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木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对氨基酸的检测
技术领域
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体涉及木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对氨基酸的检测。
背景技术
近年来，MALDI-TOF MS由于其软电离、高通量、质量检测范围宽、准确度高、灵敏度高、耐盐度高、样品需求量少、分析速度快等优点被广泛应用于蛋白质、多肽、多糖、寡核苷酸及氨基酸等生物分子检测领域。基质在MALDI-TOF MS检测过程中起着举足轻重的作用，不仅可以提高待测分子的分散度，并且能吸收激光能量转化为待测分子的激发能，从而使待测分子在MALDI-TOF MS中被电离及检测。常见基质类型主要分为有机基质与无机基质，其中，金属材料、沸石材料及半导体材料等无机基质由于离子化效率高、结晶均匀等优点被广泛应用于生物分子物质的检测。然而，金属材料价格昂贵，且制备过程复杂，半导体材料实用性差，沸石材料性能不稳定等缺点使得MALDI-TOF MS检测生物分子存在一定的局限性。开发新型MALDI-TOF MS基质，已经成为MALDI-TOF MS质谱分析中具有关键性与创新性的研究方向。
近年来，碳材料因其优良的电子转移能力和较强的激光能量吸收能力，良好的化学稳定性，不易与生物分子发生反应等特性在MALDI-TOF MS检测生物分子领域备受关注。碳微球作为一种小尺寸碳材料，由于其低成本、良好的导电性及来源广泛等优点使得作为基质在检测生物分子领域得到进一步拓展。碳点作为纳米级材料，由于其颗粒尺寸小，共结晶分散均匀，可进行元素掺杂等优势被作为MALDI-TOF MS基质。
发明内容
本发明目的是为解决碳点量子产率与电子传递效率低的问题，而提供一种木犀草素基碳点的制备及应用。
一种木犀草素基碳点，它是由下述方法制备的：
1）将0.01-0.5g木犀草素加入聚四氟乙烯反应釜中，加入20mL去离子水，搅拌均匀，在反应温度80-350℃，反应时间1-60h下得到反应产物；
2）将步骤1）得到的反应产物经5000~10000rpm离心处理15~30min，得到澄清的上层碳点溶液；
3）将步骤2）中得到的碳点溶液通过0.22μm滤纸过滤，得到下层碳点溶液；
4）将步骤3）中得到的碳点溶液通过透析粒径为1000Da的透析袋进行透析处理40~60h，每6h更换一次去离子水；
5）干燥，得到木犀草素基碳点；
步骤1）所述的木犀草素为0.03~0.2g，反应温度为160~200℃，反应时间为12~36h。
一种氮掺杂木犀草素基碳点，它是由下述方法制备的：
1）将0.01-0.5g木犀草素加入聚四氟乙烯反应釜中，加入20mL去离子水，加入双氧水、乙二胺，搅拌均匀，在反应温度80-350℃，反应时间1-60h下得到反应产物；所述的木犀草素、双氧水、乙二胺摩尔比为0.00024：1：0.001-10；
2）将步骤1）得到的反应产物经5000~10000rpm离心处理15~30min，得到澄清的上层氮掺杂木犀草素基碳点溶液；
3）将步骤2）中得到的碳点溶液通过0.22μm滤纸过滤，得到下层氮掺杂木犀草素基碳点溶液；
4）将步骤3）中得到的氮掺杂木犀草素基碳点溶液通过透析粒径为1000Da的透析袋进行透析处理40~60h，每6h更换一次去离子水；
5）干燥，得到氮掺杂木犀草素基碳点；
步骤1）所述的木犀草素为0.03~0.2g，反应温度为160~200℃，反应时间为12~36h。
所述的一种木犀草素基碳点在检测氨基酸方面的应用；
所述的应用，它包括：所述的木犀草素基碳点溶于去离子水，得到浓度为0.05~25mg/mL的木犀草素基碳点溶液，超声处理3~10min；取1μL木犀草素基碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1μL氨基酸溶液覆盖在碳点溶液上，再滴加1 μL木犀草素基碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次，干燥，进行检测；
所述的氨基酸为谷基酸、组氨酸、亮氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸。
所述的一种氮掺杂木犀草素基碳点在检测氨基酸方面的应用；
所述的应用，它包括：所述的氮掺杂木犀草素基碳点溶于去离子水，得到浓度为0.05~25mg/mL的氮掺杂木犀草素基碳点溶液，超声处理3~10min；取1μL氮掺杂木犀草素基碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1μL氨基酸溶液覆盖在碳点溶液上，再滴加1 μL氮掺杂木犀草素基碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次，干燥，进行检测；
所述的氨基酸为谷基酸、组氨酸、亮氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸。
本发明提供了一种木犀草素基碳点和氮掺杂木犀草素基碳点的制备及在检测氨基酸方面的应用；本发明有益效果：可提高碳点量子产率，提高共结晶稳定性；氮掺杂木犀草素基碳点提高量子产率，并且增加电子传递效率，增强基质效应；木犀草素基碳点及氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对氨基酸检测结果显示，基质背景干扰小，特征信号峰明显，对多种氨基酸具有适用性。该基质材料对氨基酸的检测性能有望在化学、生物、医药、环境领域具有重要的应用前景。
附图说明
图1 木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对空白样品图谱；
图2 N掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对空白样品图谱；
图3 紫外吸收检测结果；
图4 木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对谷基酸检测结果图；
