一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法。
背景技术
三叶木通(学名：Akebia%20trifoliata(Thunb.)Koidz.)是木通科，木通属落叶木质藤本植物。茎皮灰褐色，掌状复叶互生或在短枝上的簇生；叶柄直，叶片纸质或薄革质，卵形至阔卵形，先端通常钝或略凹入，基部截平或圆形，边缘具波状齿或浅裂，上面深绿色，下面浅绿色；总状花序自短枝上簇生叶中抽出，总花梗纤细，雄花：花梗丝状，尊片淡紫色，阔椭圆形或椭圆形，花丝极短，药室在开花时内弯；退化心皮长圆状锥形。雌花：花梗稍较雄花的粗，柱头头状，具乳凸，橙黄色。果长圆形，直或稍弯，种子极多数，扁卵形，种皮红褐色或黑褐色，稍有光泽。4-5月开花，7-8月结果。
三叶木通的果皮中含有丰富的果胶成分，果胶是一类结构复杂的酸性杂多糖，主要由半乳糖醛酸聚糖(HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)三个结构区域构成，其中HGA为光滑区，RG-I和RG-II为须状区。每种果胶随植物来源、组织和发育阶段的不同，其侧链中残基的数目、种类和连接方式以及其它取代基存在的情况都有相当大的变化，体现出果胶多糖在结构上的高度复杂性。
目前对于果胶多糖的分离纯化方法较为简单，提取量小、分离效率低，不适于大规模推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供了一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：
一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)水解处理：
将果皮果胶投入到酸液中进行酸水解处理，水解时长控制为5～6h，完成后得酸水解液备用；
(2)通气处理：
向步骤(1)所得的酸水解液中通入复合气体，控制通入的时长为6～8h；
(3)超声处理：
将超声仪器的探头浸没在步骤(2)处理后的酸水解液中，然后进行超声处理，50～55min后备用；
(4)离心处理：
对步骤(3)处理后的酸水解液进行离心处理，过滤滤液后得离心沉淀物备用；
(5)酶解处理：
先将步骤(4)所得的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混，然后加入果胶酶进行酶解处理，随后再进行皂化、中和后除盐，最后进行冷冻干燥处理后得果胶寡糖混合物；所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-25～-30℃；
(6)层析处理：
将步骤(5)所得的果胶寡糖混合物与蒸馏水共混溶解后，再依次使用DEAE-纤维素柱及SephadexLH-60凝胶柱进行层析处理，完成后得分级纯化后的果胶寡糖。
进一步的，步骤(1)中所述的酸液是浓度为1～1.5mol/L的磷酸溶液，所述果皮果胶投入到酸液时两者对应的重量比为1：95～100；所述酸水解处理时始终保持酸液的温度为70～75℃。
进一步的，步骤(2)中所述的复合气体的是由氧气和氩气对应按照体积比2～3:1混合而成。
进一步的，步骤(3)中所述的超声处理时控制超声波的频率为300～340kHz、脉冲时间控制为2～3s、间歇时间控制为2s、强度为260～280W/cm2。
进一步的，步骤(4)中所述的离心处理时控制离心的转速为2200～2400rpm。
进一步的，步骤(5)中所述的醋酸钠缓冲液的pH值为4～5。
进一步的，步骤(5)中所述的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混时对应的重量比为1：80～85。
进一步的，步骤(5)中所述的皂化处理时条件控制为：1～1.2mol/L的氢氧化钠溶液皂化处理30～40min；皂化处理时控制溶液的温度为30～33℃。
进一步的，步骤(6)中所述的DEAE-纤维素柱装填采用湿法自然压力均匀装填；所述的SephadexLH-60凝胶柱采用湿法高压氮气脉冲装填，其压力控制为不大于4.5MPa。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种果胶的降解工艺，通过合理搭配的处理操作，有效的实现了果胶的高效、精准降解，其中先进行酸水解处理，可以降解掉果胶多糖中大部分的中性糖，接着进行了通气处理，利用独配的复合气体进行溶液的饱和吸收，改变了溶液的气泡含量及导热性等，进而能够明显增强超声处理时的空化及发热效应，进而加快了果胶的降解效率和效果，之后进行了酶解处理，进一步保证了降解的纯度及产物得率，最后用DEAE-纤维素柱和SephadexLH-60凝胶柱对产物进行了层析处理，将其中的多糖及寡糖有效的进行了分离，实现了级分的分离纯化操作。本发明方法整体工艺简单，利用推广应用，能够高效、高产的实现多糖及寡糖的分离和纯化，为后续进行分子量、糖醛酸含量、单糖组成、酯化度、乙酰化度、均一度等成分性质的测量和探究提供了基础，有很好的推广应用价值。
具体实施方式
实施例1
一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)水解处理：
将果皮果胶投入到酸液中进行酸水解处理，水解时长控制为5h，完成后得酸水解液备用；所述的酸液是浓度为1mol/L的磷酸溶液，所述果皮果胶投入到酸液时两者对应的重量比为1：95；所述酸水解处理时始终保持酸液的温度为70℃；
(2)通气处理：
向步骤(1)所得的酸水解液中通入复合气体，控制通入的时长为6h；所述的复合气体的是由氧气和氩气对应按照体积比2:1混合而成；
(3)超声处理：
将超声仪器的探头浸没在步骤(2)处理后的酸水解液中，然后进行超声处理，50min后备用；所述的超声处理时控制超声波的频率为300kHz、脉冲时间控制为2s、间歇时间控制为2s、强度为260W/cm2；
(4)离心处理：
对步骤(3)处理后的酸水解液进行离心处理，过滤滤液后得离心沉淀物备用；所述的离心处理时控制离心的转速为2200rpm；
(5)酶解处理：
