一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于组织工程和再生医学领域，具体涉及一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用，特别是可用于骨缺损的修复治疗。
背景技术
骨缺损是指由于创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等造成的骨结构完整性被破坏的疾病，是临床上常见的症状。通常，严重的骨缺损无法自行愈合和修复，必须借助骨修复材料才能得到有效的恢复。据统计，在全球范围内，每一年需要进行骨移植手术的患者超过2200万，手术费用超25亿美元；而在中国每年因骨缺损或骨折所需要进行移植手术的患者数量可达到300万以上。
干细胞是骨缺损治疗和修复的种子，起到生成骨的作用。然而移植的干细胞通常在损伤部位的微环境下难以定向诱导分化进行主动修复。因此，联合外源的生长因子作为干细胞分化的指导者，促进种子干细胞对骨损伤进行修复格外重要。
目前研究较多的生物支架材料有壳聚糖、胶原和丝素蛋白等。其中，壳聚糖是一种带正电的天然碱性多糖，由于其具备优良的生物相容性，生物降解性，无免疫原性以及抗细菌和真菌的特性，而被广泛应用于组织工程当中。天然的生物衍生材料可制备成多种形式应用于骨缺损修复中。例如凝胶、微球、海绵、薄膜和静电纺丝等。其中，水凝胶具有与天然ECM 最为相似的结构。可注射水凝胶可以直接注射到患处无需手术过程，最大限度减少了手术创伤，提高了患者的舒适度；其次，水凝胶可以适应各种损伤环境，随着伤口形状大小的改变而改变，避免了因不规则形状造成的机体损伤；再者，载药水凝胶持续缓慢释放药物不仅降低了给药次数和药物副作用，同时提高治疗靶向性。但是，传统的水凝胶遇到了一些应用的挑战，如注入后的机械力的变化会导致支架变形甚至破坏，赋予水凝胶自愈能力可保持其结构和功能完整性。
发明内容
针对现有技术上存在的不足，本发明的首要目的是提供一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。本发明的第二个目的是提供上述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的用途。
因此，本发明提供以下各项：
1.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；
2)制备壳聚糖微球的溶液，在所述壳聚糖微球的溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；
3)以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；和
4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与bFGF混合，再与步骤2)中制备的含有TGFβ3的壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。
2.根据以上1所述的方法，其中在步骤1)中，将壳聚糖水溶液作为水相，将石油醚、液体石蜡、Span80、或它们的混合物作为油相，在搅拌下将所述水相加入所述油相，加入戊二醛交联，获得壳聚糖微球。
3.根据以上1所述的方法，其中在步骤2)中，所述壳聚糖微球含有包括TGFβ3或其他活性因子中的一种或几种的组合。
4.根据以上1所述的方法，其中在步骤3)中，所述自愈合水凝胶的制备方法如下：称取壳聚糖谷氨酸盐(CSG)粉末，于pH为7.4的PBS 溶液中搅拌使其完全溶解，然后将其转移至含pH为7.4的PBS溶液的透析袋中透析至获得的壳聚糖谷氨酸盐溶液pH至6.8，室温保存备用；同时，称取四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)粉末在超纯水中溶解完全，-20℃下保存备用；最后将配置好的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)溶液混合，得到自愈合水凝胶。
