一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子及制备方法和应用、药物递送系统及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子及制备方法和应用、药物递送系统及应用。
背景技术
5-氟尿嘧啶(5-FU)作为氟嘧啶抗代谢药被广泛用于胃肠道癌治疗(如：胃癌、结肠癌、胰腺癌等)。然而，大部分进入体内的5-FU会被二氢嘧啶脱氢酶或尿嘧啶迅速转化为非活性代谢物，静脉内给药后的体内生物半衰期仅为6～20min，降低了其对于胃肠道癌治疗效果；而且5-FU的靶向性差，进入体内后分布广泛，且有心脏毒性，会引发皮炎和中枢神经系统损伤等毒副作用，限制了5-FU的广泛使用(Pharmacology&Therapeutics,2020,206,107447；Biomaterials Science,2017,5(3):502-510)。
为了解决上述技术问题，一般将5-氟尿嘧啶负载于材料内部形成药物递送系统。目前，用于5-氟尿嘧啶药物递送系统的材料主要有碳纳米管、二氧化硅、金属有机框架材料(MOFs)和聚合物等。其中，聚合物具有化学结构可调、合成方法简单、分子量可控、制备成本低廉、易于结合功能化基团、生物相容性好、毒性低等特点，在药物输送研究领域中备受关注，然而现有的聚合物(聚乙二醇、聚乳酸等)对pH响应性差，限制了其应用。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子及制备方法和应用、药物递送系统及应用，本发明提供的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子对pH和谷胱甘肽(GSH)响应性能好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子，包括壳体和与所述壳体表面通过酰胺键连接的碳点，所述壳体为共聚物，所述共聚物为甲基丙烯酸/N,N'-双(丙烯酰)胱胺共聚物。
优选的，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的粒径为90～285nm。
优选的，所述壳体的厚度为10～50nm。
本发明提供了上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将正硅酸四乙酯和氨水混合，进行水解缩聚反应，得到二氧化硅；将所述二氧化硅和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的醇溶液混合，进行缩聚反应，得到修饰有双键的纳米二氧化硅；
(2)将所述修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、甲基丙烯酸、自由基引发剂和腈类溶剂混合，在所述修饰有双键的纳米二氧化硅表面进行自由基聚合反应，得到核壳型共聚物纳米粒子；
(3)保护气氛下，将所述核壳型共聚物纳米粒子、缩合试剂、碳点、交联剂和腈类溶剂混合，依次进行活化和酰胺化反应，得到碳点修饰的共聚物纳米粒子；
(4)将所述碳点修饰的共聚物纳米粒子、氢氟酸和和腈类溶剂混合，进行刻蚀反应，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子。
优选的，步骤(1)中，所述正硅酸四乙酯、氨水和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的质量比为1：(0.5～0.9)：(0.4～0.5)，所述氨水以氨计。
优选的，所述修饰有双键的纳米二氧化硅的粒径为125～275nm。
优选的，步骤(2)中，所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺和甲基丙烯酸的质量比为1：(7.5～8.5)；
所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺和修饰有双键的纳米二氧化硅的质量比为1：(2.6～2.8)。
优选的，步骤(3)中，所述缩合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺；
所述交联剂包括乙二胺；
所述核壳型共聚物纳米粒子、缩合试剂、碳点和交联剂的质量比为1：(4.8～5.2)：(0.45～0.55)：(4.5～5)。
优选的，步骤(4)中，所述碳点修饰的共聚物纳米粒子的质量和氢氟酸的体积之比为1：(20～25mL)。
本发明提供了一种药物递送系统，包括上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子或上述技术方案制备所述方法得到的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子，以及负载在所述纳米粒子空心内的药物；所述药物包括5-氟尿嘧啶。
本发明提供了上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子、上述技术方案所述制备方法制备的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子或上述技术方案所述药物递送系统在制备治疗胃肠道癌药物中的应用。
本发明提供了一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子，包括壳体和与所述壳体表面通过酰胺键连接的碳点，所述壳体为共聚物，所述共聚物为甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物。本发明碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子用于输送药物时，在酸性条件下，甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的羧基不易离子化，使被输送药物的释放速度减缓；在中性环境下，羧基离子化程度增加，使被输送药物的释放速度加快，对pH响应灵敏。
而且在本发明中，甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的双硫键可以被谷胱甘肽(GSH)还原成硫醇，在含GSH环境中降解速度加快，药物释放速度也会加快，对GSH响应灵敏。碳点具有靶向性和荧光性，能够实现对药物的靶向递送以及荧光成像。
本发明提供的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的在光照下可以生成活性氧(ROS)，ROS可以导致细胞的凋亡，能够用于制备治疗胃肠道癌药物；而且本发明提供的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子生物相容性好且毒性低。
本发明提供的制备方法，操作简单，原料来源广泛，成本低，适宜工业化生产。
附图说明
图1为MPS@SiO2制备路线图，其中，
图2为CDs@CS-PMAA制备路线图；
图3为实施例1制备的CDs、CDs@CS-PMAA、CDs@HPMAA和5-FU@CDs@HPMAA的红外光谱图；
图4为实施例1制备的CDs和CDs@CS-PMAA的光谱图，其中，(a)为CDs和CDs@CS-PMAA的归一化紫外可见吸收光谱，(b)为CDs的激发光谱(CDsex)，CDs和CDs@CS-PMAA的发射光谱(CDsem，CDs@CS-PMAAem)；
图5实施例1和对比例1制备的不同样品(从左到右依次为：H2O、CS-PMAA、HPMAA、CDs和CDs@CS-PMAA)在日光灯和365nm紫外灯照射下的荧光图，其中，(a)为日光灯，(b)为365nm紫外灯；
