一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法。
背景技术
整形美容外科是医学外科里的一个分支，是指运用手术、药物、医疗器械以及其他医学技术方法对人的容貌和人体各部位形态进行的修复与再塑，进而增强人体外在美感为目的的科学性、技术性与艺术性极强的医学科学。
随着科学技术的进步以及医疗行业的发展，各种整形美容手段如雨后的春笋不断涌现，包括传统的整形外科手术、显微外科技术、皮肤扩张技术及注射移植技术等，其中注射移植技术尤其受到整形美容就医者的追捧；应用注射性软组织填充材料进行无创的面部填充成为目前最流行的操作手段，在全世界范围内得到医疗美容行业专业人员与爱美人士的广泛认同。注射填充技术操作简单，仅需几分钟的注射就能显示出效果，没有痛苦、不影响工作与日常生活，非常方便，同时，注射填充技术操作不留痕迹、秘密性好，有效保障了就医者的隐私。
羟基磷灰石，其晶系为六方晶系、是一种新型的骨替代物。羟基磷灰石不像骨松质、磷酸钙陶瓷等材料一样，需要预制成各种形状，它可以简单地注射入骨缺损处、能够原位固化、适应骨缺损部位进行塑形。因具有优良的生物相容性，无毒、无刺激性，无排斥反应，不老化、不致敏、不致癌，可与骨组织发生化学性结合等特点，羟基磷灰石受到市场的广泛应用。羟基磷灰石内部孔径平均为2～5μm、孔隙率为29.4％，利于新骨长大，因而在后期其可逐渐由机械固定演变为生物固定，可应用于骨折、干骺端骨缺损、牙周组织缺损的治疗以及人工眼座的制备。
但是，现有的羟基磷灰石填充材料分散不均匀、易成团，使得注射后的组织中存在硬结；同时，羟基磷灰石机械强度相对较低、吸附能力相对较弱的特性也极大的制约了其应用市场。
发明内容
针对以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法，该方法制备了一种改性纳米棒状羟基磷灰石，该改性纳米棒状羟基磷灰石分散均匀、不易成团。并且，这种纳米羟基磷灰石机械强度高，有利于改善美容整形材料的机械强度，能够促进新骨大量形成，生物降解性以及骨引导性均良好；同时，该纳米羟基磷灰石具有更高的吸附性能，会暴露出更多的活性位点，更能满足各种生物活性物质的高载活性成分的需求。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法，其特征在于：包括纳米棒状羟基磷灰石的制备、纳米棒状羟基磷灰石的改性以及制备填充剂；
其中，所述纳米棒状羟基磷灰石的制备具体为：首先将Ca(NO3)2、(NH4)2HPO3分别置于盛有去离子水的容器中、搅拌溶解，然后将两种溶解后的溶液混合并高速搅拌、得到白色乳浊液；然后加入0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至10～12后，加入十八烷基二甲基苄基氯化铵、持续搅拌15～25min；再将搅拌混合后的悬浮液进行高压、高温的水热处理，然后冷却至室温、进行离心分离并用去离子水洗涤至中性，得到羟基磷灰石粗品；然后将羟基磷灰石粗品溶解于酸性溶液中、持续搅拌15～20min，再将搅拌后的溶液与碳酸氢氨放置在一个密闭的容器中、分段加热反应，最后离心收集、反复洗涤、冷冻干燥，得到纳米棒状羟基磷灰石。
在强碱性条件下，以硝酸钙和磷酸氢铵作为原料，合成了羟基磷灰石；然后通过采用相对高温以及高压的水热反应，实现羟基磷灰石的溶解、重结晶过程，使得晶体择优取向、形成有规则的晶体轮廓，能得到大且分散良好的晶体尺寸、低团聚的粒子；同时配合十八烷基二甲基苄基氯化铵作为阳离子表面活性剂，使得十八烷基二甲基苄基氯化铵带正电的胶束表面可以选择性地吸附在羟基磷灰石亲水的晶面上，从而使得羟基磷灰石按一定方向依附在十八烷基二甲基苄基氯化铵胶束表面生长，进而有效地钝化了羟基磷灰石的亲水晶面、使平行于亲水晶面的增长速率比其他晶面增长速率快很多倍，单向增长使得分散性好、不易团聚、光滑的纳米棒状结构的形成。