5.根据以上4所述的方法，其中所述壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液与四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)溶液的体积比为1：0.01-1：1(例如，1:0.025、 1:0.05和1:0.1)，壳聚糖谷氨酸盐溶液的质量体积浓度为5-50％，PEG-BA 溶液的质量体积浓度为1-30％。
6.根据以上1所述的方法，其中在步骤4)中，所述自愈合水凝胶包括bFGF或其他活性因子(例如血小板衍化生长因子(PDGF))中的一种或几种的组合。
7.根据以上1所述的方法，其中在水凝胶中壳聚糖微球的浓度为 0.1-10mg/mL(诸如0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0mg/mL)。
8.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶，其包括：1)含有bFGF或其他活性因子中的一种或几种的组合的、以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料采用Schiff碱反应制备的自愈合水凝胶；和2)分散在1)中所述的自愈合水凝胶中的壳聚糖微球，所述壳聚糖微球含有TGFβ3或其他活性因子中的一种或几种的组合。
9.根据以上8所述的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶，其可通过根据以上1-7中任一项所述的方法制备。
10.根据以上8或9所述的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶在制备用于骨损伤(例如牙齿损伤，牙槽骨损伤)修复的药物中的应用，任选地/ 优选地所述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶与牙周膜干细胞(hPDLSCs) 联合使用用于修复牙槽骨损伤。
发明详述
本发明人通过深入研究，发现不同生长因子在人牙周膜干细胞 (hPDLSCs)成骨分化的过程中具有时空特异性，即bFGF促进其增殖和干性维持，TGFβ3促进其成骨分化，为此设计了一种次序释放bFGF和 TGFβ3的自愈合水凝胶，原位注射于牙槽骨缺损部位，通过序贯释放不同生长因子来修复损伤的牙槽骨组织，为牙周组织工程领域的基础研究提供一种新的解决方案和修复手段。
具体技术方案如下：
一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于：其步骤包括：
1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；
2)在壳聚糖微球溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；
3)以壳聚糖谷氨酸盐和四臂聚乙二醇苯甲醛为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；
4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与一定量的bFGF混合，再与步骤2)中的含有TGFβ3壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。
壳聚糖是一种带正电的天然碱性多糖，由于其具备优良的生物相容性、生物降解性、无免疫原性以及抗细菌和真菌的特性，而被广泛应用于组织工程当中。bFGF释放，可以促进细胞增殖、促进血管生长和发育，为后续修复过程提供充足的营养物质，TGFβ3可以诱导原始的间充质干细胞迁移，同时在bFGF的辅助作用下，可促进间充质干细胞成骨分化。
与传统水凝胶不同的是，自愈合水凝胶可凭借自愈性能最大化的避免包埋的药物分子泄露。此外，微球载体因其性质稳定，生物相容性好，可以负载各种药物(尤其是生物活性易丢失的多肽及蛋白类药物)，在体内通过缓慢降解，延长药物作用时间。本发明中，以壳聚糖为原料，结合凝胶和微球两种药物载体的优势，设计了一种可以序贯释放生长因子的凝胶体系。将TGFβ3载于微球中，载TGFβ3壳聚糖微球又悬浮于含bFGF的自愈合的水凝胶系统中，早期快速释放bFGF来促进细胞增殖和微小血管的生成，再利用壳聚糖微球降解缓慢的特性持久释放TGFβ3，前期低浓度募集间充质干细胞，后期高浓度刺激干细胞成骨分化。