图6为实施例1制备的CDs和CDs@CS-PMAA生成活性氧物质(ROS)的效果图，其中，(a)为CDs存在下DPBF在水溶液中的吸收变化，内插图为DPBF消耗率(A-ACDs)/(A0-ACDs)；(b)为在CDs@CS-PMAA存在下DPBF在水溶液中的吸收变化，插图为DPBF消耗率(A-ACDs@CS-PMAA)/(A0-ACDs@CS-PMAA)；
图7为实施例1制备的CDs@CS-PMAA和CDs@HPMAA的描电镜图，其中，(a)为CDs@CS-PMAA，内插图为随机挑选的100个CDs@CS-PMAA纳米粒子的粒径统计分布图；(b)为CDs@HPMAA，内插图为随机挑选的100个CDs@HPMAA纳米粒子的粒径统计分布图；
图8为对比例2制备的5-FU@CS-PMAA、对比例3制备的5-FU@HPMAA和实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的扫描电镜图，其中，(a)为5-FU@CS-PMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@CS-PMAA纳米粒子的粒径统计分布图；(b)为5-FU@HPMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@HPMAA纳米粒子的粒径统计分布图；(c)为5-FU@CDs@HPMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@CDs@HPMAA纳米粒子的粒径统计分布图；
图9为PBS溶液(pH＝7.4)中5-FU的浓度与液相峰面积的线性关系以及实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的高效液相色谱其中，(a)为PBS溶液中5-FU的浓度与液相峰面积的线性关系，内插图为不同浓度下5-氟尿嘧啶溶液的高效液相色谱图；(b)为5-FU@CDs@HPMAA的高效液相色谱图；
图10为5-FU和实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA和在不同pH条件下的释放曲线图；
图11为在不同GSH浓度下实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的释放率曲线、不同样品(从左到右依次为：pH＝7.4的PBS缓冲溶液、5-FU@CDs@HPMAA+PBS、5-FU@CDs@HPMAA+PBS+10mmol/LGSH、5-FU@CDs@HPMAA+PBS+20mmol/LGSH)的初始图和培养96h的图，其中，(a)为5-FU@CDs@HPMAA的释放率曲线，(b)为不同样品的初始图，(c)为为不同样品的培养96h的图；
图12为实施例2～11制备的甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物(PMAA-1～PMAA-10)在不同pH的磷酸盐缓冲溶液中的动力学尺寸图；
图13为PMAA-6的氢谱图；
图14为实施例12～18制备的MPS@SiO2的扫描电镜图，其中，(a)为MPS@SiO2-1，(b)为MPS@SiO2-2，(c)为MPS@SiO2-3，(d)为MPS@SiO2-4，(e)为MPS@SiO2-5，(f)为MPS@SiO2-6，(g)MPS@SiO2-7；
图15为实施例12～18制备的MPS@SiO2在乙醇中的动力学尺寸分布图，其中，(a)加入不同体积的液氨制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-1、MPS@SiO2-2和MPS@SiO2-4)；(b)不同水解缩聚反应温度制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-3、MPS@SiO2-4和MPS@SiO2-5)；(c)为不同的乙醇/水体积比下制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-3、MPS@SiO2-6和MPS@SiO2-7)；
图16为CS-PMAA-1和CS-PMAA-5的扫描电镜图，其中，(a)为CS-PMAA-1，(b)为CS-PMAA-5；
图17为实施例19～25制备的CS-PMAA在乙腈中的动力学尺寸及多分散系数图，其中，(a)为不同MAA加入量制备的CS-PMAA(CS-PMAA-1～CS-PMAA-5)，(b)不同尺寸MPS@SiO2制备的CS-PMAA(CS-PMAA-4、CS-PMAA-5和CS-PMAA-7)，(c)不同批次制备的CS-PMAA-5。
具体实施方式
本发明提供了一种碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子，包括壳体和与所述壳体表面通过酰胺键连接的碳点，所述壳体为共聚物，所述共聚物为甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物。
在本发明中，所述甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中N,N’-双(丙烯酰)胱胺和甲基丙烯酸的质量比优选为1：(7.5～8.5)，更优选为1：(7.8～8.2)，最优选为1:8。
在本发明中，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子呈现单分散性，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子粒径优选为90～285nm，更优选为94～281nm，最优选为100～200nm。在本发明中，所述壳体的厚度优选为10～50nm，更优选为20～40nm，最优选为30nm。在本发明中，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的空心尺寸优选为50～165nm，更优选为54～261nm，最优选为70～170nm。
本发明制备的碳点，表面含羟基和羧基含氧基团，是一种碳基零维材料，具有优异的光学性质，良好的水溶性、低毒性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点，具有靶向性和荧光性，能够实现对药物的靶向递送以及荧光成像。
在本发明中，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的粒径小，肿瘤组织对于碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子能够产生高通透性和滞留性增强效应(EPR效应)，提高了药物在肿瘤组织的选择性分布，进而增加药效并减少副作用。在酸性条件下，甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的羧基不易离子化，使被输送药物释放速度减缓；在中性环境下，羧基离子化程度增加，使被输送药物释放速度加快，对pH响应灵敏。当碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子进入癌细胞后，甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的双硫键被谷胱甘肽(GSH)还原成硫醇而断裂，使得碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子快速降解，释放其包埋的药物，对GSH响应灵敏。
