基于纳米金属有机框架的阵列传感器用于结肠癌的组织学诊断
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其涉及基于纳米金属有机框架的新型阵列传感系统的构建原理，过程，实验条件及应用。
发明背景
组织活检作为准确诊断癌症的检查方法，是一种典型的复杂样品分析过程，主要涉及到对细胞或组织的提取以及对癌症的发生鉴定和发生程度的诊断过程。而结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是造成死亡的第四大类型癌症类型。而癌组织与正常结肠上皮细胞区分主要由于蛋白质表达的差异。通过显微镜观察进行的包含免疫组织化学和酶组织化学的组织病理学检查是结肠癌诊断的金标准。然而，在结肠组织中没有特定的单个或多个肿瘤标志物作为有效的准则去区分正常的和肿瘤的组织。另外，石蜡包埋和组织切片的过程需要经过培训的实验操作人员，并且医学结果取决于临床医生的个体判断，这种主观性上的差异容易导致不准确的诊断。因此，迫切需要设计一种合理的结肠癌组织学诊断方法。
阵列识别方法可以为复杂样本的传感分析提供一种选择性的策略，其利用特有的靶标与受体结合识别事件作为基础。纳米级金属有机骨架(NMOFs)是一种新兴的分子纳米材料，由于其合成的可调性和多功能性，是设计成多种人工受体的理想元件。含金属单元和有机配体的高选择性赋予了NMOF的种类多样性，例如MIL或UiO系列。此外，NMOF具有适当的表面区域，非常用于结合生物分子。典型的有，已经证明标记的单链DNA(ssDNA)可以有效地吸收在NMOF的表面上，对DNA的序列和长度的控制提供了较高的选择性。表面电荷和芳香族基团的多样性导致与生物分子不同程度的相互作用，这允许很容易地设计各种受体用于阵列识别传感。鉴于NMOF的多功能设计性和巧妙的 DNA结构，我们推测两者的组装可能有望构建一个性能优异的传感器阵列，用于复杂样本的生物分析。
发明内容
本发明的目的是构建一种阵列传感体系，为提高结肠癌组织学诊断的准确性、缩短检查时间提供一种方法。
发明原理：
基于结肠组织成分和DNA吸附的NMOFs之间的选择性非共价相互作用，构建了一种基于阵列传感的荧光非特异性识别系统。三种NMOFs用作人工受体的核心部分以及用于荧光标记的DNA序列的纳米猝灭剂。当与各种分析物相互作用时，NMOF表面上的反应性有机部分或可接近的配位点将形成多个分子间作用力，例如静电相互作用，配位相互作用，π堆积和氢键吸引而造成荧光强度的变化，通过线性判别分析(LDA)方法直接绘出指纹图谱，从而对蛋白质靶标进行灵敏的鉴定分析。使用这些元件，由于细胞内独特的蛋白质组特征，癌症结肠细胞系和组织可以有效地区别于非癌细胞系和组织。整个翻译过程大大缩短了检查时间，提高了效率。此外，它已成功用于识别42例临床样本并且具有高度的准确性，实现了临床的初步应用。总的来说，这种方法为人类肿瘤分类提供了一种新方法，并拓宽了MOF在生物传感中的应用。
需要的试剂：
由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成的Azo-DNA寡核苷酸序列为：5′-(CHO)-CCTAGCAACAGACCGCACTTTATGATAGCAA(Azo) GC(Azo)TA(Azo)GG-3′。PAA购自合肥普元纳米技术有限公司(中国安徽)。(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，氯化钾(KCl)和其他的分析试剂从Sigma-Aldrich(中国上海)或Sigma-Aldrich Co.，Ltd(St Louis，MO，USA)购得。所有溶液均用去离子水制备，用Milli-Q纯化系统(Bedford， MA，USA)纯化至电阻为18.2MΩcm。
制备方法包括如下过程：
一、合成纳米尺度MOF：
Cu-MOF：室温下搅拌50mL甲醇水溶液，其中含Cu(NO3)2·3H2O(0.9g)和 PVP(0.4g)。然后将H3BTC(0.43g)溶于另外50mL甲醇中形成配体母液。然后用注射器将上述溶液滴加到金属前体液中。滴下过程中可观察到蓝色胶体悬浮液形成，约10分钟，然后停止搅拌，静置24小时，在避光条件下使胶体纳米颗粒稳定生长。所得的蓝色固体以10000rpm离心10min，用新鲜的甲醇洗涤数次。最后，沉淀物在60℃的温度下真空干燥过夜，以备后面使用。
Fe-MOF：FeCl3·6H2O(1.350g)和BDC(0.412g)在30mL DMF中的溶液超声溶解在50mL体积的四氟乙烯为内衬的水热釜中，并在110下加热20小时。通过以10500rpm离心10分钟收获所得橙色固体，并用新鲜乙醇洗涤数次。最后，将沉淀物在减压下在120℃下真空干燥6小时。
Zr-MOF：将ZrCl4(37.5mg)和TCPP(6.5mg)溶解在16.25mL DMF中超声约3分钟。然后将二氯乙酸(0.25mL)加入溶液中，再将混合物装入四氟乙烯为内衬的水热釜中并在130℃下加热18小时。在10500rpm下，离心10分钟收集得到深紫色固体，并用新鲜的DMF和乙醇洗涤数次。最后，将沉淀物在 130℃下真空干燥过夜以备后用。
二、序列设计：
DNA 1：AAAAAA AAAAAAAAAAAA
DNA 2：CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