优选地，步骤1)中所述乳液法制备壳聚糖微球的制备工艺如下：
用5mL注射器取1-5％的壳聚糖溶液1-10mL作为水相；取石油醚 (0-30mL)、液体石蜡(0-30mL)、span80(0-3mL)混合作为油相。将水相用5ml注射器逐滴加入油相中，边加边搅拌。0-10h后用1mL注射器分三次加入5-50％的戊二醛，每次0-5mL，交联1～10h，静置过夜后去掉上清。最后用石油醚、甲醇、乙醇和超纯水洗涤，每种溶液洗涤至少2次，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后得到壳聚糖微球。
优选地，步骤2)中所述壳聚糖微球，其中含有的活性因子为TGFβ3 或其他活性因子中的一种或几种的组合。
优选地，步骤3)中，所述的自愈合水凝胶的制备方法如下：称取一定量的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)粉末，于pH为7.4的PBS溶液中搅拌使其完全溶解，然后将其转移至含pH为7.4的PBS溶液的透析袋中透析至壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液pH至6.8，室温保存备用。同时，称取一定量的四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)粉末在超纯水中溶解完全，-20℃下保存备用。最后将配置好的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液和PEG-BA溶液按照一定的比例混合，得到不同配比的自愈合水凝胶。
优选地，步骤4)中所述自愈合水凝胶可与bFGF或其他活性因子中的一种或多种混合。且其中负载活性因子的壳聚糖微球将其中负载的活性因子与外界的含有活性成分的自愈合水凝胶体系相阻隔，形成了一个内室结构，可以达到序贯释放不同生长因子的目的。
优选地，上述壳聚糖谷氨酸盐(CSG)与PEG-BA的体积比为1：0.01-1： 1，壳聚糖谷氨酸盐的质量体积浓度为5-50％，PEG-BA的质量体积浓度为 1-30％。壳聚糖微球的浓度为0.1-10mg/mL。自愈合水凝胶中壳聚糖谷氨酸盐(CSG)、PEG-BA以及壳聚糖微球的最优体积比是通过凝胶化时间、流变特性、SEM、溶胀性能、体外降解性能研究、凝胶的力学性能以及凝胶的自愈合能力等进行表征进行筛选的。
本发明的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶可用于骨损伤修复的原位注射，通过序贯释放不同生长因子(bFGF和TGFβ3)来修复损伤的骨组织。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
本发明中所涉及到的活性因子bFGF和TGFβ3具有时空特异性，并根据这一发现设计了一种载双因子的自愈合水凝胶来实现修复损伤骨组织目的。在此设计中，bFGF置于水凝胶外层，先行释放；TGFβ3包裹于微球内再混悬水凝胶中，在后期释放。此水凝胶具有自愈的特性，方便口腔狭小空间的注射给药。
本发明制备的自愈合水凝胶具有良好的生物相容性和自愈合性能，同时可以实现多种生长活性因子的贯序释放，可应用于骨组织工程等领域。
本发明的原料来源广泛，均可工业化生产，且本发明的制备方法简单方便，较容易实现推广的价值。
附图说明
图1为本发明的壳聚糖微球(CM)的形貌外观以及粒径分布图。A 为CM在扫描电镜下的形貌。B为CM的粒径分布。
图2为CM的载药性能研究。A.在不同浓度BSA溶液中，CM的蛋白吸附量；B.在350μg/mL TGFβ3蛋白溶液中，CM的蛋白吸附量。
图3为不同浓度自愈合水凝胶的扫描电镜图。A-F依次为1％CSG， 1％CSG+CM，2％CSG，2％CSG+CM，3％CSG，3％CSG+CM。其中，A1-F1是水凝胶上表面结构照片，A2-F2是横切面结构照片，A3-F3 是水凝胶纵切面结构照片。微球的浓度为5mg/mL。