本发明提供了上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将正硅酸四乙酯和氨水混合，进行水解缩聚反应，得到二氧化硅；将所述二氧化硅和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的醇溶液混合，进行缩聚反应，得到修饰有双键的纳米二氧化硅；
(2)将所述修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、甲基丙烯酸、自由基引发剂和腈类溶剂混合，在所述修饰有双键的纳米二氧化硅表面进行自由基聚合反应，得到核壳型共聚物纳米粒子；
(3)保护气氛下，将所述核壳型共聚物纳米粒子、缩合试剂、碳点、交联剂和腈类溶剂混合，依次进行活化和酰胺化反应，得到碳点修饰的共聚物纳米粒子；
(4)将所述碳点修饰的共聚物纳米粒子、氢氟酸和和腈类溶剂混合，进行刻蚀反应，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将正硅酸四乙酯(TEOS)和氨水混合，进行水解缩聚反应，得到二氧化硅；将所述二氧化硅、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)和醇类溶剂混合，进行缩聚反应，得到修饰有双键的纳米二氧化硅(简写为MPS@SiO2)，发生的反应如图1所示。
本发明将正硅酸四乙酯(TEOS)和氨水混合，进行水解缩聚反应，得到二氧化硅。在本发明中，所述氨水的浓度优选为0.0074～0.013wt％，更优选为0.008～0.012wt％，最优选为0.009～0.010wt％。在本发明中，所述氨水作为碱性催化剂能够控制正硅酸四乙酯(TEOS)的水解速度，有助于硅酸缩聚反应生成二氧化硅纳米粒子，并实现对二氧化硅的粒径的控制，具体的，随着氨浓度的增加，OH－浓度增大，抑制了二氧化硅成核速度，使二氧化硅成核数量减少，每个二氧化硅纳米粒子上水解生长的硅酸量相对增加，促进了二氧化硅的生长，粒径相应增大。在本发明中，所述正硅酸四乙酯和氨水中的氨的质量比优选为1：(0.5～0.9)，更优选为1：(0.6～0.8)，最优选为1:0.7。
在本发明中，所述正硅酸四乙酯和氨水混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述水解缩聚反应的温度优选为30～50℃，更优选为40～50℃，最优选为50℃；时间优选为24～36h，更优选为28～32h，最优选为30h。在本发明中，所述水解缩聚反应过程中TEOS先水解成硅酸后缩聚生成二氧化硅。
所述水解缩聚反应后，本发明优选还包括将所述水解缩聚反应的体系冷却至室温，得到二氧化硅。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可。
得到二氧化硅后，本发明将所述二氧化硅、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)和醇类溶剂混合，进行缩聚反应，得到修饰有双键的纳米二氧化硅(MPS@SiO2)。
在本发明中，所述修饰有双键的纳米二氧化硅的粒径优选为125～275nm，更优选为127.9～275nm，最优选为127.9～165.54nm。
在本发明中，所述3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的醇溶液中的醇类溶剂优选包括乙醇。在本发明中，所述3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的醇溶液中MPS的浓度优选为0.0285～0.0292g/L，更优选为0.029g/L。在本发明中，所述正硅酸四乙酯和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的质量比优选为1：(0.4～0.5)，更优选为1：(0.42～0.48)，最优选为1：(0.44～0.46)。
在本发明中，所述二氧化硅和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的醇溶液混合的方式优选为搅拌混合，所述搅拌混合的速度优选为550～650r/min，更优选为580～620r/min，最优选为600r/min；本发明对于所述搅拌混合的时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述缩聚反应的温度优选为室温，所述缩聚反应的时间优选为12～24h，更优选为15～22h，最优选为18～20h。在本发明中，所述缩聚反应过程中，MPS与SiO2发生缩聚反应，实现MPS对SiO2表面的修饰。
所述缩聚反应后，本发明优选还包括将所述缩聚反应的体系固液分离，将所得固体产物乙醇洗后干燥，得到修饰有双键的纳米二氧化硅。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述乙醇洗优选为乙醇超声洗涤；所述乙醇洗的次数优选为3～4次；所述乙醇洗的目的是除去有机杂质。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为40～50℃，更优选为42～48℃，最优选为45℃；时间优选为24～36h，更优选为26～34h，最优选为28～32h。
得到修饰有双键的纳米二氧化硅(MPS@SiO2)后，本发明将所述修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、甲基丙烯酸(MAA)、自由基引发剂和腈类溶剂混合，在所述修饰有双键的纳米二氧化硅表面进行自由基聚合反应，得到核壳型共聚物纳米粒子(简写为CS-PMAA)。
在本发明中，所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺的制备方法，优选包括以下步骤：将胱胺二盐酸盐水溶液和无机强碱水溶液混合，进行中和反应；向所述中和反应得到的反应液中加入丙烯酰氯溶液混合，进行酰胺化反应，得到N,N’-双(丙烯酰)胱胺，发生的反应如式(1)所示：
在本发明中，所述胱胺二盐酸盐水溶液的浓度优选为0.6～0.7mol/L，更优选为0.62～0.65mol/L，最优选为0.625mol/L。在本发明中，所述无机强碱水溶液的浓度优选为4～6mol/L，更优选为5mol/L；所述无机强碱优选为氢氧化物，所述氢氧化物优选包括氢氧化钠和/或氢氧化钾。在本发明中，分别以胱胺二盐酸盐和无机强碱的量计，所述胱胺二盐酸盐水溶液与无机强碱水溶液的质量比优选为1：(0.82～0.90)，更优选为1：(0.84～0.88)，最优选为1：0.851。在本发明中，所述酸碱中和反应的温度优选为-4～2℃，更优选为0℃；时间优选为0.5～1h，更优选为0.6～0.8h。
在本发明中，所述胱胺二盐酸盐水溶液和无机强碱水溶液混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述胱胺二盐酸盐水溶液和无机强碱水溶液混合优选为将胱胺二盐酸盐水溶液冷却后滴加无机强碱水溶液；所述冷却后的温度优选-4～2℃，更优选为-2～0℃；所述混合的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述无机强碱水溶液的滴加优选利用恒压滴液漏斗进行，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速滴加即可。
在本发明中，所述丙烯酰氯溶液的浓度优选为4.5～5.5mol/L，更优选为4.8～5.2mol/L，最优选为5.0mol/L；所述丙烯酰氯溶液中的溶剂优选包括二氯甲烷或乙酸乙酯。在本发明中，分别以胱胺二盐酸盐和丙烯酰氯的量计，所述胱胺二盐酸盐水溶液和丙烯酰氯溶液的质量比优选为1：(0.68～0.71)，更优选为1：(0.69～0.70)，最优选为1：0.7。
