一种可缓释外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物支架领域，特别是涉及一种外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体作为一种由细胞内体通过多种转运机制释放至胞外的脂质双分子层囊泡，已有大量研究对外泌体的结构和功能进行探索。外泌体直径在50-100 nm之间，形态多为球形。通过内体膜向内萌芽形成多囊泡体后，多囊泡体与质膜融合，从而将外泌体释放到细胞外环境。外泌体作为重要的调控细胞间通讯的纳米囊泡，其携带的分子成分包括脂质（前列腺素、磷酸激酶C/D等），蛋白质（跨膜蛋白、脂锚定膜蛋白、外部周围膜蛋白、内部周围膜蛋白等）和核酸（DNA、RNA），其中外泌体携带的RNA几乎涵盖所有RNA种类。外泌体的成分具有选择性包裹的特点，包裹的蛋白和miRNA不仅受细胞种类、细胞状态影响，同时受细胞所处的微环境所调控。同现有的细胞疗法相比，外泌体具有更小的炎症反应，在储存的过程中还可以保留生物化学活性，因此在组织工程领域已有越来越多的研究利用外泌体进行研究。
由于外泌体的产能有限，目前尚无法大规模量产，因此如何提高外泌体治疗时的有效浓度，对外泌体的临床转化有重要的应用意义。同以往直接进行外泌体注射的方法相比，近几年已经有许多研究团队通过对外泌体控释的载体形式进行设计来实现对外泌体释放速率的调控。常见的释放策略包括以下几类：①外泌体与水凝胶前驱体混合，通过交联实现负载；②水凝胶浸泡在溶剂中去除结合水，再浸泡在含有外泌体的溶液中溶胀，从而吸附外泌体；③利用电荷吸附的方式将外泌体吸附在支架表面。这些方法虽然都可以减缓外泌体在支架中的释放速率，但是同组织生长愈合需要的时间相比仍然较快。根据我们对已有文献的统计，目前对外泌体体外释放的降解曲线的实验都在PBS水环境下进行，且释放的半衰期大多都在10天以内。在进行组织的损伤修复实验中，支架植入体内需要面对一系列排异反应，以及由多种胶原酶介导的酶解释放反应，这会大幅提高外泌体的释放速率。基于目前控释策略制备的支架，在早期炎症反应阶段（两周左右）就会释放50%甚至更多的外泌体，这会导致外泌体有效浓度的显著下降，不利于软骨的再生。如何通过对外泌体的缓释策略进行研究，实现外泌体的长效释放，并且能够伴随支架的降解持续对组织的生长过程进行调控，是目前亟需解决的一个难点。
目前现有技术中所公开的用于外泌体缓释的生物支架具有如下缺点：
1、无法长期保存。水凝胶在低温保存的时候由于冰晶的形成，凝胶结构会被破坏，融化后出现结构坍塌；
2、现有的技术不论是水凝胶包裹还是溶胀吸附还是电荷吸附，外泌体的释放都是以扩散的形式为主，释放速率快。10天水环境的释放量几乎都超过50%，部分甚至达到90%。面对大面积组织修复以及血供匮乏的组织修复，通常需要数月的时间，这导致外泌体释放过快，无法实现后期调控；
3、在释放完成后，支架依旧存在，导致其生物调控的功能消失，只能提供力学支撑。随着支架开始出现降解，又会有局部炎症反应产生。且支架存在的位置通常已被组织包裹，生长能力缓慢。支架降解留下的孔隙被组织长入的过程需要调控。
基于上述现有技术中存在的问题，如何设计生物支架材料的形式，使其可以在冰冻环境下长期保存，在保证支架结构不被破坏的前提下，还需实现减缓释放速率，使支架降解与外泌体释放的速率同步展开，对组织修复意义重大。
在申请人早先的研究中，利用丝素蛋白冷冻海绵技术实现了分子药物的缓释，支架的缓释依赖降解实现，不依赖扩散形式，从而大幅减缓了药物的释放速率（中国专利公开号：CN 110624135 A）。然而外泌体是脂质体的一种，其结构相对于化学药物受外界环境影响更大，温度、pH、电荷、溶剂种类的选择都对外泌体的形态结构均有着重要影响。因此同传统药物负载在支架上的策略相比，负载外泌体的难度更高。申请人在研究中发现，之前的专利中公开的丝素蛋白冷冻海绵技术并不适合外泌体的缓释，需要对缓释体系进行进一步开发探索。
参考文献：[1] D.M. Pegtel, S.J. Gould, Annual Review of BiochemistryExosomes. Annu. Rev. Biochem 2019.