图5 氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对谷基酸检测结果图；
图6木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对组氨酸检测结果图；
图7 木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对亮氨酸检测结果图；
图8 木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对天冬氨酸检测结果图；
图9 木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对苯丙氨酸检测结果图；
图10 氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对组氨酸检测结果图；
图11 氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对亮氨酸检测结果图；
图12 氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对天冬氨酸检测结果图；
图13 氮掺杂木犀草素基碳点作为MALDI-TOF MS基质对苯丙氨酸检测结果图。
具体实施方式
实施例1 木犀草素基碳点的制备
将0.07 g木犀草素为碳源加入聚四氟乙烯反应釜中，加入20 mL去离子水，搅拌均匀，反应温度180℃，反应时间24h，得到木犀草素基碳点溶液；将木犀草素基碳点溶液经8000rpm离心处理20 min，通过0.22μm滤纸过滤得到澄清木犀草素基碳点溶液；将澄清的木犀草素基碳点溶液通过透析粒径为1000 Da的透析袋进行透析处理48 h，每6 h更换一次去离子水；
将透析后的木犀草素基碳点溶液进行5 min超声处理，使其分散均匀；取1μL碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1μL氨基酸溶液覆盖在碳点溶液上，其上再次滴加1μL碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次。室温下，自然晾干，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-TOF MS进行分析，结果如图1所示，碳点溶液作为基质，在低分子量区域背景峰很少，对于氨基酸的检测是十分有利的。
实施例2 N掺杂木犀草素基碳点的制备
将0.07g木犀草素为碳源加入聚四氟乙烯反应釜中，依次加入20mL去离子水，10mL双氧水，0.9mL乙二胺，搅拌均匀，反应温度范围180℃，反应时间范围24h得到N掺杂木犀草素基碳点溶液；将氮掺杂木犀草素基碳点溶液经8000rpm离心处理20min，通过0.22μm滤纸过滤得到澄清氮掺杂木犀草素基碳点溶液；将澄清的木犀草素基碳点溶液通过透析粒径为1000Da的透析袋进行透析处理48h，每6h更换一次去离子水；
将透析后的氮掺杂木犀草素基碳点溶液进行5min超声处理，使其分散均匀；取1μL碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1μL氨基酸溶液覆盖在碳点溶液上，其上再次滴加1μL碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次；室温下，自然晾干，待溶剂挥发结晶，送入MALDI-TOF MS进行分析，结果如图2所示，碳点溶液作为基质，在低分子量区域背景峰很少，对于氨基酸的检测是十分有利的。
实施例3 紫外线检测
将木犀草素基碳点溶液与N掺杂木犀草素基碳点溶液分别进行紫外测试，取相同体积的碳点溶液同样条件下进行紫外吸收检测。
结果如图3所示，表明该物质在300-400 nm处有良好的紫外吸收，在质谱图中得到了该化合物的峰，证明该化合物能较好地离子化，具有基质效应，符合MALDI-TOF MS中基质的要求。
实施例4 两种基质对谷基酸的检测
实例1中木犀草素基碳点溶液与实例2中N掺杂木犀草素基碳点溶液分别作为MALDI-TOF MS基质，对谷基酸进行检测。
将碳点溶液进行5 min超声处理，使其分散均匀；取1 μL碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1 μL谷基酸溶液覆盖在碳点溶液上，其上再次滴加1 μL碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次。室温下，自然晾干，待溶剂挥发结晶后进行检测分析；木犀草素基碳点溶液与氮掺杂木犀草素基碳点溶液对谷氨酸检测结果见图4，图5。
实施例5 两种基质对几种氨基酸的检测
实例1中木犀草素基碳点溶液与实例2中N掺杂木犀草素基碳点溶液分别作为MALDI-TOF MS基质，对氨基酸进行检测。
将木犀草素基碳点溶液进行5 min超声处理，使其分散均匀。取1 μL木犀草素基碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1 μL氨基酸溶液覆盖在木犀草素基碳点溶液上，其上再次滴加1 μL木犀草素基碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次。室温下，自然晾干，待溶剂挥发结晶后进行MALDI-TOF MS检测分析。氨基酸种类为组氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸。组氨酸检测结果见图6；亮氨酸检测结果见图7；天冬氨酸检测结果见图8、苯丙氨酸检测结果见图9。
将N掺杂木犀草素基碳点溶液进行5 min超声处理，使其分散均匀。取1 μLN掺杂木犀草素基碳点溶液快速滴加在MALDI-TOF MS靶板上，将1 μL氨基酸溶液覆盖在N掺杂木犀草素基碳点溶液上，其上再次滴加1 μLN掺杂木犀草素基碳点溶液，依照上述步骤共累积滴加7次。室温下，自然晾干，待溶剂挥发结晶后进行MALDI-TOF MS检测分析。氨基酸种类为组氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸。组氨酸检测结果见图10；亮氨酸检测结果见图11；天冬氨酸检测结果见图12、苯丙氨酸检测结果见图13。