在本发明中，所述丙烯酰氯溶液的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速滴加即可。
在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为室温；时间优选为12～24h，更优选为15～22h，最优选为18～20h。
所述酰胺化反应后，本发明优选还包括将所述酰胺化反应的体系固液分离，将所得固体产物进行重结晶后干燥，得到N,N’-双(丙烯酰)胱胺。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。在本发明中，所述重结晶用溶剂优选包括溶剂A和溶剂B的混合溶剂；所述溶剂A优选包括石油醚或正己烷；所述溶剂B优选包括乙酸乙酯或二氯甲烷；所述溶剂A和溶剂B的体积比优选为1：(0.8～1)，更优选为1:0.9；本发明对于所述重结晶用溶剂的用量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的重结晶的溶剂的用量即可。在本发明中，所述干燥的温度优选为35～45℃，更优选为38～42℃，最优选为40℃；时间优选为24～36h，更优选为24～30h，最优选为24h。
在本发明中，所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺、修饰有双键的纳米二氧化硅和甲基丙烯酸的质量比优选为1：(2.6～2.8)：(7.5～8.5)，更优选为1：(2.65～2.75)：(7.8～8.2)，最优选为1:2.7:8。在本发明中，所述自由基引发剂优选包括偶氮二异丁腈(AIBN)或N,N’-双丙烯酰胱胺。在本发明中，所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺和自由基引发剂的质量比优选为1：(0.79～0.81)，更优选为1：(0.795～0.805)，最优选为1:0.8。在本发明中，所述腈类溶剂优选包括乙腈；本发明对于所述腈类溶剂的用量没有特殊限定，能够将修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、甲基丙烯酸(MAA)和自由基引发剂分散均匀即可；在本发明的实施例中，所述N,N’-双(丙烯酰)胱胺的质量和腈类溶剂的体积的比优选为1g:(660～666.5)mL，更优选为1g:(662～664)mL。
在本发明中，所述所述修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、甲基丙烯酸(MAA)、自由基引发剂和腈类溶剂混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述自由基聚合反应的温度优选为82～84℃，更优选为83℃；时间优选为0.45～0.55h，更优选为0.5h。在本发明中，所述自由基聚合反应过程中，自由基引发剂受热分解形成引发单体自由基，然后与修饰有双键的纳米二氧化硅、N,N’-双(丙烯酰)胱胺和甲基丙烯酸发生聚合反应得到核壳型共聚物纳米粒子。
所述自由基聚合反应后，本发明优选还包括将所述自由基聚合反应的体系依次进行加热浓缩、冷却至室温和固液分离，将所得固体产物有机溶剂洗涤后干燥，得到核壳型共聚物纳米粒子。在本发明中，所述加热浓缩的温度优选为103～107℃，更优选为105℃，本发明对于所述加热浓缩的时间没有特殊限定，能够将体系中的溶剂去除约1/2即可。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述有机溶剂洗涤用有机溶剂优选为腈类溶剂，更优选为乙腈；所述有机溶剂洗涤优选为有机溶剂离心洗涤；所述有机溶剂洗涤的次数优选为3～4次；所述有机溶剂洗涤的目的是除去有机杂质。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为40～50℃，更优选为45～48℃；时间优选为24～36h，更优选为28～30h。
在本发明中，所述核壳型共聚物纳米粒子的壳层厚度优选为10～50nm，更优选为20～40nm，最优选为25～30nm；所述核壳型共聚物纳米粒子的核的直径优选为127～275nm，更优选为140～250nm，最优选为150～200nm。
得到核壳型共聚物纳米粒子后，本发明在保护气氛下，将所述核壳型共聚物纳米粒子、缩合试剂、碳点、交联剂和腈类溶剂混合，依次进行活化和酰胺化反应，得到碳点修饰的共聚物纳米粒子(简写为CDs@CS-PMAA)，发生的反应如图2所示。
在本发明中，所述碳点的制备方法优选包括以下步骤：将叶酸和水混合，进行水热反应，得到碳点。在本发明中，所述叶酸质量和水体积的比优选为1g:(330～335)mL，更优选为1g:(331～334)mL，最优选为1g:(332～333)mL。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述水热反应的温度优选为178～182℃，更优选为179～181℃，最优选为180℃；时间优选为1.8～2.5h，更优选为2～2.2h；所述水热反应的容器优选为具有聚四氟乙烯内衬的高压釜，然后将所述高压釜置于电热鼓风干燥箱中进行水热反应。
所述水热反应后，本发明优选还包括将所述水热反应的体系进行过滤，将所得滤液进行浓缩，得到碳点。在本发明中，所述过滤用的滤膜孔径优选为0.22μm。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，能够将溶剂完全去除即可。在本发明中，所述碳点的保存条件优选为低温保存，所述低温保存的温度优选为2～4℃，更优选为3℃。
在本发明中，所述缩合试剂优选为N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)的质量比优选为(2.8～3)：(2～2.2)，更优选为(2.85～2.95)：(2.05～2.15)，最优选为2.9:2.1；所述NHS和DCC的作用是作为羧基和和胺基反应生成酰胺键的脱水缩合试剂。在本发明中，所述交联剂优选包括乙二胺；所述交联剂的作用是促进碳点修饰于核壳型共聚物纳米粒子表面。在本发明中，所述核壳型共聚物纳米粒子、缩合试剂、碳点和交联剂的质量比优选为1：(4.8～5.2)：(0.4～0.6)：(4.5～5)，更优选为1：(4.9～5.1)：(0.45～0.55)：(4.6～4.9)，最优选为1：(5～5.1)：0.5：(4.7～4.8)。在本发明中，所述腈类溶剂优选包括乙腈；所述核壳型共聚物纳米粒子的质量和腈类溶剂的体积的比优选为1g:(100～120)mL，更优选为1g:(105～115)mL，最优选为1g:110mL。
本发明对于所述保护气氛有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的保护气氛即可，具体如氮气或氩气。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述活化的温度优选为50～60℃，更优选为52～58℃，最优选为54～55℃；时间优选为10～12h，更优选为11h；所述活化过程中，核壳型共聚物纳米粒子在缩合试剂的作用下被活化形成中间态酰基异脲。
在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为50～60℃，更优选为52～58℃，最优选为54～55℃；时间优选为10～12h，更优选为11h。在本发明中，所述酰胺化反应过程中，碳点在交联剂作用下与中间态酰基异脲结合形成酰胺键，形成碳点修饰的共聚物纳米粒子。