图4为自愈合凝胶的可注射性和自愈合能力测试。A-B.用1mL注射器检测自愈合水凝胶的可注射性性能测试。C-D.在自愈合水凝胶中加入不同颜色的染料，切碎后再组合观察，观察到可重新胶凝，即具备自愈合能力。
图5为自愈合水凝胶的体外释放曲线。
图6为载TGFβ3微球自愈合水凝胶诱导成骨分化实验。载TGFβ3微球和hPDLSCs的自愈合水凝胶在成骨诱导培养基中培养7天，14天进行碱性磷酸酶染色。图中标尺为200μm。
图7为MTT检测自愈合水凝胶浸提液培养hPDLSCs细胞24h，48h， 72h的生长情况。
图8为自愈合水凝胶体内相容性研究及体内降解情况。A.自愈合水凝胶在SD大鼠皮下埋植7天，14天，28天，42天后取材拍照；B.自愈合水凝胶的体内降解情况。A中的标尺为1cm。
图9为各组水凝胶局部注射到牙周膜内牙槽骨缺损部位后1周和6 周Micro-CT图。正常组，不做任何处理；模型组，造模后不给予任何处理；空白凝胶组，造模后，给予不载TGFβ3的自愈合凝胶；低剂量组，造模后，给予载1μg/mL TGFβ3微球的自愈合凝胶；高剂量组，造模后，给予载4μg/mL TGFβ3微球的自愈合凝胶。a-e各组给药1周后大鼠牙槽骨Micro-CT图；f-j各组给药6周后大鼠牙槽骨Micro-CT图。
图10.多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备示意图及药物释放示意图。
具体实施方案
本发明提出了一种载双因子的自愈合水凝胶来实现骨组织损伤修复的目的，其中，bFGF置于水凝胶外层，先行释放，可以促进细胞增殖和微血管的生成；TGFβ3包裹于微球内再混悬水凝胶中，在后期释放，能够刺激干细胞向成骨分化。制备方法简单方便，在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
转化生长因子-β是一个多肽生物因子超家族，在胚胎发育、骨改建、细胞增殖分化等方面起到重要的作用。研究发现，BMP-2和TGF-β3能显著上调骨特异性标志物RUNX-2和OSX的表达水平，且TGF-β3可增强BMP-2的成骨功能，认为TGF-β3可能是促进骨形成的启动因子。同时 TGF-β3是一种同源双链多肽蛋白，在骨组织中含量丰富，它可以促进干细胞的有丝分裂和蛋白合成，下调ALP活性、OC的合成、矿化结节的形成等成骨表型的表达。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，具体步骤包括：
壳聚糖微球的制备：
乳液法制备壳聚糖微球的具体制备工艺如下：用5mL注射器取1-5％的壳聚糖溶液1-10mL作为水相；取石油醚(0-30mL)、液体石蜡(0-30 mL)、Span80(0-3mL)混合作为油相。将水相用5ml注射器逐滴加入油相中，边加边搅拌。0-10h后用1mL注射器分三次加入5-50％的戊二醛，每次0-5mL，交联1～10h，静置过夜后去掉上清。最后用石油醚、甲醇、乙醇和超纯水洗涤，每种溶液洗涤至少2次，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后得到壳聚糖微球
负载(含有)TGFβ3壳聚糖微球的制备：
将上述制备的壳聚糖微球颗粒加入至PBS溶液中，涡旋使其充分溶解，离心除去上清，加入一定量的TGFβ3溶液，37℃。下恒温震荡吸附，即可得到负载TGFβ3的壳聚糖微球。
自愈合水凝胶的制备：
称取一定量的壳聚糖谷氨酸盐粉末，于pH为7.4的PBS溶液中搅拌使其完全溶解，然后将其转移至含pH为7.4的PBS溶液的透析袋中透析至壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液pH至6.8，室温保存备用。同时，称取一定量的四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)粉末在超纯水中溶解完全，-20℃下保存备用。最后将配置好的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液和PEG-BA溶液按照一定的比例混合，得到不同配比的自愈合水凝胶。
负载bFGF自愈合水凝胶的制备：
在上述制备的不同比例的自愈合水凝胶凝胶化完成前，将一定量的 bFGF加入其中，涡旋使其混合均匀。即可得到负载bFGF的自愈合水凝胶。