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发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种可缓释外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法。更为具体的，所述方法包括如下技术步骤：
1）丝素蛋白提炼
将蚕茧（市售）加入到煮沸的0.02 mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌30-90分钟，将固体絮状物取出，多次水洗并烘干，得到丝素蛋白固体；
按丝素蛋白与溴化锂的质量比1:3-5称取溴化锂，并配备8-10mol/L的溴化锂水溶液；
将溴化锂水溶液导入丝素蛋白容器内，令溴化锂完全覆盖蛋白固体，在50-65℃环境下搅拌3-5小时；
将充分溶解后的混合溶液对水透析，多次换水后收集液体，9000rpm以上的转速在4℃离心15-25min，取上清重复离心，再取上清液，4℃保存；
将上清液冻干，得到白色海绵状丝素蛋白，可以室温干燥下长期保存。
2）外泌体分离与鉴定
将细胞培养至约70%汇合时弃去培养上清，使用PBS清洗2-3遍，换成无外泌体完全培养液，培养48h，收集上清；
利用差速离心法，500g离心5-10min；2000g离心30min，弃去沉淀；10000g离心30min，取上清液至超速离心管中；100000g离心70min，弃去上清后，使用无菌PBS溶液重悬沉淀；100000g离心70min，弃去上清后，按计算浓度加入无菌PBS重悬沉淀，即为分离得到的外泌体；分装外泌体并冻于-80℃中。
取部分外泌体稀释后用透射电镜观察形貌，10uL滴加至铜网上，90s后用滤纸吸去液体，滴加10uL醋酸铀染液复染30s，置于电镜下观察；
取部分外泌体稀释后，用纳米颗粒分析设备观察粒径分布。稀释至合适浓度后加入1mL到仪器中，对外泌体的布朗运动进行追踪，分析后即可得到颗粒的大小及浓度；
取部分外泌体进行蛋白提取，使用RIPA裂解液按步骤操作得到可用于蛋白印迹检测的蛋白样品，通过western blotting技术检测外泌体的特异性标志CD9，ALIX，TSG101。
3）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的前驱体溶液配置
① 对于需要冷冻海绵的体系pH需要维持在中性的（pH在5.5-7.5之间）前驱体溶液配置方法：
利用PBS和水配成具有不同离子浓度的溶剂，并将其与丝素蛋白固体混合。假设最终需要X倍PBS的离子浓度作为蛋白+外泌体的最终溶剂（X通常在0-1之间），最终需要的丝素蛋白的质量比例为Y，则Y/X应该≥0.1（例如,终浓度10%的蛋白海绵需要溶解在0.5x PBS中）。根据该算式计算丝素蛋白固体、PBS浓度、外泌体用量的比例后，进行丝素蛋白的溶解。充分溶解后，2000 rpm离心5min后，取中间澄清溶液，与计算好的外泌体悬液混合。
② 对于需要冷冻海绵的体系pH维持在弱酸性的（pH在3.5-5.5之间）前驱体溶液配置方法：
利用PBS作为溶剂按照所需要的浓度溶解丝素蛋白充分溶解后用1000rpm及以上的转速离心1min，其中所述丝素蛋白终浓度不超过15%；取中间层澄清溶液，通过盐酸或者磷酸向丝素蛋白溶液中滴定，亦或者直接加入过量的L-谷氨酸或天冬氨酸，待pH稳定在弱酸性区间内后，与计算好的外泌体悬液混合。
4）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵制备与保存
将3）中的前驱体溶液先在-20℃到-80℃之间速冻，结冰之后取出并置于冷冻保存盒中。待温度保存至设定的时间后，取出解冻使用，亦或者直接冻于-80℃中长期保存。温度的设定由丝素蛋白的玻璃化转变温度决定，所述玻璃化转变温度可通过差式热实验确定，所述温度的设定为将温度设定在溶液玻璃化转变温度和体系凝固点中间的温度。优选的，所述温度设定接近凝固点。更为优选的，进行反应的冷冻保存盒温差控制在±1℃。
在一些实施方案中，步骤1）中所述的煮沸的碳酸钠溶液，可以使用煮沸的CaCl2-乙醇-水混合液或硫氰酸钠溶液替换。
在一些实施方案中，步骤1）中所述的溶解丝素蛋白的溴化锂溶液，可以替换为用六氟异丙醇或者89%的蚁酸溶液。
在一些实施方案中，步骤3）的方法①中，更为优选的，Y/X≥0.2。