所述酰胺化反应后，本发明优选还包括将所述酰胺化反应的体系冷却至室温后固液分离，将所得固体产物进行水洗后干燥，得到碳点修饰的共聚物纳米粒子。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述水洗利用的水优选为蒸馏水或去离子水；所述水洗的次数优选为3～4次；所述水洗能够去除水溶性杂质。在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥；所述干燥的温度优选为-40～-35℃，更优选为-39～-36℃，最优选为-38～-37℃；时间优选为24～36h，更优选为28～34h，最优选为30～32h。
得到碳点修饰的共聚物纳米粒子后，本发明将所述碳点修饰的共聚物纳米粒子、氢氟酸和和腈类溶剂混合，进行刻蚀反应，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子(简写为CDs@HPMAA)。
在本发明中，所述氢氟酸的浓度优选为35～45wt％，更优选为40wt％。在本发明中，所述碳点修饰的共聚物纳米粒子的质量和氢氟酸的体积之比优选为1.0g：(20～30)mL，更优选为1.0g：(22～28)mL，最优选为1.0g：(25～26)mL。在本发明中，所述腈类溶剂优选包括乙腈；所述碳点修饰的共聚物纳米粒子质量和腈类溶剂的体积的比优选为1g:(200～250)mL，更优选为1g:(220～240)mL，最优选为1g:(225～230)mL。
在本发明中，所述混合优选为将碳点修饰的共聚物纳米粒子和腈类溶剂超声混合，然后在搅拌条件下滴加氢氟酸。本发明对于所述超声混合的功率和时间没有特殊限定，能够将原料分散均匀即可；所述超声混合的时间优选为10～15min，更优选为12～14min。本发明对于所述搅拌的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，逐滴加入即可。
在本发明中，所述刻蚀反应的温度优选为室温；时间优选为24～36h，更优选为28～34h，最优选为30～32h；所述刻蚀反应过程中发生的反应为SiO2+4HF＝SiF4↑+2H2O，经过刻蚀反应后，碳点修饰的共聚物纳米粒子中的二氧化硅核被刻蚀掉，形成中空结构。
所述刻蚀反应后，本发明优选还包括将所述刻蚀反应的体系固液分离，将所得固体产物水洗后干燥，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述水洗利用的水优选为蒸馏水或去离子水；所述水洗的次数优选为3～4次；所述水洗能够去除水溶性杂质。在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥；所述干燥的温度优选为-40～-35℃，更优选为-39～-36℃，最优选为-38～-37℃；时间优选为24～36h，更优选为28～34h，最优选为30～32h。
本发明提供了一种药物递送系统，包括上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子或上述技术方案制备所述方法得到的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子，以及负载在所述纳米粒子空心内的药物；所述药物包括5-氟尿嘧啶。
在本发明中，所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子和药物的质量比优选为1：(0.2～0.3)，更优选为1：(0.22～0.28)，最优选为1：(0.25～0.26)。
在本发明中，所述药物递送系统的制备方法优选包括以下步骤：将碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子、磷酸盐缓冲溶液(PBS)和药物混合后负载，得到药物递送系统。
所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述混合的顺序优选为将将碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子分散于磷酸盐缓冲溶液后加入药物混合。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4；所述磷酸盐缓冲溶液的作用是分散碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子并溶解5-氟尿嘧啶。
在本发明中，所述负载优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速度没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速度即可；所述负载的时间优选24～36h，更优选为28～34h，最优选为30～32h。在本发明中，以负载5-氟尿嘧啶为例，所述负载过程中，5-FU是弱碱性的抗肿瘤药物，其pKa＝8.0±0.1，CDs@HPMAA中的羧基与5-FU之间可以产生静电吸附作用和渗透作用，而使得5-FU负载于CDs@HPMAA内部。
所述负载后，本发明优选将所述负载后的体系固液分离，将所得固体产物PBS溶液洗后干燥，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离。在本发明中，所述PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4；所述PBS溶液洗的次数优选为3～4次；所述PBS溶液洗的作用是碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子表面未负载的5-氟尿嘧啶洗去。在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥；所述干燥的温度优选为-40～-35℃，更优选为-39～-36℃，最优选为-38～-37℃；时间优选为24～36h，更优选为28～34h，最优选为30～32h。
本发明提供了上述技术方案所述碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子、上述技术方案所述制备方法制备的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子或上述技术方案所述药物递送系统在制备治疗胃肠道癌药物中的应用。
本发明碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子用于输送药物时，在酸性条件下，甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的羧基不易离子化，使被输送药物的释放速度减缓；在中性环境下，羧基离子化程度增加，使被输送药物的释放速度加快，对pH响应灵敏。甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中的双硫键可以被谷胱甘肽(GSH)还原成硫醇，在含GSH环境中降解速度加快，药物释放速度也会加快，对GSH响应灵敏。碳点具有靶向性和荧光性，能够实现对药物的靶向递送以及荧光成像。碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子的在光照下可以生成活性氧(ROS)，ROS可以导致细胞的凋亡，能够用于制备治疗胃肠道癌药物；而且本发明提供的碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子生物相容性好且毒性低。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)修饰有双键的纳米二氧化硅(MPS@SiO2)的制备