本发明的另一目的是提供一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的应用。
本发明提供了一种通过序贯释放不同生长因子用以修复损伤的骨组织的自愈合水凝胶的应用，具体步骤包括：
(1)多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备：多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法根据本发明所提供的一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法进行；
(2)骨损伤部位的准备：无菌条件下用尖头手术刀切开上颌门牙左侧牙龈，轻轻翻开龈瓣，暴露牙槽骨骨面后，用牙科钻钻孔，间歇性磨除，低速、喷水，防止骨坏死，最后使其达到手术标准统一为直径2mm，深度1mm的球形缺损。
(3)多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的移植：通过外科手术的方式将与上述步骤(1)中制备的与牙槽骨缺损部位大小适中的自愈合水凝胶移植到步骤(2)中的牙槽骨缺损部位，缝合伤口、固定自愈合水凝胶得移植部位、消毒；
(4)多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶对牙槽骨损伤的治疗和修复效果的鉴定：通过Micro-CT、自愈合水凝胶体内的相容性研究来评价牙槽骨损伤修复的效果。
本发明针对在骨组织缺损和重建方面存在的问题，采用负载TGFβ3的壳聚糖微球与负载bFGF的自愈合水凝胶进行混合的方法制备了具有多功能改性壳聚糖的自愈合水凝胶，具有良好的生物相容性、自愈合性以及可注射性，并且能够实现序贯释放不同生长因子用以修复损伤的牙槽骨组织。本发明属于骨组织工程和再生医学技术领域，在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
实施例
本发明提供的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶所用试剂、材料或仪器均可由市场购得，除非另外指出或明显矛盾，百分比为重量百分比。
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案，实施例仅为了更好地理解本发明而不限制本发明的范围。
不限于具体理论，本发明人发现，bFGF和TGFβ3在hPDLSCs成骨分化过程中具有时空特异性，即bFGF促进其增殖和干性维持，TGFβ3促进其成骨分化。鉴于上述发现，发明人以壳聚糖为原料，结合凝胶和微球两种药物载体的优势，设计了一种可以序贯释放生长因子的凝胶体系。将 TGFβ3载于微球中，载TGFβ3壳聚糖微球又悬浮于含bFGF的水凝胶系统中，预期其在早期快速释放bFGF来促进细胞增殖和微小血管的生成，再利用壳聚糖微球降解缓慢的特性持久释放TGFβ3，前期低浓度募集间充质干细胞，后期高浓度刺激干细胞成骨分化。
实施例1
负载TGFβ3壳聚糖微球的制备
具体步骤如下
采用乳化法制备微球，用5mL注射器取2％的壳聚糖(Mw＝200万，郑州科瑞精细化工)溶液5mL作为水相；取石油醚(10mL，天津科密欧化学试剂有限公司)、液体石蜡(14mL，天津科密欧化学试剂有限公司)、 Span 80(0.74mL)混合作为油相。将水相用5ml注射器逐滴加入油相中，边加边搅拌。
1-2h后用1mL注射器分三次加入25％的戊二醛，每次1.5mL，交联 3～4h，静置过夜后去掉上清。
最后用石油醚、甲醇、乙醇和超纯水洗涤，每种溶液洗涤至少2次，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后得到壳聚糖微球，显微镜观察。
将上述制备的20mg的壳聚糖微球颗粒加入至PBS溶液中，涡旋使其充分溶解，离心除去上清，加入一定量的TGFβ3(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司提供)溶液，37℃。下恒温震荡吸附，即可得到负载TGFβ3的壳聚糖微球。