上述技术方案中所述外泌体是由细胞内的多泡体和细胞膜融合后释放到细胞外的一些直径约30-100nm小囊泡，其广泛存在于各种体液中，内含多种物质，包括细胞因子、蛋白质、脂类、信使RNA、微小RNA(miRNA)及核糖体RNA等，在细胞间信号交流中发挥重要作用。作为优选，本发明所述多肽纳米纤维水凝胶中，所述外泌体的来源为市售的商品化胚胎干细胞细胞系、间充质干细胞、心脏祖细胞或心脏球细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。由于间充质干细胞的外泌体能够改善心梗后微环境，提高心脏功能，所述多肽纳米纤维水凝胶能进一步提高心梗后心脏功能。
在一些实施方案中，所述技术方案还包括丝素蛋白冷冻海绵的消毒，所述丝素蛋白海绵的消毒可通过各种本领域已知的方法进行。例如：钴源放射消毒、紫外消毒等。
进一步的，本发明还提供一种缓释外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的使用方法，具体为，使用时取出冻存的冷冻海绵，在37℃环境下解冻，之后浸泡在PBS中维持渗透压，中和pH，随后即可使用。
基于上述技术方案，本发明实现了如下的技术效果：
1、通过蛋白自组装的物理交联形式，最大限度保存外泌体的结构，避免外泌体在支架制备、冷冻处理和长期保存时出现结构破坏；
2、克服了前期研究中使用去离子水会导致外泌体由于离子强度过低而发生膜破裂的问题。通过大量实验摸索，发现渗透压在0.5x PBS的中性溶液或者渗透压为1x PBS的生理渗透压的弱酸性溶液中，外泌体在几小时内均不会出现膜结构的破坏，并且在冷冻过程中可保持外泌体的结构完整。解冻取出支架并浸泡在PBS中，使得支架体系迅速恢复生理渗透压和pH，对支架的结构没有影响，且更有利于外泌体在实验过程中膜结构完整性的保持；
3、同传统方法相比，将外泌体包裹在丝素蛋白的支架内部可保持丝素蛋白的冷冻海绵在水解环境下稳定，1个月内不会出现降解，而海绵受酶解调控，只有通过酶裂解海绵，外泌体才会释放出来。因此实现了仅通过调控丝素蛋白冷冻海绵的降解速率，便可以调控外泌体的释放速率，从而可以针对不同的组织修复进行外泌体释放速率的筛选；
4、通过降解调控外泌体缓释，也避免了支架在释放外泌体后无法继续调控细胞应答和组织生长的问题，赋予了细胞支架从植入到完全裂解全程的生物活性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 丝素蛋白的冷冻成海绵能力受离子强度和蛋白浓度影响结果
图2 丝素蛋白冷冻海绵的力学性能实验结果
图3 丝素蛋白冷冻海绵酶解实验结果
图4 负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵缓释出外泌体的结构完整度实验结果
图5 负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵在体内的缓释速率验证结果
图6 外泌体缓释支架对血管生长和组织再生的促进效果验证结果
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1）丝素蛋白提取
将10 g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.02 mol/L的无水碳酸钠溶液（2 L）煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解30 min，将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂=1：4的质量比例称取相应的溴化锂，配备9.3mol/L的溴化锂水溶液（先计算好液体体积，之后称取60 %左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值），并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白，之后在60 ℃下搅拌4 h，随后将得到的黄褐色粘稠溶液进行透析，每12 h换一次水，3天之后收集并进行离心，离心转速为9000 rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液，将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。
2）外泌体提取与鉴定