作进一步优化，所述Ca(NO3)2、(NH4)2HPO3以及去离子水溶解时的用量分别为15～20重量份、8～15重量份以及200～250重量份。
作进一步优化，所述高速搅拌溶解时的转速为500～600rpm。
作进一步优化，所述十八烷基二甲基苄基氯化铵的用量为5～11重量份。
作进一步优化，所述水热处理的高压范围为0.5～1MPa，温度为50～70℃；水热处理时间为4～16h。
作进一步优化，所述羟基磷灰石粗品溶解于pH值为3～5的磷酸溶液中，磷酸溶液的用量为500～700重量份。
作进一步优化，所述碳酸氢氨用量为30～50重量份。
作进一步优化，所述分段加热反应具体步骤为：首先加热到52～58℃、反应2～3h；再加热到59～62℃、反应16～24h；最后加热到63～66℃、反应2～3h。
得到的磷灰石粗品在特定pH值的磷酸溶液下，其表面实现溶解重结晶平衡，得到分散良好、光滑的棒状结构；然后通过分段加热反应使得碳酸氢铵逐步扩散，溶液的pH值逐步增加，使得溶液中纳米棒状的羟基磷灰石表面出现二次成核和生长，由于pH值的不同提供的驱动力、从而促使羟基磷灰石表面晶体的形成，最终随着反应的持续进行、羟基磷灰石逐渐形成均匀、多孔、光滑的纳米棒状结构。
作进一步优化，所述反复洗涤具体步骤为：用15～20重量份的去离子水与15～20重量份的乙醇交替冲洗，冲洗总次数为5～10次。
作进一步优化，所述冷冻干燥温度为-30～-20℃，压力为-95～-90KPa，时间为24～30h。
作进一步优化，所述纳米棒状羟基磷灰石的改性具体步骤为：
首先将得到的纳米棒状羟基磷灰石加入pH值为3～5的磷酸溶液中、再加入硅烷偶联剂，磁力搅拌30～40min；然后升温至70～85℃并保持、进行回流反应5～8h，回流反应结束后降温至25～30℃、调节pH值至中性、离心分离，然后将离心后所得的固体重新分散至去离子水中，升温至70～85℃并保持、进行回流反应10～20min，再次降温至25～30℃、调节pH值至中性、进行二次离心分离；最后将二次离心分离后的固体采用真空干燥，即得改性纳米棒状羟基磷灰石。
通过使用硅烷偶联剂作为活性桥接剂，配合特定pH值的磷酸溶液、磁力搅拌以及特定温度的回流反应进行水解，使得水解后的硅烷偶联剂端含有3个反应活性较高的羟基，同时其与羟基磷酸钙表面的羟基在一定的条件下能化学反应键合，从而使无机物和有机物形成稳定结构；由于羟基磷灰石与有机物的有机结合，有机物包裹在无机物表面且结构稳定，从而进一步避免了羟基磷灰石的团聚而分布不均匀，同时避免了注射后的组织中存在硬结的问题。
作进一步优化，所述纳米棒状羟基磷灰石、磷酸溶液以及硅烷偶联剂的用量分别为5～20重量份、80～150重量份以及0.05～1重量份。
作进一步优化，所述磁力搅拌的转速为200～300rpm。
作进一步优化，所述真空干燥时间为4～8h，温度为90～100℃，压力为-95～-80KPa。
作进一步优化，所述制备填充剂的步骤具体为：
首先将纳米棒状羟基磷灰石的改性后制得的改性纳米棒状羟基磷灰石粉碎成羟基磷灰石颗粒，然后将羟基磷灰石颗粒与胶原蛋白粉采用钴60进行辐照灭菌；再将50～80重量份的灭菌后的胶原蛋白粉均分为4～6次与灭菌注射水分批交替加入到反应釜中、灭菌注射水总用量为1000～1200重量份，然后密封反应釜，均匀持续搅拌，搅拌总共时间为20～30h；搅拌完成后再加入200～300重量份经灭菌后的羟基磷灰石颗粒、持续搅拌3～4h；最后采用灌装机将搅拌后得到的注射填充材料灌入注射器中，灭菌、备用。
作进一步优化，所述羟基磷灰石颗粒粒径控制在20～30μm。
作进一步优化，所述搅拌的转速为150～200rpm。
本发明具有如下技术效果：
本发明通过采用相对高温以及高压的水热反应、同时配合十八烷基二甲基苄基氯化铵作为阳离子表面活性剂，实现了羟基磷灰石的溶解、重结晶，得到了分散性好、不易团聚、光滑的纳米棒状结构；同时通过酸性溶液实现晶体表面的溶解重结晶平衡，配合碳酸氢铵的逐步扩散，实现纳米棒状的羟基磷灰石表面出现二次成核和生长，从而得到均匀、多孔、光滑的纳米棒状结构；相比颗粒状结构的羟基磷灰石，本发明得到的纳米棒状结构的羟基磷灰石具有更高的吸附性能、会暴露出更多的活性位点，更能满足各种生物活性物质的高载活性成分的需求。