三、细胞培养与处理：
NCM-460和Colo 205细胞系在含有10％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco，Invitrogen)并置于5％CO2培养箱(Thermo 3111)中培养。HCT-116在 McCoy’s 5A培养基(Gibco，Invitrogen)中生长，其它培养条件与上述相同。在1000rpm条件下，离心5分钟收集细胞，并用PBS缓冲液洗涤两次。将得到的细胞重悬于PBS溶液中以形成细胞悬浮液。用自动细胞计数器(Invitrogen Countess)计数数目以备后用。
四、结肠癌组织的获取与处理：
所有患者的组织取自东南大学第二附属医院。病例均获得知情同意，该研究经南京大学和东南大学科学伦理委员会批准。
组织病理学检查：将获得的组织脱水并包埋在石蜡中，然后切片，接着进行H&E染色。使用显微镜进行观察同时记录图像。
裂解液的制备：首先，使用冷PBS缓冲液将新鲜组织洗涤两次。然后将预冷的提取试剂(一步法动物组织中有活性的蛋白质提取试剂盒，生工生物科技有限公司)加入到收集的组织并超声(每次30秒，3-4次，每次间隔1分钟)。超声之后，将组织裂解液在12000rpm(4℃)下离心10分钟，并将上清液转移到新的EP管中用于蛋白质定量和后续的传感实验。
五、传感分析实验：
对于目标传感研究中，两条荧光标记的DNA链(DNA 1和2)分别与三种 NMOFs孵育并用HEPES缓冲液(10mM，100mM NaCl，pH为7.2)稀释，使得DNA元件，Cu-MOF，Fe-MOF和Zr-MOF最终浓度分别为50nM，1μg/ mL，10μg/mL和20μg/mL。将混合物(每孔中200μL)转移到黑色96孔板 (Corining Inc.，America)中。温育30分钟后，在多功能酶标板上在540nm的激发波长下测量570nm处的荧光强度(I0)。当引入分析的靶标(蛋白质，结肠癌的细胞系或组织裂解液)并孵育30分钟(细胞系1小时)，每个孔的反应体系在570nm处给出不同的响应(I)。两个值之间的差值(ΔI＝I-I0)用作阵列传感分析的响应信号。每组目标实验重复六次。最后，使用Xlstat(2015版) 和IBM SPSS Statistics 24软件中的线性判别分析(LDA)处理原始数据矩阵。
八、结论
总之，我们已经证明具有DNA元件的NMOF组件可以制造能够分析结肠癌和正常组织的肿瘤组织的荧光传感器阵列。NMOF大小和表面的形态提供了与蛋白质的选择性相互作用，并且固有的猝灭荧光性质促进结合事件的信号转导。使用传感器阵列，我们可以快速(～1小时)地识别各种分析物，从纯的标准样品到复杂的临床样品，通过LDA分析具有高灵敏性和准确度。短时间的检测大大提高了诊断效率。值得注意的是，实现了完全分化以分析结肠癌的不同组织样本，其水平低至150ng，从而最小化活检组织大小。此外，该方法已经对未知的结肠癌组织进行了临床初步诊断，为传统的组织学检查方法提供了一种补充策略。总之，我们认为该基于NMOF的传感器阵列在生物医学诊断方面具有广阔的前景。
以上详细描述了本发明的装置原理，实施的方法及检测条件等，但是本发明不限于上述检测的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明进行检测底物的变换，这些检测底物的变换均属于本发明的保护范围内，另外需要说明的是，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
附图说明
图1：基于纳米金属有机框架的阵列传感器结构和原理图。(A)本研究中使用的三种NMOFs的结构类型；(B)利用NMOFs与两个单链DNA之间的纳米组装，设计了6个识别元件(NP1-NP6)。所制备的传感器阵列对不同的结合过程产生不同的响应。
图2：三种NMOFs的PXRD图谱和TEM图像表征，分别是(a和b)Cu- MOFs，(c和d)Fe-MOFs，(e和f)Zr-MOFs。
图3：荧光标记的DNA 1在570nm处对Fe-MOFs的荧光滴定，即NP3识别元件。荧光强度被归一化并与Fe-MOFs的质量浓度作图。DNA浓度为50nM。插图为紫外光下随加入Fe-MOFs的浓度梯度而产生的荧光强度变化。
图4：基于阵列传感分析浓度为5μM的蛋白质。(A)传感阵列(NP1-NP6) 对多种蛋白的荧光响应：牛血清白蛋白(BSA)、血红蛋白(Hb)、溶菌酶 (Lyso)、辣根过氧化物酶(HRP)和蛋白酶K，误差条表示六个平行测量值的标准差；(B)从五种蛋白质的荧光反应模式得到的热图；(C)通过对5种浓度为5μM的五种蛋白质的LDA分析获得的荧光响应模式的前两个标准因子的典型得分图，具有95％置信椭圆。
图5：基于阵列的细胞系传感。(一)荧光响应(ΔI，I-I0)模式的传感器阵列(NP1-NP6)对各种恒定细胞数量(～1000)的细胞系(NCM 460，Colo 205和HCT 116)；(B)LDA分析获得的三种细胞系荧光响应模式前两个因子的典型评分图，95％置信椭圆。
图6：光(A)用传感阵列预测的医学结果与组织病理学切片的金标准进行了比较；(B)基于建立的数据模型得到的标准分布图，分布的各点代表42个样本；(C)仅使用癌症与正常个体两组样本进行LDA分析，LDA数据集已被转换为统计直方图；(D)将两组样本进行ROC分析，曲线下面积AUC值是 0.90。