将大鼠的间充质干细胞培养至70%汇合时弃去培养基，PBS清洗两次之后换成新鲜的完全培养基，培养48小时后收集上清。利用差速离心法，500g离心5min；2000g离心30min，弃去沉淀；10000g离心30min，取上清液至超速离心管中；100000g离心70min，弃去上清后，使用无菌PBS溶液重悬沉淀；100000g离心70min，弃去上清后，按计算浓度加入无菌PBS重悬沉淀，即为分离得到的外泌体；分装外泌体并冻于-80℃中。得到的外泌体分别通过透射电镜、纳米颗粒分析、western blotting对外泌体的结构粒径分布等进行分析鉴定。
3）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的前驱体溶液配置
为配置丝素蛋白最终浓度为9%，外泌体最终浓度为108/mL的中性溶液体系，溶液的离子浓度应该为0.45x PBS。配置时用0.26x PBS溶解蛋白，配成12%的丝素蛋白溶液3mL，离心后取中间层，与1mL由PBS配置的4*108/mL的外泌体悬浮液混合。
4）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵制备与保存
将上述溶液置于-80℃环境下速冻20min，随后置于温度设定为-5℃的冰盒中保存2天，即可取出使用或者置于-80℃中保存。
实施例2
1）丝素蛋白提取
将15 g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.02 mol/L的无水碳酸钠溶液（2 L）煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解60 min，将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂=1：4的质量比例称取相应的溴化锂，配备9.3mol/L的溴化锂水溶液（先计算好液体体积，之后称取60 %左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值），并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白，之后在60 ℃下搅拌4 h，随后将得到的黄褐色粘稠溶液进行透析，每12 h换一次水，3天之后收集并进行离心，离心转速为9000 rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液，将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。
2）外泌体提取与鉴定
将大鼠的脂肪干细胞培养至70%汇合时弃去培养基，PBS清洗两次之后换成新鲜的完全培养基，培养48小时后收集上清。利用差速离心法，500g离心5min；2000g离心30min，弃去沉淀；10000g离心30min，取上清液至超速离心管中；100000g离心70min，弃去上清后，使用无菌PBS溶液重悬沉淀；100000g离心70min，弃去上清后，按计算浓度加入无菌PBS重悬沉淀，即为分离得到的外泌体；分装外泌体并冻于-80℃中。得到的外泌体分别通过透射电镜、纳米颗粒分析、western blotting对外泌体的结构粒径分布等进行分析鉴定。
3）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵的前驱体溶液配置
为配置丝素蛋白最终浓度为9%，外泌体最终浓度为1*108/mL，pH为弱酸性的体系，本实施例选用谷氨酸进行pH调节。配置时用1x PBS溶解丝素蛋白，配成12%的丝素蛋白溶液3mL，加入过饱和度的谷氨酸，充分震荡搅拌后静置在室温2小时，随后离心后取中间层，与1mL由PBS配置的4*108/mL的外泌体悬浮液混合。
4）负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵制备与保存
将上述溶液置于-20℃环境下速冻20min，随后置于温度设定为-5℃的冰盒中保存2天，即可取出使用或者置于-80℃中保存。
实施例3 丝素蛋白的冷冻成海绵能力受离子强度和蛋白浓度影响
为了分析冷冻海绵的制备能力与离子强度和蛋白浓度之间的影响，制备了具有不同离子强度和蛋白浓度的丝素蛋白溶液，并利用差式热实验对比了这些批次蛋白的玻璃化转变温度。经过试验发现，离子强度越大，丝素蛋白溶液的玻璃化转变温度越低，成海绵能力越差。相比之下，蛋白浓度越高，离子强度的影响就越小（附图1）。
实施例4 丝素蛋白冷冻海绵的力学与降解性能