本发明还通过硅烷偶联剂作为活性桥接剂，配合特定pH值的磷酸溶液、磁力搅拌以及特定温度的回流反应进行水解，实现羟基磷灰石的改性，使得羟基磷灰石和有机物形成稳定结构，从而进一步避免了羟基磷灰石的团聚而分布不均匀，同时避免了注射后的组织中存在硬结的问题。
本发明提供的改性纳米棒状羟基磷灰石材料机械强度较高，注射后可见成骨现象，且注射后能达到最自然的效果，组织柔软、无硬结。
附图说明
图1为本发明羟基磷灰石以硅烷偶联剂改性的化学反应式图。
图2为本发明实施例与对比例的吸附率对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法，其特征在于：
1、纳米棒状羟基磷灰石的制备：
101、首先将15重量份的Ca(NO3)2、8重量份的(NH4)2HPO3分别置于盛有200重量份的去离子水的容器中搅拌溶解，然后将两种溶解后的溶液混合并进行转速为500rpm的高速搅拌、得到白色乳浊液；
102、然后加入0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至10后，再加入5重量份的十八烷基二甲基苄基氯化铵、持续搅拌15min；
103、将搅拌混合后的悬浮液进行压力为0.5MPa的高压以及温度为50℃的水热处理4h；
104、水热处理后冷却至室温、进行离心分离并用去离子水洗涤至中性，得到羟基磷灰石粗品；
105、将羟基磷灰石粗品溶解于pH值为5的磷酸溶液中、磷酸溶液的用量为500重量份，持续搅拌15min，再将搅拌后的溶液与30重量份的碳酸氢氨放置在同一个密闭的容器中，首先加热到52℃、反应2h；再加热到59℃、反应16h；最后加热到63℃、反应2h；
106、离心收集样品，然后用15重量份的去离子水与15重量份的乙醇交替冲洗，冲洗总次数为5次，最后冷冻干燥，冷冻干燥温度为-20℃、压力为-90KPa、时间为24h，得到纳米棒状羟基磷灰石。
2、纳米棒状羟基磷灰石的改性：
201、首先将步骤106中得到的纳米棒状羟基磷灰石、用量为5重量份加入pH值为5、用量80重量份的磷酸溶液中、再加入0.05重量份硅烷偶联剂，磁力搅拌30min、磁力搅拌转速为200rpm；
202、磁力搅拌后升温至70℃并保持、进行回流反应5h，回流反应结束后降温至25℃、调节pH值至中性、离心分离；
203、将离心分离后所得的固体重新分散至去离子水中，升温至70℃并保持、进行回流反应10min，再次降温至25℃、调节pH值至中性、进行二次离心分离；
204、最后将二次离心分离后的固体采用真空干燥，真空干燥时间为4h，温度为90℃，压力为--80KPa，即得改性纳米棒状羟基磷灰石。
3、制备填充剂：
301、首先将步骤204中制得的改性纳米棒状羟基磷灰石粉碎成羟基磷灰石颗粒、颗粒粒径控制在20μm，然后将羟基磷灰石颗粒与胶原蛋白粉采用钴60进行辐照灭菌；
302、将50重量份的灭菌后的胶原蛋白粉均分为4次与灭菌注射水分批交替加入到反应釜中、灭菌注射水总用量为1000重量份(灭菌注射水也均分)，然后密封反应釜，均匀持续搅拌，搅拌总共时间为20h，搅拌的转速为150rpm；
303、搅拌完成后再加入步骤301中200重量份的羟基磷灰石颗粒、持续搅拌3h，搅拌的转速为150rpm；
304、最后采用灌装机将搅拌后得到的注射填充材料灌入注射器中，灭菌、备用。
除方案中另有限定，本发明中搅拌过程的搅拌速率均在100～300rpm范围内。
实施例2：
一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法，其特征在于：
1、纳米棒状羟基磷灰石的制备：