图1结果表明壳聚糖微球(CM)颗粒呈完整的球形，表面相对光滑，结构较为紧密，但是有些位置表面有褶皱，并且也有一些微球碎片，这可能与微球制备过程中机械搅拌和冷冻干燥有关的。CM的粒径分布柱状统计图如图1中B所示，制备的微球的粒径分布均匀。微球粒径主要分布在 10～60μm之间，其中分布在20～30μm之间的微球数量最多。如图2， A所示，CM对BSA吸附量随时间的变化。图2，B为CM对TGFβ3的吸附，结果表明，CM对TGFβ3的吸附量为23.53±0.41μg/mg。
壳聚糖微球的载药实验
精确称取20mg的壳聚糖微球粉末，加入PBS缓冲液后，涡旋使其充分溶胀，离心去除上清，加入一定浓度的BSA溶液，37℃恒温振荡吸附，到达预定时间(l，3，6，12，24，36，48，60，72，96h)后，离心分离取上清，BCA试剂盒(Sigma，美国)测定吸附后BSA溶液中的蛋白含量。以 BSA原液作为对照，计算微球载药量。
载TGFβ3微球的制备：根据上述方法，将BSA蛋白溶液更换为TGFβ3 蛋白溶液。
实施例2
负载TGFβ3丝胶微球的制备
具体步骤如下
采用乳化法制备微球，用5mL注射器取2％的丝胶溶液5mL作为水相；取石油醚(10mL)、液体石蜡(14mL)、Span80(0.74mL)混合作为油相。将水相用5ml注射器逐滴加入油相中，边加边搅拌。
1-2h后用1mL注射器分三次加入25％的戊二醛，每次1.5mL，交联 3～4h，静置过夜后去掉上清。
最后用石油醚、甲醇、乙醇和超纯水洗涤，每种溶液洗涤至少2次，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后得到丝胶微球，显微镜观察。
将上述制备的20mg的丝胶微球颗粒加入至PBS溶液中，涡旋使其充分溶解，离心除去上清，加入一定量的TGFβ3溶液，37℃。下恒温震荡吸附，即可得到负载TGFβ3的丝胶微球。
实施例3
负载BMP-2壳聚糖微球的制备
具体步骤如下
采用乳化法制备微球，用5mL注射器取2％的壳聚糖溶液5mL作为水相；取石油醚(10mL)、液体石蜡(14mL)、Span80(0.74mL)混合作为油相。将水相用5ml注射器逐滴加入油相中，边加边搅拌。
1-2h后用1mL注射器分三次加入25％的戊二醛，每次1.5mL，交联 3～4h，静置过夜后去掉上清。
最后用石油醚、甲醇、乙醇和超纯水洗涤，每种溶液洗涤至少2次，将洗涤后的沉淀冷冻干燥后得到壳聚糖微球，显微镜观察。
将上述制备的20mg的壳聚糖微球颗粒加入至PBS溶液中，涡旋使其充分溶解，离心除去上清，加入一定量的BMP-2溶液，37℃。下恒温震荡吸附，即可得到负载BMP-2的壳聚糖微球。
实施例4
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备
具体步骤如下
1)称取3g的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)(武汉远城科技发展有限公司) 粉末，将其加入到100mL pH为7.4的PBS溶液中，搅拌器搅拌过夜使其完全溶解；
2)使用MW＝3000Da的透析袋，透析液为pH为7.4的PBS透析，CSG 溶液pH为6.8左右，室温密封保存。
3)精确称取200mg PEG-BA(芜湖芃硕生物科技有限公司)粉末，溶解于1mL超纯水中，涡旋振荡使其充分溶解，-20℃保存备用。
4)将配置好的CSG用PBS稀释为1％，2％，3％的浓度，CSG与PEG-BA (20％)溶液的体积比分别为1:0.025、1:0.05和1:0.1，混合后得到不同比例的水凝胶。
将100μg的bFGF(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司提供)或血小板衍化生长因子(100μg PDGF)(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司提供)加入步骤4)中，涡旋使其混合均匀。即可得到负载bFGF或PDGF的自愈合水凝胶。
将负载bFGF或PDGF的自愈合水凝胶与实施例1中的负载TGFβ3或 BMP-2壳聚糖微球混合得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。