丝素蛋白冷冻海绵的力学性能通过拉伸试验和压缩实验进行检测，并和传统通过乙醇诱导实现自组装的丝素蛋白海绵进行了对比。结果发现，同传统海绵相比，冷冻海绵的拉伸模量和压缩模量更低，但是断裂伸长率更大（附图2）。此外，支架的降解通过酶解实验探究，酶解选用的是0.1U/mL的胃蛋白酶溶液，每两天换一次溶液，并通过比较降解前后的干重来判断降解率。丝素蛋白支架的酶解速率和蛋白浓度关系密切，蛋白浓度越高，降解速率越慢。同传统海绵相比，冷冻海绵降解更快（附图3）。
实施例5 丝素蛋白冷冻海绵的体外缓释速率
为了验证丝素蛋白冷冻海绵携带外泌体的体外缓释速率，同时选择水解和酶解两种方式，对照组选用纤维蛋白胶，一种医用常见的生物粘合剂。为了检测外泌体，选用PKH-67对外泌体的膜进行荧光修饰，通过利用荧光光谱仪分析降解产物的荧光强度，半定量分析外泌体的含量。纤维蛋白胶在PBS环境下，第二天便实现外泌体的完全释放，尽管纤维蛋白胶没有任何降解，而丝素蛋白支架在10天内也仅有5%的外泌体缓释。在酶解环境下，纤维蛋白胶的释放速率更快，而丝素蛋白支架也展现出了酶解依赖的降解缓释效果，随着时间的延长，外泌体缓释累计率逐渐提高 ，在10天时达到70%。
实施例6 负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵缓释出外泌体的结构完整度
为了对比外泌体制备对外泌体的影响，选择较低的酶浓度降解支架，并且每隔1小时更换酶解液，将收集下来的酶解液用BSA溶液终止酶反应。随后通过差速离心法提取外泌体，并通过TEM观察。可以看到，外泌体在制备前呈现半球状（图4左），支架包裹再缓释后依旧保持了外泌体的形态（图4右）。
实施例7 负载外泌体的丝素蛋白冷冻海绵在体内的缓释速率验证
为了分析丝素蛋白支架在体内的缓释外泌体速率，选用裸鼠皮下背部囊植入模型作为实验对象。对照组选用纤维蛋白胶包裹的外泌体。经过试验可以发现，同纤维蛋白胶组相比，冷冻海绵在两个月的时候，依旧具有外泌体荧光，证明其长效缓释能力。相比之下，纤维蛋白胶组在5周的时候就已经快释放结束，而在2个月的时候已经没有任何荧光（附图5）。
实施例8 丝素蛋白和离子强度之间的比例对丝素蛋白海绵成型制备的影响
为了探究蛋白浓度和溶液离子强度共同对丝素蛋白低温成型的影响，分别用0X,0.25X, 0.5X,1.0X PBS溶液分别配置2.5%，5%，10%三个丝素蛋白浓度，总共12组样品。每组样品分别在-2℃到-24℃之间每隔2℃保存3天，每12小时取出解冻，观察样品在不同保存温度下发生蛋白自组装所需要的时间。经过大量实验，发现对没有离子强度的去离子水组，不论蛋白浓度的多少，均可以成海绵。但是当离子强度达到0.25X PBS时，2.5%组就无法在任意温度下成海绵，当离子强度达到0.5X PBS时，5%组就无法成海绵，当离子强度达到1.0XPBS时，10%组就无法成海绵。因此可以推断，蛋白浓度的提升有助于丝素蛋白在较高离子强度自组装，克服离子强度的对蛋白性质的影响。
表1
实施例9 pH调控对丝素蛋白克服离子强度实现蛋白自组装的影响实验
基于实施例8的结果，进一步尝试在保持蛋白溶液处于等渗（1X PBS）的情况下，通过改变pH实现丝素蛋白自组装成海绵的方法。选择10%丝素蛋白浓度+1.0X PBS作为实验组10（1.0）。在表1中可知实验组10（1.0）在-2到-24℃之间均无法成海绵。用盐酸对丝素蛋白-PBS溶液进行滴定，分别滴定至pH为4、5、6、7.当pH=4时，pH达到丝素蛋白的等电点，蛋白出现自聚合，从溶液中析出。当pH=6和7时，蛋白在不同的保存温度下均没有出现冷冻自组装现象。在pH=5时，蛋白在24小时即发生自组装。
实施例10 外泌体缓释支架对血管生长和组织再生的促进效果验证
为了验证丝素蛋白海绵支架携带外泌体后支架对组织生长的促进效果，通过裸鼠皮下植入的动物模型，分别对比了无外泌体包裹的丝素蛋白冷冻海绵和有外泌体的海绵在1个月和2个月时支架的HE染色结果。结果显示（附图6），没有外泌体负载时，支架几乎不具有细胞应答的调控效果。在第一个月时细胞几乎无法长入，没有新生血管形成。而负载外泌体的支架在第一个月时已有大量细胞侵入，并且在支架内部出现新生血管。在2个月的时候，随着支架出现降解，细胞逐渐侵入无外泌体包裹的空白支架，而有外泌体包裹的支架由于细胞代谢旺盛，已经逐渐变薄，内部空腔基本被新生组织填满。空白支架组虽然可以为细胞提供力学支撑，作为生物材料也具有较好的生物相容性，但是受到排异反应等影响，细胞很难侵入支架内部。相比之下，携带外泌体后，外泌体随着支架的初步降解不断释放，调控炎症反应细胞，并且促进血管再生，进而加快支架降解速率。随着支架的降解，新生组织也在不断替代支架，从而使得支架持续具有优异的生物活性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