101、首先将18重量份的Ca(NO3)2、11重量份的(NH4)2HPO3分别置于盛有225重量份的去离子水的容器中搅拌溶解，然后将两种溶解后的溶液混合并进行转速为550rpm的高速搅拌、得到白色乳浊液；
102、然后加入0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至11后，再加入8重量份的十八烷基二甲基苄基氯化铵、持续搅拌10min；
103、将搅拌混合后的悬浮液进行压力为0.8MPa的高压以及温度为60℃的水热处理10h；
104、水热处理后冷却至室温、进行离心分离并用去离子水洗涤至中性，得到羟基磷灰石粗品；
105、将羟基磷灰石粗品溶解于pH值为4的磷酸溶液中、磷酸溶液的用量为600重量份，持续搅拌18min，再将搅拌后的溶液与40重量份的碳酸氢氨放置在同一个密闭的容器中，首先加热到55℃、反应2.5h；再加热到60℃、反应20h；最后加热到65℃、反应2.5h；
106、离心收集样品，然后用18重量份的去离子水与18重量份的乙醇交替冲洗，冲洗总次数为7次，最后冷冻干燥，冷冻干燥温度为-25℃、压力为-92KPa、时间为27h，得到纳米棒状羟基磷灰石。
2、纳米棒状羟基磷灰石的改性：
201、首先将步骤106中得到的纳米棒状羟基磷灰石、用量为12重量份加入pH值为4、用量110重量份的磷酸溶液中、再加入0.5重量份硅烷偶联剂，磁力搅拌35min、磁力搅拌转速为250rpm；
202、磁力搅拌后升温至78℃并保持、进行回流反应7h，回流反应结束后降温至28℃、调节pH值至中性、离心分离；
203、将离心分离后所得的固体重新分散至去离子水中，升温至78℃并保持、进行回流反应15min，再次降温至28℃、调节pH值至中性、进行二次离心分离；
204、最后将二次离心分离后的固体采用真空干燥，真空干燥时间为6h，温度为95℃，压力为-88KPa，即得改性纳米棒状羟基磷灰石。
3、制备填充剂：
301、首先将步骤204中制得的改性纳米棒状羟基磷灰石粉碎成羟基磷灰石颗粒、颗粒粒径控制在25μm，然后将羟基磷灰石颗粒与胶原蛋白粉采用钴60进行辐照灭菌；
302、将65重量份的灭菌后的胶原蛋白粉均分为5次与灭菌注射水分批交替加入到反应釜中、灭菌注射水总用量为1100重量份(灭菌注射水也均分)，然后密封反应釜，均匀持续搅拌，搅拌总共时间为25h，搅拌的转速为180rpm；
303、搅拌完成后再加入步骤301中250重量份的羟基磷灰石颗粒、持续搅拌3.5h，搅拌的转速为180rpm；
304、最后采用灌装机将搅拌后得到的注射填充材料灌入注射器中，灭菌、备用。
除方案中另有限定，本发明中搅拌过程的搅拌速率均在100～300rpm范围内。
实施例3：
一种改性羟基磷灰石整形材料的制备方法，其特征在于：
1、纳米棒状羟基磷灰石的制备：
101、首先将20重量份的Ca(NO3)2、15重量份的(NH4)2HPO3分别置于盛有250重量份的去离子水的容器中搅拌溶解，然后将两种溶解后的溶液混合并进行转速为600rpm的高速搅拌、得到白色乳浊液；
102、然后加入0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至12后，再加入11重量份的十八烷基二甲基苄基氯化铵、持续搅拌25min；
103、将搅拌混合后的悬浮液进行压力为1MPa的高压以及温度为70℃的水热处理16h；
104、水热处理后冷却至室温、进行离心分离并用去离子水洗涤至中性，得到羟基磷灰石粗品；
105、将羟基磷灰石粗品溶解于pH值为3的磷酸溶液中、磷酸溶液的用量为700重量份，持续搅拌20min，再将搅拌后的溶液与50重量份的碳酸氢氨放置在同一个密闭的容器中，首先加热到58℃、反应3h；再加热到62℃、反应24h；最后加热到66℃、反应3h；
106、离心收集样品，然后用20重量份的去离子水与20重量份的乙醇交替冲洗，冲洗总次数为10次，最后冷冻干燥，冷冻干燥温度为-30℃、压力为-95KPa、时间为30h，得到纳米棒状羟基磷灰石。
2、纳米棒状羟基磷灰石的改性：