如图3所示，3％CSG浓度条件下制备的水凝胶表面的山脊状突起相对较少一些，随着CSG浓度的降低，凝胶表面的山脊状突起增多但比较脆弱，表面孔径相对较大，随着CSG的增大，水凝胶内部形成的片层变厚，片层之间结合增多，2％CSG浓度时水凝胶内形成的片层有所变厚，片层间存在较多的结合点，凝胶内部碎片变少且内部网孔分布较为均匀； 3.0％CSG浓度时水凝胶内形成的片层进一步变厚,片层间结合更加紧密，但是内部网孔大小不均。另外，从加入微球的组别中可以看到，1％CSG，微球分布不太均匀，而2％和3％CSG中微球分布较为均匀，这对于微球中药物释放是有利的。图4是对水凝胶自愈合能力的评估，在浸入少量PBS 溶液后1h后用镊子夹起水凝胶，发现拼接后的水凝胶不发生脱落分离。产生自愈合的原因可能是水凝胶中发生Schiff碱反应，又交联在一起。因此，可以得出结论，将此种水凝胶植入牙槽骨缺损中以进一步使用后，若由于外力的原因导致材料形态破碎，断裂，材料后续又会实现自愈，继续承担治疗和修复的任务。图5中是利用ELISA试剂盒(酶免试剂盒，江苏酶免实业有限公司)对bFGF和TGFβ3的体外释进行测定(TGFβ3浓度为4μg/ml、bFGF浓度为100ng/ml、CSG浓度为最优配比2％、CSG： PEG-BA＝1:0.05)，在整个释放试验的7天中，bFGF和TGFβ3释放量分别为总负载量的87.3％±2.7％和40.0％±4.8％。包裹于凝胶的bFGF在12h 已经检测到释放，释放量占总量的4.7％±1.2％，在随后的6天中缓慢持续释放了约82.6％；TGFβ3被层层包裹，在36h时才检测到其释放，释放量占总量的4.3％±2.3％，在7天时释放量达到40.0％±4.8％，这意味着仍有大量的TGFβ3残留于水凝胶中。总的来说，包裹于凝胶中的bFGF快速释放，而处于微球和凝胶双层包裹的TGFβ3的释放速率远低于bFGF的释放速率，初步达到了我们次序释放的目的。
实施例5
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶诱导hPDLSCs向成骨分化的研究
1)取第5代的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)细胞(细胞提取方法参见： [1]刘焱,陈青宇,高翔,高俊武.胶原蛋白支架对载杜仲叶提取物处理的人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的作用[J].中国组织工程研究,2020,24(16):2537-2543.[2]张洁.Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨中的作用及转导机制[J].浙江实用医学.2018,23(5)：313-316)，胰酶消化制成6×106/mL细胞悬液。
2)在无菌条件下，按照实施例1中的方法制备负载不同浓度的 TGFβ3的壳聚糖微球；
3)按照实施例4中的方法制备浓度为2％的CSG，CSG与PEG-BA (20％)溶液的体积比分别为1:0.05；
4)将50μL细胞悬液的加入到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶体系中(其中含5mg负载不同浓度TGFβ3溶液、1mL无菌的2％的CSG和 50μL的20％的PEG-BA以及100ng/mL bFGF溶液)后，然后37℃孵育 30min后待其成型后，加入诱导培养基培养。
5)实验分组：空白凝胶组，0.25μg/mL TGFβ3自愈合水凝胶组， 0.50μg/mL TGFβ3自愈合水凝胶组，1.00μg/mL TGFβ3自愈合水凝胶组。培养7天，14天后，按照ALP染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司，中国)的步骤进行染色并拍照。如图6所示，7天时，与对照组相比，载TGFβ3微球的组颜色比较深，并且TGFβ3浓度为1μg/mL时效果比其它组要好。14天的染色结果也表现出同样的趋势。
