一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法
技术领域
本发明属于干细胞芯片技术领域，具体涉及一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法。
背景技术
成体细胞由于其无伦理特性以及可自体提取和移植的特点，被广泛研究。而口腔组织由神经嵴分化而来，组织中分离得到的干细胞，不仅具有成体干细胞的优点，还具成神经样细胞的特点，而且还具有免疫原性低的优点，成为应用于临床的良好材料。
牙髓干细胞(DPSCs)被从成年人第三磨牙DPSCs在Eagle’s培养基中显示成纤维样细胞形态，集落形成的发生率比骨髓干细胞(BMSCs)更高，表明在牙髓来源干细胞比骨髓来源干细胞有更好的生长潜力。从7-8岁儿童身上收集正常脱落的门牙，分离组织，消化后将单细胞悬液放置于常规培养基中培养，并将由并得到的细胞并为脱落并牙干细胞(SHED)。第三磨牙的根尖并头中分离出具有干细胞特性的细胞群，与载体羟基磷灰石/磷酸钙(HA/TCP)结合后，实现了免疫缺陷小鼠的牙本质再生，他们将这种细胞群并为根尖并头干细胞(SCAP)。牙周膜中分离得到的单细胞悬液，能够表达MSC标志物，在特殊培养条件下分化成牙本质细胞，脂肪细胞和胶原细胞，并且在移植后能够帮助啮齿修复牙周，于是他们将其命名为牙周膜干细胞(PDLSCs)。人牙囊组织中提取细胞，成功分离后，发现其IGF-2比hMSC中表达高100多倍，得到牙囊干细胞(DFSCs)。人牙龈组织中有着MSC细胞成为GMSCs。牙胚组织分离得到新的干细胞，被命名为牙胚细胞(TGPCs)。通过手术从6-44岁患者体内获得牙槽骨，分离得到牙槽骨干细胞(ABMSCs)。
众所周知，中国人的口腔问题很严重。人们不健康的生活及卫生习惯导致日常生活中常有牙周炎、牙龈出血、龋齿、口腔溃疡等状况。由于牙齿干细胞的优秀的成牙本质细胞特性，常常被作为一种牙科组织工程的再生材料。口腔是一个复杂的环境，炎性反应以及微生物的存在，让口腔细胞受到多种刺激从而具有一些优良的功能比如抑制微生物生长。牙科干细胞也可以被用作一种疾病药物测试的模型。另外，由于从组织中原代分离得到的细胞是一个高度异质性的混合细胞群，干细胞来源的稳定性直接限制了其应用。相对应的，干细胞膜表面标志物的研究的开展能有效解决这个问题。但是来源于口腔中不同部位、不同组织的干细胞不论是在标志物表征还是在功能特性方面，依然具有比较大差异。
现有研究是直接将干细胞单独分离后，分别研究或者进行平行研究，这导致结果的稳定性差，可重复性差。且单独分离细胞培养，因为细胞不能随时保存，有分化、老化甚至细胞死亡的风险，所以每次检测一种细胞基础数据指标，都需要从头开始繁琐的细胞实验操作，每种细胞逐项指标检测，不仅耗费大量时间，还浪费大量试剂。需要一种集合了多种口腔干细胞的微型化的、高效的多细胞平台，去除细胞实验组别的差异，在同一系统中进行干细胞分化、表征、异质性以及药物测试等研究。
细胞芯片技术是在一张载玻片上检测数十或上百个病人样本，与各种生物检测技术结合可以低成本高效率地检测多种疾病指标。
但截止目前，还仍未见有任何关于口腔干细胞芯片的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法，其包括如下步骤：
S1细胞爬片的制备
分别将6种口腔干细胞的单细胞悬液接种于细胞基片的各分区框内培养至细胞贴在细胞基片上，随后加入培养基覆盖；
取出细胞爬片，用冲洗液冲洗后固定、重溶得6种口腔干细胞细胞悬液；
S2细胞芯片的制备
将6种口腔干细胞细胞悬液与点样液混合后加入到标准细胞培养板中进行点样后培养，即可制成；
其中，所述6种口腔干细胞为DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs。
优选地，步骤S1中所述细胞基片为三维基片，其中由固相基片表面修饰一层极薄的含活化醛基的三维结构高分子聚合物。
优选地，所述制备方法中采用的培养基为含有10％胎牛血清和1％的青/链霉素双抗的α-MEM培养基。
优选地，步骤S1中6种口腔干细胞的单细胞悬液经由如下步骤制得：分别培养6种口腔干细胞待生长至80-90％亚汇合状态，用胰酶消化细胞，培养液吹打后转移到离心管，离心去掉上层培养液，加入新鲜培养基重悬沉淀得6种口腔干细胞的单细胞悬液。
优选地，步骤S1中固定所使用的固定液为4％多聚甲醛，固定时间为15-30min。
优选地，步骤S2中标准细胞培养板为384孔。