将3.6mLNH3·H2O和10mLH2O混合均匀，得到氨水溶液，再将4mL正硅酸四乙酯(TEOS)溶解于60mL乙醇中，得到TEOS溶液，将TEOS溶液与氨水溶液以600r/min的搅拌速度混合均匀，在40℃进行水解缩聚反应24h，冷却至室温后加入2mL3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)进行缩聚反应12h，离心分离，将所得固体产物乙醇离心洗涤3次后在40℃真空干燥24h，得到修饰有双键的纳米二氧化硅(简写为MPS@SiO2)。
(2)N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)的制备
将40mL浓度为0.625mol/L的胱胺二盐酸盐水溶液的温度降至0℃，用恒压滴液漏斗滴加20mL浓度为5.00mol/L的NaOH溶液后在搅拌条件下中和反应10min，用恒压滴液漏斗向所述中和反应得到的反应液中滴加10.0mL浓度为5.00mol/L的丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，在0℃条件下酸碱中和反应0.5h，后将体系温度升至室温后酰胺化反应12h，减压抽滤，将所得固体产物用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝1/1)进行重结晶后干燥，得到N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)；
核磁数据：1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ8.39(s,2H),6.23(dd,J1＝17.1,10.1Hz,2H),6.09(dd,J1＝17.1,2.2Hz,2H),5.60(dd,J1＝10.1,2.2Hz,2H),3.42(dd,J1＝12.7,6.4Hz,4H),2.82(t,J＝6.8Hz,4H)。13CNMR(100MHz,DMSOd6)δ165.21(s),132.04(s),125.80(s),38.40(s),37.52(s)。
(3)核壳型共聚物纳米粒子(CS-PMAA)的制备
将0.600g甲基丙烯酸(MAA)、0.075gN,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、0.200gMPS@SiO2、0.06gAIBN和50mL乙腈超声混合10min，在200r/min、83℃条件下自由基聚合反应0.5h，温度升高至105℃后蒸馏出约一半溶剂后停止加热，冷却至室温后离心分离，将所得固体产物乙腈离心洗涤3次后真空干燥(40℃，24h)，得到核壳型共聚物纳米粒子(简写为CS-PMAA)。
(4)碳点(CDs)的制备方法
将0.150g叶酸(FA)和50mL蒸馏水以650r/min的速度搅拌混合后置于带聚四氟乙烯内衬的高压釜中，将高压釜放入电热鼓风干燥箱中在180℃条件下水热反应2h，冷却至室温后经0.22μm滤膜过滤，去除将所得滤液中的溶剂，得到碳点(简写为CDs)。
(5)碳点修饰的共聚物纳米粒子(CDs@CS-PMAA)的制备
在氮气条件下，将0.200gCS-PMAA、0.575gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、0.413g二环己基碳二亚胺(DCC)、0.10g碳点(CDs)和20mL乙腈混合，在60℃活化10h，然后加入乙二胺(EN，1.0mL)酰胺化反应12h，冷却至室温后离心分离，将所得固体产物水洗3次后在-40℃下真空冷冻干燥24h，得到碳点修饰的共聚物纳米粒子(简写为CDs@CS-PMAA)。
(6)碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子(简写为CDs@HPMAA)的制备
将0.200gCDs@CS-PMAA和45mL乙腈超声分散10min，在搅拌条件下滴加5mL氢氟酸，刻蚀反应24h，离心分离，将所得固体产物水洗3次后在-40℃条件下真空冷冻干燥24h，得到碳点修饰的中空型共聚物纳米粒子(简写为CDs@HPMAA)。
(7)药物递送系统(5-FU@CDs@HPMAA)的制备
将CDs@HPMAA(0.200g)分散于25.00mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入0.10g5-氟尿嘧啶搅拌混合，得到药物递送系统(简写为5-FU@CDs@HPMAA)。
实施例1制备的CDs、CDs@CS-PMAA、CDs@HPMAA和5-FU@CDs@HPMAA的红外光谱图如图3所示，由图3可知，CDs的红外光谱中3200cm-1附近的包峰可以归结于羧基上羟基的伸缩振动和羧基与羧基间形成的氢键；1700cm-1的吸收峰可以归属为C＝O的伸缩振动；1600～1500cm-1范围内的吸收可以归属为苯环的骨架伸缩振动。此外，CDs@CS-PMAA、CDs@HPMAA和5-FU@CDs@HPMAA的峰型和位置几乎相同，在3600～2500cm-1处的包峰为仲胺中的N-H伸缩振动，共聚物中羟基的伸缩振动以及甲基、亚甲基的伸缩振动，形成包峰的主要原因是羧基与氨基间的缔合以及可能形成的铵盐；1700cm-1处的强吸收峰归属酰胺键和羧基中碳氧双键的伸缩振动；1638cm-1附近的中等强度包峰归属为酰胺键中的N-H的伸缩振动，这一吸收与1700cm-1处的酰胺键吸收相对应；1500cm-1附近中等强度的吸收峰可以归属为氨基上的N-H的剪式振动；1450cm-1附近的吸收为甲基和亚甲基中的反对称变形振动。CDs@PMAA的红外光谱在1100cm-1处有强而宽的包峰为Si-O-Si的反对称伸缩振动，且在949cm-1处有属于Si-OH的弯曲振动，802cm-1和471cm-1处的Si-O键的对称伸缩振动。在CDs@HPMAA和5-FU@CDs@HPMAA中没有发现这样的包峰，但在出现了1254cm-1和1170cm-1两个尖峰，这可以被归属为酰胺键和醚键的伸缩振动；位于802cm-1和471cm-1处的Si-O键对称伸缩振动位于峰也消失了；这些都表明了通过氢氟酸刻蚀除去了CDs@PMAA中的二氧化硅。
实施例1制备的CDs和CDs@CS-PMAA的归一化紫外可见吸收光谱和激发光谱如图4所示，其中，(a)为归一化紫外可见吸收光谱，插图中为400～500nm的放大谱图；(b)为CDs的激发光谱(CDsex)、CDs和CDs@CS-PMAA的发射光谱。由图4可知，在290nm附近的强峰被归结于碳点中石墨化碳中sp2杂化平面中π-π*跃迁；在360nm处的肩峰吸收被归结于叶酸残余在碳核表面形成的。而相较于碳点的吸收光谱而言，CDs@CS-PMAA的吸收光谱存在蓝移现象，这是由于碳点与CS-PMAA之间可能存在能量转移。从激发光谱中可以看出CDs的发射波长不依赖激发波长，其发射波长在437nm处，呈蓝色荧光。相较于没有碳点修饰的CS-PMAA，CDs@CS-PMAA可以在365nm紫外光激发下发射出蓝色荧光。
对比例1
将0.200g实施例1步骤(3)制备的CS-PMAA和45mL乙腈超声分散10min，在搅拌条件下5mL滴加氢氟酸，刻蚀反应24h，离心分离，将所得固体产物水洗3次后在-40℃条件下真空冷冻干燥24h，得到中空型共聚物纳米粒子(简写为HPMAA)。
H2O、实施例1制备的CS-PMAA、CDs和CDs@CS-PMAA和对比例1制备的HPMAA在日光灯和365nm紫外灯照射下的荧光图如图5所示，其中，(a)为日光灯，(b)为365nm紫外灯，样品从左至右依次为H2O、CS-PMAA、HPMAA、CDs和CDs@CS-PMAA。由图5可知，CDs和CDs@CS-PMAA都具有蓝色荧光，表明，经CDs修饰的中空型共聚物纳米粒子具有细胞成像领域的潜在应用。