另外，使用MTT测定法分析hPDLSCs在水凝胶浸提液中(24h、48h、 72h)的细胞存活率，低细胞毒性有利于牙周细胞在水凝胶上的生长和分化。如图7所示，以对照组为1，24h时，所有组别的水凝胶100％浸提液的增殖率均大于1，但与对照组相比没有显著性差异；48h时，1％CSG 的增殖率最高，其它各组，载微球的组比不载微球的组的增殖率要低，各组的增殖率都在85％以上，并且与对照组(control)相比没有显著性差异； 72h的结果与48h相同。总体来说，与对照组相比各组之间无显著性差异，这说明我们的水凝胶无明显细胞毒性。
实施例6
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶体内相容性研究
具体步骤如下：
取72只体重220±20g的SD大鼠，3％的戊巴比妥钠麻醉后.，在大鼠背部靠近脊椎部位剃毛，然后按照分组分别在左右两侧皮下注射100μL 的水凝胶材料。实验分组：1％CSG组，2％CSG组，3％CSG组，1％ CSG+CM组，2％CSG+CM组，3％CSG+CM组(n＝12)。在第1周、第 2周、第4周、第6周，收集组织，拍照，并称重记录其重量并作图来考察水凝胶在体内的降解情况。
从图8，A中可以看到，突起状皮丘没有快速消失，说明水凝胶没有被快速吸收，而是缓慢降解，这样水凝胶中的药物可以达到原位释放的目的。另外，皮丘部位颜色正常，未出现红肿、破溃的现象，说明注射部位没有发生明显的炎症反应。从图中可以看到随着时间的延长，水凝胶逐渐缩小，说明大部分水凝胶可以在体内完全降解。并且，将凝胶从体内取出后称重，统计后得到图8，B所示的曲线图。从图中可以发现，1％CSG 浓度组，降解是最快的，在42天时基本完全降解；3％CSG浓度组降解较慢，42天时，还有30％左右未完全降解；2％CSG浓度组降解速度在两者之间，42天时，降解了80％左右。根据不同的骨损伤部位以及不同的骨修复时间，选择不同的自愈合水凝胶浓度，降解速率较快的，如1％或2％的CSG可用于牙槽骨损伤修复，降解速率较慢的，如3％的CSG可以尝试用于颅骨损伤修复。
实施例7
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶对牙槽骨损伤的治疗和修复
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶修复牙槽骨的研究，包括以下步骤：
多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备：按照实施例4中提供的方法制备。
牙槽骨损伤模型构建：配置3％戊巴比妥钠(Sigma，美国)麻醉剂，腹腔注射后，观察SPF级SD大鼠(雄性，购自广东省实验动物中心(合格证号：44007200069979))(大鼠饲养于25℃，湿度(55±10)％的环境中，每天接受光照12h黑暗周期变化，自由饮水进食。实验前适应性喂养1周。此一系列动物实验均得到了暨南大学实验动物伦理委员会的批准) 约5～10min后开始手术。仰卧位固定大鼠，提拉下颌骨使尽量暴露其上颌牙列。无菌条件下用尖头手术刀切开上颌门牙左侧牙龈，轻轻翻开龈瓣，暴露牙槽骨骨面后，用直径为1.5mm的牙科钻钻孔，间歇性磨除，低速、喷水，防止骨坏死，最后使其达到手术标准统一为直径2mm，深度1mm 的球形缺损。用生理盐水清洗伤口，但不缝合伤口，按照分组将大鼠分笼饲养。术后进软食3天，且每只皮下注射100μL抗生素2次。
试验分组：将SD大鼠随机分为4组，每组12只，分笼饲养。a.模型组(自身愈合组，即只造损伤不给药物)；b.空白凝胶组(对照组，只给空白水凝胶)；c.低剂量组(实验组，载100ng/mL bFGF+1μg/mL TGFβ3微球水凝胶组)；d.高剂量组(实验组，载100ng/mL bFGF+4μg/mL TGFβ3 微球水凝胶组)。
取材前，分别在7天，42天时间点，对SD大鼠进行Micro-CT(日立 Micro-CT：LCT200)拍照，观察牙槽骨的修复情况。
如图9所示，模型组牙槽骨缺损部位牙槽骨丧失严重，未见明显恢复；空白凝胶组牙槽骨缺损部位同样没有恢复但牙槽骨的丧失情况较模型组弱；TGFβ3微球的低剂量组和高剂量组缺损部位都有不同程度的牙槽骨再生，两者对比高剂量组恢复效果更佳(图9)。给药处理6周后，可以看到载TGFβ3微球自愈合水凝胶高剂量组红色标记的损伤部位明显少于其它组，起到了再生修复损伤的牙槽骨的效果。