优选地，步骤S2中口腔干细胞细胞悬液与点样液混合时的比例为1：1-3。
优选地，步骤S2中芯片点样湿度40-50％，进一步优选为50％；洗针条件为超纯水流洗10S、超声10S、抽干10S，共4个循环。
优选地，步骤S1中所述的细胞基片在接种之前进行如下处理：
将均匀分区后的细胞基片依次用水洗、浓酸浸泡、水洗后湿法灭菌。
进一步优选地，所述浓酸为浓盐酸或者浓硫酸，浓度为12mol/L。
进一步优选地，浓酸浸泡的时间为5-10min。
优选地，步骤S2点样仪的参数设置为：300mm，40个预点样，单矩阵内为6×10，包含每个样点10个，多矩阵为2×3。
优选地，步骤S2中所述点样液为
本发明中步骤S3所得细胞芯片在检测时可进行如下操作：
复温芯片，加入分别加入染色剂进行染色，再加上封片剂，4℃避光过夜；PBS洗片3次后晾干，置于荧光显微镜下观察。
其中染色剂为CD34-FITC、CD146-FITC中的一种。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法制得的细胞芯片具有如下有益效果：
(1)微型化，本发明将6种口腔干细胞样本设计放在一种微型的固相载体上。
(2)时效性，和经典的流式细胞术检测表面标志物的表达相比，本发明能够长期保存，通过交联处理的细胞-20℃能保存3个月，-80℃能够保存半年。流式细胞术则需要新消化的细胞；
(3)经济性，本发明涉及的细胞爬片和细胞芯片，只需要少量细胞即可在同一个固相平台检测多种指标，不仅节省细胞样本的使用，也很大程度节省了昂贵的抗体试剂；
(4)便捷性，一旦制作完成，不需要重新复苏细胞传代等繁琐流程，直接复温后即可使用。
(5)本发明提供的细胞芯片还具有稳定性好、可重复性好、检测准确性高的优点。
附图说明
附图1是本发明提供的口腔干细胞芯片的结构示意图
附图2是本发明提供的口腔干细胞芯片的又一结构示意图；
附图3口腔干细胞爬片的示意图；
附图4是实施例1中口腔干细胞DFSC和SCAP用CD146-FITC的染色结果图；
附图5是实施例1中口腔干细胞DFSC和SCAP用CD34-FITC的染色结果图；
附图6是对比例中用流式细胞术检测DFSC和SCAP的表面标志物CD146和CD34的结果图；
附图7是显微镜下观察的不同表面修饰的基片上的细胞图；
附图8是不同表面修饰基片上的细胞的DAPI蓝色荧光图；
附图9是-20℃保存一个月后基片经分别CD34-FITC和CD146-FITC染色的结果图；
附图10是口腔干细胞DFSC和SCAP用CD34-FITC的重复染色结果图；
附图11是口腔干细胞DFSC和SCAP用CD146-FITC的重复染色结果图。
附图标记：1是指三维基片，2是指单矩阵，3是指多矩阵。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于并。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种基于口腔干细胞的芯片的制备方法，其包括如下步骤：
S1细胞爬片的制备
S1-1细胞基片的制备
取三维基片，用组化笔或者塑料框将基片划分分成6个区域；用水洗后用浓盐酸或者浓硫酸于通风橱中泡5-10min，然后再次水洗干净，湿法灭菌。
S1-2细胞爬片的制备
分别培养DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs 6种口腔干细胞，换液待生长至80-90％亚汇合状态；0.05％胰酶温和消化1-2min，离心1000rpm、5min后，去掉上层培养液，加入新鲜培养基重悬沉淀；
分别在三维基片6种框内接种DPSCs,SHED,SCAP,PDLSCs.DFSCs,GMSCs6种口腔干细胞悬液(浓度为1×106个/mL)，37℃培养放4h或者过夜放置，让细胞贴在三维基片上，随后加入培养基覆盖以防止培养液挥发干；
取出细胞爬片，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入4％多聚甲醛固定20min，用无菌PBS再次冲洗，-20℃保存；
S2细胞芯片的制备
将细胞悬液用PBS重溶后，分别将DPSCs，SHED，SCAP，PDLSCs，DFSCs和GMSCs 6种口腔干细胞细胞悬液与点样液1：1成20μL的混合液，依次加入到384孔板中。打开点样仪，分别设置参数为30mm，40个预点样，单矩阵内为6×10，包含每个样点10个；多矩阵为2×3，以适应共6个测试指标。
