估药效学和/或机制生物标志物。
根据一个实施方案，所述装置和方法可能特别可用于通过在动态条件下将诸如抗癌药之类的药物递送到获自高密度细胞悬浮液或低密度细胞悬浮液的多细胞球状体或类器官而研究和/或筛选药物以进行治疗处理。
在另一非限制性实例中，为了证明本发明的方法和系统在研究和/或筛选化合物对球状体或类器官的作用中的用途，使用流体动力学直径为12nm的荧光染料异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-葡聚糖)来表征多细胞球状体的渗透率。在引入FITC-葡聚糖溶液之前，在微流体装置中形成具有多细胞球状体的细胞浓度为1.2×108个细胞/mL的a-CNC/明胶微凝胶的2D阵列，并且在处于0.01mL/h的培养基的流速下将所述阵列培养3天(图27a)。然后，将0.1mg/mL FITC-葡聚糖的HBSS溶液以0.1mL/h的流速注入到具有多细胞球状体的a-CNC/明胶微凝胶中。在10分钟的灌注时间t之后，通道和孔的内容物发出荧光。在30分钟的灌注时间之后，供应微通道和孔内容物的荧光强度不再变化(图27b)。在此之后，将不含染料的细胞培养基以0.1mL/h的流速注入到通道中。图27c示出了在10秒或灌注之后的微凝胶。在10分钟的短暂灌注时间(t’)之后，供应通道中的荧光强度明显降低。具有多细胞球状体的a-CNC/明胶微凝胶的荧光强度也降低。在80分钟灌注之后，具有多细胞球状体的a-CNC/明胶微凝胶中的FITC-葡聚糖的荧光强度大大减弱(图27d)。
具有多细胞球状体的a-CNC/明胶微凝胶中的FITC-葡聚糖的平均荧光强度的降低被量化为洗涤时间的函数(图27f)。在最初20分钟洗涤之后，荧光强度大幅(约80％)降低，然后在随后的50分钟期间缓慢地(约10％)降低，在t’＝60分钟之后保持几乎恒定。
已通过举例示出了上文描述的特定实施方案，并且应理解，这些实施方案可能容许有各种修改和替代形式。应进一步理解，权利要求并不意图限于所公开的特定形式，而是意图覆盖落在本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。