先将步骤(4)所得的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混，然后加入果胶酶进行酶解处理，随后再进行皂化、中和后除盐，最后进行冷冻干燥处理后得果胶寡糖混合物；所述的醋酸钠缓冲液的pH值为4；所述的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混时对应的重量比为1：80；所述的皂化处理时条件控制为：1mol/L的氢氧化钠溶液皂化处理30min；在皂化处理时控制溶液的温度为30℃；所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-25℃；
(6)层析处理：
将步骤(5)所得的果胶寡糖混合物与蒸馏水共混溶解后，再依次使用DEAE-纤维素柱及SephadexLH-60凝胶柱进行层析处理，完成后得分级纯化后的果胶寡糖；所述的DEAE-纤维素柱装填采用湿法自然压力均匀装填；所述的SephadexLH-60凝胶柱采用湿法高压氮气脉冲装填，其压力控制为不大于4.5MPa。
实施例2
一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)水解处理：
将果皮果胶投入到酸液中进行酸水解处理，水解时长控制为5.5h，完成后得酸水解液备用；所述的酸液是浓度为1.3mol/L的磷酸溶液，所述果皮果胶投入到酸液时两者对应的重量比为1：98；所述酸水解处理时始终保持酸液的温度为74℃；
(2)通气处理：
向步骤(1)所得的酸水解液中通入复合气体，控制通入的时长为7h；所述的复合气体的是由氧气和氩气对应按照体积比2.6:1混合而成；
(3)超声处理：
将超声仪器的探头浸没在步骤(2)处理后的酸水解液中，然后进行超声处理，52min后备用；所述的超声处理时控制超声波的频率为330kHz、脉冲时间控制为2s、间歇时间控制为2s、强度为270W/cm2；
(4)离心处理：
对步骤(3)处理后的酸水解液进行离心处理，过滤滤液后得离心沉淀物备用；所述的离心处理时控制离心的转速为2300rpm；
(5)酶解处理：
先将步骤(4)所得的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混，然后加入果胶酶进行酶解处理，随后再进行皂化、中和后除盐，最后进行冷冻干燥处理后得果胶寡糖混合物；所述的醋酸钠缓冲液的pH值为4.5；所述的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混时对应的重量比为1：82；所述的皂化处理时条件控制为：1.1mol/L的氢氧化钠溶液皂化处理35min；在皂化处理时控制溶液的温度为32℃；所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-28℃；
(6)层析处理：
将步骤(5)所得的果胶寡糖混合物与蒸馏水共混溶解后，再依次使用DEAE-纤维素柱及SephadexLH-60凝胶柱进行层析处理，完成后得分级纯化后的果胶寡糖；所述的DEAE-纤维素柱装填采用湿法自然压力均匀装填；所述的SephadexLH-60凝胶柱采用湿法高压氮气脉冲装填，其压力控制为不大于4.0MPa。
实施例3
一种三叶木通果皮果胶降解产物中多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)水解处理：
将果皮果胶投入到酸液中进行酸水解处理，水解时长控制为6h，完成后得酸水解液备用；所述的酸液是浓度为1.5mol/L的磷酸溶液，所述果皮果胶投入到酸液时两者对应的重量比为1：100；所述酸水解处理时始终保持酸液的温度为75℃；
(2)通气处理：
向步骤(1)所得的酸水解液中通入复合气体，控制通入的时长为8h；所述的复合气体的是由氧气和氩气对应按照体积比3:1混合而成；
(3)超声处理：
将超声仪器的探头浸没在步骤(2)处理后的酸水解液中，然后进行超声处理，55min后备用；所述的超声处理时控制超声波的频率为340kHz、脉冲时间控制为3s、间歇时间控制为2s、强度为280W/cm2；
(4)离心处理：
对步骤(3)处理后的酸水解液进行离心处理，过滤滤液后得离心沉淀物备用；所述的离心处理时控制离心的转速为2400rpm；
(5)酶解处理：
先将步骤(4)所得的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混，然后加入果胶酶进行酶解处理，随后再进行皂化、中和后除盐，最后进行冷冻干燥处理后得果胶寡糖混合物；所述的醋酸钠缓冲液的pH值为5；所述的离心沉淀物与醋酸钠缓冲液共混时对应的重量比为1：85；所述的皂化处理时条件控制为：1.2mol/L的氢氧化钠溶液皂化处理40min；在皂化处理时控制溶液的温度为33℃；所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-30℃；
(6)层析处理：
将步骤(5)所得的果胶寡糖混合物与蒸馏水共混溶解后，再依次使用DEAE-纤维素柱及SephadexLH-60凝胶柱进行层析处理，完成后得分级纯化后的果胶寡糖；所述的DEAE-纤维素柱装填采用湿法自然压力均匀装填；所述的SephadexLH-60凝胶柱采用湿法高压氮气脉冲装填，其压力控制为不大于4.2MPa。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例3相比，区别仅在于，省去了步骤(2)通气处理操作，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例2与实施例3相比，区别仅在于，省去了步骤(3)超声处理操作，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例3与实施例3相比，区别仅在于，省去了步骤(2)通气处理操作和步骤(3)超声处理操作，除此外的方法步骤均相同。
为了对比本发明效果，以果皮果胶作为原料，然后用上述实施例3、对比实施例1～3对应的方法进行分离纯化处理，然后对产物进行成分的测定(摩尔百分比含量)，具体对比数据如下表1所示：
表1
由上表1可以看出，本发明对于多糖的提取量大、纯度高，能够为后续的进一步研究提供坚实的技术支持，极具推广应用价值。