点样后，放于孵育盒中4℃过夜，即可制成。
本实施例中三维基片是由固相基片表面修饰一层极薄的含活化醛基的三维结构高分子聚合物；所述三维基片是市场购入，公司为博奥生物有限公司，产品名为
细胞培养过程中采用的培养基包括如下组分：胎牛血清10mL、青/链霉素双抗500μL，基础DMEM高糖培养基490mL。
S3复温芯片，加入分别加入CD34-FITC、CD146-FITC染色，再加上封片剂，4℃避光过夜；PBS洗片3次后晾干，置于荧光显微镜下观察；如上所述封片剂含有甘油的PBS甘油。从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买，名并为甘油-PBS封片剂，货号为AR-0831。
试验例1
如上述实施例1的方法制备含有DFSC和SCAP两种口腔干细胞的爬片。
分别用CD146-FITC和CD34-FITC覆盖在细胞表面，避光室温孵育1h。把爬片浸泡在PBS中，放于摇床上震荡3-5min，重复3次，晾干。用DAPI覆盖在细胞表面，避光室温孵育30min，把爬片浸泡在PBS中，放于摇床上震荡3-5min，重复6次，晾干。
在爬片上滴加2-3滴封片剂，用盖玻片缓缓盖上。置于荧光显微镜下观察，拍照保存。
如图1、2所示，为本实施例提供的细胞芯片的结构示意图。
测试在同一平台上的不同口腔干细胞的表面标志物的表达。并处随机选择6种中的2种，检测了2个指标。CD146和CD34都是鉴定口腔干细胞的常用表面标志物。其中CD146为口腔干细胞常规检测的强阳性指标，CD34是弱阳性的指标，不同的口腔干细胞会有差别。并处举例只是展示口腔干细胞在鉴定标志物上的一类应用。
图3为口腔干细胞爬片的示意图。
试验例2
培养DFSC和SCAP两种口腔干细胞至80-90％汇合的时候，胰酶消化后，1000rpm离心5min，去掉上清。用PBS重悬，缓慢吹打，调整细胞浓度，将0.5～1×106个细胞重悬至50～100μL。
分别加入1μg CD146-FITC和CD34-FITC抗体，避光室温孵育30min，离心去掉荧光抗体，PBS重悬，轻轻吹打，再次离心去掉上清，PBS重悬，重复2-3次。染色后避光保存，上样前轻轻吹散细胞团块。
根据图4、5、6可以看出，本发明提供的细胞芯片，经过-20℃保存复温后可以使用。这表明本发明提供的细胞芯片具有较好的稳定性。
同时，流式细胞术结果表明DFSCs细胞和SCAP都是CD146标志物强阳性和CD34标志物弱阳性表达的细胞。芯片染色结果也显示了与流式细胞术相同的结果。这表明本发明提供的芯片具有较好的准确性。
对比例
按照上述方法制备芯片，分别在表面有结构高分子聚合物修饰的三维基片(同实施例1)和普通的三维基片上接种干细胞。放于-20℃冻存，复温后，通过荧光染色观察细胞被标记的效率，所用抗体都是细胞表面阳性表达的抗体。1:1000稀释DAPI储液，避光室温孵育15min，PBS洗涤6次。在荧光显微镜下观察。
如附图7可以明显看出，经过三维结构高分子聚合物修饰的基片，细胞轮廓清晰，背景干净，细胞容易聚集，有典型的细胞纤维状，并且细胞标记物的荧光被很好地呈现；而没有经过修饰的基片，细胞没有铺展成经典的梭形，细胞分散，贴壁率相比于有凝胶修饰的基片低。图8显示了同时用DAPI进行细胞核染色的细胞图，图中可以看到，凝胶修饰的基片上，细胞核被染色成经典的椭圆状，而缺乏凝胶修饰的细胞，细胞核呈现圆形。
稳定性测试
按照上述方法制备芯片，分别在表面有三维结构高分子聚合物修饰的三维基片和普通的三维基片上接种干细胞。放于-20℃冻存。
低温保存一个月后，复温，通过荧光染色观察细胞被标记的效率，所用抗体都是细胞表面阳性表达的抗体。分别加入1μg经过CD146-FITC和CD34-FITC标记的荧光抗体，避光室温孵育30min，PBS洗涤2次。再进行DAPI染色，PBS洗涤6次。在荧光显微镜下观察。
如附图9可以看出，在-20℃放置一个月后，有三维结构高分子聚合物修饰的基片上的细胞依然保持纤维状，能够保持良好的形状，显示出良好的荧光效果。无凝胶的基片上细胞呈现不规则形状，荧光不清晰，染色效果不明显。
重复性测试
重复芯片制备和随机染色实验。
结果如附图10和附图11所示，随机2种细胞依然能够被准确的染色，细胞形态呈现典型纤维状，核呈现椭圆形，并表现为标志物CD146阳性和CD34阴性。与第一次实验的结果基本相同，见附图4和附图5。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