以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为检测剂，含CDs的DPBF水溶液(CDs的浓度为0.01g/L，DPBF的浓度为0.3mmol/L)和含CDs@CS-PMAA的DPBF水溶液(CDs@CS-PMAA的浓度为0.01g/L，DPBF的浓度为0.3mmol/L)在光照(467nm，3W)条件下，碳点在光的激发下从基态到达激发态，激发态的碳点将能量转移给三线态氧使其转化为活性氧(ROS)，实施例1制备的CDs和CDs@CS-PMAA生成活性氧物质(ROS)的效果如图6所示，其中，(a)为CDs存在下DPBF在水溶液中的吸收变化，内插图为DPBF消耗率(A-ACDs)/(A0-ACDs)；(b)为在CDs@CS-PMAA存在下DPBF在水溶液中的吸收变化，插图为DPBF消耗率(A-ACDs@CS-PMAA)/(A0-ACDs@CS-PMAA)。由图6可知，在406nm处的吸收随时间的增加而降低，表明在光(λ＝467nm)照射下CDs和CDs@CS-PMAA可将溶液中的三线态氧转变为ROS，从而能够达到杀死癌细胞的效果，说明CDs和CDs@CS-PMAA具有光动力治疗潜力。
实施例制1备的CDs@CS-PMAA和CDs@HPMAA的描电镜图如图7所示，其中，(a)为CDs@CS-PMAA，内插图为随机挑选的100个纳米粒子进行的粒径统计分布图；(b)为CDs@HPMAA，内插图为随机挑选的100个纳米粒子进行的粒径统计分布图。由图7可知，CDs@CS-PMAA刻蚀前后均为球形，形貌上没有改变，CDs@CS-PMAA的平均粒径为159.4nm，经过刻蚀得到的CDs@HPMAA平均尺寸为168.1nm，这可能是由于经氢氟酸刻蚀后溶剂进入CDs@CS-PMAA中导致的溶胀。
对比例2
按照实施例1步骤(7)的方法制备药物负载系统，与实施例1的区别在于，将CDs@HPMAA替换为实施例1步骤(3)制备的CS-PMAA，得到药物递送系统(简写为5-FU@CS-PMAA)。
对比例3
按照实施例1步骤(7)的方法制备药物负载系统，与实施例1的区别在于，将CDs@HPMAA替换为对比例1制备的HPMAA，得到药物递送系统(简写为5-FU@HPMAA)。
对比例2制备的5-FU@CS-PMAA、对比例3制备的5-FU@HPMAA和实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的扫描电镜图如图8所示，其中，(a)为5-FU@CS-PMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@CS-PMAA纳米粒子的粒径统计分布图；(b)为5-FU@HPMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@HPMAA纳米粒子的粒径统计分布图；(c)为5-FU@CDs@HPMAA，内插图为随机挑选的100个5-FU@CDs@HPMAA纳米粒子的粒径统计分布图。由图8可知，5-FU@CS-PMAA的平均尺寸为177.3nm，5-FU@HPMAA的平均粒径为162.1nm，5-FU@CDs@HPMAA的平均尺寸为138.9nm；5-FU@CDs@HPMAA的粒径小的原因是5-FU的负载及碳点的修饰导致了CS-PMAA表面电荷被中和，羧基的离子化程度增加使部分CS-PMAA溶解。从图8中(c)也可以看出5-FU@CDs@HPMAA存在少量的大颗粒纳米粒子，这些纳米粒子是两个及以上的CS-PMAA结合形成的，当CS-PMAA之间的静电斥力减小后，CS-PMAA趋近于向熵降低的方向移动，CS-PMAA粒子间相互结合形成大颗粒。
配置不同浓度(C＝5×10-6～5×10-4mol/L)的5-氟尿嘧啶水溶液，利用HPLC测定各溶液的液相色谱图，再通过对相应位置进行积分得到峰面积，获取峰面积与浓度间的对应关系；PBS溶液(pH＝7.4)中5-FU的浓度与液相峰面积的线性关系、实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的高效液相色谱如图9所示，其中，(a)为PBS溶液中(pH＝7.4)5-FU的浓度(C＝5×10-6～5×10-4mol/L)与液相峰面积的线性关系，内插图为不同浓度下5-氟尿嘧啶溶液的高效液相色谱图；(b)为5-FU@CDs@HPMAA的高效液相色谱图。由图9可知，5-FU浓度与液相峰面积存在良好的线性关系，其拟合的线性方程为：S＝57246.89C-0.0116，R2＝0.9999(其中，C的单位为mol/L)。
5-FU和实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA和在不同pH条件下的释放曲线如图10所示。由图10可知，与游离的5-FU相比，5-FU@CDs@HPMAA释放率明显降低，在PBS溶液中放置24h后，5-FU的释放率分别为98.17％(pH＝7.4)和97.88(pH＝5.0)，而5-FU@CDs@HPMAA的释放率分别为8.66％(pH＝7.4)和2.10％(pH＝5.0)；在PBS溶液中放置96h后，5-FU的释放率达到了99.07％(pH＝7.4)和99.80％(pH＝5.0)，而5-FU@CDs@HPMAA的释放率仅为20.94％(pH＝7.4)和3.60％(pH＝5.0)。由图10中还可看出5-FU@CDs@HPMAA在pH＝7.4时的释放率高于在pH＝5.0的环境中，这是由于相较于中性条件，酸性条件下CDs@HPMAA中羧基的离子化程度更低。5-FU负载至CDs@HPMAA中的驱动力为静电引力和氢键相互作用，所以在酸性条件下CDs@HPMAA对5-FU的相互作用力更强，因此，5-FU@CDs@HPMAA在酸性条件下的释放率更低。
在不同GSH浓度下实施例1制备的5-FU@CDs@HPMAA的释放率曲线、不同样品(从左到右依次为：PBS缓冲溶液(pH＝7.4)、5-FU@CDs@HPMAA+PBS、5-FU@CDs@HPMAA+PBS+10mmol/LGSH、5-FU@CDs@HPMAA+PBS+20mmol/LGSH)的初始图和培养96h的图如图11所示，其中，(a)为5-FU@CDs@HPMAA的释放率曲线，(b)为不同样品的初始图，(c)为不同样品的培养96h的图。由图11中(a)可知，含有GSH条件下5-FU的释放量更多。当5-FU@CDs@HPMAA在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中培养24h后，5-FU的累计释放率分别为8.66％(GSH＝0mmol/L)、47.46％(GSH＝10mmol/L)和48.56％(GSH＝20mmol/L)。这是由于还原型GSH可以使CDs@HPMAA上的双硫键断裂生成硫醇，聚合物的交联网络逐渐断裂分解生成小片段的低聚物，低聚物上的羧基在PBS缓冲溶液中离子化导致5-FU释放。由图11中(b)和(c)可知，培养96h后含GSH的培养液明显变澄清，而无GSH的培养液中的5-FU@CDs@HPMAA没有降解仍然为悬浮液，培养96h后，样品5-FU@CDs@HPMAA在含GSH条件下释放并不完全58.41％(GSH＝10mmol/L)和70.94％(GSH＝20mmol/L)，这可能是由于仍有部分CDs@HPMAA链上氢键相互作用负载有5-FU。
实施例2
按照实施例1步骤(1)的方法制备N,N’-双(丙烯酰)胱胺。
(2)制备甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物(PMAA)