201、首先将步骤106中得到的纳米棒状羟基磷灰石、用量为20重量份加入pH值为3、用量150重量份的磷酸溶液中、再加入1重量份硅烷偶联剂，磁力搅拌40min、磁力搅拌转速为300rpm；
202、磁力搅拌后升温至85℃并保持、进行回流反应8h，回流反应结束后降温至30℃、调节pH值至中性、离心分离；
203、将离心分离后所得的固体重新分散至去离子水中，升温至85℃并保持、进行回流反应20min，再次降温至30℃、调节pH值至中性、进行二次离心分离；
204、最后将二次离心分离后的固体采用真空干燥，真空干燥时间为8h，温度为100℃，压力为-95KPa，即得改性纳米棒状羟基磷灰石。
3、制备填充剂：
301、首先将步骤204中制得的改性纳米棒状羟基磷灰石粉碎成羟基磷灰石颗粒、颗粒粒径控制在30μm，然后将羟基磷灰石颗粒与胶原蛋白粉采用钴60进行辐照灭菌；
302、将80重量份的灭菌后的胶原蛋白粉均分为6次与灭菌注射水分批交替加入到反应釜中、灭菌注射水总用量为1200重量份(灭菌注射水也均分)，然后密封反应釜，均匀持续搅拌，搅拌总共时间为30h，搅拌的转速为200rpm；
303、搅拌完成后再加入步骤301中300重量份的羟基磷灰石颗粒、持续搅拌4h，搅拌的转速为200rpm；
304、最后采用灌装机将搅拌后得到的注射填充材料灌入注射器中，灭菌、备用。
除方案中另有限定，本发明中搅拌过程的搅拌速率均在100～300rpm范围内。
对比例1：
在室温下，将0.3g磷酸肌酸(C4H8N3O5PNa2·4H2O)溶于40毫升室温的去离子水中形成A液，将0.4g乳酸钙(CH3CHOHCOO2Ca·5H2O)溶于20毫升60℃的去离子水中形成B液。取A液和B液混合，磁搅拌20分钟后，将该澄清混合溶液转入反应釜中(容量为60毫升)，在120℃下反应4小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物并离心分离，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，制得由纳米棒组装而成的羟基磷灰石材料。然后进行实施例1中的步骤2纳米棒状羟基磷灰石的改性以及步骤3制备填充剂，得到产品。
对比例2：
在室温下，将0.3g磷酸肌酸(C4H8N3O5PNa2·4H2O)溶于40毫升室温的去离子水中形成A液，将0.4g乳酸钙(CH3CHOHCOO2Ca·5H2O)溶于20毫升60℃的去离子水中形成B液。取A液和B液混合，磁搅拌20分钟后，将该澄清混合溶液转入反应釜中(容量为60毫升)，在120℃下反应4小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物并离心分离，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，制得由纳米棒组装而成的羟基磷灰石材料。直接进行实施例2中的步骤3制备填充剂，得到产品。
团聚测试：将本发明实施例1与对比例1、对比例2分别进行自然静置，观察沉淀情况：
由实验结果可以看出，本发明制备得到的改性纳米棒状羟基磷灰石材料分散性好、不容易产生团聚现象，静置超过1天后仍没有团聚后的沉淀产生，主要是因为羟基磷灰石形成纳米棒状结构时为单向增长且通过改性使其无机物与有机物形成稳定、有机物包裹无机物的结构。
吸附率测试：将本发明实施例2制得的填充剂与对比例1制得的填充剂吸附相同蛋白质，其吸附率如图2；由图2可知，本发明改性后的羟基磷灰石吸附率远远大于常规方法制备得到的羟基磷灰石。这是由于本发明采用相对高温以及高压的水热反应、同时配合十八烷基二甲基苄基氯化铵作为阳离子表面活性剂，实现了羟基磷灰石的溶解、重结晶以及单向增长，同时通过酸性溶液实现晶体表面的溶解重结晶平衡，配合碳酸氢铵的逐步扩散，实现纳米棒状的羟基磷灰石表面出现二次成核和生长，从而得到均匀、多孔、光滑的纳米棒状结构；该结构会暴露出更多的活性位点，从而具有更强的吸附率。