将0.100g甲基丙烯酸(MAA)、0.075gN,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、0.012g偶氮二异丁腈(AIBN)和10mL乙腈超声混合10min，在200r/min、83℃条件下自由基聚合反应0.5h，温度升高至105℃后蒸馏出约一半溶剂后停止加热，冷却至室温后离心分离，将所得固体产物分散于乙腈中离心洗涤3次后在40℃条件下真空干燥24h，得到甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物(简写为PMAA-1)。
实施例2～11
按照实施例2的方法制备甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物，实施例2～11中步骤(2)的制备条件如表1所示：
表1实施例2～11中PMAA的制备条件
MAA中含有羧基，BACy中含有胺基，这类甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物的pH响应性来源于PMAA链上羧基和胺基的离子化，-COOH在高pH值时离子化，而-NH2在低pH值时离子化。实施例2～11制备的PMAA在不同pH的磷酸盐缓冲溶液中的动力学尺寸如图12所示，为了表示方便以磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.0时测得的尺寸为归一化尺寸，其他pH条件下的尺寸均以此为基准。由图12可知，PMAA-1、PMAA-2、PMAA-3和PMAA-4的动力学尺寸规律相同，当pH＝6.5时，尺寸增大；当pH＝7.4时，尺寸减小；当pH＝8.0时，尺寸又增大，这是由于在PMAA中羧基和胺基两者含量相当，相互抑制；当pH＝6.5时，胺基起主要作用，离子化程度更多，粒径增大；当pH＝7.4时，胺基与羧基的离子化程度相同，导致粒径减小；当pH继续增加到8.0时，羧基的离子化呈主导作用，所以粒径增加明显。PMAA-5在pH改变时尺寸没有明显变化，这表明这一配比下的甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物中羧基和胺基离子化可以相互平衡。当甲基丙烯酸的含量进一步加大时，PMAA-6在pH＝5.0和pH＝6.5时粒径减小，当pH＝7.4和pH＝8.0时粒径增大，这是因为在甲基丙烯酸/N,N’-双(丙烯酰)胱胺共聚物链中羧基的离子化占据主导地位。而PMAA-7在在pH＝5.0、6.5、7.4时粒径较小，当pH＝8.0时粒径增大，这更进一步表明羧基的离子化占据主导地位。随着MAA含量的进一步增加，PMAA-8、PMAA-9和PMAA-10的粒径却随pH增大而减小，这是因为羧基的增加进一步增加了聚合物在水中的溶解度，只有在酸性条件下抑制羧基离子化使聚合物悬浮在水中，才能准确测出聚合物的粒径，而在中性和碱性聚合物会逐渐溶解，难以测出其准确的动力学尺寸。而药物的负载需要在pH＝7.4条件下进行，在此条件下粒径增大将为药物的负载提供更多的位置；此外，考虑到肿瘤组织内部的弱酸性环境，PMAA-6的配比最佳，本发明提供的药物递送系统在弱酸性环境下，有利于避免5-氟尿嘧啶被人体快速消除而不能充分发挥其作用。
PMAA-6的氢谱图如图13所示，由图13可知，在6.5～5.5ppm位置没有发现属于烯基上的特征氢，这表明MAA和BACy发生了聚合，12.26ppm位置的小包峰为MAA上羧基氢；1.78～0.93ppm范围内氢可以归属为其他各饱和碳上的氢。
实施例12～18
按照实施例1步骤(1)的方法制备纳米二氧化硅(MPS@SiO2)，反应条件如表2所示：
表2实施例12～18制备MPS@SiO2的条件
实施例12～18制备的MPS@SiO2的扫描电镜图如图14所示，其中，(a)为MPS@SiO2-1，(b)为MPS@SiO2-2，(c)为MPS@SiO2-3，(d)为MPS@SiO2-4，(e)为MPS@SiO2-5，(f)为MPS@SiO2-6，(g)MPS@SiO2-7；在乙醇中的动力学尺寸分布如图15和表3所示所示，其中，(a)加入不同体积的NH3·H2O制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-1、MPS@SiO2-2和MPS@SiO2-4)；(b)不同水解缩聚反应温度制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-3、MPS@SiO2-4和MPS@SiO2-5)；(c)为不同的乙醇/水体积比下制备的MPS@SiO2(MPS@SiO2-3、MPS@SiO2-6和MPS@SiO2-7)。
表3 MPS@SiO2的动力学尺寸及多分散系数
由图14可知，本发明制备的MPS@SiO2呈球形，且分布均匀。通过直接标记和染色技术(DLS)对MPS@SiO2的动力学尺寸和多分散系数测量，结果表明，通过控制氨水浓度和反应温度可以制备得到粒径为138.5～320.0nm的单分散MPS@SiO2粒子。而且，随着氨水浓度的增加MPS@SiO2的粒径不断增大(图14中(a)～(c)、表4和图15中(a))，这是由于NH3·H2O在溶液中作为催化剂来催化TEOS的水解及缩聚，NH3·H2O会不断电离出OH－和H+，保证了水解缩聚反应的进行，随着氨水浓度的增加，OH－浓度变大，抑制了SiO2成核速度，使SiO2成核数量减少，每个SiO2纳米粒子上水解生长的硅酸相对增加，促进了SiO2的生长，粒径相应增大。随着水解缩聚反应温度的增加，MPS@SiO2的粒径随之减小(如图14中(c)～(e)、表4和图15中(b))，这是由于温度升高加快了TEOS的水解速度，增加了成核数量，也加快了SiO2成核速度导致MPS@SiO2的粒径减小。此外，随着水含量的增加，MPS@SiO2的粒径也在不断减小(图14中(c)、(f)、(g)、表4和图15中(c))，这是由于水含量的增加可以加速生成硅酸的速度及浓度，进而增加成核数量，使MPS@SiO2的粒径减小。
实施例19～25
按照实施例1步骤(3)制备CS-PMAA，实施例19～25制备CS-PMAA的条件如表4所示，其中，CS-PMAA-1～CS-PMAA-5利用的修饰有双键的纳米二氧化硅为MPS@SiO2-7，CS-PMAA-6利用的修饰有双键的纳米二氧化硅为MPS@SiO2-2，CS-PMAA-7利用的修饰有双键的纳米二氧化硅为MPS@SiO2-1。
CS-PMAA-1和CS-PMAA-5的扫描电镜图如图16所示，其中，(a)CS-PMAA-1，(b)CS-PMAA-5。由图16可知，CS-PMAA-1和CS-PMAA-5为球形且粒径均一；CS-PMAA-1大部分为实心白色，而随着MAA加入的量增加后，样品CS-PMAA-5明显呈现双层结构，中间为白色而边缘部分呈透明的白色。
通过DLS技术对CS-PMAA在乙腈中的动力学尺寸及多分散系数进行了测试，结果如如表4和图17所示，其中，(a)为不同MAA加入量制备的CS-PMAA(CS-PMAA-1～CS-PMAA-5)；(b)不同尺寸MPS@SiO2制备的CS-PMAA(CS-PMAA-4、CS-PMAA-5和CS-PMAA-7)；(c)不同批次制备的CS-PMAA-5(按照CS-PMAA-5的制备条件重复3次实验得到三个批次的CS-PMAA-5)。
表4实施例19～25制备CS-PMAA的条件、所得CS-PMAA的平均动力学尺寸及多分散系数
由表4和图17可知，随着加入MAA和BACy单体及交联剂的含量增加，CS-PMAA的平均动力学尺寸由196.6nm增加至275.8nm，从多分散系数中可以看出通过整流沉淀聚合法获得的CS-PMAA粒径呈现单分散性质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
